UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NCLEO BOLVAR
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
Dr. Francisco Battistini Casalta
Ctedra: Inmunologa II. (Laboratorio)

Western, Northern, Southern BLOT.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Prof. Esmeralda Partidas. Bachilleres:

Caraballo Carmen. C.I: 20.740.915
Dalessandro Niurvis. C.I: 18.530.643
Diaz Anilda. C.I: 21.349.960
Hernndez Odalis. C.I: 24.038.868
Sosa Clement. C.I: 22.704.669
Villarroel Bianca. C.I: 21.177.234

Ciudad Bolvar, 30 de Octubre de 2017.

 Western blot.

El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas
especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular).
Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis
existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF)
para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta
la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros mtodos. De esta
forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa
respecto a otras protenas.

Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular,
la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de
anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes.

El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford. El

nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette, y consiste en un juego de
palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe
su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este
criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

Pasos del Western blot.

Preparacin de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se
procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volmenes de
muestra), con un homogeneizador (para muestras pequeas) o por sonicacin. Por
ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no
precipitada.
Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin pueden
usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las
protenas. A veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la
digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas,
respectivamente.

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin
proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas
mecnicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas.

Electroforesis en gel

Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de
uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoelctrico, peso
molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de
la naturaleza del gel.
 La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un
tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las estructuras secundaria y terciaria
(por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los
polipptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional delas protenas
no influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao.

Transferencia

Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde
el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede
realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia).

Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir
protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad):

Las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las

interacciones membrana-protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones
no covalentes de naturaleza hidrfoba.
En las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos
entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol
o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la
ausencia de surfactantes.

Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin ms
frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas
consecutivas.

Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin
embargo, no son tan usados como los anteriores.

Difusin simple

En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel
electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de
facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se
coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las
protenas. Al llegar a la membrana, quedarn retenidas en ella.

Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha
ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples transferencias de un
mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta
modificacin es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de protenas.
Transferencia al vaco

En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de

secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la membrana
de nitrocelulosa. Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de bajo peso molecular.

Electrotransferencia

Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las
protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes
elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados
en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este
montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una
corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible. Las protenas
del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.

Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un
colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha
pasado a la membrana.

La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la

velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en
comparacin con las otras tcnicas).

Bloqueo

Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es
preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el
anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la
distincin del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina

de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o casena, con
una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se
unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que no estn ya ocupados por las
transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico,
reduciendo as el ruido de fondo y los falsos positivos.

Deteccin

En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para

ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato,
catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unin con el
antgeno, la protena, as como su localizacin.

El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la

deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos.
Mtodo en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo primario
y la del anticuerpo secundario.

Aplicaciones

1. Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el Western Blot se
usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no
es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el
Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se
transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH.
Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es
equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero,
sern estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los
anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-
humano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas
contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es
seropositivo.

2. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente

llamada "enfermedad de las vacas locas".

3. Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

4. En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV
en gatos.

Resumen.

Determinacin protena.
Gel de poliacrilamida a un filtro de nitrocelulosa
Analiza sueros dudosos
Diagnstico de VIH 1 Y 2, hepatitis B
Revelador: azul de cromasse, oro coloidal
Enzimas: peroxidasa de rabano, Fosfatasa alcalina.
 Southern blot.

Es una tcnica empleada para detectar secuencias especficas de ADN. Para llevar a cabo
hibridaciones de este tipo, se asla el ADN de un tejido o lnea celular, luego se purifica, y se digiere
con enzimas de restriccin especficas. Los fragmentos generados se separan mediante electroforesis
y despus son transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva
a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solucin llamada
de transferencia (solucin salina concentrada). A continuacin se sita la membrana sobre el gel y
encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solucin de transferencia es atrada a
la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana, donde queda inmovilizado
conservando la misma posicin relativa que ocupaba en el gel. Luego, el ADN puede ser hibridado en
la membrana con una sonda marcada.

Debido a que la transferencia del ADN del gel a la membrana se produce por capilaridad, con
el mismo principio utilizado por aos para limpiar manchas con papel secante, el proceso se conoce en
ingls como blotting; Southern propuso utilizar el trmino blot (secado) o blotting para referirse a esta
tcnica y actualmente se conoce como Southern blot.

Esta tcnica se ha empleado para el diagnstico y caracterizacin de diversas

inmunodeficiencias, la distrofia muscular de Duchenne, la hipoplasia adrenal congnita, la deficiencia
de glicerol-quinasa, la distrofia miotnica severa y en anlisis de mutaciones de genes en clulas B de
leucemia linfoblstica crnica, entre otras enfermedades.

Resumen.

Determina AND.
Tincin: tinta china, negro amido.
Para diagnstico de inmunodeficiencias.
 Northern blot.

Es una variante del mtodo anterior en el que en lugar de utilizar ADN como sustrato de
estudio, se emplea ARN. El procedimiento que se sigue es similar al Southern blot y por analoga con
este se le conoce como Northern blot. Esta tcnica se ha aplicado en estudios de la modulacin de la
sntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide, en el anlisis de expresin de receptores
que participan en la sntesis de molculas en cultivos celulares, en anlisis de mutaciones y
alteraciones del RNAm de enzimas, y en la regulacin de la expresin gnica de marcadores
moleculares de clulas leucmicas humanas y molculas del reconocimiento inmunolgico.

El ensayo northern permite observar un patrn particular de expresin gentica entre tejidos,
rganos, estadios del desarrollo, niveles de estrs ambiental, infecciones causadas por patgenos y
durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta tcnica se ha utilizado para mostrar la
sobreexpresin de oncogenes y la desregulacin de genes oncosupresores en clulas cancerosas
cuando son comparadas con tejidos normales.

Los patrones de expresin obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde
que el RNA se separ por su tamao, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su
tamao, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La variacin en el tamao del
producto de un gen puede adems indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripcin.
Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar qu regin del RNA ha sido
seleccionado.

Resumen.

Determina ARN.
Gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa.
Revelado: con sondas de quimioluminiscencia.
Marcador: P32.
Quimioluminiscencia.
 PCR

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR son las siglas por las que se conoce a la reaccin en cadena de la polimerasa (en ingls
Polymerase Chain Reaction), una tcnica cientfica avanzada que fue inventada por el bioqumico
estadounidense Kary Mullis en 1985. Esta tcnica permite amplificar pequeas regiones especficas
del ADN en laboratorio. Es decir, consigue que un pequeo segmento de ADN que pasara
desapercibido en un anlisis cualquiera se multiplique millones de veces y as sea fcil de detectar.

Gracias a esta tcnica se han podido realizar estudios genticos en cualquier campo de la
ciencia. Por ejemplo, se utiliza diariamente para la identificacin de cadveres o en el estudio de
escenas del crimen para buscar rastros del culpable. Tambin se emplea en la biologa, para identificar
cadenas genticas de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos. En la medicina se rene la
experiencia de todos esos campos y se usa principalmente para identificar grmenes agresores que se
encuentran en nuestro organismo.

Cuando se desarroll la prueba de la PCR por primera vez se trataba de una tcnica cara y
algo engorrosa de realizar, pero pronto se generaliz su uso y se empezaron a desarrollar equipos
sencillos y muy baratos que se utilizan todava hoy en muchos centros diagnsticos.

Adems, se han diseado PCR ms especficas que se pueden elegir segn sea la muestra a
estudio. Los diferentes tipos de PCR, adems de la bsica, son:

PCR anidada: consigue amplificar muestras mnimas de ADN a miles de millones de

fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minsculos.PCR in situ: permite la
deteccin de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que procesarla primero con
tcnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de clulas.PCR mltiple: con
este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN a la vez y con una sola muestra.
PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar
moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza el VIH entre
otros virus.PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se aade un componente fluorescente que
permite medir la luz. A ms luz, ms cantidad del ADN detectado.
Aplicaciones.

Se recomienda realizar una PCR en todas las situaciones en las que se quiera detectar
cadenas de ADN y amplificarlo, ya sea para realizar estudios sobre l o para poder identificar su
secuencia exacta. Como por ejemplo, en las siguientes:

1. Diagnstico microbiolgico: el mtodo ms fiable para identificar un germen es aislarlo en

un cultivo microbiolgico, pero a veces no es posible llevarlo a cabo, ya sea porque el mtodo
de cultivo es difcil o porque sea demasiado caro. En esos casos la PCR puede detectar
material gentico del microorganismo que sea necesario detectar. La toma de la muestra
puede ser de cualquier tipo: Sangre. Exudado farngeo. Exudado vaginal. Exudado rectal o
heces. Exudado uretral u orina. Biopsia (cutnea, de mdula sea, heptica, etctera). Esputo.
Deteccin de mutaciones genticas: las enfermedades genticas estn causadas por una
mutacin focal en una regin del ADN concreta. Estudiarlas directamente es muy difcil, por
eso se opta por multiplicar primero todo el ADN de la muestra y hacer estudios con base ms
amplia. As se confirma el diagnstico de muchas enfermedades como la fibrosis qustica, el
corea de Huntington, la enfermedad de Rendu-Osler-Weber, etc.

2. Estudios de medicina legal: su uso est muy extendido en este campo y tiene multitud de
aplicaciones. Las ms frecuentes son la identificacin de cadveres, el estudio de pruebas de
escenas del crimen, investigacin de casos de abuso sexual, estudios de paternidad, etc.
Todas ellas se basan en la amplificacin del ADN para estudiar su secuencia con facilidad.

3. Revisiones de VIH o hepatitis vricas: el VIH y los virus de la hepatitis C y B se encuentran

constantemente en la sangre de las personas infectadas. Se deben estudiar sus niveles
peridicamente para conocer la gravedad de la enfermedad y para ello se utiliza la deteccin
de ADN con PCR.

Procedimiento.

Se extrae de la muestra recogida el ADN que contenga. Esto incluye clulas de tu propio
cuerpo, pero tambin material de cualquier germen que haya. Se calienta la muestra hasta casi los
100C para que las dos cadenas de ADN se separen. Se aade a la muestra un cebador; esto es una
secuencia de ADN sintetizada en el propio laboratorio que se une a un ADN ya conocido. Por ejemplo,
si queremos detectar citomegalovirus utilizaremos un cebador especfico para l. Se enfra la muestra
para que el cebador se una al ADN que se estudia. Acto seguido empieza a funcionar una enzima
llamada DNA-polimerasa, que duplica el ADN a estudio. Se repiten todos los pasos previos; cada vez
que termine un ciclo se obtendr una duplicacin de las cadenas de ADN previas. Con el ADN
amplificado ya se pueden realizar estudios genticos de forma fcil y rpida.

Complicaciones de la PCR

Las complicaciones de la PCR son prcticamente inexistentes. Es una prueba segura que no
entraa riesgos para las personas que se someten a ella. El nico riesgo es aceptar resultados falsos
como positivos o negativos, y tomar medidas equivocadas al respecto. La toma de la muestra no suele
entraar riesgos, excepto las propias de las biopsias segn el rgano del que se tomen.
Resultados

La PCR se expresa en valores numricos, pero no hay unos lmites estndar para todos los
estudios. Cada objetivo tiene unos valores propios, de tal forma que una PCR de citomegalovirus de
100 no tiene por qu tener el mismo valor que una PCR de Chlamydia de 100.

Habitualmente el resultado de la PCR se puede resumir en positiva o negativa. Es decir, se ha

encontrado el ADN que esperbamos, o no. Eso es esencial para poder identificar grmenes concretos
y proporcionar un antibitico especfico, o poder diagnosticar una enfermedad gentica y medir la
cantidad de ADN mutado.

Aunque es una prueba muy eficaz puede proporcionar falsos positivos. Hay que tener en
cuenta que el cebador puede adherirse al ADN que queremos detectar, pero tambin se une por puro
azar a otras cadenas de ADN que se encuentren cerca. Los falsos negativos son ms raros, ya que por
poco ADN que haya se suele detectar.
 Bibliografa.

Western blot antibody (http://www.exactantigen.com/review/western-blot-antibody.html). exactantigen.com.

Consultado el 20/8/2010. Labome lists 449244 antibody products against 41374 genes, including 15695 human,
11355 mouse, and 9387 rat genes. Revisado por ultima vez (29/10/17 a las 6:18pm)

Link: http://www.uaz.edu.mx/histo/Biologia/Wiki/WesternBlot.pdf

Escobar Luis. Revista Actualidades Biolgicas. Vol. 1 No. 2. Universidad de Santa Fe De Bogot, 1972;
42-46.
Frumento A. Biofsica. Mosby / Doyma Libros. Madrid, 1995; 120-123.
Goychuk I., Hnggi P. Fractional diffusion modeling of ion channel gating. Physical Review. Vol. 70,
noviembre de 2004. Revisado por ultima vez (27/10/17 a las 6pm)

Link: https://es.wikipedia.org/wiki/Difusi%C3%B3n_simple

Autor:
Dr. Vladimir Ruiz lvarez,
Especialista de Primer Grado en Laboratorio Clnico. Master en Bioqumica General. Profesor
Asistente de Bioqumica y Laboratorio Clnico,
Direccin: Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos,
Laboratorio de Bioqumica y Fisiologa, Calzada de Infanta 1158, Entre Clavel y Llins, CP. 10300,
Ciudad de La Habana, Cuba. Telfono: (537) 879 5183

Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos20/biologia-molecular/biologia-molecular.shtml#ixzz4wwFHcako