UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NCLEO BOLVAR
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
Dr. Francisco Battistini Casalta
Ctedra: Inmunologa II. (Laboratorio)

Enzimoinmunoanlisis (EIA).
Ensayo por Inmunoabsorcin Ligado a Enzimas (ELISA).
Radioinmunoensayo (RIA).

Prof. Esmeralda Partidas. Bachilleres:

Caraballo Carmen. C.I: 20.740.915
Dalessandro Niurvis. C.I: 18.530.643
Diaz Anilda. C.I: 21.349.960
Hernndez Odalis. C.I:24.038.868
Sosa Clement. C.I: 22.704.669
Villarroel Bianca. C.I: 21.177.234

Ciudad Bolvar, 30 de Octubre de 2017.

 EIA

Enzimainmunoanlisis (EIA).

Determinacin de autoanticuerpos (anti-ENA, anti-proteinasa-3, anti-mieloperoxidasa, anti-DNA, anti-

cardiolipina, etc.), marcadores tumorales, IgE total y otras.

Fundamento.

El enzimainmunoanlisis (EIA) es una metodologa que permite cuantificar anticuerpos o antgenos

en muy baja concentracin (menos de 1 ng/ml) en la mayora de los lquidos biolgicos y
sobrenadantes de cultivos celulares. Se ha usado ampliamente en el estudio de la respuesta de
anticuerpos frente antgenos complejos. En el laboratorio de inmunologa se utiliza corrientemente para
detectar y cuantificar autoanticuerpos y diversas protenas e inmunoglobulinas en baja concentracin
en los lquidos biolgicos.
De acuerdo a lo anterior el EIA puede aplicarse a una amplia gama de situaciones, entre las que
destacan las siguientes:
Apoyo diagnstico a enfermedades autoinmunes.
Diagnstico de enfermedades infecciosas.
Diagnstico de enfermedades alrgicas.
Estudio de marcadores tumorales.
Cuantificacin de protenas circulantes en baja concentracin.
Niveles plasmticos de drogas y hormonas.

El enzimainmunoanlisis se basa en dos fenmenos biolgicos: la alta especificidad del anticuerpo

por su antgeno y la amplificacin de la unin antgeno-anticuerpo por reacciones qumicas llevadas a
cabo por enzimas. Por tanto, esta metodologa consiste en una reaccin inmunolgica y una indicadora
enzimtica. El EIA en fase lquida sin etapas de separacin, se conoce como sistema homogneo,
ejemplo, el EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique). El EIA en fase slida requiere etapas de
separacin y recibe el nombre de sistema heterogneo, ejemplos, ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay), MEIA (EIA en micropartculas).

Reactivos y Materiales.

Tampn de recubrimiento (coating). Carbonato 0.05 M;pH 9.6.

PBS - BSA 1 %.
Tampn sustrato para fosfatasa alcalina: Dietanolamina 10%; pH 9.8.
Sustrato para fosfatasa alcalina: p-nitrofenilfosfato (1 mg/mL).
Tampn sustrato para peroxidasa: tampn citrato-fosfato pH 5.0: cido ctrico x 1 H2O 21.0 g/L
y fosfato disdico 28.4 g/L.
Sustrato para peroxidasa: ortofenilendiamina al 0,04%.

Conjugado-fosfatasa alcalina o Conjugado-peroxidasa (anti-inmunoglobulinas u otro.). Usar

segn dilucin de trabajo (1/500 a 1/1500 o ms).
Solucin de detencin:
Procedimiento.
Para reactivos comerciales seguir indicaciones fabricantes.
Para tcnica del laboratorio, seguir los siguientes pasos:
1. Cubrir los pocillos de las placas con antgeno o anticuerpo, segn sea el caso, en una
concentracin de 0.01 a 1 ug/ 0.1 mL/pozo en tampn de recubrimiento.
2. Dejar 1 hora a 37C y luego toda la noche a 4C.
3. Lavar 6 veces (3 minutos por vez) con PBS y dejar 1 hora con PBS- BSA 1% a
temperatura ambiente.
4. Agregar 0.1 mL en cada pozo del anticuerpo o antgeno control, segn sea el caso, en
diferentes concentraciones (5 diluciones) y las muestras a estudiar diluidas en PBS -
BSA 1%.
5. Incubar por 1 hora a 37C.
6. Lavar seis veces con PBS.
7. Agregar 0.1 mL en cada pozo del conjugado correspondiente diluido en PBS BSA
1%.
8. Incubar por 1 hora a 37C o dejar toda la noche 4C.
9. Lavar seis veces con PBS.
10. Agregar 0.1 mL en cada pozo de la solucin sustrato correspondiente.
11. Dejar por 15 a 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
12. Detener la reaccin con 0.05 mL de NaOH 3 M o H2SO4 2.5 M, segn corresponda.
13. Leer a 405 nm para fosfatasa alcalina o 492 nm para peroxidasa.
14. Graficar en papel log-log la densidad ptica versus concentracin del anticuerpo o
antgeno control e interpolar las lecturas de las muestras.

ELISA.

ELISA son las siglas por las que se conoce al ensayo por Inmunoabsorcin ligado a enzimas
(en ingls enzyme-linked immunosorbent assay). Se trata de una tcnica de laboratorio que fue
diseada por cientficos suecos y holandeses en 1971, que permite detectar pequeas partculas
llamadas antgenos, que habitualmente son fragmentos de protenas. La identificacin es especfica, es
decir, consigue que pequeos segmentos de protenas destaquen y no puedan ser confundidas con
otras.

Para poder identificar los antgenos se utilizan molculas con dos componentes acoplados: un
anticuerpo (que se une al antgeno de forma especfica) y una enzima (que se activa y seala la unin
al antgeno). Antes del descubrimiento del ELISA se utilizaban molculas radioactivas en vez de
enzimas, lo que supona un riesgo aadido innecesario en el laboratorio y un mayor coste.

Gracias a esta tcnica se han podido realizar estudios cientficos en campos como la biologa,
la bioqumica y la medicina. La tcnica pronto se generaliz con el empleo de equipos simples y muy
baratos que se utilizan todava hoy en muchos centros diagnsticos de todo el mundo.
Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la

cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ej. en el
clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A
continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno.
Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin
analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las
analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno
buscado, o bien se le ha aadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin
de dos o ms anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es
la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema
enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos

ELISA sndwich. (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos).

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de
antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

ELISPOT: se trata de un tipo de ELISA que permite conocer de forma cuantitativa el antgeno,
incluso identifica el nmero concreto de clulas donde se encuentra.

Se recomienda realizar un ELISA en todas las situaciones en las que se quieran detectar
antgenos cuya existencia pueda ser determinante para un diagnstico o para establecer conclusiones
en un estudio cientfico. Algunas de las situaciones ms frecuentes donde se usa el ELISA son:

1. Diagnstico de VIH: es la primera prueba que se realiza para descartar una infeccin por VIH.
Se trata de una prueba muy sensible, as que prcticamente detecta todos los casos. Sin
embargo, puede dar falsos positivos, por lo que se suele repetir de nuevo un ELISA y se
confirma con un Western-Blot.
 2. Deteccin de anticuerpos contra microorganismos: a veces el antgeno a estudiar puede
ser otro anticuerpo. Esta situacin se da, por ejemplo, en la identificacin de anticuerpos contra
el bacilo de la tuberculosis, entre otros.
3. Diagnstico de hepatitis B: Al igual que con el VIH, el virus de la hepatitis B puede ser
reconocido fcilmente mediante un ELISA en sangre.
4. Deteccin de grmenes en heces: ciertos virus pueden detectarse en las heces cuando
provocan diarreas; los ms frecuentes son los rotavirus. A veces no se detecta al propio
germen, sino que se pueden identificar toxinas que produce el mismo, como sucede con el E.
coli.
5. Deteccin de antgenos en orina: es una prueba muy til y sencilla para identificar grmenes
causantes de neumonas. En las infecciones respiratorias las bacterias pasan a la sangre y de
ah a la orina, por lo que se pueden identificar antgenos fcilmente con un ELISA.

Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El
anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El
antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno.

2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza
con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas.

3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se

puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un
anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este
segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos
secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una
mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una
cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno.

4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todas las molculas
marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se
deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra.

La prueba Elisa de tipo competitivo difiere en que el anticuerpo antivih de la muestra compite
con el conjugado (que es un anticuerpo tambin dirigido contra el antgeno del VIH) para ocupar sitios
reactivos en el antgeno fijado. En este tipo de prueba, tanto la muestra que contiene el anticuerpo
antivih, como el conjugado se agregan a la fase solida (conteniendo el antgeno del VIH) al mismo
tiempo. Si la concentracinon de anticuerpos en la muestra es alta, muy poco del conjugado puede
fijarse a los antgenos inmovilizados, ya que muestra y conjugado compiten por los mismos lugares del
antgeno. Habr ausencia de coloracin dado que no habr fijacin de la enzima como para unirse al
sustrato.

Inversamente, con muestras que contienen poco o ningn anticuerpo antivih, se fijar ms
conjugado al antgeno en la fase slida y la consiguiente adicin de sustrato provocar la presencia de
color. Por esto, la cantidad de anticuerpos desconocidos en la muestra analizada es inversamente
proporcional a la cantidad de coloracin que aparezca

Se deposita la muestra recogida en bandejas con pequeos pozos. Al lado habr pozos para
muestras que se sepan que estn contaminadas y libres de antgenos conocidos.
Una vez depositada la muestra se aaden los anticuerpos que detectan los antgenos si los
hay. En el otro extremo de los anticuerpos hay enzimas acopladas.
Si es un ELISA indirecto se pueden aadir otros anticuerpos que detecten los anticuerpos
previos; as se ampla la seal.
Se realiza un lavado de los pocillos; as se eliminan los anticuerpos que no estn unidos a
antgenos.
Se aade un sustrato, es decir, una sustancia qumica que reacciona con las enzimas de los
anticuerpos que queden. Al reaccionar se forman metabolitos.
Por ltimo, se mide la cantidad de metabolito que hay mediante diferentes tcnicas, como la
espectrofotometra.

Complicaciones del ELISA

Las complicaciones de la ELISA son prcticamente inexistentes. Es una prueba segura que no
entraa riesgos para las personas que se someten a ella. El nico riesgo es aceptar resultados falsos
como positivos o negativos, y tomar medidas equivocadas al respecto.

Resultados

ELISA se expresa en valores cualitativos, es decir, o es positivo o es negativo. Slo el

ELISPOT puede aportar resultados cuantitativos, pero no hay unos lmites estndar para todos los
estudios. Cuando el ELISA es positivo quiere decir que se han detectado antgenos en la muestra
recogida, y por tanto hay grmenes presentes. Cuando es negativa, no se han podido detectar
antgenos y se considera que la muestra no est contaminada.

Aunque es una prueba muy eficaz puede proporcionar falsos positivos o falsos negativos. En
las situaciones en las que el ELISA sea determinante y cambie radicalmente la actitud del mdico, es
habitual realizar la prueba dos veces seguidas, o realizar otra para asegurar el resultado. Es el caso de
la prueba del VIH: su diagnstico es determinante para una persona, y por eso se realizan dos ELISA
seguidos y otra tcnica ms que permite confirmar el diagnstico con mucha ms fiabilidad.
 RIA.

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

Esta tcnica fue desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow en 1960 para determinar
la concentracin de insulina en el plasma sanguneo. Por ese motivo, R. Yalow recibi el Nobel de
Medicina en 1977 (Berson muri en 1972). Hoy en da, esta tcnica se utiliza para detectar y
cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas y mezcladas con muchas otras.
Es por tanto una tcnica muy sensible y muy especfica. Utilizando anticuerpos de gran afinidad se
pueden detectar hasta picogramos de antgeno. (1 pg = 10-12g).

Fundamento.

Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una cantidad

constante de un anticuerpo para ese antgeno.

Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac).

Se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de
hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2 anticuerpo dirigido contra el primero).

Se determina la radioactividad.

Si la muestra contiene adems antgeno fro (no marcado), ste competir con el marcado para
unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la radioactividad.

Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno fro en la muestra.

En el RIA, los elementos radioactivos frecuentemente utilizados para marcar los Ag son: I125 y
H3 (tritio).

El I125 posee un exceso de energa y para ganar estabilidad desintegra emitiendo fotones .
Como los fotones no poseen masa, su interaccin con la materia es pobre, por lo que pueden recorrer
grandes distancias antes de colisionar con molculas del medio circundante (tienen alta penetrancia).
El nmero de desintegraciones que el I125 emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador
de centelleo slido.

Los mtodos de separacin del Ag libre y unido pueden agruparse en tres tipos:

1) Mtodo de adsorcin: El Ag libre se retiene superficialmente en un material insoluble

adecuado (carbn activo, silicato magnsico, resinas de intercambio inico). La centrifugacin
deja en el sobrenadante la fraccin unida y lleva al sedimento la fraccin libre.
2) Mtodo de precipitacin: El Ag unido se separa del libre precipitando el Ag unido con
compuestos precipitante de protenas como el sulfato amnico, etanol, cido perclrico. Tras
centrifugar, el Ag unido queda en el sedimento y el libre en el sobrenadante.
3) Mtodo de doble anticuerpo: El Ag unido puede precipitarse con un segundo Ac para l.
Despus de centrifugar, el Ag unido queda en el sedimento y el libre en el sobrenadante.

Dado que utiliza radioactividad es muy sensible. La ms sensible de todas estas tcnicas, pudiendo
llegar a detectar cantidades del orden de picogramos.

Aplicaciones de RIA

Uno de los mbitos de aplicacin de Radioinmunoensayo se encuentra en la industria

agroganadera. Por ejemplo, diversos estudios muestran su utilidad para medir los niveles de
progesterona en reses gestantes. En general, su objetivo es mejorar la capacidad reproductiva en
explotaciones ganaderas bovinas.

La progesterona es una hormona implicada en el proceso reproductivo, tanto de los seres

humanos como de otras especies.

Del mismo modo, las herramientas de Radioinmunoensayo son muy eficaces para determinar
la presencia de anticuerpos de determinadas enfermedades en el organismo humano, tales como la
peste infecciosa. Tambin suele utilizarse para encontrar hormonas, neuropptidos o sustancias
determinadas en ciertos fluidos biolgicos.

Estamos, pues, ante un mtodo muy especfico y fcilmente reproducible, adems de fiable y
slido en cuanto a resultados.
 Bibliografa

Kern P., Kron M. and Hiesche K. Measurement of antinuclear antibodies: assessment of

different test systems. Clin. Diag. Lab. Immunol. 2000; 7 (1): 72-78.
Revisado por ultima vez el (25/10/17 a las 4pm)
Link: http://www.ispch.cl/lab_sal/inmunologia/proc_inmuno.html#ocho

Fingerle V, Schulte-Spechtel UC, Ruzic-Sabljic E, Leonhard S, Hofmann H, Weber K, et al.

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Revisado por ultima vez 26/10/11 a las 7pm

Link: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-570X2016000100002

Strauss E. Rosalyn Yalow. Nobel laureate: her life and work in medicine. New York: Perseus
Books; 1990. 7. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J
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Revisado por ultima vez el (29/10/17 a las 6:30pm)
link: http://www.redalyc.org/pdf/4577/457745504001.pdf