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Trabajo Final para optar al Ttulo

de
Licenciada en Biotecnologa

OBTENCIN DE ACEITE COMO


MATERIA PRIMA
PARA BIOCOMBUSTIBLES A PARTIR
DE PLANTAS NATIVAS
DE LA REGIN DEL NOA:
EXPERIENCIA CON JATROPHA SP.

Constanza Mara Adn


Alumna
Lic. Gloria Susana Jaime
Directora
Dra. Cintia Mariana Romero
Co-Directora
Este trabajo fue realizado en:

Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia


Ctedra de Farmacobotnica
ndice

RESUMEN 5

INTRODUCCIN. 7
Problemtica energtica. 8

Biocombustibles.. 8

Biodiesel 9

El gnero Jatropha: taxonoma y distribucin. 11

Usos de Jatropha. 12

Importancia del gnero Jatropha como cultivo energtico. 15

HIPTESIS.. 17

OBJETIVOS. 17

OBJETIVOS ESPECFICOS. 17

MATERIALES Y MTODOS.. 19
1. Recoleccin del material vegetal.. 20

2. rea de estudio 20

3. Identificacin taxonmica... 21

3.1 Clave de identificacin para especies del gnero Jatropha. 22

4. Recoleccin de frutos y obtencin de semillas de Jatropha sp. ... 23

5. Anlisis de semillas de Jatropha sp. 23

5.1 Estudio morfolgico.. 23

5.2 Estudio histolgico 24

5.2.1 Pruebas histoqumicas.. 24

5.2.2 Anlisis histolgico 24

5.2.3 Microscopa electrnica de Transmisin y Barrido 26

5.3 Clculo de volumen de oleosomas y estimacin de rendimiento de aceite 26

5.4 Anlisis de Viabilidad 29

5.4.1 Aplicacin de tcnica de Viabilidad en semillas de Jatropha sp. 29


6. Germinacin de semillas.... 31

7. Extraccin de aceite de Jatropha sp. ... 34

7.1 Extraccin con n-hexano.. 34

7.2 Extraccin con mezcla cloroformo-metanol.. 34

8. Determinacin de la composicin qumica del aceite de Jatropha sp. 35

8.1 Evaluacin del perfil lipdico por Cromatografia en capa fina (TLC)... 35

8.2 Evaluacin del perfil lipdico por Cromatrografa Gaseosa (GC-FID) 36

9. Anlisis Termo gravimtrico (TLC) 37

10. Determinacin de Actividad Enzimtica lipoltica. 37

RESULTADOS Y DISCUSIN.. 38

1. Caracterizacin del rea de estudio.. 39

2. Identificacin taxonmica... 40

3. Descripcin Botnica de la especie. Caractersticas exomorfolgicas 41

3.1. Exsiccata... 45

4. Caracterizacin del fruto de Jatropha peiranoi 48

5. Caracterizacin morfolgica de la semilla de Jatropha peiranoi... 49

5.1 Forma, tamao y color de las semillas.. 50

6. Aspectos anatmicos. Caracterizacin histolgica de la semilla.. 53

6.1 Estructura y composicin de las semillas.. 54

6.2 Pruebas histoqumicas. 55

6.3 Estructura Interna del tegumento 56

6.4 Estructura Interna del endosperma y embrin.. 58

6.5 Clculo de volumen de oleosomas y estimacin de rendimiento de aceite. 61


7. Anlisis de Viabilidad.. 62

8. Germinacin de semillas 63

9. Extraccin del aceite con solventes................ 67

10. Caracterizacin fsico-qumica del aceite de Jatropha peiranoi. 68


10.1 Cromatografa en placa (TLC)... 68

10.2 Cromatografa Gaseosa (GC-FID) 69

10.3 Anlisis Termo gravimtrico (TGA).. 71

11. Actividad lipoltica.. 73

CONCLUSIONES 74

BIBLIOGRAFA 78
Abreviaturas

DO: densidad ptica.

FAA: formaldehido-alcohol etlico-cido actico-agua.

FAME: mtil ster de cidos grasos.

FID: detector de ionizacin en llama.

GC: cromatografa de gases.

GC-FID: cromatografa de gases con detector de ionizacin en llama.

LIL: sigla de reconocimiento del Herbario Miguel Lillo

m s. n. m.: metros sobre nivel del mar

NOA: noroeste argentino

p-NPA: p-nitrofenil acetato

P-NPL: p-nitrofenil laurato

Rf: movilidad electrofortica relativa

rpm: revoluciones por minuto

S: south: sur

SEM: microscopio electrnico de barrido

TEM: microscopio electrnico de transferencia

TLC: cromatrografa en placa

W: west: oeste
Resumen

La bsqueda de energas alternativas que reduzcan la dependencia

petrolera y los problemas asociados a las materias primas empleadas en la

obtencin de biocombustibles, motivan la investigacin de nuevas especies, no

comestibles, productoras de aceite. Diferentes trabajos reportan el uso de

especies del gnero Jatropha, J.curcas, J. macrocarpa, J. hieronymi como

materia prima para la produccin de biodiesel. Las semillas del gnero Jatropha,

son ricas en contenido de aceite, lo que hace interesante investigar nuevas

especies, de Jatropha sp.

Para la realizacin de este trabajo se recolect una especie nativa y

silvestre en zonas ridas del Valle Calchaqu para ser estudiada como potencial

especie oleaginosa, como una va alternativa para la produccin de

biocombustible.

En este trabajo se realiz la identificacin y caracterizacin botnica de la

especie recolectada, Jatropha peiranoi Lourteig & O'Donnell, planta endmica de

las provincias de Catamarca, Tucumn y Salta (Argentina). El estudio de su

aspecto vegetativo aporta caracteres diagnsticos para su reconocimiento,

presencia de pecolos canaliculados con expansiones foliceas en el borde del

canal, con glndulas estipitadas, y hojas con borde crenado. Los caracteres

reproductivos, flores y frutos, permitieron conocer su fenologa en cuanto a la

poca de floracin, fructificacin, maduracin y recoleccin de frutos y de

semillas. La morfologa de la semilla, permiti definir forma, tamao y color,

parmetros tiles al momento de seleccionarlas para realizar pruebas de

viabilidad y germinacin. La anatoma e histoqumica de las semillas aport a la

diagnosis de la especie, en cuanto a su estructura externa e interna, cuyo


tegumento posee episperma liso, macroesclereidas, parnquima colapsado,

fibras y restos de nucela y endosperma con parnquima rico en oleosomas e

inclusiones proteicas. El nmero de oleosomas encontrados fue entre 14 y 16,

con distribucin espacial agrupada dentro de la clula. Las pruebas de viabilidad

y de germinacin dieron como resultado un 80% de semillas viables y un 32%

de semillas germinadas. Caracteres que se informan por primera vez en este

trabajo.

En cuanto a la extraccin del aceite por mtodos qumicos con solventes

de distintas polaridades, permitieron conocer la eficiencia de extraccin y

rendimiento de aceite, obtenindose con n-hexano el mejor rendimiento, 88%.

El anlisis del contenido de triglicridos indic que el mismo es rico en

cido linoleico, presente en un 74,5% encontrandose tambin, cido oleico

(15,6%), cido palmtico (5,9%) y cido esterico (4%).

El anlisis termo gravimtrico del aceite de Jatropha peiranoi determin el

comportamiento del aceite frente a la temperatura y establecer que a

temperaturas inferiores a 380 C se mantiene estable. A temperaturas superiores

a 500 C la descomposicin es total.

Se detect actividad enzimtica lipoltica (lipasa y esterasa) en la biomasa

residual, esterasa con actividad de 4,23 U/L y lipasa con 2,35 U/L.

El conocimiento morfolgico e histolgico de la semilla de J. peiranoi y la

caracterizacin del aceite rico en cido linoleico, hacen a esta planta nativa una

especie promisoria como cultivo oleaginoso para ser usada como materia prima

en la produccin de biocombustible. Por otro lado, se aporta a la revalorizacin

de especies vegetales nativas promoviendo su cultivo como una nueva actividad

para el sector agrario de la regin.


Introduccin
Problemtica energtica

En los ltimos aos el mundo atraviesa una crisis debido al creciente

aumento de precios de los combustibles y la posibilidad de que las reservas se

agoten en un futuro mediato (Falasca et al., 2008). Esto se debe a que los

productos derivados de fuentes fsiles tienen un perodo acotado en el tiempo,

en particular el petrleo, principal materia prima utilizada para la elaboracin de

combustibles. La disponibilidad de este recurso radica en pocos pases, lo que

lleva a la bsqueda de nuevas fuentes de energa (IEA, 2015). Por otro lado es

necesario considerar la elevada contaminacin que genera el uso de

combustibles fsiles. De all que es necesario el vuelco hacia el uso de otro tipo

de energas alternativas y renovables (Falasca et al., 2008).

Las energas alternativas ms importantes son: elica, solar,

hidroelctrica, geotrmica y biomasa (IEA, 2015).

La biomasa se define como la fraccin biodegradable de productos,

desechos y residuos procedentes de la agricultura (incluidas las sustancias de

origen vegetal y de origen animal), de la silvicultura y de las industrias, as como

la fraccin biodegradable de los residuos industriales y municipales. Surge como

una fuente potencial de energa alternativa y en particular los cultivos energticos

que son aquellos destinados a la produccin de biocombustibles (Castells,

2005).

Biocombustibles

Segn la FAO (2015), los biocombustibles se presentan como una

solucin alternativa y transitiva a la escasez de los combustibles fsiles.


Los biocombustibles son combustibles producidos directa o

indirectamente de biomasa, se consideran renovables por provenir en forma

indirecta de la energa solar, a travs de la fotosntesis (FAO, 2015).

Los biocombustibles pueden ser slidos, lquidos o gaseosos. Los

primeros son la lea, el carbn vegetal y el estircol; lquidos, el bioetanol y el

biodiesel; gaseosos, el biogs y biohidrgeno (FAO, 2015).

Biodiesel

El biodiesel es un biocombustible derivado de aceites vegetales o grasas

animales que puede ser utilizado como sustituto o aditivo del disel

convencional, por lo que representa una alternativa a los combustibles fsiles

(Canakci, 2007). Es una fuente de energa limpia, renovable, de calidad y

econmicamente viable, que adems contribuye a la conservacin del medio

ambiente (Zheng et al., 2006).

Segn la norma de calidad IRAM 6515 (IRAM, 1989), el biodiesel es una

mezcla de steres metlicos o etlicos (de acuerdo al alcohol utilizado) de cidos

grasos saturados o insaturados de diferentes pesos moleculares, derivados de

la transesterificacin de aceites de origen vegetal.

El biodiesel puede ser sintetizado por un proceso de transesterificacin

catalizado por va qumica o enzimtica. En la primera se utilizan catalizadores

cidos o alcalinos y generalmente la reaccin es producida a elevadas

temperaturas (Huerga, 2010).

En la catlisis enzimtica o biocatlisis se utilizan enzimas del tipo lipasas

generalmente de origen microbiano. La biocatlisis se realiza en condiciones


ms suaves de reaccin, obteniendo productos ms limpios comparados con la

catlisis qumica (Luna-Durn, 2015).

El biodiesel puede ser producido por una gran variedad de materias

primas, entre las ms importantes se incluye el aceite de plantas oleaginosas.

Se denominan plantas oleaginosas a aquellas especies vegetales que se

cultivan por acumular aceite como sustancia de reserva en frutos y/o semillas.

Entre estos se pueden discriminar dos tipos de cultivos, los que presentan una

mayor concentracin de aceite que de protena, entre los que se encuentran,

pin o higuerilla, girasol, colza y ricino que son netamente oleaginosos. En

cambio otros como la soja tienen ms contenido de protenas que de aceite y

forma parte de los proteoleaginosos (Windauer et al., 2006).

Actualmente la produccin de biodiesel en nuestro pas se sustenta

principalmente en la soja. Sin embargo, se duda sobre la sostenibilidad

estratgica, ecolgica y social de la soja debido a algunas consecuencias

negativas que conlleva, como la expansin de la frontera agrcola y prdida de

biodiversidad por destruccin de ecosistemas naturales (Aizen et al., 2009).

As, se torna necesario ampliar la oferta de aceites para produccin de

biocombustibles. Actualmente, las actividades se centran en encontrar cultivos

alternativos como materia prima del proceso, abrindose un nuevo escenario, lo

que motiva la investigacin de nuevas especies oleaginosas no tradicionales, no

comestibles, productoras de aceite, como por ejemplo el gnero Jatropha sp.

(Falasca et al., 2008; Alves, 2008; Deore et al., 2008).


El gnero Jatropha: taxonoma y distribucin

Jatropha es una planta perteneciente a la familia de las Euphorbiaceae, la

palabra Jatropha proviene del griego iatrs que significa mdico y troph

alimento (Brtoli, 2008), conocida popularmente como nuez purgante, tempate,

pin o pioncillo, higuerilla, pin botija, yupur, barbasco, coquito (Janick, 2008).

El gnero Jatropha tiene histricamente su origen en Centro Amrica y el

norte de Amrica del Sur. Dentro del gnero se pueden encontrar ms de 170

especies distribuidas en diferentes partes del mundo (Rodrguez-Acosta et al.,

2009). Crece en reas tropicales como frica, el Sudeste Asitico, India y

Malasia, entre otros.

Se han localizado plantas nativas en Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador,

Paraguay, Per y Argentina (Heller, 1996) (Tabla 1).

Tabla 1. Diferentes especies del gnero Jatropha autctonas (Falasca et. al., 2008)

Jatropha Distribucin en Amrica Provincias Argentinas

Brasil,
breviloba Corrientes, Formosa
Noroeste de Argentina

Corrientes, Misiones, Jujuy,


curcas Desde Mexico hasta Argentina
Salta.

Paraguay, Bolivia y Norte de Formosa, Santiago del estero,


chacoana
Argentina Salta.

excisa Catamarca, Crdoba, Corrientes, Formosa,


Norte de Argentina
La Rioja, Salta, Santiago del Estero, San Luis,
San juan, Tucumn.

grossidentata Bolivia, Argentina Chaco, Formosa, Salta

isabelli W y Centro de Brasil,


Corrientes, Misiones
Noreste de Argentina

hieronymi Argentina, Bolivia, Paraguay Catamarca, Jujuy, La Rioja, Santiago del


Estero, Salta, San Juan, Tucumn

macrocarpa Argentina, Bolivia Catamarca, Chaco, Jujuy, La Rioja, Salta,


Santiago del Estero, San Luis, Tucumn

matacensis Paraguay, Argentina Formosa, Crdoba

pedersenii Argentina Corrientes

peiranoi Argentina Catamarca, Salta, Tucumn


En Argentina (Heller, 1996), se han registrado 11 especies pertenecientes

al gnero Jatropha: J. breviloba, J. chacoana, J. curcas, J. excisa, J.

grossidentata, J. isabelli, J. hieronymi, J. macrocarpa, J. matacensis, J.

pedersenii y J. peiranoi (Tabla 1).

Cinco de estas especies son endmicas, J. excisa, J. hieronymi, J.

macrocarpa, J. pedersenii y J. peiranoi (Zuloaga et al., 1999) (Fig. 1).

Fig. 1 Distribucin geogrfica de las especies de Jatropha de la Argentina (Clrici et al., 2013).

Usos de Jatropha

Esta planta ha sido histricamente empleada por indgenas en

aplicaciones medicinales. Fue producida comercialmente en la isla de Cabo

Verde y exportada a Portugal y Francia, en donde el aceite se us como

combustible para motores, lmparas y cocinas y como materia prima para la

produccin de jabones. En India, debido a la toxicidad de las hojas, la emplean

para alejar plagas, mientras que en frica, pases como Madagascar y Uganda
la emplean para proveer soporte fsico a las plantas de vainilla (Srivastava et al.,

2011; Brittaine et al., 2010).

El extracto de las hojas de Jatropha posee taninos (37%) que tie las telas

de un color negro indeleble que puede ser aprovechado para la industria textil,

tambin el ltex de esta planta contiene un 10% de taninos el cual puede ser

usado como tinta y tiene propiedades antimicrobianas contra Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pyogenes y

Candida albicans, posee efectos coagulantes y se aplica directamente en

heridas, cortes, sarpullidos, quemaduras como antisptico (Heller, 1996).

El uso de Jatropha como combustible sustituto se inici durante la

Segunda Guerra Mundial en Madagascar, Benn y Cabo Verde, y, su glicerina

era valiosa en la produccin de nitroglicerina (Brittaine et al., 2010). Durante los

ltimos aos, su cultivo ha sido considerado como una alternativa adecuada en

la produccin de biocombustibles debido a caractersticas de cultivo tales como

resistencia a la sequa, rpido crecimiento, fcil propagacin en reas no

competentes para cultivo con fines alimentarios y alto contenido de aceite

(Causarano, 2011; Akbar et al., 2009; Baroi et al., 2009; Kamarudin et al., 2009).

Adicionalmente, los residuos generados en la produccin de biodiesel pueden

emplearse como fertilizantes o en la produccin de biogs, considerando su uso

como un ciclo limpio (Abhilash et al., 2011).

La adaptacin de la semilla de Jatropha frente a distintas condiciones

ambientales aumenta su potencial como materia prima para su aplicacin

industrial (Achten et al., 2008).


La Figura 2 muestra un resumen de las mltiples aplicaciones de Jatropha

y sus productos.

Fig. 2 Usos de la planta y granos de Jatropha (Putten et al., 2010).


Importancia del gnero Jatropha como cultivo energtico

En el gnero Jatropha, los aceites se acumulan principalmente en semillas

y frutos, pero tambin se encuentran en cantidades importantes en rizomas y

otros rganos subterrneos. En las semillas se almacenan en compartimentos,

que van de 1 a 10 micrmetros de dimetro, conocidos como cuerpos de aceites,

oleosomas, rganos de lpidos o esferosomas (Moreau et al., 1980; Huang, 1994;

Cardinali et al., 2010). Se ha sugerido que los oleosomas surgen por la

acumulacin de aceite entre los fosfolpidos del retculo endoplasmtico rugoso

(Beaudoin et al., 1999) aunque tambin se ha reportado que se forman en el

citosol (Dutta et al., 1991).

En Argentina diferentes trabajos reportan el uso de especies del gnero

Jatropha (Casotti, 2008; Huerga, 2010; Falasca et al., 2008). Realizndose

estudios para la produccin de biocombustibles a partir de J. curcas, J.

macrocarpa, y J. hieronymi (Achten et al., 2008).

Las semillas de J. curcas se caracterizan por tener un contenido de aceite

(30-40% en peso) (Openshaw, 2000) con cidos grasos del tipo palmtico, oleico,

linoleico y esterico, siendo mayoritarios oleico 45,8% y linoleico 29%. El aceite

de Jatropha curcas, actualmente el ms utilizado para la produccin de biodiesel,

presenta un contenido de aceite, superior al de soja y palma (Arbak et al. 2009).

Las semillas de J. macrocarpa poseen un contenido del 36-40% de aceite,

siendo en este mayoritarios linoleico 55% y oleico 39%. Sin embargo la

produccin de semillas es baja por lo que necesita de mejoramiento en cuanto a

su cultivo para ser aprovechada (Wassner et al., 2012).


Las semillas de J. hieronymi poseen un 32% de aceite en sus semillas, en

el cual se encuentran en mayor proporcin el cido oleico en un 30% y el cido

linoleico en un 58% (Casotti, 2008)

El aceite de J. macrocarpa y J. hieronymi, tiene un buen rendimiento tanto

en cantidad y calidad, siendo el biodiesel obtenido a partir de estas dos especies

de similar calidad a los de soja, girasol y colza. La baja produccin de semillas

de estas especies, son todava motivo de investigacin para ser incorporadas

como cultivos oleaginosos (Falasca et al., 2008).

Debido al escaso conocimiento de especies nativas de Jatropha que

crecen en el NOA, en este trabajo se plantea el estudio de plantas nativas de

este gnero, en la zona de los Valles Calchaques, particularmente de la

localidad de Santa Mara, Catamarca, (Argentina). A partir de estos estudios se

busca contribuir al conocimiento de cultivos oleaginosos alternativos para la

produccin de biodiesel y aportar una nueva actividad para el sector agrario de

la regin.
Hiptesis

Especies nativas de Jatropha sp. recolectadas en zonas ridas del Valle

Calchaqu son potenciales especies oleaginosas para ser usadas como materia

prima en la produccin de biodiesel.

Objetivo General

Obtener y caracterizar aceite a partir de semillas de especies de Jatropha nativas

del Valle Calchaqu, para su aplicacin como materia prima en la obtencin de

biodiesel.

Objetivos especficos

1- Localizar especies de Jatropha sp. en zonas ridas de los Valles Calchaques.

Realizar la geolocalizacin, recoleccin e identificacin taxonmica de las

especies vegetales encontradas.

2- Caracterizar histolgicamente semillas de Jatropha sp. y realizar la

germinacin de las semillas de Jatropha sp.

3- Realizar la extraccin de aceite a partir de distintas tcnicas de extraccin y

caracterizar el aceite obtenido por tcnicas cualitativas y cuantitativas.

4- Evaluar la presencia de actividad enzimtica lipoltica en la biomasa residual

para dar valor agregado a las semillas de Jatropha sp.


Materiales
y
Mtodos
1. Recoleccin del material vegetal

La especie vegetal utilizada en este trabajo Jatropha sp. fue recolectada

en el Valle de Santa Mara, Catamarca (Argentina) a 1,5 Km del centro de esta

ciudad, a 1885 m s. n. m., coordenadas (66 2 33 W 26 41 16 S), en el mes

de marzo del ao 2015.

2. rea de estudio

El Valle de Santa Mara, coordenadas (66 2 00 W 26 41 00 S), se

encuentra en la provincia de Catamarca, delimitado geogrficamente por la falda

occidental del Aconquija, hacia el este, y la ladera oriental de la Sierra de Quilmes

o del Cajn por el oeste. Recorrido por el Ro Santa Mara que fluye de Sur a

Norte, con afluentes que provienen de la vertiente occidental de la Sierra del

Aconquija. En sus mrgenes se desarrollan cultivos de importancia para la

economa regional (Morlans, 1995), (Fig. 3 A). Corresponde a la Provincia

Fitogeogrfica de Monte (Fig. 3 B).

Este Distrito fitogeogrfico se ubica en el oeste y noroeste de la Argentina,

en la denominada diagonal rida; que abarca las provincias de Salta, Tucumn,

Catamarca, La Rioja, San Juan, y Mendoza (Cabrera, 1976). En el Valle de Santa

Mara, esta provincia fitogeogrfica se encuentra en el extremo sur en unidades

fisiogrficas entre los 500 y 2200 m s. n. m.


A B

Fig. 3 A- Regiones Naturales de Catamarca: Provincias Geolgicas y Provincias Fitogeogrficas


(Morlans, 1995) B- Mapa de Catamarca mostrando sus regiones fitogeogrficas. Tomado de
www.atlas.catamarca.gob.ar.

3. Identificacin taxonmica

Para la identificacin de esta especie, se recolect y herboriz la planta

entera de Jatropha sp., con partes vegetativas y reproductivas. Las hojas, tallos,

flores y frutos, fueron observados a la lupa para su caracterizacin.

El material vegetal fue determinado mediante claves taxonmicas segn

Lourteig & O'Donnell (1943), comparado con material de referencia del Herbario

LIL (Herbario Miguel Lillo) y bibliografa correspondiente consultada (Zuloaga et

al., 2008; Fernndez Casas, 2013; Fernndez Casas & Pizarro Domnguez,

2013). Muestras del ejemplar fueron ingresados al herbario de la

Fundacin Miguel Lillo (LIL), Tucumn, para su codificacin.

3.1 Clave de identificacin para las especies del gnero Jatropha


(tomada de Lourteig & O' Donell (1943), Euforbiaceae argentinae. Lilloa 9: 119)

A. Hojas con borde estipitado-glanduloso.

a. Pecolos 3-6 mm J. isabelli var. antisyphillitica.

aa. Pecolos ms de 1 cm (generalmente ms de 4 cm).

b. Pecolos con expansiones foliceas. J. peiranoi.

bb. Pecolos sin expansiones foliceas.

c. Hojas generalmente enteras o lobadas.

J. ribifolia var. breviloba.

cc. Hojas generalmente 5-3-partidas.

d. Hojas pubescentes, generalmente 3-partidas.

J. excisa var. pubescens.

dd. Hojas glabras generalmente 5-partidas.

e. Flores rojizas. J. excisa.

ee. Flores verdosas. J. excisa var. vidiflora.

B. Hojas sin borde estipitado-glanduloso.

a. Hojas con borde entero.

b. Hojas apenas lobadas o enteras. J. curcas.

bb. Hojas 5-7 partidas. J. macrocarpa.

aa. Hojas con borde serrado.

c. Borde groseramente serrado. Flores purpreas.

J. grossidentata.

cc. Borde no groseramente serrado. Flores amarillo-rojizas.

J. hieronymi.

4. Recoleccin de frutos y obtencin de semillas de Jatropha sp.


Los frutos de Jatropha sp. se obtuvieron por recoleccin manual, al estado

inmaduro, se colocaron sobre papel y se dejaron expuestos al ambiente hasta

su maduracin.

Luego se separaron las semillas y se almacenaron en oscuridad en

ambiente fresco y seco.

5. Anlisis de semillas de Jatropha sp.

Semillas de Jatropha sp. se seleccionaron para su estudio morfolgico e

histolgico.

5.1 Estudio morfolgico

Se tuvieron en cuenta parmetros morfolgicos como forma, tamao y

color de las semillas. Para definir la forma de las semillas, se sigui a Murley

(1951). Para determinar el tamao se midi largo, ancho y espesor (l a e) de

60 semillas, con papel milimetrado, siempre en este orden y expresado en

milmetros. El largo de las semillas fue medido desde el extremo hilar hasta el

calazal; el ancho fue medido en la porcin media y ms ancha de la semilla al

igual que el grosor (Bentacur-Prisco et al., 2014) (Fig. 4). El color del tegumento

fue tenido en cuenta para estimar semillas maduras y vigorosas de semillas

inmaduras y vacas. El anlisis se realiz al azar por seleccin y separacin

manual de 215 semillas, segn el color del pericarpio en marrn oscuras,

castaas, castaas grisceas y marrn claro a pardo grisceas marmoreadas,

poco marmoreadas a no marmoreadas.


Fig. 4 Sistema de referencia definido para medicin de dimensiones de semilla de Jatropha
sp.

5.2 Estudio histolgico

5.2.1 Pruebas histoqumicas

Se realizaron cortes a mano alzada de endosperma y embrin de las

semillas para detectar grasas, aceites y almidn. La identificacin de grasas y

lpidos se realiz usando una solucin alcohlica saturada de Sudn IV y almidn

con solucin acuosa de Lugol (Iodo e Ioduro de Potasio, IKI) (Ruzin, 1999;

DAmbrogio de Argeso, 1986). Se tomaron fotografas microscpicas con

cmara digital TSVIEW 5.0 MP conectada a un Microscopio Invertido Olympus

CKX41.

5.2.2 Anlisis histolgico

Para el anlisis y caracterizacin histolgica se emplearon semillas

previamente esterilizadas y sin carncula (eleosoma), unas sin cubierta y otras

con cubierta seminal. Fueron fijadas en FAA (Formaldehido-alcohol etlico-cido

actico-agua 5:3:1:1), deshidratadas e incluidas segn tcnica de inclusin en

parafina descripta por Dizeo de Strittmater (1979), (DAmbrogio de Argeso,

1986).

A partir de este material se realizaron preparados microscpicos,

modificando los tiempos de deshidratacin y de inclusin en parafina, al igual


que las concentraciones de colorantes y soluciones utilizadas para tejidos

adultos (Tabla 2).

Tabla 2. Planilla de procedimiento para inclusin del material vegetal en parafina.

Tejidos adultos

FAA* 48 h
Fijacin

Alcohol 96 3 das
Deshidratacin Alcohol 100 12 h
Alcohol 100 12 h
Alcohol 100-xilol (3:1) 2h
Alcohol 100-xilol (1:1) 2h
Alcohol 100-xilol (1:3) 2h
Clarificacin
Xilol puro 1h
Xilol puro 1h
Xilol puro 1 noche
Xilol-parafina (3:1) 2h
Xilol-parafina (1:1) 2h
Xilol-parafina (1:3) 1h
Infiltracin
Parafina pura 4h
Parafina pura 1 noche
Parafina pura 1h
*Formaldehido-alcohol etlico-cido actico-agua (5:3:1:1), (DAmbrogio de Argeso, 1986).

Se obtuvieron cortes longitudinales y transversales de 25 m de espesor,

con micrtomo de rotacin Minot, Bausch & Lomb. Las muestras previamente

desparafinadas fueron teidas aplicndose tinciones diferenciales, con Safranina

1 %-Sudn IV 80 %-Azul de metileno 1%; Safranina-Fast green saturado en

alcohol 100 % (Conn, 1953), Safranina-Sudn IV y Azul de metileno-Sudn IV,

las cuales fueron modificadas en este trabajo en tiempo de exposicin y

coloracin a fin de aumentar el contraste de los cuerpos de aceite. Los

preparados permanentes se montaron en Blsamo de Canad para su posterior

observacin al microscopio ptico. Se tomaron fotografas microscpicas de los

preparados con cmara digital TSVIEW 5.0 MP conectada a un Microscopio

Invertido Olympus CKX41.


5.2.3 Microscopa Electrnica de Transmisin y de Barrido

Se utilizaron para examinar las estructuras celulares, oleosomas y

cuerpos proteicos presentes en la semilla. Todas las observaciones fueron

realizadas en el Centro Integral de Microscopa Electrnica (CIME), CONICET-

UNT.

Microscopa de Transmisin (TEM): las muestras fueron fijadas en

tetrxido de Osmio al 1% durante toda la noche, deshidratadas en una serie de

alcoholes, de graduacin creciente, e incluidas en resina Spurr (Pelco I). Los

cortes ultrafinos fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo.

Se examinaron con microscopio electrnico de transmisin Zeiss EM109 (TEM)

operado a 50 kv.

Microscopa de Barrido (SEM): secciones transversales y longitudinales

de semillas fueron montadas con cinta doble faz en tacos especiales, para el

metalizado con oro. Las observaciones y fotografas digitales se realizaron a

travs de un microscopio electrnico de barrido Zeiss Supra 55VP (SEM).

5.3 Clculo de volumen de oleosomas y estimacin de rendimiento de

aceite

Se realiz el clculo del volumen de oleosomas, correlacionando con el

rendimiento de aceite contenido en las semillas, mediante observacin al

microscopio ptico de cortes transversales del endosperma de la semilla de J.

peiranoi, medidos con escala micromtrica. Para cada muestra se analizaron 10

campos pticos al azar y se calcul el volumen de oleosomas, teniendo en

cuenta nmero y dimetro de los oleosomas y nmero de clulas observadas

por rea del campo celular y tisular.


Para calcular el volumen de oleosomas, se tuvo en cuenta el dimetro

promedio de los oleosomas (3,53 m, para n= 15) y se utiliz el radio promedio

(1,76 m) de los mismos, aplicando la siguiente frmula:

V = 4/3 r3 considerando a los oleosomas como esferas perfectas

V = 4/3 (1.76 m)3 V= 22,83 m3 o 0,02283 mm3 o 2,283 10-1 L

El volumen celular (Vcelular) se calcul teniendo en cuenta el nmero de

oleosomas por clula, contndose 15 oleosomas por clula (valor promedio).

Vcelular= volumen del oleosoma nmero de oleosomas

Vcelular= 0,02283 mm3 15 Vcelular= 0,34245 mm3

Para realizar el clculo del volumen tisular (Vtisular), se tuvo en cuenta el

nmero promedio de clulas observadas en el campo visual microscpico

contndose 115 clulas (valor promedio).

Vtisular= volumen celular nmero de clulas observadas

Vtisular= 0,34245 mm3 115 Vtisular= 39,38 mm3

Para estimar % de aceite a extraer y % de rendimiento de la semilla, se

tuvo en cuenta el volumen y peso de las semillas que fueron pesadas en balanza

granataria.
Para el clculo de volumen de la semilla se consideraron las dimensiones

largo (l), ancho (a) y espesor (e) de las semillas.

Vsemilla= l mm a mm e mm

Vsemilla= 9,25 mm 4,2 mm 3,1 mm Vsemilla= 120,43 mm3

Clculo de Porcentaje de aceite extrado de la semilla

Con el Vsemilla= 120,43 mm3 se estim el % de aceite extrado aplicando

la siguiente relacin

120,43 mm3----------------100%

39,38 mm3----------------x= 33%

El peso promedio de la semilla= 0,1 g.

Este valor sirvi para calcular o estimar el porcentaje de aceite extrado.

0,1 g----------------100%

0,033 g-------------x= 33 % de aceite

Clculo de % de rendimiento de aceite o Estimacin de rendimiento de

aceite

Considerando que en las semillas de Jatropha el 40% de su peso

corresponde a aceite se calcul el rendimiento de aceite.

40---------------100%

33--------------x= 82,5%
5.4 Anlisis de Viabilidad

El anlisis de la viabilidad se realiz empleando el test de tetrazolio que

se basa en la actividad de enzimas deshidrogenasas (Moore, 1973).Es un

mtodo bioqumico que utiliza el 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio como reactivo

indicador. Las soluciones de estas sales son incoloras, cuando se reducen se

transforman en trifenilformazn, una sustancia estable, no difusible de color rojo

intenso, que permite distinguir las reas vivas de las semillas (reas de color rojo

o rosado) de las zonas muertas sin coloracin (Ellis et al., 1985a; Moore, 1973;

Frana-Neto, 1989)

Sal de tetrazolio + H+ deshidrogenasas Trifenilformazn


incoloro rojo
difunde no difunde

5.4.1 Aplicacin de Tcnica de Viabilidad en semillas de Jatropha sp.

Acondicionamiento

Las semillas fueron lavadas sucesivas veces con agua destilada a fin de

eliminar contaminantes. Se colocaron 20 semillas en una caja de Petri con papel

de filtro hmedo, cubiertas con papel de Aluminio y mantenidas en estas

condiciones por un perodo de 18 h, en estufa a 37 C a fin de activar el

metabolismo de las semillas (Frana-Neto, 1989; ISTA, 2016; Ellis et al., 1985b)

Coloracin

Las semillas sin tegumento (el tegumento oscuro de las semillas de

Jatropha, no permite la difusin de la solucin de tetrazolio, por lo que fue

retirado antes del proceso de tincin) fueron colocadas en vaso de precipitacin,

inmersas en la solucin de tetrazolio (0,075%), llevadas a estufa a una


temperatura de 37 C, durante 3 h y en oscuridad, debido a que la solucin de

tetrazolio es sensible a la luz (Lakon, 1949).

Lavado de la muestra

Una vez que se alcanz la coloracin, las semillas fueron retiradas de la

estufa y lavadas con agua comn, y se mantuvieron sumergidas en agua hasta

el momento de la evaluacin (Frana-Neto, 1989).

Evaluacin de la Viabilidad

Las semillas se analizaron una a una, seccionndolas longitudinalmente

a travs del centro del eje embrionario (Fig. 5), con ayuda de un bistur u hoja de

afeitar.

Durante la evaluacin se tuvo en cuenta dao del eje radcula-hipoctilo

(corteza y cilindro central) y color de las semillas. Si hay dao en el eje radcula-

hipoctilo la semilla es NO VIABLE. Si no hay dao en el eje, la semilla es

VIABLE.

La diferenciacin del color presente en los tejidos de las semillas indica:

rojo intenso, TEJIDO VIVO y vigoroso y blanco lechoso, TEJIDO MUERTO

(Prez-Garca et al., 2001).

Las observaciones se realizaron en Microscopio estereoscpico Olympus

y las fotografas fueron tomadas con cmara digital Canon A620, Power Shot 7,1

MP.
Fig. 5 Corte longitudinal de semilla, con detalle de eje radcula-hipocotilo. Tomado de (Fahn,
1985).

6. Germinacin de semillas

Para el ensayo de germinacin, se seleccionaron semillas de Jatropha sp,

vigorosas y de mayor tamao, desinfectadas con una solucin diluida de

hipoclorito de sodio en agua (1:5 v/v) y sin cubiertas seminales (se elimin el 40

% del tegumento) para favorecer la germinacin (Ellis et al., 1985b).

Las semillas se colocaron en cajas de Petri estriles de 10 cm de

dimetro, sobre un colchn de algodn hmedo (2mL de agua destilada) como

soporte y medio de imbibicin. Se ubicaron de su lado ventral donde se

encuentra el rafe, de manera que tome contacto el micrpilo de la semilla con el

medio hmedo para favorecer el ingreso de agua y la emisin de la radcula.

Para poner a punto la tcnica y asegurar la germinacin, se probaron

distintos tratamientos con variaciones en el tiempo de esterilizacin, activacin

de las semillas y exposicin a la luz. En cada tratamiento se pusieron a germinar

25 semillas, simulando condiciones de la germinacin bajo tierra.


Tratamiento 1

Las semillas fueron esterilizadas durante 1 h, se pusieron en cajas de Petri

sometidas a un fotoperiodo luz-oscuridad: 8 h de luz artificial y 16 h de oscuridad.

Regndose con 2 mL de agua destilada estril cada dos das durante el tiempo

en que se desarroll el experimento (14 das).

Fig. 6 Semillas de Jatropha sp. puestas a germinar segn tratamiento 1.

Tratamiento 2

Semillas sin esterilizar se colocaron en heladera a 4 C por un tiempo de

12 h y posteriormente en estufa a 25 C durante 3 h a fin de someterlas a cambios

de temperatura (T nocturnas y diurnas) condiciones simuladas como en su

ambiente natural. Posteriormente se esterilizaron durante 3 h, fueron sembradas

en cajas de Petri con un fotoperiodo luz-oscuridad: 3 h de luz artificial y 21 h de

oscuridad, regndose con 2 mL de agua destilada estril, cada dos das durante

el tiempo en que se desarroll el experimento (14 das).


Fig. 7 Semillas de Jatropha sp. puestas a germinar segn tratamiento 2.

Tratamiento 3

Semillas sin esterilizar se colocaron en heladera a 4 C por un tiempo de

12 h y posteriormente en estufa a 25 C durante 3 h. Repitiendo condiciones

(cambios de temperatura frio-calor) como en el tratamiento 2. Se esterilizaron

durante 5 h y se sembraron en cajas de Petri, regndose con 2 mL de agua

destilada estril, cada dos das. Mantenindolas en oscuridad durante todo el

tiempo que dur el experimento (25 das).

Fig. 8 Semillas de Jatropha sp. puestas a germinar segn tratamiento 3.


7. Extraccin de aceite de Jatropha sp.

La extraccin del aceite se realiz utilizando dos sistemas de solventes

orgnicos, n-hexano y una mezcla de cloroformo-metanol (1:2). En ambos casos

se utilizaron semillas descascaradas. Las almendras obtenidas se secaron

previamente en estufa a 105 C durante 1 h, las cuales fueron a continuacin

trituradas en mortero para su posterior tratamiento con solventes.

7.1 Extraccin con n-hexano

A 2 g de semilla triturada se agreg 8 mL de n-hexano, la muestra fue

agitada en vortex durante 2 min y luego centrifugada para recuperar el

sobrenadante con el aceite extrado. La biomasa se continu tratando con n-

hexano hasta no observar turbidez, de manera de recuperar el aceite residual. A

continuacin se centrifug a 8.000 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes

obtenidos se colocaron en campana para la evaporacin del n-hexano.

7.2 Extraccin con mezcla cloroformo-metanol

La extraccin con esta mezcla de solvente se realiz siguiendo la tcnica

de Bling y Dyer (1959). La semilla triturada (2 g) fue tratada con una mezcla de

cloroformo-metanol en una relacin 1:2 (v/v). La muestra fue homogenizada en

vortex durante 2 min. Luego se agregaron 2 mL de cloroformo y se mezcl

durante 30 seg. A continuacin se agregaron 2 mL de H 2O destilada, y se

continu mezclando por otros 30 seg.

El homogenizado obtenido se filtr con papel de filtro Whatman n 1.

Luego el filtrado se transfiri a un vaso de precipitacin de 50 mL. Se dej en

reposo para permitir la separacin de las fases y clarificacin.


Una vez obtenidas las fases, se retir la capa alcohlica, quedando la

capa de cloroformo que contiene el aceite, se dej en campana para evaporacin

del solvente.

Para extraer el aceite residual que qued retenido en los restos de

muestra, se realizaron 4 lavados con cloroformo. El filtrado obtenido de los

lavados, se agreg al primer filtrado.

Se calcul el contenido de aceite en las semillas para ambas tcnicas,

segn la siguiente frmula: % Aceite = (Peso aceite/ Peso inicial semilla)

100.

8. Determinacin de la composicin qumica del aceite de Jatropha sp.

8.1 Evaluacin del perfil lipdico por cromatografa en capa fina (TLC)

Para evaluar el perfil lipdico del aceite de Jatropha sp se realiz

inicialmente una TLC. Se utiliz como fase estacionaria una placa de slica de 10

cm de largo por 6 cm de ancho y como fase mvil una mezcla de n-hexano:

acetato de etilo: cido actico (90:10:1). Se sembr una muestra de aceite de

Jatropha sp. directamente en la placa y otra con previa extraccin con n-hexano.

Se utilizaron como controles para comparar el perfil lipdico, aceite de oliva,

aceite de soja y como cido graso libre, cido linoleico. Las muestras se

sembraron a 1 cm de distancia entre cada una de las muestras. Luego de la

corrida, la placa se sec y se revel en una cmara con granallas de Iodo.


8.2 Evaluacin del perfil lipdico por cromatografa gaseosa con detector a

la llama (GC-FID)

Metilacin de los cidos grasos

La muestra de aceite (1mg) fue disuelta en 1 mL de mezcla metilante (HCl

en MeOH) y calentada en bao seco a 100 C durante 2 h con agitacin

espordica. Luego de enfriar, se agreg 1 mL de agua y se extrajo con n-hexano

(31 mL). Se sec el extracto hexnico con sulfato de sodio anhidro y se filtr.

Se llev a sequedad con corriente de N2 y se resuspendi en 1 mL de n-hexano

(steres metlicos de cidos grasos).

Condiciones cromatogrficas GC-FID y anlisis cuantitativo de los steres

metlicos de los cidos grasos (FAME)

Los anlisis fueron realizados en un equipo GC-2014 Shimadzu equipado

con inyector split/splitness y detector de ionizacin de llama (FID). Se utiliz una

columna capilar SE 52 (30 m 0.25 mm 0.25 m) y el programa de temperatura

fue: 150C durante 2 min., (150-260) C a 5C/min., 260C durante 20 min. La

temperatura del inyector y del detector fue 300C. El volumen de inyeccin fue 1

L y fue operado en modo split (100:1), el gas carrier fue He, el flujo total 31

mL/min y el flujo de la columna fue 0.55 mL/min.

Los FAME fueron identificados por comparacin directa con estndares

puros y los porcentajes individuales de los mismos fueron hechos en relacin al

rea total del cromatograma.

Para calcular la composicin de los cidos grasos (%) se tomaron los

picos y se realizaron correccin de las reas. Para ello se multiplic el rea por
un factor dado para cada cido graso en particular. El rea total por muestra

indica la cantidad total de cidos grasos producidos.

9. Anlisis termo gravimtrico (TGA)

El anlisis termo gravimtrico se realiz empleando un analizador

Shimadzu TGA-50, con una atmsfera de Nitrgeno con velocidades de flujo de

20 mL/min. El anlisis se realiz a una velocidad constante de calentamiento de

30 C/min, desde temperatura ambiente hasta 800 C (en crisol de platino). Se

utiliz una muestra de 8,267 mg correspondiente a un volumen de 10 L.

10. Determinacin de actividad enzimtica lipoltica en la biomasa residual

Para evaluar la actividad enzimtica se emple la biomasa residual

obtenida luego de la extraccin del aceite. La biomasa se dej bajo campana

para evaporar el n-hexano y luego se coloc en estufa a 30 C, para realizar el

secado de la misma hasta peso constante. A continuacin la biomasa se

fraccion en 4 tubos conteniendo cada uno 0,05 g de biomasa.

La determinacin de actividad enzimtica se realiz a 37 C con agitacin

frente a dos sustratos p-nitrofenil acetato (C2) (p-NPA) y p-nitrofenil laurato (C12)

(p-NPL) en una concentracin 1 mM.

El buffer de reaccin utilizado present la siguiente composicin: pH 7,

Buffer fosfato 100 mM, Goma Arbiga 0,1 % (p/v) y Tritn X-100 0,4% (p/v)

(Winkler y Stuckman, 1979). En cada ensayo se realiz un control de reaccin

sin enzima para cuantificar la hidrlisis del sustrato por causas ajenas a la accin

enzimtica. Este control solo contiene buffer de reaccin y sustrato (p-NPA o p-

NPL).
La cuantificacin de p-nitrofenol liberado se realiz en espectrofotmetro

a 405 nm (Coeficiente de extincin molar (): 0,15 mM). La reaccin se realiz

por duplicado para ambos sustratos.

Se defini como Unidad de Actividad Enzimtica a la cantidad de enzima

que libera un mol de p-nitrofenol por minuto.


Resultados
y
Discusin
1. Caracterizacin del rea de estudio

El rea donde se realiz la recoleccin de la especie en estudio (Fig. 9),

corresponde a la Provincia Fitogeogrfica de Monte. Se caracteriza por presentar

vegetacin de tipo arbustiva, xerfila, dominada por Zigofilceas, siendo la

comunidad ms importante el jarillal. En su composicin florstica dominan las

especies del gnero Larrea, principalmente Larrea cuneifolia (jarilla macho) y

Larrea divaricata, (jarilla hembra), Bulnesia retama (retama o retamo), Fabceas:

Zuccagnia punctata (pus-pus o poposa), Cassia rgida (pichana), Geoffroea

decorticans (chaar), Cercidium praecox (brea), tambin algarrobales, que

aparecen exclusivamente como bosques marginales de los ros: Prosopis

chilensis, Prosopis nigra, Prosopis alba, entre otras y como acompaantes

cactceas y plantas halfitas del gnero Atriplex sp. y otras especies como Celtis

spinosa (talas) (Morello, 1958).

El suelo, se caracteriza por ser rido y semirido, pobre en materia

orgnica, arenoso o areno-arcilloso y alcalino, de baja retencin hdrica y de

estructura dbil (Palmieri et al., 2014).

Fig. 9 Fuente: Google Maps. Punto de referencia de recoleccin de muestra vegetal


en el Valle de Santa Mara, Catamarca (Argentina) a 1,5 Km del centro de esta
ciudad, a 1885 m s. n. m., coordenadas (66 2 33 W 26 41 16 S).
2. Identificacin taxonmica

Para determinar la identidad de la especie vegetal, se tuvo en cuenta

caracteres diagnsticos obtenidos a partir de hojas, tallos, flores y frutos,

confrontados (cfr) con ejemplares de la provincia de Catamarca y Tucumn de

la coleccin del Herbario LIL (Tucumn, Argentina).

La especie, recolectada corresponde a Jatropha peinaroi Lourteig &

O'Donell, nombre cientfico actualmente aceptado para la Flora del Cono Sur

segn Zuloaga et al. (2008). Muestras del ejemplar fueron ingresados al herbario

de la Fundacin Miguel Lillo (LIL), para su codificacin. Pertenece a la Familia

Euphorbiaceae (Tabla 3), es una planta arbustiva, endmica que habita las

provincias de Catamarca, Salta, Tucumn y crece entre 1700 a 1900 m de altura

(Lourteig & O'Donell, 1943).

Tabla 3. Jerarqua taxonmica de Jatropha peiranoi Lourteig & O'Donell

Jerarqua Taxonmica

Reino Plantae Planta

Subreino Tracheobionta Planta vascular

Divisin Magnoliophyta Angiosperma

Clase Magnoliopsida Dicotilednea

Subclase Rosidae

Orden Euphorbiales

Familia Euphorbiaceae

Subfamilia Crotonoideae

Gnero Jatropha

Especie Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell


3. Descripcin Botnica de la Especie. Caractersticas exomorfolgicas

Planta arbustiva, de aspecto herbceo, semirastrera, crece formando

matas, en parches hasta 50 cm de altura (Fig. 10 A, B), con ltex transparente o

lechoso. Tallo carnoso, de 4 a 7 mm de dimetro, de color verde claro a morado

y ramificado desde la base. Tallo subterrneo, rizoma grueso que vara desde

30 a 50 mm de dimetro (Fig. 10 C).

A B

Fig. 10 Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell. A- Aspecto vegetativo de la planta en su


hbitat natural. B- Planta en floracin. C- Detalle de Rizoma, tallo subterrneo.

Pecolos de 1 a 7 mm, glabros, surcados, canaliculados, cuyos bordes

presentan expansiones foliares de forma variada, generalmente lanceolados,

con glndulas estipitadas notables (Fig. 11 A, B). Lmina foliar coricea 3 a 5

partidas, de base cordada con pelos hirsutos en la base y sobre las nervaduras,

con nervaduras secundarias notables; lbulos obovados, contrados en la base,


obtusos, mucronados (Fig. 11 C). Borde foliar de color verde amarillento,

suavemente crenado, con glndulas estipitadas notables (Fig. 11 D, E). Estpulas

foliceas, laciniadas, cuyos bordes presentan al igual que los mrgenes foliares,

glndulas estipitadas.

A B

C
F

D E
G H

Fig. 11 Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell A, B- Detalle de pecolos con expansiones
foliares y estructuras glandulares. C- Detalles de lmina foliar mucronada, D, E- Lmina foliar
con bordes crenados, glandulosos (glndulas estipitadas).
Inflorescencias cimosas, cortamente pedunculadas, densifloras, con

pednculos vellosos y brcteas lanceoladas, pubescentes, de borde glanduloso

estipitado.

Posee flores unisexuales (Fig. 12, 13). Flor Masculina: Spalos 5, ovado-

lanceolados, acuminados, vellosos, soldados 1/3, borde glanduloso-ciliado.

Ptalos obovados espatulados de color blanquecino, amarillentos, a rosado claro

y oscuro internamente, pubescentes. Disco: 5 glndulas libres. Estambres 10,

monadelfos dispuestos en 2 ciclos.

Flor Femenina: Spalos 5 obovado-lanceolados, acuminados,

glanduloso-ciliado. Ptalos de color blanquecino, amarillentos, rosado a fucsias

internamente y glandulosos-estipulados. Disco: 5 glndulas libres. Ovario glabro

o pubescente. Estilos 3; soldados en la base y estigmas bilobados.

Fig. 12 Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell. A- Inflorescencias cimosas con flores masculinas
y femeninas fructificadas. Flores, blanquecinas y amarillentas. B- Detalle de flores pubescentes.
C- Detalle de frutos pubescentes.
D

Fig.13 Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell. D, E, F-Inflorescencias cimosas con flores
masculinas y femeninas fructificadas. Ntese la variacin de colores de las flores,
rosado claro a fucsia.

Frutos cpsula, trigamocarpelar, trilocular, una semilla por cada lculo,

verdes al estado inmaduro y amarronados a la madurez (Fig. 14). Dehiscencia

explosiva o balstica. Semillas color marrn claro a oscuro rojizo, marmoreadas

y en algunos casos marrn grisceas. Con carncula desarrollada, 9 partida, de

color amarillento a marrn rojizo, de borde blanquecino.


Fig. 14 (2) Frutos cpsula verdes al estado inmaduro y semillas donde se observa la variabilidad
de colores.

Fenologa: Florece en los meses de Octubre a Diciembre, fructifica en

Noviembre y madura en el perodo comprendido entre Enero y Abril,

encontrndose con flores y frutos hasta el mes de abril inclusive. El perodo

vegetativo transcurre desde Agosto a fines de Mayo, en que la planta

desaparece, coincidiendo con la poca fra.

Hbitat: se encuentra en lugares degradados, en campos arenosos, a lo

largo de caminos entre vegetacin arbustiva xerfila.

3.1 Exsiccata

- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. LIL N 6535, Catamarca, Santa Mara, altura

1950 m s.n.m. Leg. Peirano, 12- XI-1933.

- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. LIL N 5186, Catamarca, Dep. Santa Mara,

Valle de Santa Mara (Punta de Balasto) Leg. Castillon, XI- 1915.

- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. Sin LIL., Catamarca, Dep. Santa Mara Leg.

Bragadin (529) I-1943.


- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. Sin LIL, Catamarca, Dep. Santa Mara en

arenales del Valle de Santa Mara, altura 2000 m s. n. m. Leg. Schreiter (552)

XII-1917

- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. LIL N5181, Amaicha del Valle, Tucumn.

19/05/ 1912; LIL N 5188, Valles Calchaques, Amaicha del Valle, Tucumn.

- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. LIL N5177, Dep. Taf, Arenal de Tiopunco,

Tucumn, altura 2000 m s. n. m., Leg. Schreiter (1674), 18/2/1920

- Jatropha peiranoi Lourt. et O' Don. LIL N 4943, Villa Nougues, Tucumn, lado

W, 1200 m s. n. m, Leg. Venturi (1614), 27/12/1921.

La descripcin realizada en este trabajo para la diagnosis e identificacin

de J. peiranoi Lourteig & O'Donell coincide en su gran mayora con los caracteres

descriptos para la especie en la revisin del gnero Jatropha realizada por

Lourteig & O'Donell (1943), y en la revisin de la especie por Fernndez Casas

(2013). El carcter que define y diferencia a J. peiranoi de otras del mismo

gnero, es la presencia de pecolos canaliculados con expansiones foliares

lanceoladas, que portan glndulas estipitadas notables, en los bordes del canal;

diagnosis coincidente con los autores citados anteriormente. Esta caracterstica

permiti a Lourteig & O'Donell, reconocer la especie J. peiranoi de J. excisa, J.

hieronymi, J. ribifolia, J. macrocarpa, J. curcas, J. isabelli y J. grossidentata

quienes carecen de expansiones foliares (Lourteig & O'Donell, 1943) y a

Fernndez Casas, delimitar y diferenciar J. peiranoi de J. chacoana.

Observaciones obtenidas en este trabajo y las realizadas por Lourteig &

O'Donell y Fernndez Casas para el caso de J. peiranoi, difieren con Fortunato

(1988) quien elabor una clave para delimitar la especie J. chacoana, de J


peiranoi. Fortunato (1988) atribuye como carcter comn, la presencia o

ausencia de apndices foliceos para ambas especies sin precisar cul de las

dos especies carece o presenta el mismo. Fernndez Casas, describe y delimita

J. peiranoi por la presencia exclusiva de pednculos canaliculados con

expansiones foliceas, generalmente lanceoladas, con sus mrgenes

pectinados por glndulas estipitadas (Fernndez Casas, 2013) y a J. chacoana

por la presencia de pednculos relativamente finos, canaliculados por la faz,

desprovistos de expansiones foliceas que portan en los bordes del canal,

glndulas estipitadas ramificadas (Fernndez Casas & Pizarro Domnguez,

2013).

En su descripcin Lourteig & O'Donell (1943) informan la presencia de

flores blancas y amarillas para la especie en estudio, descripcin no coincidente

con lo observado tanto en este trabajo como por Fernndez Casas (2013) donde

se observan flores de colores que varan desde blanquecinas, amarillas y

rosadas a fucsias. Esta variacin se debe al desarrollo y a la madurez floral en

que se encuentra la planta, debido a que presenta floracin escalonada. Por lo

tanto la descripcin realizada por Lourteig & O'Donell se debe a que recolectaron

el espcimen en las primeras etapas de floracin.

En cuanto al aspecto fenolgico, J. peiranoi, florece y fructifica en los

meses clidos y templados del ao desde octubre a abril. Perodo coincidente

para casi todas las especies de Jatropha (Casotti, 2008).


4. Caracterizacin del fruto de J. peiranoi

El fruto de Jatropha peiranoi es una cpsula ovoide, pubescente, de tipo

esquizocarpo, formado por tres carpelos, cada uno conteniendo una semilla,

verde al estado inmaduro y amarronado a la madurez (Fig. 15). La dehiscencia

de esta planta es explosiva o balstica, es un tipo de autocoria en el que las

semillas son dispersadas a travs de la dehiscencia sbita del fruto (Aranda-

Rickert, 2011). Razn por la cual los frutos se obtuvieron por recoleccin manual,

al estado inmaduro. Caracterstica comn con otras especies del gnero y de la

familia, como J. curcas, J. macrocarpa (Casotti, 2008), J. excisa, (Aranda-

Rickert, 2011) y Ricinus communis (Perea Flores, 2011).

A B

C D

Fig. 15 Frutos de J. peiranoi. (4) A- Fruto inmaduro, cerrado con restos de flores
B- Fruto inmaduro, cerrado. C, D- Frutos maduros prximos a la apertura o
dehiscencia.
5. Caracterizacin morfolgica de la semilla de J. peiranoi Lourteig &

ODonell

Las semillas presentan una forma oval o elipsoide, de consistencia dura,

comprimida de su lado ventral y plano convexa dorsalmente. La superficie

seminal se presenta levemente lisa con un brillo satinado suave y de un color

marrn claro a oscuro rojizo, marmoreadas y en algunos casos marrn grisceas

(Fig. 16 A, B; C, D).

En su cara ventral se observa el rafe y el hilio ubicado prximo al micrpilo

debido a que se origina de un vulo antropo.

A B
Ca
h

rf

C D
Ca
h

rf

Fig. 16 (20) Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell. Aspecto morfolgico de las semillas
vistas a la lupa A, C- Semilla vista de lado dorsal se observa carncula u eleosoma con bordes
blanquecinos (Ca). B, D- Semilla vista de lado ventral, se observa el rafe (rf) e hilio (h). (A:
Semillas marrn oscuro rojizo, C: Semillas marrn grisceas). La misma presenta una forma
oval o elipsoide
Cercano al micrpilo, se encuentra una excrecencia superficial en forma

de abanico, originada del funculo a modo de tercer tegumento denominada arilo,

carncula u eleosoma, dividida en nueve ramas de borde blanquecino,

orientadas hacia el lado dorsal (Fig. 16 A, C y 17 A, B). Esta carncula es rica en

aceites y constituye un rgano de atraccin, adaptado para la dispersin de la

semilla (Corner, 1949) por medio de hormigas, y otros mecanismos de dispersin

por vertebrados y el viento (Aranda-Rickert, 2011).

En la Fig. 17 se observa en detalle el aspecto morfolgico de las semillas

vistas por microscopa electrnica de barrido (SEM).

A B
Ca Ca

Fig. 17 A, B- Microfotografas obtenidas por microscopa electrnica de barrido (SEM) detalles


de las ramas de la carncula u eleosoma (Ca).

5.1 Forma, tamao y color de las semillas

Las semillas presentan tres semiejes desiguales, cuya forma se describi

como oval o elipsoide. El tamao se determin a travs de la medicin de sus

dimensiones caractersticas: largo (l), ancho (a) y espesor (e). Los valores fueron

referidos a valores promedio de 60 semillas. La dimensin longitudinal (l) vari

entre 7 y 9 mm, el espesor (e) entre 2 y 3 mm, mantenindose constante el ancho

(a) en 4 mm. Determinndose tres tipos de semillas, grandes, medianas y

pequeas.
En la Figura 18 y Tabla 4, se muestra la clasificacin de acuerdo al tamao

de las mismas.

Fig. 18 (2) Medicin y determinacin del tamao de las semillas de J. peiranoi.

Tabla 4. Dimensiones de las semillas de J. peiranoi.


Dimensiones
promedios de
Grandes Medianas Chicas
las semillas
(mm)

Longitud 9,25 8,06 7,06

Ancho 4,2 4,1 4,1

Espesor 3,1 2,6 2,4

El color del tegumento de las semillas muestra una gran variabilidad dada

por la poca de recoleccin y el tiempo y grado de maduracin de los frutos.

Debido a que la fructificacin es escalonada, fructifica a partir de noviembre,

encontrndose con flores y frutos hasta el mes de abril inclusive. En un lote de

215 semillas examinadas encontramos semillas marrn oscuras marmoreadas,

castaas (Fig. 19 A, B), castaas grisceas, poco marmoreadas y semillas

marrn claro a pardo grisceas poco marmoreadas a no marmoreadas (Fig. 19

C, D). Esto permiti diferenciar semillas maduras de inmaduras y estimar

semillas vigorosas de semillas vacas. El 66%, representa en su mayora,


semillas maduras de color marrn oscuro marmoreadas, generalmente

vigorosas y llenas, provenientes de aquellos frutos que han alcanzado su

desarrollo y madurez y un 33% semillas inmaduras, de llenado incompleto a

vacas, de color marrn claro a pardo grisceas, levemente marmoreadas a no

marmoreadas, provenientes de frutos verdes que no alcanzaron completo

desarrollo ni madurez.

A B

C D

Fig. 19 (2) Variacin de color de las semillas de J. peiranoi. A- Marrn oscuro (n= 70), B-
Castao (n= 47). C- Castao grisceo (n= 27). D- Marrn claro a pardo grisceo (n= 71).
La forma y el tamao de la semilla la diferencian de otras especies del

gnero. La semilla de J. peiranoi tiene forma elipsoide u oval de 7-9 5 mm y

una testa dura al igual que J. excisa y J. curcas ambas oblongo elipsoides, de

aproximadamente 7,73 4,74 mm y 20 10 mm, respectivamente (Aranda-

Rickert, 2011; Toral et al., 2008). A diferencia de J. chacoana, cuyas semillas son

angostamente elipsoides y miden 6-9 2,0-2,5 mm, (Fernndez Casas & Pizarro

Domnguez, 2013), de J. macrocarpa y J. hieronymi que presentan semillas

subesfricas que miden 15 mm de longitud (Casotti, 2008).

El color de la semilla de J. peiranoi vara de marrn claro a oscuro rojizo,

marmoreada y en algunos casos marrn griscea, carcter que permite

diferenciarla de otras especies, J. macrocarpa y J. hieronymi de coloracin

castao (Casotti, 2008), J. excisa castao rojiza a pardo oscura (Aranda-Rickert,

2011), J. curcas, negra (Lpez-Monte, 2008) y J. chacoana color marrn o rojiza

con hombros oscuros bien definidos, moteada o lisa (Fernndez Casas & Pizarro

Domnguez, 2013; Fortunato, 1988).

Se observ que el color y desarrollo del fruto y de la semilla de J. peiranoi,

est relacionado con la madurez fisiolgica; siendo indicador de madurez frutos

amarronados y semillas marrn oscuro marmoreadas. Esta caracterstica es

reportada por Zavala-Hernndez et al., (2015) quien determin la madurez

fisiolgica de la semilla y fruto para J. curcas, frutos amarillos y semillas negras.

6. Aspectos anatmicos: Caracterizacin histolgica de la semilla

La semilla de J. peiranoi ha sido estudiada por diversas tcnicas de

microscopa (fotnica y electrnica) en orden de caracterizar su microestructura.


6.1 Estructura y composicin de las semillas por microscopa

estereoscpica y de barrido (SEM)

Los cortes histolgicos de semillas de J. peiranoi, muestran la

organizacin general de la misma. La semilla consta de una cubierta seminal o

testa, el endosperma y el embrin, el cual est compuesto principalmente por la

radcula, gmula (eje embrionario) y cotiledones. En cortes longitudinales se

observ la cubierta seminal, endosperma y dos cotiledones, insertos al eje

embrionario corto y recto, con su porcin radical orientada hacia el extremo

micropilar de la semilla y su porcin apical o gmula orientada hacia el extremo

opuesto. En corte transversal, en la porcin ms ancha, se observa la misma

estructura y composicin seminal, con abundante endosperma y dos cotiledones

(Fig. 20, 21).

A B C
e
e
co

t
t co
co

e
r
r

Fig. 20 (20) Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell. Microscopa estereoscpica A- Seccin
longitudinal lateral de la semilla se observa testa o tegumento (t), endosperma (e) y cotiledones
(c). Seccin longitudinal media B- testa (t), endosperma (e), cotiledones (co) y radcula (r). C-
Sin testa, (e), (c) y (r).
A B

e
co

e co

t t

C D
t

r
e

co
r

Fig. 21 Jatropha peiranoi Lourteig & ODonell. Microscopa electrnica de barrido (SEM). A-
Corte transversal, (t), (e) y (c). Corte longitudinal medio. B- (t), (e) y (co). C- (t), (e), (c) y (r).
D- Detalle de la radcula (r).

6.2 Pruebas histoqumicas

Las pruebas histoqumicas revelaron la presencia de grasas y aceites en

endosperma y embrin de semillas de J. peiranoi, que se tieron de color amarillo

naranja, con solucin alcohlica saturada de Sudn IV (Fig. 22); no se detect la

presencia de almidn con solucin acuosa de Lugol (Iodo e Ioduro de Potasio,

IKI). (Ruzin, 1999; DAmbrogio de Argeso, 1986).

CL

40 100

Fig. 22 Semillas de J. peiranoi, deteccin de cuerpos lipdicos (CL) teidos con Sudn
IV.
6.3 Estructura Interna del tegumento por microscopa ptica y de barrido

(SEM)

Cortes longitudinales de semillas de J. peiranoi, muestran una notable

cubierta seminal o tegumento que envuelve al endosperma y embrin de la

misma (Fig. 23 A). En ella se evidencia un tegumento externo o testa formado

por una cutcula levemente rugosa y macroesclereidas columnares,

pigmentadas, dispuestas radialmente, que confieren color castao a marrn

oscuro, a la semilla. Por debajo se visualiza el tegumento interno o tegmen que

muestra un exotegmen o mesfilo formado por clulas parenquimticas

colapsadas y un endotegmen formado por clulas que se alargan y esclerosan

radialmente y clulas esclerenquimticas columnares, en disposicin tangencial,

tapizado por restos de nucela de aspecto esponjoso, que envuelve al

endosperma rico en cuerpos de aceite u oleosomas y cuerpos proteicos (Fig. 24

A, B, C). Este endosperma ocupa un volumen importante en la semilla, contiene

y nutre al embrin.

Fig. 23 A- Detalle del tegumento externo o testa con una cutcula levemente rugosa.
Fig. 24 Microfotografas obtenidas por microscopa ptica A, B- Corte transversal de semilla
mostrando estructura interna: tegumento externo (a), tegumento interno formado por exotegmen
o mesfilo (b) y endotegmen (c), restos de nucela (d) y endosperma con oleosomas y cuerpos
proteicos (e) C- Microfotografa obtenida por microscopa electrnica de barrido (SEM) En corte
longitudinal se observa: tegumento externo con cutcula y macroesclereidas columnares (a),
tegumento interno formado por exotegmen o mesfilo con parnquima colapsado (b),
endotegmen con clulas esclerenquimticas (macroesclereidas y fibras esclerenquimticas) (c);
restos de nucela (d).

No hay registros de anlisis de anatomas del tegumento de semillas del

gnero Jatropha. En este trabajo se presenta por primera vez la descripcin

histolgica en cortes transversales y longitudinales de semilla de J. peiranoi.

La disposicin de los tejidos que conforman el tegumento de la semilla de

esta especie, (tegumento externo y tegumento interno) es similar al descripto por


Esau (1982) para Ricinus communis (Perea-Flores, 2011), especie perteneciente

a la misma familia.

6.4 Estructura Interna del Endosperma y embrin. Microscopa ptica, de

barrido (SEM) y de transmisin (TEM)

El endosperma ocupa un volumen importante en la semilla de J. peiranoi,

es rico en oleosomas o cuerpos de aceite. Su estudio histoqumico en cortes

longitudinales y transversales, teidos con tinciones diferenciales, triple

coloracin Sudn IV-Safranina-Azul de Metileno, y la doble coloracin Sudn IV

Safranina y Azul de Metileno-Sudn IV, dieron buenos resultados que

permitieron la localizacin y diferenciacin de los cuerpos de aceite, cuerpos

proteicos y determinacin del nmero de oleosomas en las clulas

endosprmicas (Fig. 25).

Los oleosomas son esferoidales miden entre 2,5 y 4,5. m de dimetro,

se encuentran en un nmero de 15 oleosomas por clula, con arreglo espacial

agrupado ocupando un volumen celular importante. Estos valores son

semejantes a lo descripto por Adriano-Anaya et al. (2014) para J. curcas, quienes

informan oleosomas de 2,18 m a 4,15 m de dimetro, nmero de oleosomas

que vara entre 13 a 15 por clula y con arreglo espacial agrupado y disperso en

85 genotipos de poblaciones de J. curcas estudiadas.

En cortes realizados para microscopa de barrido y de transmisin se

observan clulas endosprmicas (parnquima reservante) en distintos grados de

magnificacin en cuyo interior se visualizan estructuras oleosmicas y proteicas

ocupando todo el volumen celular (Fig. 26, 27). El embrin posee las mismas
caractersticas celulares que las clulas endosprmicas en cuanto a su contenido

rico en oleosomas.

La Figura 25 muestra las imgenes obtenidas mediante microscopa

ptica con tincin diferencial histoqumica en preparados permanentes

CP
Dr
CL
CL

CP

20 100

B
Dr
CL
CP

CP
CL

40 100

CP
CP
CL

CL

20 100

Fig. 25 Corte transversal de endosperma de la semilla. A- Tincin Sudn IV-Safranina-Azul de


Metileno. B- Sudn IV-Safranina. C- Sudan IV-Azul de metileno. Se observan oleosomas (CL),
cuerpos proteicos (CP) y drusas (Dr) (cristales de oxalato de Ca).
CP
CL

CL

CP

Fig. 26 Microfotografas obtenidas por microscopa electrnica de barrido (SEM). Endosperma


de la semilla en diferentes grados de magnificacin, observndose cuerpos lipdicos (CL) y
cuerpos proteicos (CP).

CL

Pc

Lm
CL

7500 12800

Fig. 27 Microfotografas obtenidas por microscopa electrnica de transmisin (TEM) a partir de


cortes ultrafinos de endosperma, observndose cuerpos lipdicos (CL), laminilla media (Lm) y
pared celular (Pc)
6.5 Clculo de volumen de oleosomas y estimacin de rendimiento de

aceite

El anlisis de las variables nmero de oleosomas, volumen de oleosomas,

volumen celular y tisular de las clulas endosprmicas de semillas de J. peiranoi

por observacin y medicin microscpica, permitieron estimar la relacin

oleosomas/tejido (v/v) (Tabla 5). Encontrndose correlacin entre la relacin

porcentual oleosomas/tejido (v/v) y el rendimiento de la semilla. La relacin

porcentual volumen de oleosomas por volumen de tejido estara correlacionada

con la cantidad de aceite acumulada en la semilla. Las semillas vigorosas,

pesaron 0,1 g. Este valor sirvi para estimar el porcentaje de aceite extrado, que

arroj un valor de 33% de aceite y de un 82,5% de rendimiento.

Tabla 5. Variables calculadas para oleosomas de J. peiranoi por observacin y medicin


microscpica de clulas endosprmicas. Estimacin de % de extraccin y rendimiento de
aceite.
Tamao de oleosomas 2-4 m
3
Volumen de oleosomas 0, 02283 mm
por L de tejido
N de oleosomas por
15
clulas
N de clulas por L de
1 115
tejido
3
Volumen celular 0,34245 mm
3
Volumen tisular 39,38 mm
3
Volumen de la semilla 120,43 mm
3
mm
Peso de la semilla en g 0,1 g
% rendimiento (v/v) 82,50%
% aceite 33%

La caracterizacin de los oleosomas y su relacin con el contenido de

aceite de las semillas de J. peiranoi revela caracteres semejantes a J. curcas en

cuanto a tamao y nmero de oleosomas por clula, con los genotipos Veracuz

y Soconusco respectivamente, estudiados por Anaya et al., (2014).


Esto permitir en futuras investigaciones realizar estudios de la herencia

de caracteres, contribuyendo al mejoramiento gentico de esta especie.

7. Anlisis de Viabilidad

Se evalo la viabilidad de 20 semillas, mediante la aplicacin del test de

tetrazolio que dio reaccin positiva en el 80% de las semillas. Se tieron de color

rojo intenso que indica que no hubo dao del eje radcula-hipoctilo (corteza y

cilindro central) y el 20% presenta daos. Esto permiti distinguir TEJIDO VIVO

y vigoroso (color rojo) de TEJIDO MUERTO (color blanco lechoso) y clasificarlas

en VIABLES y NO VIABLES (Fig. 28).

Esto se debe a que en las reas teidas con la solucin de tetrazolio las

clulas vivas llevan a cabo reacciones de xido-reduccin en la cual participan

las enzimas deshidrogenasas. En esta reaccin, los protones liberados en el

proceso de respiracin reducen el trifeniltetrazolio a trifenilformazn.

V V V V V V

ERH

V V V V V V V

V V V NV NV NV NV

Fig. 28 (2) Test de tetrazolio. Semillas viables (V). Semillas no viables (NV).
Eje radcula-hipoctilo (ERH).
8. Germinacin de semillas

En su ambiente natural, la semilla pasa por un perodo de latencia o

dormancia bajo tierra, soportando temperaturas muy fras durante el invierno.

Inicia la germinacin entre los meses de agosto a septiembre, donde hay una

gran amplitud trmica entre el da y la noche, (variacin trmica tpica de climas

ridos y semiridos). Teniendo en cuenta estas caractersticas, se puso a punto

la tcnica para asegurar la germinacin de las semillas de J. peiranoi,

probndose distintos tratamientos con variaciones en el tiempo de esterilizacin,

activacin de las semillas y exposicin a la luz, simulando condiciones de la

germinacin bajo tierra (Tabla 6). Considerando como criterio de germinacin la

aparicin visible de la radcula.

Tabla 6. Ensayo de germinacin: % germinacin y contaminacin en los diferentes tratamientos.

N de Tiempo de Activacin Fotoperodo N de % de N de % de


Tratamientos semillas Esterilizacin Frio-calor Luz-oscuridad semillas Semillas Semillas Semillas
(h) (h) (h) Contaminadas Contaminadas Germinadas Germinadas

Tratamiento 1 25 1 - 8 - 16 24 96 1 4

Tratamiento 2 25 3 12 - 3 3 - 21 24 96 1 4

Tratamiento 3 25 5 12 - 3 oscuridad 1 4 8 32

La germinacin se inicia entre los tres y siete das del ensayo y germinan

en forma escalonada entre los 3, 7 y 14 das (Fig. 29, 30). Observndose que el

crecimiento radicular en longitud, es constante desde que germina hasta que

avanza el crecimiento, para los 3 tratamientos


En la Figura 29 se observa detalle de la evolucin de crecimiento radicular

en longitud de semillas de J. peiranoi.

Fig. 29 (4) Desarrollo evolutivo en longitud de la radcula de J. peiranoi.


En la Figura 30, se observan diferentes estadios de germinacin de la

semilla de J. peiranoi, desde que se inicia la aparicin de la radcula a los 7 das

de iniciado el ensayo, hasta que se reabsorbe el endosperma y los cotiledones

se vuelven fotosintticos entre 18 y 25 das.

A B

C D

F E

Fig. 30 Jatropha peiranoi tratamiento 3. (2) Semillas en distintos estadios de germinacin. A-


Semillas germinadas 7-13. B- Semillas germinadas de 11-16. C- Semillas germinadas de 13-18.
D- Semillas germinadas 15-20, E- Semillas germinadas de 17-22. F- Reabsorcin del
endosperma y cotiledones fotosintticos independientes 20-25.
En el grfico (Fig. 31) se muestra la germinacin escalonada (n=8) y

promedios de longitud radicular en milmetros (mm) para el tratamiento 3.

Fig. 31 Promedios de longitud radicular (mm) para tratamiento 3.

De los diferentes tratamientos probados el que mejores resultados dio fue

el tratamiento 3, ya que este permiti obtener un 32% de semillas germinadas y

disminuir el porcentaje de semillas contaminadas, en un 96%. La activacin junto

a un mayor tiempo de esterilizacin, durante todo el proceso de germinacin,

fueron las condiciones que permitieron optimizar la obtencin de un mayor

nmero de semillas germinadas en comparacin a los tratamientos 1 y 2. Las

condiciones de oscuridad contribuiran a mejorar la germinacin en el tratamiento

3.

En los tratamientos 1 y 2, las semillas se contaminaron en un porcentaje

de 96%. Lo que result en 4% de semillas germinadas para ambos tratamientos.

A pesar de los resultados obtenidos en el tratamiento 3, el porcentaje de

semillas germinadas es bajo, teniendo en cuenta que las pruebas de viabilidad


indicaron un porcentaje del 80%. Por lo que es necesario ajustar otros

parmetros como temperatura y humedad en cmara de germinacin, para

potenciar la misma.

No existen datos publicados acerca de pruebas de viabilidad y

germinacin de las semillas de Jatropha peiranoi, datos importantes para

determinar el valor til de las mismas.

Snchez Herrera (2008), realiz estudios de viabilidad mediante la

aplicacin de rayos X para determinar el estado de las semillas de J. curcas,

previo a la germinacin, reportando resultados superiores de un 99% de

viabilidad y germinacin respecto a los obtenidos en este trabajo, viabilidad del

80% y germinacin del 32%.

El tiempo de germinacin, se encuentra dentro de los tiempos citados en

diferentes bibliografas para la germinacin de semillas. En J. peiranoi, germina

en forma escalonada entre los 3, 7, 11 y 14 das, mientras que J. curcas, germina

a partir del tercero al quinto da y entre los 7, 9, 11 y 14 DDS (Das Despus de

Siembra en tratamientos con pulpa-cascarilla-madera como sustrato) con

porcentajes de germinacin del 70 al 90% segn Lpez-Montes (2008) y con

50% de germinacin a 14 DDS segn Fnez-Oseguera (2009), respectivamente.

9. Extraccin del aceite con solventes

Para la extraccin del aceite, se utilizaron dos sistemas de solventes, n-

hexano y una mezcla de cloroformo-metanol, de manera de evaluar el efecto de

diferentes polaridades de solventes.


De los resultados obtenidos, se observ que con la mezcla cloroformo-

metanol, se logr una extraccin del 20% de aceite mientras que con n-hexano

se obtuvo un 35%. En semillas de Jatropha curcas la extraccin de aceite

utilizando n-hexano como solvente, tambin mostr el mejor rendimiento

(Tambunan et al., 2012)

Se sabe en general que en las semillas de Jatropha el 40% de su peso

corresponde a aceite (Putten et al., 2010). Teniendo en cuenta estos valores

podemos estimar que el rendimiento en la extraccin de aceite en 2 g de semillas

de Jatropha peiranoi usando n-hexano fue del 88%.

Los valores estimados en cuanto a % de aceite (33%) y rendimiento

(82,5%) obtenidos del recuento y medicin microscpica, son similares a los

valores obtenidos mediante extraccin con n-hexano 35% y 85%,

respectivamente.

Los rendimientos obtenidos en este trabajo fueron superiores a los

observados en la extraccin de aceite de semillas de J. curcas usando n-hexano,

en donde se observ un rendimiento del 78%, Shivani et al. (2011) o al

observado por Sayyar et al. (2009) donde el rendimiento de la extraccin con n-

hexano fue del 47%.

10. Caracterizacin fsico-qumica del aceite de Jatropha peiranoi

10.1 Cromatografa en Placa (TLC)

Para analizar el perfil lipdico de Jatropha peiranoi, la muestra fue corrida

y evaluada inicialmente por cromatografa en capa fina. Se utilizaron como

controles aceites vegetales; aceite de oliva y aceite de soja.


Como se observa en la Fig. 32 el perfil lipdico de Jatropha peiranoi

presenta mayor similitud con el aceite de soja. Los Rf encontrados para los

distintos aceites se observan en la Tabla 7.

Tabla 7. Rf de los spots encontrados para los aceites


evaluados.

Fig. 32 Cromatografa en capa fina.1- cido linoleico. 2- Aceite de J. peiranoi. 3- Aceite de J.


peiranoi + n-hexano. 4- Aceite de soja. 5- Aceite de oliva.

10.2 Cromatografa Gaseosa con detector de ionizacin a la llama (GC-FID)

La composicin de cidos grasos del aceite de Jatropha se analiz por

GC-FID (Fig. 33). El anlisis por cromatografa gaseosa mostr que el triglicrido

de Jatropha est compuesto por cido linoleico (75%), cido oleico (15,6%),

cido esterico (4%) y cido palmtico (5,9%).


Fig. 33 Cromatograma de GC-FID. Tiempos de retencin en el anlisis del aceite de
Jatropha peiranoi. A- cido palmtico B- cido linoleico. C- cido oleico. D- cido esterico.

En la tabla 8 puede observarse la composicin de cidos grasos que

presentan los aceites vegetales de especies del mismo gnero; Jatropha

peiranoi, Jatropha curcas (Berchmans et al., 2008) y Jatropha excisa (Clerici et

al., 2013), y otros aceite vegetales como soja (Molina-Mayo, 2013) y oliva (Kostik

et al., 2013). Se puede observar una variacin en la composicin de cidos

grasos, tanto en el mismo gnero como en los aceites de otras especies

vegetales tales como el aceite de soja y oliva. Cabe destacar que la mayora de

los aceites presentan una mayor proporcin de cido oleico y linoleico, excepto

oliva que posee poca cantidad de cido linoleico.

Tabla 8. Composicin de cidos grasos del triglicrido de distintas especies de Jatropha


comparados con Jatropha peiranoi. Se realiza tambin una comparacin con aceite de Soja y
Oliva.
Composicin (%)
Compuesto Jatropha Jatropha Jatropha Jatropha Jatropha
Soja Oliva
peiranoi curcas macrocarpa hieronymi excisa
cido palmitico C 16:0 5,9 14-15 11-12 11-14 8,2 7-11 11,5
cido esterico C 18:0 4 3,7-9,8 3-4 7-9 5,68 3-6 2
cido oleico C 18:1 15,6 34,3-45,8 27-39 20-30 18,36 22-34 78
cido linoleico C 18:2 74,5 29-44,2 42-55 45-58 66,49 50-60 7
Fuente: Berchmans et al., 2008; Casotti, 2008; Clerici et al., 2013; Molina-Mayo, 2013; Kostik et
al., 2013
En este trabajo se presenta por primera vez la composicin del aceite de

Jatropha peiranoi, el cual posee una composicin similar a la reportada para el

aceite de Jatropha excisa (Clerici et al., 2013) y de soja (Molina-Mayo, 2013).

El aceite de Jatropha peiranoi, si bien presenta una composicin similar al

aceite de Jatropha excisa y de soja difiere de las otras especies de Jatropha,

como J. curcas, J. macrocarpa y J. hieronymi, en cuanto al contenido de cido

oleico y linoleico. El contenido de cido oleico, proporciona estabilidad oxidativa

en el biodiesel y el cido linoleico, mejora las propiedades a baja temperatura

(punto de nube, punto de fluidez y punto de obstruccin del filtro fro),

propiedades importantes que debern ser evaluadas para nuestra especie en

estudios posteriores.

Es sabido que en la industria de los biocombustibles se buscan aceites

cuya composicin sea rica en cidos grasos de cadena media a larga y que

presenten, estabilidad oxidativa y buenas propiedades de baja temperatura entre

otras, caractersticas necesarias para la calidad del biocombustible (Moreira-

Santos, 2012).

El hecho que J. peiranoi presente elevado contenido de aceite en las

semillas, cuya composicin de cidos grasos sea rica en cido linoleico la hacen

una especie promisoria para su aplicacin como biocombustible entre otras

aplicaciones industriales (Moreira-Santos, 2012; Balat, 2011).

10.3 Anlisis termo gravimtrico (TGA).

Para caracterizar el proceso de degradacin trmica del aceite se realiz

el anlisis termo gravimtrico que permiti medir la prdida de peso de la

muestra de aceite empleada (8,267 mg), en funcin de la temperatura bajo una


atmsfera controlada de nitrgeno. La Fig. 34 presenta el anlisis

termogravimtrico del aceite de Jatropha peiranoi en el que se evidencian tres

fases de prdida de peso por evaporacin. La primera fase corresponde al

intervalo de temperatura de 30 C a 380 C. En esta fase la reduccin de masa

es 4,70%, principalmente a temperaturas superiores a 300 C. La segunda fase

presenta una rpida evaporacin registrada como una prdida de peso cercana

al 90%, en el intervalo de 380 C a 448,67 C, por efecto de la volatilidad de los

componentes del aceite al incrementar la temperatura. La tercera fase se

produce a partir de 448,67 C donde se alcanza una reduccin de 100% en peso

del aceite, cuando la temperatura se acerca a los 600 C. Estos resultados

permitieron establecer que a 380 C el aceite de Jatropha peiranoi inicia su

ebullicin y que en atmsfera de nitrgeno no hay descomposicin del aceite an

a 400 C. Estos parmetros, permitieron conocer el comportamiento del aceite a

la temperatura. El perfil de prdida de peso para Jatropha peiranoi mostr ser

ms estable que el observado por Sharma et al. (2015) en aceite de canola, que

mostr ser estable por debajo de 333 C.

Fig. 34 Anlisis termo gravimtrico del aceite de Jatropha peiranoi


De esta manera el aceite de J. peiranoi mostr ser ms estable a la

temperatura, lo que podra deberse a la presencia de uniones hidrogeno intra

moleculares. As, el aceite de Jatropha peiranoi presenta propiedades deseadas

para su aplicacin como biolubricante especialmente a altas temperaturas

(Sharma et al., 2015).

Actualmente los lubricantes utilizados a nivel industrial o en el sector

automotriz son de aceites minerales. Sin embargo en los ltimos aos han

cobrado gran inters en el estudio de lubricantes obtenidos a partir de aceites

vegetales fundamentalmente si estos son aceites no comestibles (Sharma et al.,

2015). Estos aceites lubricantes presentan ventajas sobre los minerales tales

como, ser renovables, no contaminantes y biodegradables (Lathi et al., 2007;

Campanella et al., 2010).

11. Actividad lipoltica

La biomasa residual es un subproducto de la obtencin de aceite y se la

conoce como torta de semilla. Generalmente esta torta es utilizada como

fertilizante. Tambin puede ser utilizada en biodigestores para producir biogs

para la generacin de calor y energa elctrica (Huerga, 2010).

Sin embargo se busca dar un valor agregado a la produccin de esta

especie vegetal.

La biomasa residual es fuente de enzimas lo que proporciona a la misma

un potencial valor agregado de gran inters a nivel comercial. El uso de

biocatalizadores o enzimas permiten aplicar procesos de biocatlisis a nivel

industrial lo que aporta al desarrollo de industrias verdes en proceso. En las dos

ltimas dcadas la contaminacin ambiental como as tambin la bsqueda de


mejorar los rendimientos de los procesos industriales ha impulsado el uso de

enzimas para obtener bioproductos. El inconveniente de este proceso es el costo

de las enzimas. Es por esto que poder obtener enzimas como subproducto de la

obtencin del aceite de Jatropha hace del mismo un producto ms rentable.

Tal es el caso de la recuperacin de enzimas lipoliticas del tipo esterasas

o lipasas. Estas enzimas se encuentran presentes en la biomasa vegetal

fundamentalmente en semillas oleaginosas (Barros et al., 2010). Durante el

periodo de germinacin de semillas oleaginosas, los lpidos de reserva son

rpidamente usados para producir energa para el crecimiento del embrin. Las

lipasas pueden estar localizadas en las membranas de los cuerpos lipdicos u

otros compartimentos celulares (Borgstn et al., 1984). Se han estudiado las

lipasas de distintas semillas oleaginosas como semillas de lino, de girasol,

Jatropha curcas entre otras. (Staubmann et al., 1999; Sadeghipour y Bhatla,

2003; Barros et al., 2010). Sin embargo no se ha estudiado hasta ahora la

actividad lipasa en semillas de Jatropha peiranoi.

La biomasa residual de J. peiranoi mostr ambas actividades enzimticas,

con una actividad esterasa de 4,23 U/L y lipasa de 2,35 U/L y una actividad

especfica de 84,5 U/g y 46,7 U/g respectivamente (Fig. 35).

Fig. 35 Actividad enzimtica presente en la biomasa residual.


De esta manera la obtencin de enzimas lipoliticas a partir de la biomasa

residual brinda la posibilidad de plantear un ciclo de produccin de un

biocombustible como el biodiesel a partir de transesterificacin del aceite de J.

peiranoi catalizada por lipasas propias de la planta.

Este tipo de plataforma biotecnolgica se ha planteado en los ltimos aos

para dar valor agregado a tecnologas con aplicacin comercial (Zhu et al., 2016).

En nuestro caso esta plataforma se genera a partir de una especie vegetal

oleaginosa nativa de nuestra regin, no comestible, para su aplicacin en

diversas reas industriales.


Conclusiones
- En este trabajo se describi y caracteriz el hbitat de la especie motivo

de estudio, Jatropha peiranoi, como una ecorregin de vegetacin tpica de la

provincia Fitogeogrfica de Monte.

- Se determin a travs de claves diacrticas la posicin taxonmica de J.

peiranoi, Familia Euphorbiaceae, a fin de asegurar su identidad, delimitar el

gnero y especie y diferenciarla de otras especies del gnero Jatropha.

- Se realiz la caracterizacin botnica de la especie, en su aspecto

vegetativo y reproductivo. Lo que permiti establecer caractersticas

diagnsticas vegetativas, intrnsecas de la especie, como forma de vida de la

planta, tamao o altura y caracteres foliares. Los caracteres reproductivos, flores

y frutos determinaron la fenologa de la misma en cuanto a la poca de floracin,

de madurez y recoleccin de frutos y semillas.

- El anlisis morfolgico de las semillas permiti determinar su forma,

tamao y color. A travs de este anlisis se pudo precisar de modo cualitativo la

madurez fisiolgica del fruto, madurez y vigor de la semilla, caractersticas

asociadas al rendimiento (frutos maduros y semillas marrones oscuras).

- El estudio anatmico de la semilla de J. peiranoi por diversas tcnicas

de microscopa permiti caracterizar por primera vez, la estructura anatmica

externa e interna de la semilla e identificar las estructuras celulares, oleosomas

y cuerpos proteicos presentes en esta especie.

La localizacin, identificacin y diferenciacin histoqumica de los cuerpos

de aceite y proteicos, se vio mejorada por la modificacin de las tcnicas

histolgicas utilizadas en este trabajo.


El conocimiento morfolgico e histolgico de las semillas aport datos

tiles para realizar los ensayos de viabilidad, germinacin y obtencin de aceite,

y proyectarla con potencial utilidad como biocombustible.

-La caracterizacin de los oleosomas de J. peiranoi, y su relacin con el

contenido de aceite hace que esta especie sea promisoria para la obtencin de

biocombustible y permitir en futuras investigaciones realizar estudios de la

herencia de caracteres, contribuyendo al mejoramiento gentico de esta especie.

- La extraccin de aceite de las semillas de J. peiranoi con solventes de

distintas polaridades, permitieron conocer la eficiencia de extraccin y

rendimiento de aceite, obtenindose con n-hexano los mejores rendimientos,

superiores a los de J. curcas.

- La caracterizacin cualitativa y cuantitativa del aceite, permiti conocer

el perfil lipdico del aceite de J. peiranoi y compararlo con otros aceites vegetales

como soja y oliva, presentando mayor similitud con el aceite de soja. Se

determin la composicin de cidos grasos (cido linoleico 75%, cido oleico

15,6%, cido palmtico 5,9% y cido esterico 4%), de fundamental importancia

para conocer las propiedades fsicas que podra presentar el biodiesel producido

a partir de este aceite.

- Se determin la estabilidad trmica del aceite establecindose el rango

de temperatura al que es estable, punto de ebullicin y descomposicin,

parmetros importantes para la aplicacin del proceso de transesterificacin o

para su futura utilizacin como biocombustible.

- La determinacin de la presencia de actividad enzimtica lipoltica (lipasa

y esterasa) en la biomasa residual, dando un valor agregado a este subproducto.


- El estudio de la caractersticas fsico-qumicas del aceite de J. peiranoi

contribuira a ampliar el espectro de materias primas no comestibles tiles para

su aplicacin a nivel industrial, sumado a esto el valor agregado de la biomasa

residual, que cerrara de este modo el ciclo til productivo de esta especie, ya

que la semilla presenta alto potencial para la extraccin de aceite y podra ser

rentable en base al rendimiento final obtenido.


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