UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA
IASA I

Informe N 2
Integrantes: Beltrn Mariana, Flores Martn, Loor Mayra, Sangache Marlon, Sosa Valeria.
Asignatura: Agrobiotecnologa
Nivel: 8vo
Fecha: 15/12/2016

1. TEMA:
Anlisis de paternidad usando Cibertorio

2. OBJETIVOS:
2.1. Objetivo General:
Realizar un anlisis de paternidad mediante marcadores polimrficos mediante
el uso de laboratorio virtual Cibertorio.

2.2. Objetivos Especficos:

Hacer una amplificacin de ADN por PCR partiendo de muestras de la madre,
hijo y cuatro posibles padres.
Ejecutar mediante electroforesis para la comparacin.
Determinar cul de los cuatro candidatos es el padre, mediante los patrones de
las bandas.

3. HIPTESIS:
H0: El uso de marcadores polimrficos no permite determinar cul es el padre,
mediante la comparacin de los patrones de bandas.

H1: El uso de marcadores polimrficos permite determinar cul es el padre, mediante

la comparacin de los patrones de bandas.
4. MARCO TERICO:

Marcadores moleculares
La informacin gentica de las personas es idntica en todas las clulas nucleadas de su
cuerpo y es diferente comparada con cualquier otro individuo. Los seres humanos
reciben la informacin gentica de su madre y padre. Esta informacin gentica se
localiza en una molcula en el ncleo de las clulas llamado ADN (TecnoGen, 2015).
Los individuos mantienen esta informacin en sus ncleos celulares. En consecuencia
el diagnstico de paternidad consiste en el estudio de las clulas del presunto padre y
las de supuesto hijo a travs de pruebas de ADN, las cuales permiten determinar si existe
una relacin gentica entre estas dos personas por la similitud entre las dos muestras; es
decir compara las secuencias genmicas altamente polimrficas denominadas STR
(Short Tandem Repeats) del presunto padre y del hijo o hija (Infogen, 2015).
En primer lugar se contrasta con la madre, para averiguar la parte gentica del hijo que
ha sido heredada de la misma. La otra mitad de la informacin gentica del hijo es
contrastada con el presunto padre. Si el presunto padre posee las caractersticas
heredadas por el hijo existe una probabilidad de paternidad; en el caso contrario, si el
presunto padre no tiene esas caractersticas queda excluido como padre biolgico
(TecnoGen, 2015).

Figura 1. Prueba de paternidad, anlisis de genes madre - hijo - supuesto padre.

Considerando la gran cantidad de informacin que contiene el genoma, podemos

visualizar su potencial para identificacin humana y para el estudio de paternidad. Para
esta tcnica se usan marcadores moleculares, estos son biomolculas que se pueden
relacionar con un rasgo gentico. Es decir, una entidad gentica que presenta un cierto
grado de polimorfismo y sigue las reglas de las leyes mendelianas de manera que pueden
ser heredadas en la descendencia. Pueden ser marcadores moleculares, las protenas
(antgenos e isoenzimas) y el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificacin de
especies y variedades. (Claros, 1998).
La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de estudiar
poblaciones de organismos y seleccionar aquellos que presentan rasgos de inters para
el hombre. La metodologa que se utiliza es bsicamente la misma en todo el mundo y
consiste en el anlisis de entre 13 a 15 marcadores.
Los marcadores son de tres tipos: microsatlites, minisatlites y de variacin de
secuencia.
Las secuencias de tipo microsatlite (SSR o STR, Simple Sequence Repeats o Short
Tndem Repeats), muy abundantes en los genomas de eucariotas y algunos procariotas,
estn constituidas por unidades cortas de 1 a 6 pares de bases (pb), que se repiten en
tndem un elevado nmero de veces. Una repeticin en tndem es una secuencia de dos
o ms pares de bases de ADN que se repite de tal manera que las repeticiones se
encuentran uno al lado del otro en el cromosoma (Rotimi. s.f).
Los microsatlites poseen altas tasas de mutacin y se emplean para la amplificacin
especfica de los alelos de cada locus. Su deteccin se basa en la amplificacin por PCR
de la regin que los contiene, empleando cebadores complementarios a las regiones
flanqueantes, y la posterior visualizacin de la diferencia de tamao de estos
ampliaciones.

Pruebas de paternidad
Son aquellas que tienen la finalidad de probar que un hombre es el padre biolgico de
un nio o nia. La prueba de ADN para determinar la paternidad es el procedimiento
que permite determinar, a travs del anlisis de los marcadores de ADN, la informacin
de herencia gentica que es propia de cada persona. Por lo tanto, permite conocer con
certeza mediante una pequea muestra de sangre o saliva quienes son los padres
biolgicos de un nio o una nia (Mundolab, 2015).
La PCR es una de las tcnicas esenciales para la preparacin de huellas dactilares. La
reaccin bsica de la PCR comienza con la desnaturalizacin del DNA molde para
separar las cadenas, contina con el alineamiento de un par de oligonucletidos con su
 DNA molde, y termina con la polimerizacin para sintetizar un nuevo DNA entre los
dos oligonucletidos (Infogen, 2015).

Tcnica para obtener el Perfil de ADN

La forma de obtener un perfil de ADN se basa en generar millones de copias o
amplificar las secuencias del genoma que permiten diferenciar individuos, en este caso
los marcadores STRs. Esta tcnica permite replicar al ADN in vitro, y se conoce
ampliamente por sus siglas en ingls como PCR (Villalobos, 2010).
La PCR se realiza por ciclos de temperatura en los que bsicamente suceden los
siguientes tres pasos en cada ciclo:
1. Desnaturalizacin, por calor se abren las cadenas de ADN,
2. Alineamiento de secuencias cortas conocidas como primers, que delimitan las
regiones que se van a replicar, y
3. Extensin, formndose cadenas nuevas de ADN por accin de la Taq polimerasa, una
enzima termoestable capaz de aadir nucletidos a los extremos de los primers.

Figura 2. Amplificacin exponencial de una secuencia de ADN por ciclos de temperatura por
la tcnica de PCR. (Villalobos, 2010)

El anlisis combinado de diversos STRs, proporciona la huella gentica de cada

individuo, por esta razn se utilizan como marcadores para pruebas genticas de
identificacin de individuos y para pruebas de paternidad. Para cada una de estas
regiones STR, un individuo tiene dos copias, una heredada por su madre y otra por el
 padre. La metodologa incluye la amplificacin por PCR multiplex de marcadores STR
y su anlisis por electroforesis capilar (Genos Mdica, s.f).
Para distinguir uno del otro se separan los fragmentos mediante electroforesis
(migracin en un campo elctrico sobre una superficie de un gel) sobre geles de
poliacrilamida capaz de distinguir los fragmentos en funcin de sus tamaos diferentes
(BioGenmica, 2014).

Figura 3. Amplificacin de STRs y deteccin por electroforesis en geles verticales de

poliacrilamida. (Villalobos, 2010)

Interpretacin de resultados
Despus de obtener los perfiles en una prueba de ADN para determinar la paternidad
entre un supuesto padre y un hijo en disputa, existen dos resultados posibles al comparar
sus perfiles:
1. Que para al menos dos marcadores no exista ninguna coincidencia entre los
alelos/genotipos del supuesto padre e hijo, lo que se denomina exclusin, y se descarta
de inmediato la paternidad biolgica;
2. Que s coincida el padre con el hijo en al menos un alelo en todos los marcadores
analizados, lo que se puede interpretar como que el supuesto padre es el padre biolgico
del hijo en disputa (Villalobos, 2010).
5. METODOLOGA
5.1. Materiales
Cibertorio:
Al momento de comprar el formulario de pedido, en este viene un grupo de muestras
para anlisis de paternidad que contiene las siguientes muestras de ADN:
ADN de un hijo o hija (H).
ADN de su madre (M).
ADN de cuatro varones cuya paternidad se desea evaluar (P1, P2, P3, P4).
Cebadores de PCR para cuatro marcadores STR: a) AMEL, D18S51, D3S1358,
FGA; b) D8S1179, D21S11, VWA, FGA; c) cebadores dados por el sitio web:
AMEL, D8S1179, D18S51, D21S11.
Reactivos (PCR master mix) para realizar PCR mltiplex.
Hay que tener en cuenta que cada vez que se haga un nuevo pedido, las muestras
de ADN de padres e hijos van a ser distintas.

5.2. Mtodos
En el laboratorio virtual, se seleccion la opcin laboratorio de reacciones.
Despus en los tubos 1 - 6, para la prueba de PCR se mezcl lo siguiente: a) en cada
tubo, 20 ul de una de las 6 muestras de ADN (M, H, P1, P2, P3, P4); b) en todos los
tubos, 5 ul de la mezcla de reactivos para PCR (PCR mix); c) en todos los tubos, 1
ul de cada uno de los cebadores para los 4 marcadores STR; d) completar con agua
el volumen hasta un total de 50 ul, es decir, 21 ul de agua.
Continuando con el proceso, se puso en marcha la reaccin PCR pulsando la opcin
Incubar. Cuando transcurri el tiempo virtual requerido, se complet la
amplificacin del ADN de los marcadores STR. En ese momento, apareci un
mensaje que confirm que la amplificacin del ADN fue correcta.
En el laboratorio de electroforesis se realiz lo siguiente: a) se eligi el gel de tipo
poliacrilamida 5%; b) despus se puls el botn Autocargar, que har que las 6
muestras preparadas en el laboratorio de reacciones se transfieran a los 6 primeros
pocillos del gel virtual; el pocillo N 13 se carg automticamente una mezcla de
patrones de tamao (escalera de ADN); c) luego se ajust la fuente de voltaje a 300
voltios y el tiempo a 1 hora y 10 minutos virtuales. Para finalizar, se conect la
corriente para comenzar la electroforesis, se encendi la luz UV y se apag las luces
 de la habitacin virtual para ver cmo iba avanzando el ADN y separndose las
bandas.
Al completarse la electroforesis, se hizo una captura de pantalla y se interpret los
resultados.

6. RESULTADOS
A continuacin se puede observar el resultado de las pruebas de paternidad realizadas
mediante electroforesis. Cada electroforesis observada en cada ilustracin fue realizada
con distintas combinaciones de cebadores para marcadores moleculares STR. En todas
las ilustraciones las calles fueron numeradas y representan lo siguiente:
Calle 1: Madre
Calle 2: Hijo/a
Calle 3: Presunto padre 1
Calle 4: Presunto padre 2
Calle 5: Presunto padre 3
Calle 6: Presunto padre 4
Al lado derecho se encuentra un carril con un marcador de peso.

Prueba de paternidad N 1 (Equipo 1):

Fuente: Prueba realizada por el autor.

En la presente electroforesis se observan los resultados de la PCR con marcadores
moleculares STR realizada en 6 individuos: la madre, el hijo/a, y 4 posibles padres. Los
cebadores en este caso fueron D18S51, D3S1358, FGA y AMEL. Para facilitar la
comparacin se dividi a las bandas producidas por el hijo/a en dos partes unas
procedentes de la madre (azul) y otras del padre (rojo). Una vez determinadas las bandas
que provienen de la madre, se analizan las bandas restantes con cual posible padre
coinciden en su localizacin. En este caso se determinaron todas las coincidencias con
el posible padre 2, lo cual lo vuelve el padre biolgico. Adems, ya que se utiliz
amelogenina (AMEL) como diagnstico gentico del sexo, se puede determinar que el
hijo es varn.

Prueba de paternidad N 2 (Equipo 2):

Fuente: Prueba realizada por el autor.

En este caso, al igual que el anterior, se puede observar la electroforesis realizada en 6

individuos: la madre, el hijo/a, y 4 posibles padres. Los cebadores en este caso fueron
D8S1179, D21S11, VWA y FGA. En este caso, al examinar las bandas al igual que el
anterior, se determinaron todas las coincidencias con el posible padre 1, lo cual lo
vuelve el padre biolgico. En este caso no se puede determinar el sexo del hijo/a, ya
que no se utiliz amelogenina.
 Prueba de paternidad N 3 (Grupo):

Fuente: Prueba realizada por el autor.

Por ltimo en este caso, al igual que el resto, se puede visualizar la electroforesis
realizada en 6 individuos: la madre, el hijo/a, y 4 posibles padres. Los cebadores en este
caso fueron D8S1179, D18S51, D21S11 y AMEL. En este caso, al examinar las bandas
al igual de igual forma que en anteriores casos, se determinaron todas las coincidencias
con el posible padre 1, lo cual lo vuelve el padre biolgico y el resto de posibles padres
se los excluye. Adems, ya que se utiliz amelogenina (AMEL) como diagnstico
gentico del sexo, se puede determinar que el hijo es mujer.

7. DISCUSIN
La facilidad para obtener perfiles genticos ha revolucionado la identificacin de
relaciones biolgicas de parentesco, comnmente paternidad y las repeticiones cortas
en tndem, ms bien conocido como STRs son los marcadores genticos ms utilizados
con este fin; como en el caso de este experimento que usaron marcadores STRs
(D8S1179, D18S51, D21S11, FGA, AMEL, D3S1358). Un perfil de ADN se compone
de los genotipos para varios STRs, que forman un cdigo casi nico para diferenciar o
relacionar a una persona biolgicamente. En paternidad se espera que entre el perfil de
 ADN de un supuesto padre e hijo, exista al menos una concordancia por cada marcador
(Villalobos, 2010).

Despus de obtener los perfiles en una prueba de ADN para determinar la paternidad
entre un supuesto padre y un hijo en disputa, existen dos resultados posibles al comparar
sus perfiles, el primero es que, para al menos dos marcadores no exista ninguna
coincidencia entre los alelos/genotipos del supuesto padre e hijo, lo que se denomina
exclusin y se descarta de inmediato la paternidad biolgica. Segundo, que s
coincide el padre con el hijo en al menos un alelo en todos los marcadores analizados,
lo que se puede interpretar como que el supuesto padre es el padre biolgico del hijo en
disputa (Universidad de Arizona, 2004).

En el experimento 1, se cumple que existe coincidencia entre el hijo y uno de los padres
en al menos un alelo en todos los marcadores analizados (D18S51, D3S1358, FGA y
AMEL), ya que, se observ que el hijo y el padre 2, comparten dos bandas similares.
Para el caso del experimento 2, tambin se cumple que existe coincidencia entre el hijo
y uno de los padres en los marcadores analizados (D8S1179, D21S11, VWA y FGA)
ya que, se observ que el hijo y el padre 1, comparten cuatro bandas similares, sin la
utilizacin de amelogenina no se pudo diferenciar el sexo del hijo analizado. En el
ltimo caso utilizando como marcadores (D8S1179, D18S51, D21S11 y AMEL) se
determin un grado de parentesco entre el hijo y el padre 1 adems se concluy el sexo
del individuo como mujer.

Se ha sugerido por parte del FBI, entre otros organismos, el uso de 13 STRs para
identificacin gentica humana que constituyen el CODIS, los cuales son suficientes
para resolver la mayora de casos de paternidad. Sin embargo, en realidad el nmero de
marcadores depende del caso, pudiendo ser mucho menor o mayor a 13 marcadores; en
realidad lo fundamental es llegar a una conclusin lo suficientemente confiable
(Villalobos, 2010). Por lo cual en nuestro caso, se pudo evidenciar que con el uso de
cuatro marcadores para cada anlisis, se pudo determinar cul es el padre.

8. CONCLUSIONES
El laboratorio virtual genera una experiencia muy cercana a la realidad, brindando
un acercamiento a las diferentes tcnicas genticas utilizadas en la actualidad.
 El mtodo de pruebas de paternidad realizado a partir de marcadores moleculares
STR, brinda resultados con altos niveles de confiabilidad debido a los
polimorfismos que son detectados, los cuales son altamente variables en una
poblacin.
Todos los cebadores para marcadores moleculares STR presentes en el Cibertorio
son vlidos para realizar pruebas de paternidad a excepcin del cebador para el gen
Amelogenina (AMEL) que se utiliza para determinacin del sexo.
A mayor cantidad de cebadores para marcadores moleculares STR, utilizados en
pruebas de paternidad, se consigue una mayor confiabilidad de los resultados.

9. RECOMENDACIONES
Se recomienda la utilizacin del software de laboratorio virtual ya que puede ser
utilizado para identificar las ideas previas en relacin con los fenmenos estudiados.
El protocolo a seguir en el laboratorio virtual no es difcil, es una herramienta de
trabajo fcil y til, la cual se asemeja mucho al protocolo a seguir en un laboratorio,
es un instrumento que sirve para el aprendizaje de los estudiantes.
Se recomienda aumentar el nmero de cebadores para tener mayor confiabilidad
en el laboratorio virtual.
10. BIBLIOGRAFA
CIBERTORIO. sf. Anlisis de paternidad usando Cibertorio. Disponible en:
http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio-material/paternidad.htm (Cosultado el 12 de
diciembre del 2016).

Claros, M. 1998. Marcadores moleculares: Qu son, cmo se obtienen y para qu valen.

Dpto. de Biologa Molecular y Bioqumica. Universidad de Mlaga.

Infogen. 2015. Prueba de paternidad. Disponible en: http://infogen.org.mx/prueba-de-

paternidad/

Rotimi, C. s.f. Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional de Investigacin del

Genoma Humano " Glosario Hablado de Trminos Genticos". Consultado el 11 de agosto
2016, desde https://www.genome.gov/glossaryS/?id=193.

BioGenmica. 2014. Mtodo STR para la Prueba de Paternidad por ADN. Disponible en:
http://biogenomica.com/STR.htm

Mundolab. 2015. Test de paternidad, prueba de ADN. Disponible en:

http://www.mundolab.com/media/PDF/Test-Paternidad_ADN.pdf Recuperado el:
01/02/16.

TecnoGen. 2015. Fundamentos tcnicos de las pruebas de ADN. Disponible en:

http://www.adftecnogen.es/informacion/fundamentos-tcnicos. Recuperado el: 01/02/16.

Villalobos, H. 2010. LA PRUEBA DE PATERNIDAD CON ADN. Disponible en:

http://dnaprofile.com.mx/informacion-prueba-de-paternidad-adn.php

Universidad de Arizona. 2004. Pruebas de paternidad con datos STR. Disponible en:
http://www.biologia.arizona.edu/human/activities/blackett2/act_paternity1.html.
11. ANEXOS

1) Se ingres al Cibertorio.

2) Se sigui todas las indicaciones de la gua que se encuentran en el sitio web.

3) Luego se seleccionaron los cebadores de PCR para cuatro marcadores STR.

Equipo 1: Beltrn Mariana, Loor Mayra y Sosa Valeria.

Equipo 2: Flores Martn y Sangache Marlon.

Grupo: Cebadores dados por el sitio web.

4) Se ingres en el laboratorio de reacciones.

5) Se prepar las muestras en los 6 tubos y se inici la reaccin PCR.

6) Al finalizar el proceso de PCR, apareci un mensaje que indica que el proceso fue un xito.
7) Despus se seleccion a opcin laboratorio de electroforesis, en el cual se sigui una serie
de pasos descritos anteriormente y se realiz la corrida electrofortica virtual de las 6
muestras.

8) Los resultados de la electroforesis son los siguientes:

Equipo 1:
Equipo 2:

Grupo: