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MICROBIOLOGIA GENERAL
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
ODONTOLOGACAMPUS XALAPA
FACULTAD DE
La Microbiologa es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la
Biologa. El estudio de los microorganismos se inici a partir de que Anton van
Leewenhoek en 1670 invent el microscopio y que a partir de los estudios de Louis Pasteur
en 1876, se logr el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como
actores de una diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de
enfermedades en plantas, animales y humanos, tambin es cierto que desde la antigedad
algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de produccin de alimentos
fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha
reconocido su importancia en diversas reas de investigacin bsica, en la industria
alimentaria, ambiental y farmacutica.
El objetivo general del curso prctico de Microbiologa General es que el alumno se
inicie con el conocimiento de la biologa bsica de los microorganismos, en sus
caractersticas morfolgicas, nutricionales, de crecimiento, control y que adquiera las
habilidades necesarias para su manipulacin en el laboratorio.
Este manual est dirigido a estudiantes que iniciarn su experiencia en el manejo
de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio
del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del
laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deber aprender, para que
manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como
la de sus compaeros.
Este manual contiene 10 prcticas, diseadas para que el estudiante se familiarice
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observacin de microorganismos.
En cada prctica se presentan los objetivos y una breve introduccin para facilitar la
comprensin de los mismos, despus se indican los materiales necesarios y
procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan
con figuras y esquemas.
Posteriormente en cada prctica se proponen formas de presentacin de los
resultados en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. Tambin se
incluyen preguntas en forma de cuestionario que el estudiante deber resolver
consultando los materiales bibliogrficos sugeridos al final de este manual.
REGLAS DE LABORATORIO
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
1. Siempre deber usar bata de algodn, de manga larga, abotonada, que deber quitarse
antes de abandonar el laboratorio
2. Se prohibe fumar, aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o algn otro
objeto. Se deber lavar meticulosamente las manos con agua y jabn antes de salir del
laboratorio.
3. Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica
de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona
especificada por el acadmico.
4. No se admiten visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad
en el trabajo que se realiza.
5. Limpiar su sector de mesa , antes y despus de trabajar , con un algodn embebido en
solucin desinfectante. Para ello se puede emplear bicloruro de mercurio, solucin de
formol al 5-10%, alcohol 70 grados, etc. (no corrosivas para la piel).
6. Tener siempre a mano sobre la mesa: a) un vaso de precipitado o similar llena con solucin
desinfectante para introducir las pipetas luego de ser utilizadas; b) un recipiente para
colocar el material contaminado o sucio; c) mechero.
7. Tener en cuenta que el cultivo con el que se trabaja puede ser patgeno, razn por la cual
hay que manejarlo siempre como si lo fuera.
8. Al recibir el cultivo NO LO DESTAPE, tome el tubo por su parte media apoyado sobre la
palma de la mano de manera de ver fcilmente el contenido y la inscripcin que lo
identifica.
9. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deber notificarlo
inmediatamante al acadmico. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes
con cultivos activos, deber conservar la calma y adems de informar al acadmico, seguir
inmediatamente el procedimiento:
A)Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin.
B)Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas.
C)Dejar transcurrir por lo menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el recipiente
destinado a la eliminacin de materiales contaminados.
10. En caso de heridas por accidentes durante el manipuleo del material infectado, debe
prevenirse la posibilidad de infeccin. Comunique el hecho al personal de la ctedra.
11. Realice las tcnicas bacteriolgicas al abrigo de las corrientes de aire, con movimientos
pausados, poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar mientras realiza maniobras
microbiolgicas a fin de evitar que se contaminen los cultivos.
12. Debe siempre llevarse el asa al rojo antes y despus de toda operacin que se realice con
ella.
13. No deben depositarse los tapones sobre la mesa, para evitar contaminaciones de y con los
cultivos de trabajo.
14. Los tubos con medio de cultivo, ya sean lquidos o slidos, sembrados o no, deben
colocarse siempre sobre una gradilla y nunca sobre la mesa.
15. Los cultivos de descarte deben colocarse siempre en recipientes adecuados para luego ser
esterilizados.
16. Tanto las placas como los tubos deben ser identificados con marcas o rtulos.
17. Los papeles de envoltura de material de vidrio deben arrojarse en los cestos destinados a
tal fin.
18. No deber pipetear oralmente ningn tipo de cultivo microbiano; esta actividad se
realizar con pipetas automticas o accionadas de forma mecnica, tratando de evitar la
formacin de aerosoles.
19. 16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia, completando
con dibujos.
20. Al abandonar el laboratorio, debe controlar que los mecheros y llaves de gas, agua, as
como las luces .
21. REQUIERA LA PRESENCIA DEL DOCENTE PARA QUE LO ASESORE CORRECTAMENTE TODA
VEZ QUE TENGA DUDAS SOBRE LA REALIZACIN DE UNA TCNICA.
REGLAS DE LABORATORIO..............................................................................................................2
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA......................2
MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIN DE LABORATORIO...............................................3
PRCTICA # 1..................................................................................................................................6
MICROSCOPA................................................................................................................................6
OBJETIVO....................................................................................................................................6
INTRODUCCIN..........................................................................................................................6
EL MICROSCOPIO........................................................................................................................6
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO............................................................................................7
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES..........................................................................................8
ACTIVIDADES..............................................................................................................................9
PRCTICA # 2................................................................................................................................10
TCNICAS DE TINCIN..................................................................................................................10
OBJETIVO..................................................................................................................................10
GENERALIDADES.......................................................................................................................10
TINCIN DE BACTERIAS............................................................................................................10
TIPOS DE TINCIN....................................................................................................................10
TINCIN SIMPLE.......................................................................................................................11
TINCIN NEGATIVA...................................................................................................................11
TINCIN DE GRAM...................................................................................................................12
TINCIN DE ESPORAS...............................................................................................................13
PRACTICA # 3................................................................................................................................17
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO........................................................................................17
OBJETIVO..................................................................................................................................17
GENERALIDADES.......................................................................................................................17
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO...........................................................................17
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS.....................................................................................18
PRCTICA # 4................................................................................................................................20
MORFOLOGA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS...........................................................................20
OBJETIVO..................................................................................................................................20
GENERALIDADES.......................................................................................................................20
PRCTICA # 5................................................................................................................................25
PRUEBAS BIOQUMICAS...............................................................................................................25
OBJETIVO......................................................................................................................................25
GENERALIDADES...........................................................................................................................25
Caldos de carbohidratos con indicador de pH..............................................................................25
Agar de hierro y triple azcar (TSI)...............................................................................................26
Agar de hierro y lisina (LIA)...........................................................................................................26
Prueba del citrato de Simmons....................................................................................................27
Prueba de la ureasa......................................................................................................................27
Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina).....................................................................................27
MATERIAL Y EQUIPO.....................................................................................................................28
TCNICA.......................................................................................................................................28
PRESENTACON DE RESULTADOS..................................................................................................29
PRCTICA # 6................................................................................................................................30
CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FSICOS Y QUMICOS......................................30
OBJETIVO..................................................................................................................................30
GENERALIDADES.......................................................................................................................30
RADIACIN ULTRAVIOLETA.......................................................................................................30
TEMPERATURA.........................................................................................................................30
DESINFECTANTES......................................................................................................................31
PRCTICA # 7................................................................................................................................35
OBSERVACIN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES...................................35
OBJETIVO..................................................................................................................................35
GENERALIDADES.......................................................................................................................35
PRCTICA # 1
MICROSCOPA
OBJETIVO
Conocer las partes y funcionamiento de un microscopio as como tomar conocimiento del
cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el Laboratorio de Microbiologa.
INTRODUCCIN
Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y
para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en
el Laboratorio de Microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los
microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual junto con otros
criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es importante conocer su adecuado
manejo.
Adems de la ampliacin de la imagen, en microscopa, hay que tener en cuenta dos
factores ms: el contraste y la resolucin. Los objetos deben poseer un cierto grado de
contraste con su medio circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio.
Por ello es que la mayora de los organismos necesitan ser previamente teidos para poder
distinguirlos del medio (tinciones simples). Para contrastar o realzar de forma especfica
distintas caractersticas morfolgicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales.
Estas tcnicas tienen un gran inters en la identificacin y clasificacin de las bacterias. La
tincin diferencial ms utilizada es la tincin de Gram. Otras tinciones de gran importancia
son las que diferencian bacterias cido- alcohol resistentes, las que diferencian
estructuras significativas como las esporas o la tincin negativa de cpsulas.
Por otra parte, el grado de resolucin (la capacidad para ver separados dos objetos
adyacentes muy prximos entre s), depende de las caractersticas del sistema de lentes
que posea el microscopio. ste se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz
emitida, el ndice de
refraccin del medio en
el que se realiza la
visualizacin y la
apertura numrica del
objetivo.
EL MICROSCOPIO
El microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o ms lentes de aumento. Un
microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico.
2) Sistema ptico. Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los
oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.
1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estn limpias: de no ser as,
lmpielas cuidadosamente con papel especial para ptica. No tocar las lentes con los
dedos.
a) Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y
el objetivo de 40x
1) No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pauelos especiales para
lente.
2) No dejar nunca una preparacin sobre la platina cuando no est usando el microscopio.
TCNICAS DE TINCIN
OBJETIVO
El alumno aprender y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms frecuentes.
GENERALIDADES
La coloracin es el proceso de teir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscpico forma, agrupacin y
estructuras)
Un colorante es un compuesto orgnico que consta de anillos bencnicos y grupos
cromforos (agrupacin de tomos que da color a ciertos compuestos) y auxocromos
(sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las caractersticas de
absorcin del cromforo).
En el laboratorio de microbiologa se pueden usar los colorantes de varias formas
como:
a) Para teir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificacin de microorganismos en base a sus caractersticas de tincin,
por ejemplo, si son o no alcohol-cido resistentes, si son Gram positivas o Gram
negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y as poder
estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.
TINCIN DE BACTERIAS
La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como el
cristal, azul de metileno y fucsina bsica, pero relativamente mal con colorantes cidos
como la eosina.
Un colorante bsico es aquel constituido por un agrupamiento de tomos orgnicos
con carga positiva que ser la parte activa del colorante ya que tendr afinidad por los
cidos nucleicos. Un colorante cido es aquel que se encuentra constituido por tomos
orgnicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por el citoplasma.
TIPOS DE TINCIN
1. Tincin simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer ms
fcilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna caracterstica en especial.
Una tincin simple se lleva a cabo cubriendo con colorante bsico un frotis seco y
fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las clulas por un minuto y se lava
suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante para que
quede listo para observarse.
2. Tincin negativa. Este mtodo de tincin utiliza colorantes neutros o cidos ya que
tienen poca afinidad por la clula bacteriana por lo tanto como no se absorben se
colorea el fondo en el que estn las bacterias pero la clula queda incolora y
transparente, as pues las bacterias aparecen como pequeas reas iluminadas en
un fondo oscuro. La tincin acdica con nigrosina, o neutral ( con tinta china) son
las ms usadas.
3. Tincin diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto fsica como
qumicamente, por lo cual su reaccin ante algunos colorantes tambin ser
diferente dando lugar as a grupos tintoreales caractersticos. Entre estos grupos
estn los que se originan por la tincin descubierta por Hans Christian Gram, esta
tincin divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no solo
sirve para diferenciarlas sino an para elegir la terapia adecuada en algunos casos.
Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiologa clnica como la de
Ziehl- Neelsen.
4. Tincin estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su
afinidad se utilizan para teir y detectar ciertas estructuras de la clula bacteriana
como son las esporas, los flagelos y las cpsulas.
TINCIN SIMPLE
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Azul de metileno de Leffler
Cepa de Escherichia coli, Staphylococcus aureus
TCNICA
1. Preparar un frotis de E. coli y se S. aureus de acuerdo a las indicaciones de la figura
1 y fijarlo al calor.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersin.
TINCIN NEGATIVA
MATERIAL Y EQUIPO
4 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Vaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5%
Nigrosina o tinta china
Puente de tincin
Cepa de Klebsiella pneumoniae
TCNICA
1. Hacer una suspensin ligera en solucin salina de K. pneumoniae y mezclar una
gota de esta suspensin con una pequea gota de nigrosina o tinta china en el
borde central del portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho del primer
portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso.
3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR.
4. Observe con el objetivo de inmersin.
TINCIN DE GRAM
MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Puente de tincin
Cepas de Gram negativos (Escherichia coli) y de Gram positivos (Staphylococcus
aureus).
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina
TCNICA
1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno con
una mezcla de ambos microorganismos.
2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.
3. Teir con cristal violeta por un minuto.
4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto.
6. Enjuagar con agua corriente y escurrir
7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la charola
de tincin y aada goteando el etanol, dejando que corra por todo el frotis.
Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la accin decolorante lavando con agua.
9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el frotis.
10. Examinar con el objetivo de inmersin.
TINCIN DE ESPORAS
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Papel filtro
Lmpara de alcohol
Cepa de Bacillus subtilis
cido actico al 5%
Azul de metileno de Leffler
TNICA
1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 1.
2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lmpara de alcohol hasta
la emisin de vapores. Es importante que su puente de tincin est bien
nivelado para que la fucsina no se escurra y el frotis no se seque al calentar.
3. Dejar en reposo por 5 minutos
4. Lavar con agua corriente
5. Decolorar con cido actico al 5% hasta que el frotis tome un ligero color rosa
6. Lavar con agua corriente
7. Teir durante 3 minutos con azul de metileno de Leffler
8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el objetivo de
inmersin
FIGURA 1
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Cuadro 2
Observaciones microscpicas de frotis de cultivos bacterianos
Tincin simple
Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)
Tincin negativa
Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)
Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)
Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)
PRACTICA # 3
OBJETIVO
GENERALIDADES
Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una
fuente de energa exgena y nutriente esenciales tales como agua, carbn, nitrgeno,
minerales y factores de crecimiento, adems de las condiciones ambientales apropiadas
como son pH, temperatura, presin osmtica y oxgeno atmosfrico. Cuando las bacterias
se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los medios de cultivo los
cuales pueden ser de muy variados tipos de acuerdo al microorganismo que se desee
estudiar. Muchos materiales naturales como jugos, leche, vegetales y carnes pueden ser
usados como bases para medios de cultivo.
El medio de cultivo puede ser lquido como los caldos, semislido o slido dependiendo de
la consistencia que adquiere el medio lquido al agregar diferentes concentraciones de un
solidificante como el agar, que es un extracto de algas marinas. El agar no es utilizado
como nutriente por la mayora de las bacterias, as pues acta solamente como
solidificante. Se funde alrededor de 100 C y permanece lquido hasta que se enfra de 42
a 43C. La gelatina se puede usar tambin pero con el inconveniente de que funde a 25C y
puede ser hidrolizada por muchas bacterias.
Existen diversas clasificaciones de los medios de cultivo: se abocar a dos de uso prctico,
una de acuerdo a su composicin y la otra de acuerdo a su uso en el laboratorio:
~ Medios de cultivo de uso general. En este grupo se encuentran los medios qe contienen
los nutrientes bsicos y no contienen sustancias inhibitorias por lo que en ellos pueden
crecer una gran variedad de hetertrofos. Entre estos medios tenemos Agar de soya y
tripticasena, agar de Mller Hinton, agar nutritivo, etc.
~ Medios de cultivo diferencial. Este tipo de medios es usado para distinguir entre
diferentes tipos de bacterias. Usualmente contienen colorantes o indicadores de pH que
darn un color caracterstico a las colonias o viraran el color del medio de cultivo de
acuerdo al microorganismo que se trate.
Agar de MacConkey el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los
microorganismos Grampositivos, adems de lactosa y como indicador rojo de fenol para
distinguir las bacetrias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen.
Agar EMB (Eosina azul de metileno) mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los
organismos Grampositivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar de MacConkey, permite
diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen.
El Agar de sal y manitol, por su alto contenido de NaCl (7.5%) inhibe a las bacterias que no
lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la
fermentacin del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciacin del gnero
Staphylococcus.
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS
Hasta 1930 la preparacin de medios de cultivo requera de mucho tiempo ya que se deba
de partir de materiales crudos que se iban pesando individualmente y algunos se tenan
que preparar como las infusiones y extractos por mtodos muy tediosos. Sin embargo,
ahora se cuenta con medios de cultivo deshidratado que han simplificado mucho el
trabajo ya que solo hace falta leer las instrucciones en cada frasco, disolver la cantidad
necesaria en agua, ajustar el pH, dispensar en tubos y esterilizar.
Para disolver los medios de cultivo deshidratados se debe utilizar agua recin destilada o
desmineralizada con un pH lo ms cercano posible a 7.0. El recipiente que se utilice debe
ser de preferencia un matraz Erlenmeyer con una capacidad mayor al volumen de medio
que se va a preparar para que se pueda agitar fcilmente. Los medios que no contienen
agar se pueden disolver fcilmente en agua fra o con un ligero calentamiento, sin
embargo si el medio contiene agar o gelatina requerir de calentamiento.
AJUSTE DEL pH
ESTERILIZACIN
Los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el caso de
los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para vaciar una
placa (aprox. 20 ml cada uno) o bien matraces para varias placas.
Si en las instrucciones del medio no se indica otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en
autoclave a 121C por 15 minutos.
PRCTICA # 4
OBJETIVO
MATERIAL Y EQUIPO
Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior.
1 mechero Bunsen
1 asa bacteriolgica
COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido difusible
o no.
CARACTERSTICAS PTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a traves de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a
travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramentelos objetos observados a travs
de la colonia.
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la bacteria
sembrada se reflejan en las caracteristicas que presenta el caldo inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contnuo sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla , basndose en el texto, las
figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consistencia
Color
Luz transmitida
Luz reflejada
CALDO
Pelcula
Turbidez
Sedimento
MEDIO SEMISLIDO
Movilidad
PRCTICA # 5
PRUEBAS BIOQUMICAS
OBJETIVO
GENERALIDADES
2. Aergenas: las que producen gas como hidrgeno y dixido de carbono como resultado
de su actividad metablica.
5. Fotgenas: las que causan putrefaccin y producen una dbil fosforescencia (algunas
bacterias marinas)
Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de carbono en
una serie de reacciones como sigue:
OXALACETATO PIRUVATO + CO
Los cidos orgnicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos
y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino as logrado hace que el indicador de pH en el
medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso.
Prueba de la ureasa
Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del
medio (amarillo) a un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo a la
degradacin de la urea el color ser ms o menos intenso.
Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccon de
indol y descarboxilacin de la ornitina.
MATERIAL Y EQUIPO
Aguja bacteriolgica
Mechero de Bunsen
Gradilla
Medio de MIO
TCNICA
1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea,
Citrato y MIO
MIO Picadura
1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y despus de inocular), utilizando los
colores apropiados.
2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no
corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioqumicas,
especifique de que bacteria se trata.
PRCTICA # 6
OBJETIVO
Observar el efecto de algunos agentes fsicos y qumicos utilizados como germicidas para
el control de los microorganismos.
GENERALIDADES
Una variedad de agentes fsicos y qumicos son tiles para provocar la muerte bacteriana o
para prevenir su multiplicacin. Entre estos encontramos las radiaciones ultravioleta, la
temperatura, los agentes desinfectantes y otros.
RADIACIN ULTRAVIOLETA
La mayora de los microorganismos mueren bajo grandes dosis de radiacin
electromagntica, especialmente en la zona ultravioleta (UV), ondas ultrasnicas de muy
alta frecuencia y con pequeas dosis de radiacin ionizante, como los rayos gamma y rayos
catdicos. La muerte se presenta por los daos causados al DNA y la variacin en la
resistencia, normalmente reflejada en las diferentes facultades de las clulas para reparar
el DNA daado por la radiacin.
TEMPERATURA
Muchas clulas son sensibles al calor hmedo, despus de la exposicin por algunos
minutos a una temperatura ms elevada que su mxima de crecimiento. La proporcin de
clulas muertas depende del tiempo de exposicin y la temperatura.
La destruccin efectiva por temperaturas bajas rara vez ocurre. La causa del dao
celular durante el congelamiento no es muy conocida, pero se sabe que la concentracin
de solutos durante el congelamiento rompe las membranas y causa la lisis durante el
deshielo.
DESINFECTANTES
Los desinfectantes son generalmente agentes qumicos que matan a las bacterias y otros
microorganismos. Dentro de estos tenemos:
1. cidos y lcalis> Tanto los cidos y lcalis son muy bactericidas dado su grado de
disociacin. Entre estos se puede mencionar KOH, NaOH, HNO3 y H2SO4.
3. Compuestos orgnicos. Como los derivados del alquitrn de hulla, el cresol, tricresol,
alcanfor, creosota, cido fnico y el fenol que es el de uso ms comn. Actan
precipitando las protenas. Esta accin guarda relacin con la destruccin de la estructura
de la membrana y sus funciones.
a) compuestos aninicos como las sales sdicas y potsicas de cidos grasos de peso
molecular elevado sulfatos de alquilo y los jabones.
ACCIN OLIGODINMICA
Accin oligodinmica es la propiedad antibacteriana que presentan ciertos metales
pesados en cantidades de partes por milln (ppm), lo cual se debe a la formacin de sales
pobremente disociables con los grupos sulfhidrilos de las protenas.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
El efecto de la temperatura en la eliminacin de bacterias se ilustrar con un ejercicio en el
cual se calentarn los tubos con una suspensin de la bacteria a estudiar por diferentes
tiempos, evaluando despus el efecto por conteo de clulas vivas.
MATERIAL Y EQUIPO
Asa bacteriolgica
2 mecheros Bunsen
Tela de asbesto
3 pipetas de 5 ml estriles
Cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli (24 hrs incubacin), Bacillis subtilis (48
hrs de incubacin).
TCNICA
1. Prepare una suspensin ligera de cada bacteria (con la misma turbidez todas).
2. Deposite 1 ml de cada suspensin en 5 tubos para cada bacteria, los cuales irn
marcados con el tiempo de calentamiento (sin calentamiento, 5, 10, 15 y 20 minutos
respectivamente).
3. Caliente los tubos en un bao de agua de ebullicin constante por los tiempos
indicados 5, 10, 15 y 20 minutos y deje un tubo de cada bacteria sin calentar.
4. Despus del calentamiento siembre con el asa calibrada una asada de cada suspensin
en las cajas marcadas para cada bacteria con el tiempo de exposicin (5 cajas para
cada bacteria).
5. Incube por 24 horas y cuente cuantas colonias crecen en cada placa para poder
estimar el efecto del tiempo de exposicin en cada caso.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
1. Elabore una curva con el nmero de bacterias por ml (y) vs el tiempo de exposicin (x).
2. Concluya cual es el tiempo mnimo de exposicin para eliminar al 50% de cada una de
las bacterias estudiadas.
Para demostrar el efecto de los metales sobre los microorganismos se utilizarn soluciones
de los compuestos en cuestin que se aplicaran sobre el medio para que se difundan.
Midiendo posteriormente el halo de inhibicin producido por cada una.
MATERIAL Y EQUIPO
Asa bacteriolgica
Mechero Bunsen
Cajas Petri con discos de papel filtro impregnados con las siguientes soluciones:
- Cloro 6%
- Fenol al 5%
- Benzal
1. Inocular con cada cepa un tubo de agar nutritivo fundido y enfriado alrededor de 45 por
separado.
2. Verter en una caja Petri estril y dejar solidificar sobre una superficie nivelada.
3. Colocar un disco impregnado con cada solucin en forma equidistante sobre las placas.
PRESENTACION DE RESULTADOS
OBJETIVO
GENERALIDADES
MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
1 cubreobjetos
1 tubo de ensaye de 13 X 100 con tapn de rosca con solucin salina estril
1 placa agar nutritivo
1 placa agar EMB
1 placa agar sal y manitol
1 placa agar Mac Conkey
Hisopos estriles
Puente de tincin
Cristal violeta
Yodo de Gram o lugol
Etanol al 95% o alcohol acetona
Safranina
Aceite de inmersin
Mechero
Microscopios
TCNICA
1. Tomar una muestra de alrededor de los dientes incluyendo las encas con un hisopo
estril, sembrar en las placas de agar nutritivo, EMB, MacConkey y sal y manitol. Incubar a
36 C por 24 horas. Anotar resultados y observaciones.
2. Con el otro hisopo tomar nuevamente muestra y realizar 2 extendidos e introducir el
hisopo en el tubo con sol. salina estril.
3. Los extendidos secarlos con ayuda del mechero y proceder a teir como indica la tcnica
de Gram.
4. Observar al microscopio con objetivo de 100 X.
5. Tomar una muestra con el hisopo en solucin salina, colocarla en el portaobjetos y
cubrir. Observar en 40 X.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
1. Investigar los microorganismos de la microbiota bucal, as como las caractersticas
morfolgicas en cada medio y microscpicas tintoreales.
2. Anotar resultados y observaciones de las extensiones y de crecimiento en las placas de
agar, obtenidas en la prctica.
3. Anotar los gneros que crecieron en cada placa.