Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia

Universidad Nacional de Tucumn

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

N 9

Pruebas bsicas y especiales para el

estudio de la coagulacin sangunea
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MECANISMO DE LA HEMOSTASIA NORMAL

INTRODUCCIN
Hemostasia es el conjunto de mecanismos encargados de mantener el flujo
sanguneo constante, evitando la produccin de hemorragias excesivas y
limitando la magnitud del cogulo formado. En ella participan distintos
sistemas o factores:
Sistema de coagulacin.
Sistema fibrinoltico.
Endotelio vascular.
Plaquetas.
Factores reolgicos (se refieren a la velocidad, viscosidad y caractersticas
del flujo sanguneo).
Las alteraciones en alguno de ellos son las que provocan los cuadros
hemorrgicos y/o las trombosis localizadas o generalizadas.
El cogulo hemosttico perfecto se forma especficamente en el lugar de la
injuria y lleva a que la pared vascular detenga su sangrado, pero tambin
implica que dicha activacin del sistema de coagulacin no se extienda al resto
del rbol vascular. El cogulo formado constituye un marco delimitador para la
reparacin del tejido daado y dicho tapn hemosttico es lo suficientemente
lbil para ser removido durante la remodelacin.
Cuando ocurre una injuria vascular se produce una vasoconstriccin refleja,
con exposicin de la matriz subendotelial y reduccin del flujo sanguneo. El
punto de partida lo constituye la unin de una protena soluble, el factor von
Willebrand (FvW), a la matriz subendotelial. El mismo, una vez pegado al
subendotelio, expone mltiples sitios intrnsecos de unin para la glicoprotena
Ib especfica de la membrana plaquetaria (GPIb).
La unin FvW al complejo GPIb-V-IX estimula a la plaqueta, la cual expone la
glicoprotena IIb-IIIa (GPIIb-IIIa) que une ms FvW y fibringeno.
Los grnulos densos de las plaquetas liberan ADP, ATP, serotonina, calcio y
por activacin de la cascada del cido araquidnico generan tromboxano A2,
potente agregante plaquetario y vasoconstrictor. El calcio es esencial en la
activacin de las protenas solubles del sistema de coagulacin.
Los grnulos alfa de las plaquetas liberan fibringeno, factor plaquetario 4,
trombospondina, fibronectina, FvW, FV, FVIII, FXI y factores de crecimiento.
En la plaqueta activada se produce una redistribucin de los fosfolpidos de la
membrana celular (fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina) quedando expuestos
sobre la superficie externa. De esta manera se crea una superficie
procoagulante que permite la interaccin de las plaquetas con los factores de
la coagulacin, sirviendo de base esencial para el inicio de la coagulacin.
La coagulacin se desencadena rpidamente cuando el factor tisular (FT: un
complejo protena-fosfolpido) es expuesto al FVII en presencia de calcio. El
FT est normalmente presente en las clulas extravasculares que circundan
los vasos sanguneos y en otros tejidos. Tambin est presente en leucocitos
circulantes y monocitos, de forma encriptada, de manera que se expone
cuando hay activacin de la clula que lo contiene.
MECANISMO DE COAGULACIN
El proceso de coagulacin se describi 1964 como un modelo que se
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desarrolla en forma de cascada. Si bien con fines didcticos se describen dos

mecanismos de activacin, uno intrnseco y otro extrnseco, entre ambos
existen interconexiones y sistemas de retroalimentacin (positivos y negativos)
que lo hace un mecanismo complejo y nico. Este modelo de cascada se basa
en una serie de reacciones proteolticas que actan como amplificadores de la
reaccin.
El sistema intrnseco est compuesto por factores que se encuentran todos en
circulacin, mientras que el sistema extrnseco incluye el FT que, en
condiciones normales, no se encuentra en circulacin.
El sistema de coagulacin est constitudo por protenas plasmticas llamadas
factores de coagulacin, que circulan en la sangre en forma inactiva como
zimgenos o proenzimas. Los mismos se activan secuencialmente, al sufrir un
clivaje enzimtico, dando lugar a la formacin de enzimas activas que
culminan con la formacin de trombina, que al actuar sobre el fibringeno
forma la malla de fibrina.
Hasta ahora han sido reconocidos como factores de coagulacin diez
glicoprotenas plasmticas, que se designaron con nmeros romanos por el
Comit Internacional de Nomenclatura de Factores de la Coagulacin, pero
adems existen otras protenas que tambin intervienen en la coagulacin y
an no han sido designadas numricamente (ver Tabla N 1).
MECANIMO EXTRNSECO
El mecanismo extrnseco se inicia cuando la sangre entra en contacto con
elementos tisulares. El FT se combina en forma estequiomtrica con el FVII, en
presencia de calcio, y forma un complejo enzimtico capaz de activar al FVII
en FVIIa, que es ms activo que el FVII nativo (retroalimentacin positiva), y a
los factores X y IX formando FXa y FIXa.

MECANISMO INTRNSECO
En el modelo celular de la coagulacin se observ que en la llamada fase de
contacto slo interviene el FXI ya que el FXII y precalicrenas no
desempean un papel importante en la coagulacin.
El FXIa acta sobre el FIX en una reaccin dependiente del calcio formando el
FIXa, el cual forma un complejo enzimtico con los fosfolpidos (factor
plaquetario 3), calcio y FVIII (complejo tenasa) para transformar el FX en FXa.
A partir de all se inicia la va final comn.

VIA FINAL COMN

Se inicia con la activacin del FX por el mecanismo intrnseco o extrnseco. In
vitro puede ser activado por otras enzimas proteolticas como tripsina o veneno
de vbora de Russell en presencia o no de fosfolpidos. El FXa forma el
complejo protrombinasa con fosfolpidos, calcio y FV, el cual acta sobre el
FII para generar trombina.
La trombina es la enzima coagulante por excelencia. Acta sobre el
fibringeno para formar la malla de fibrina, sobre los cofactores V y VIII
aumentando su actividad, y sobre el FXIII, estabilizador de la fibrina. Participa
adems en la adhesividad y agregacin plaquetaria.
El fibringeno es un dmero constitudo por tres pares de cadenas: 2A, 2B y
2. A y B son los fibrinopptidos con densidad de carga negativa que producen
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repulsin entre las molculas de fibringeno. La trombina libera el

fibrinopptido A de la cadena alfa y luego el B de la cadena beta. As se
forman los monmeros que se polimerizan mediante uniones tipo hidrgeno
formando un gel soluble, la fibrina.
Los polmeros adquieren mayor cohesin y estabilidad cuando acta sobre
ellos el FXIII, previamente activado por trombina, introduciendo enlaces
covalentes entre los monmeros de fibrina.

TABLA N 1. Componentes del sistema de coagulacin

Nivel Vida
FACTOR SINONIMO PROTEINA FUNCION Cc. Plasmtica Hemostt Media
(g/mL) ico (%) (horas)

I Fibringeno Estructural Forma fibrina al sufrir un 300 50 72-120

clivaje enzimtico

II Protrombina Serinoproteasa vitamina K Activa a los factores 100 40 67-106

dependiente I,V,VIII,XIII,Prot.C y
plaquetas

V Proacelerina Unin Ayuda al FXa en la 10 10-15 12-15

activacin del FII

VII Proconvertina Serinoproteasa vitamina K Activa FIX y FX 0.1 10 4-6

dependiente

VIII Antihemoflico A Unin Ayuda al FIXa en la 0.1 25 10-16

activacin del FX

IX Factor Christmas o Serinoproteasa vitamina K Activa al FX 5 25-20 18-40

antihemoflico B dependiente

X Factor Stuart-Prower Serinoproteasa vitamina K Activa al FII 8 20 20-60

dependiente

XI Antecedente Serinoproteasa Activa al FIX 5 15-20 48-80

tromboplstico

XII Factor Hageman Serinoproteasa Activa al FXI y el sistema 30 50-70

de las quininas

XIII Estabilizador de la Transglutaminasa o Entrecruza la fibrina con 10 10 100-200

fibrina transpeptidasa uniones covalentes

FACTOR VON Factor VIII antgeno Unin Une plaquetas y FVIII 10 22-40
WILLEBRAND relacionado

PRECALICREINA Factor Fletcher Serinoproteasa Activa al FXII y libera 50

bradiquinina de los QAPM

FACTOR Factor tisular Unin Se une al FVII formando 0

TISULAR un complejo que activa a
FX y FIX

QUININOGENOS Factor Fitzgerald , Unin Une la precalicrena y el 70

DE ALTO PESO Williams o Flaujeac FXI al endotelio daado
MOLECULAR

MODELO CELULAR DE LA COAGULACIN

El concepto actual de la activacin de la coagulacin involucra la cascada de

coagulacin como mecanismo que se lleva a cabo en superficies celulares
especficas; este modelo refleja ms eficientemente el proceso de coagulacin
in vivo y la regulacin del sistema. El modelo celular de coagulacin requiere
de la participacin de dos tipos celulares: clulas que expresan factor tisular y
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las plaquetas. La clave en la regulacin del proceso de coagulacin es

mantener los dos tipos celulares separados hasta que una injuria requiera la
activacin de la coagulacin.
El mecanismo hemosttico se desarrolla en tres etapas: iniciacin,
amplificacin y propagacin.
Fase de Iniciacin: La etapa de iniciacin de la coagulacin se localiza en
clulas que expresan FT en la circulacin sangunea. Dichas clulas
normalmente se encuentran fuera de la vasculatura y la injuria expone el FT.
Inmediatamente se forma el complejo FT-VIIa el cual activa pequeas
cantidades de FIX y FX. El factor Xa se asocia con el Va para formar el
complejo protrombinasa en las clulas que expresan el FT, lo cual genera
pequeas cantidades de trombina. El FXa unido a las clulas est
relativamente protegido de la inactivacin por inhibidores de proteasas;
cuando el FXa se libera de las superficies es rpidamente inhibido por el
Inhibidor del va del Factor Tisular (TFPI) o por Antitrombina. La presencia de
inhibidores circulantes localiza al FXa en el lugar de la lesin. Por el contrario,
el FIXa no es neutralizado por los inhibidores (la AT lo inhibe muy lentamente)
y se puede desplazar a las plaquetas cercanas y otras clulas, llevando la
activacin de la coagulacin de la clula endotelial a otras clulas
(principalmente plaquetas).
Fase de Amplificacin: Como consecuencia de la iniciacin se forman
pequeas cantidades de trombina que cumplirn al menos tres funciones: 1-
activar las plaquetas; 2- promover la activacin de los cofactores FVIII y FV en
las superficies de las plaquetas; 3- activar tambin al FXI en la superficie
plaquetaria. Al promediar el proceso de amplificacin se generaron las
condiciones necesarias para que en la propagacin de produzcan grandes
cantidades de trombina.
Fase de Propagacin: La finalidad de la fase de propagacin es generar
grandes cantidades de trombina de modo de llegar a la formacin del cogulo
de fibrina. La propagacin se lleva a cabo sobre la superficie de las plaquetas
activadas. En esta fase se incluyen tres conceptos: 1- El FIXa formado durante
la iniciacin se une al FVIIIa en la superficie plaquetaria formando el complejo
tenasa; 2- El factor XIa unido a plaqueta provee mayor cantidad de FIXa y 3-
Mediante el complejo FIXa/FVIIIa en la plaqueta se debe formar nuevo FXa ya
que el generado en la clula que presenta FT no se puede desplazar a las
plaquetas. De esta manera se forma el complejo protrombinasa (FXa/FVa) que
es generador de grandes cantidades de trombina.

INTERRELACIONES ENTRE MECANISMO INTRNSECO Y EXTRNSECO

El FIX es activado por el FVIIa
El FVII es activado por el FIXa , el FXIa
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GRAFICO N 1. Activacin de la coagulacin: a) va extrnseca in vitro (modelo

de cascada) y b) in vivo (modelo celular)

GRAFICO N 2. Activacin de la coagulacin: a) va intrnseca in vitro (modelo de

cascada a) e b) in vivo (modelo celular)

REACTIVOS DE USO GENERAL

1) Soluciones
1-a) Solucin fisiolgica (cloruro de sodio 0,15 M)
Cloruro de sodio ................... 9g
Agua destilada ...................... 1000 mL
1-b) Solucin sulfocrmica
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Bicromato de potasio ................. 100 g

Acido sulfrico .......................... 500 mL
Agua destilada ...........................1000 mL
Disolver el bicromato de potasio en agua y agregar lentamente el cido
sulfrico en pequeos volmenes, enfriando la solucin. Llevar a volumen.
2) Anticoagulantes o descalcificantes
2-a) Citrato de sodio 0.11 M
Citrato de sodio (2 H 20) ........ 31,3 g
Agua destilada ....................csp. 1000 mL
2-b) Oxalato de sodio 0,1 M
Oxalato de sodio .................. 13,4 g
Agua destilada ..................csp. 1000 mL
2-c) Cloruro de calcio 0,1 M (Solucin Madre)
Cloruro de calcio anhidro ......... 11,1 g
Agua destilada ...................csp. 1000 mL
2-d) Cloruro de calcio 0,025 M (Solucin de trabajo)
Se preparan a partir de la solucin madre realizando una dilucin en
agua destilada.
3) Soluciones tampones
Tampn de Owren modificado pH 7,35
Tampn de Owren pH 7,35 .............. 200 mL
Citrato de sodio 0,025 M .................. 200 mL

LIMPIEZA Y ACONDICIONAMIENTO DEL MATERIAL

Para la toma de las muestras y la realizacin de ciertas pruebas es importante

el empleo de tubos y pipetas de plstico, a fin de evitar la activacin por
contacto. En cambio, para la realizacin de las pruebas que miden tiempos de
coagulacin se utilizan tubos de vidrio, aprovechando en ciertos casos (TTPA,
por ejemplo) la propiedad de este material de activar la va intrnseca de la
coagulacin. Se prefiere el uso de tubos de vidrio a base de borosilicatos, de
11 x 74 mm. Se descartarn aquellos tubos que presenten rayaduras, ya que
afectarn los tiempos de coagulacin.
Es imprescindible la limpieza perfecta del material. De ordinario se realiza del
siguiente modo:
Lavado del material con agua y detergente no inico, cepillar
enrgicamente.
Enjuagar con agua destilada (repetir este paso varias veces).
Secar en estufa.
Ocasionalmente puede colocarse el material de vidrio en mezcla sulfocrmica
para eliminar restos de reactivos y proceder a una limpieza ms profunda an.
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CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE

HEMOSTASIA

Para obtener un buen resultado de laboratorio es imprescindible que se

cumplan correctamente con todas las etapas de una buena metodologa
diagnstica: Preanaltica, Analtica y Postanaltica.
Etapa Preanaltica: Las variables preanalticas son todos aquellos factores
que afectan a la calidad de la muestra (identificacin, condiciones previas del
paciente, correcta toma, conservacin y transporte de la muestra) hasta el
momento de su procesamiento. A todo paciente que consulta por una
alteracin de la hemostasia se le debe realizar una correcta anamnesis. La
misma debe contener datos como edad, ocupacin, ingesta de medicamentos,
sangrados por mucosas (gingivorragias, epistaxis, melena, hematuria,
menstruaciones), operaciones previas, embarazos, abortos, enfermedades
metablicas como diabetes, insuficiencia renal, dislipemias y antecedentes
familiares.
Para la toma de muestra el paciente debe concurrir con 8-12 hs de ayuno
previo y con escasa actividad fsica.
Dentro de la etapa preanaltica se considera el perfecto estado y la adecuada
seleccin de los materiales a utilizar para la extraccin, incluyendo el
anticoagulante y la limpieza del material.
La calidad del examen de coagulacin depende muy estrechamente de la
toma de muestra.
Etapa Analtica: Involucra la realizacin de la tcnica solicitada, la cual debe
estar perfectamente estandarizada. Se deben procesar los controles de
calidad correspondientes.
El trmino control de calidad describe el conjunto de medidas que se realizan
para asegurar la veracidad del dato obtenido en el laboratorio, es decir la
calidad analtica.
El programa de administracin de calidad debe comprender:
1- Mantenimiento del equipamiento (coagulmetros).
2- Calibracin de pipetas automticas y sistemas dilutores.
3- Realizar diariamente el procesamiento del control de calidad interno.
4- Participar de un control de calidad externo.
5- Evaluar la veracidad del dato.
Etapa Postanaltica: Comprende la validacin y la emisin de los resultados.
La emisin de los resultados debe ser rpida y clara; los informes deben incluir
la tcnica utilizada, los valores de referencia para la tcnica y la firma del
profesional responsable del sector. Es responsabilidad del personal del
laboratorio validar clnicamente los resultados, para lo cual se requiere
combinar los datos clnicos con los hallazgos del laboratorio para investigar si
estos hallazgos son causa o efecto de la patognesis de la enfermedad.

TOMA DE MUESTRA
Consideraciones
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Para la extraccin de sangre se debe utilizar jeringas plsticas y agujas

descartables calibre 19 o 20 G. Los tubos para recoger la muestra deben ser
de plstico.
La puncin debe ser precisa y rpida, logrando una buena canalizacin.
La velocidad de salida de la sangre debe ser semejante a la del flujo
sanguneo. Evitar la entrada de aire y la formacin de burbujas, el stasis y la
contaminacin con tromboplastina tisular (evitar el uso prolongado de
torniquete). Ante una extraccin dificultosa se debe proceder al cambio de
jeringa luego de extraer 2-3 mL de sangre.
Transvase: retirar la aguja de la jeringa y verter la sangre por la pared de
los tubos suavemente, a igual velocidad que la extraccin, hasta la marca
prevista. Mezclar inmediatamente por inversin suave varias veces.
Anticoagulante: la proporcin de anticoagulante habitual es 1 parte para 9
partes de sangre. Tener presente que se deber ajustar la relacin
anticoagulante/sangre en caso de hematocritos superiores a 55% (Figura N1
y Tabla N 2).
Centrifugacin: Inmediata (antes de los 20 minutos de realizada la
extraccin). Para obtener:
Plasma rico en plaquetas (PRP): centrifugar a 900 r.p.m. durante 5 minutos.
Plasma pobre en plaquetas (PPP): se obtiene por doble centrifugacin
(primero de sangre entera y luego el plasma citratado y separado) a 3.000
r.p.m. durante 10 minutos cada vez.
Transvase: transferir el plasma inmediatamente a tubos plsticos con
pipetas plsticas. En caso de no poder realizar las pruebas dentro de las 2
horas posteriores a la extraccin, el plasma se mantendr a 4C. Si las
muestras no se procesan en el da, guardar el plasma en freezer (-20C).

FIGURA N1: La relacin del anticoagulante con el volumen plasmtico depende del
hematocrito

Alto
 9

TABLA N 2. Relacin anticoagulante/sangre segn el hematocrito

Volumen de anticoagulante (mL) para

HEMATOCRITO un volumen total de sangre de
(%)

5 mL 10 mL
30 0,62 1,20
35 0,57 1,13
40 0,54 1,07
45 0,50 1,00
50 0,46 0,94
55 0,43 0,87
60 0,39 0,80
65 0,35 0,74
70 0,32 0,66
75 0,28 0,60
80 0,25 0,53

PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA COAGULACIN

SANGUNEA
ORIENTACIN POR EL LABORATORIO DE LOS TRASTORNOS DE LA
HEMOSTASIA

La realizacin e interpretacin de las pruebas de hemostasia deben siempre

subordinarse a los hallazgos del examen clnico. Las pruebas pueden dividirse
en:

a) Pruebas globales de coagulacin: se investigan, en conjunto, los

diferentes componentes del mecanismo hemosttico (vascular, plaquetario, pro
coagulante o fibrinoltico) o vas de activacin de algunos de estos
componentes. Sus resultados indican que hay una alteracin pero sin
identificar los factores implicados en ella.
Tiempo de protrombina: (TP): va extrnseca.
Tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT): va intrnseca.
Tiempo de trombina (TT): etapa final de la coagulacin.
Tiempo de Sangra (TS): cantidad y calidad de plaquetas, fibringeno y
subendotelio.
Retraccin del cogulo (RC): cantidad y calidad de plaquetas.
Lisis de sangre entera: evala activadores e inhibidores del sistema
fibrinoltico.
Lisis de euglobulinas: evala los activadores del sistema fibrinoltico.
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Tromboelastografa: brinda una visin global del proceso de

coagulacin desde la formacin inicial de trombina hasta el proceso de
fibrinolisis incluyendo las plaquetas
b) Pruebas especficas: se analizan en forma selectiva los factores o
elementos que intervienen o forman parte del compartimiento que se hall
anormal con la realizacin de las pruebas globales.

1) Pruebas para el estudio de la va intrnseca de la coagulacin

Tiempo de coagulacin
Tiempo de coagulacin activado*
Prueba de generacin de tromboplastina*
Tiempo de tromboplastina parcial*
Tiempo de tromboplastina parcial activado
Consumo de protrombina*
Tromboelastografa*

2) Prueba para el estudio de la va extrnseca de la coagulacin

Tiempo de protrombina en una etapa o tiempo de Quick

3) Pruebas para el estudio de la transformacin del fibringeno en

fibrina
Tiempo de trombina
Tiempo de trombina-calcio*
Tiempo de reptilasa

4) Prueba para el estudio de la va final comn

Tiempo de Stypven o tiempo del veneno de vbora de Russell

*Las tcnicas de estas pruebas pueden consultarse en la bibliografa

TCNICAS

TIEMPO DE COAGULACIN (Modificado de Lee-White)

Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular la sangre in vitro, al ser
extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular.
Procedimiento: Obtener, mediante puncin venosa 3,5 mL de sangre.
Desconectar la aguja y vaciar 1,0 mL de sangre en cada uno de 3 tubos de
hemlisis, previamente colocados en un bao a 37 C. Poner en marcha el
cronmetro al aadir la sangre al primer tubo (al llegar el tercer tubo no deben
haber transcurrido ms de 5 segundos). Inclinar ligeramente el primer tubo e
investigar el deslizamiento de sangre por las paredes del tubo. Repetir la
operacin cada 30 segundos hasta que la sangre coagule (deja de escurrir por
 11

las paredes del tubo). Seguidamente observar el segundo tubo y se anota

como definitivo el tiempo obtenido en el tercer tubo.
Resultados
Valores de referencia: 5-15 minutos
Observaciones
Este tiempo de coagulacin in vitro reflejar mejor la eficacia del sistema in
vivo, cuanto menos se modifique o manipule esta sangre, pero al carecer de
sensibilidad slo se modifica ante deficiencias severas de factores de la
coagulacin. Entre los factores de orden tcnico que modifican esta prueba
podemos mencionar:
1) Contaminacin con lquidos tisulares (tromboplsticos).
2) Formacin de espuma.
3) Inadecuada limpieza del material.
4) Dimetro de los tubos (se recomienda usar tubos de 11 mm de dimetro)
5) Los movimientos de los tubos.
6) La temperatura.

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (TTPA)

Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular el plasma pobre en
plaquetas en presencia de un activador de la fase de contacto (caoln, celite,
cido elgico), un substituto plaquetario (cefalina o inositina) e iones calcio. El
agregado de activadores (sustancia inerte con carga negativa), tiene por objeto
uniformar la activacin por contacto de todos los plasmas. El substituto
plaquetario, al ser aportado como reactivo, se encuentra disponible en su
totalidad en el momento de la recalcificacin plasmtica.
Cuando el activador es el caoln la prueba se denomina tiempo de
tromboplastina parcial activado con caoln (TTPK).
Esta prueba estudia globalmente calicrenas, quiningenos de alto peso
molecular, factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I. La sensibilidad de la tcnica no
es la misma para todos los factores, en orden decreciente tenemos: FVIII, FIX,
XI, XII y para fibringeno cuando su concentracin es inferior a 100 mg %
Procedimiento:
En un tubo de Kahn pipetear:
- 100 L del reactivo cefalina-caoln
- 100 L del PPP (muestra)
Incubar el tubo en bao a 37C y al cabo de 3 minutos adicionar 100 L de
cloruro de calcio 0,025 M. Simultneamente poner en marcha un cronmetro. A
los 30 segundos observar la formacin del cogulo. En el momento de su
aparicin, detener el cronmetro y registrar la lectura correspondiente. Esta
determinacin se efecta por duplicado y se calcula el promedio de ambas
lecturas.
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Resultados
Valores de referencia: 35-45 segundos.
Cada laboratorio debe establecer los valores de referencia de acuerdo al
reactivo y a la tcnica empleada (manual o automatizada).
El TTPa se usa para evaluar la va intrnseca de la coagulacin, y por lo tanto
se encontrar prolongado en:
Dficit congnito de los factores XII, XI, IX, VIII, X, II y V
Alteracin cualitativa de algn factor
Dficit adquirido de factores (hepatopata, antibitico-terapia,
alimentacin parenteral, etc)
Presencia de inhibidores (especficos o de interferencia)
Pacientes heparinizados
El acortamiento del TTPA puede ser tomado como un indicio de
hipercoagulabilidad.

MONITOREO DE LA ANTICOAGULACION CON HEPARINA

Introduccin
Las complicaciones tromboemblicas arteriales y venosas son susceptibles de
teraputicas preventivas y/o resolutivas por medio de medicamentos que
afectan alguno de los mecanismos normales de la hemostasia. Los
medicamentos que afectan la cintica de la coagulacin directa o
indirectamente son las heparinas y los anticoagulantes orales (dicumarnicos).
La heparina es el anticoagulante ms usado por va parenteral en medicina
clnica humana. Ejerce su efecto unindose a ciertas protenas plasmticas
llamadas serpinas, de las cuales la Antitrombina (AT) es la nica que expone
su sitio activo, normalmente inaccesible, por unin a heparina. El papel
fisiolgico de la AT es regular las serinoproteasas de la coagulacin,
incluyendo trombina y los factores XIIa, XIa, Xa y IXa. La accin de la heparina
consiste en unirse a la AT provocando cambios conformacionales en sta, que
hacen ms asequible su sitio neutralizante y por lo tanto acelerando
enormemente su capacidad inhibitoria sobre la trombina y FXa.
Las heparinas son glicosaminoglicanos sulfatados con fuerte carga negativa,
extrados de pulmn o mucosa intestinal de origen bovino o porcino, que se
presentan en forma de polmeros. Su efecto sobre la trombina y FXa vara de
acuerdo al peso molecular de las mismas.
En general, accin anticoagulante y antitrombtica no son trminos sinnimos,
ya que la accin anticoagulante puede ser observada in vitro; la sangre en
general es poco coagulable y los tiempos de coagulacin suelen estar
prolongados, siendo un proceso esencialmente plasmtico; mientras que el
efecto antitrombtico es un fenmeno primordialmente observable in vivo, los
tiempos de coagulacin podran ser normales an con buen efecto
antitrombtico, siendo un proceso multicelular en el que participan
componentes plasmticos junto a componentes celulares como endotelio,
plaquetas, eritrocitos y leucocitos. Las heparinas de bajo peso molecular (PM
entre 4.000 y 6.500) tienen reducida su capacidad antitrombnica (anti-IIa)
medida por el alargamiento del TTPA mientras que conservan su capacidad
antitrombtica medido por su accin inhibitoria sobre el FXa. En cambio las
heparinas no fraccionadas (HNF), de alto peso molecular o convencionales
tienen tanto efecto anti-IIa como efecto anti-Xa.
 13

Control de la teraputica con heparina

Se puede realizar por varios mtodos:
1. Tiempo de tromboplastina parcial activado
2. Tiempo de trombina
3. Determinacin del nivel de heparinemia
La prueba de eleccin ser aquella que tenga precisin, reproducibilidad y se
procese en un tiempo corto. El TTPA tiene la ventaja de poder ser realizado en
pocos minutos y su reproducibilidad dentro de los rangos teraputicos es
mayor que con el tiempo de coagulacin, que ha sido el mtodo ms usado en
el control. Si bien el tiempo de trombina es un mtodo rpido y reproducible,
tiene la desventaja de que el reactivo de trombina es inestable an conservado
a bajas temperaturas.
En el monitoreo de la terapia con HNF empleando el TTPA, se considera que
el tratamiento es adecuado cuando el APTT del paciente prolonga entre 1,5 a
2,5 veces los valores del APTT basal (esta relacin se denomina razn)

razn = TTPA paciente

TTPA basal

Debe establecerse el rango teraputico del sistema de TTPa usado (de

acuerdo al reactivo y sistema de deteccin), ya que para un mismo valor de
heparinemia el rango vara segn el sistema de TTPA empleado.
En la prctica lo que se hace es evaluar la respuesta del sistema de TTPA en
plasma de pacientes con diferentes dosis de HNF y adoptar la razn (rango
teraputico) que corresponda a una concentracin de heparina en sangre de
0,2 a 0,4 UI/mL. Por lo tanto, se debe ajustar la dosis de heparina de manera
de mantener el TTPA entre 1,5 y 2,5 del valor basal.

PRUEBA DE CORRECCIN CON PLASMA NORMAL

Un TTPA prolongado se debe corregir con plasma normal. La prueba consiste
en determinar el valor de TTPA en una mezcla constituida por 1 volumen de
plasma del paciente y 1 volumen de plasma normal (relacin 1/1). De esta
manera se podr evaluar si la alteracin es debida a un dficit de factores o a
la presencia de inhibidores.
P (paciente): PPP paciente
TTPA (M) - TTPA (N) N (normal): PPP normal
ndice de Rossner (IR) =
TTPA (P) M (mezcla): P+N

Interpretacin
IR < 0,1 Corrige. Por lo tanto hay dficit de factores de la va intrnseca.
IR > 0,1 No corrige. Hay un efecto inhibitorio.
Este valor tambin debe ser establecido en cada laboratorio. En nuestro
sistema se considera que corrige cuando es inferior a 0,1.

DETERMINACIN DEL NIVEL DE HEPARINEMIA

Se puede valorar la accin de la heparina de bajo peso molecular mediante
metodologa que mide directamente su capacidad de potenciar la inhibicin del
 14

FXa por la AT, para ello se desarrollaron mtodos coagulables y mtodos

amidolticos.

TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA EN UNA ETAPA

Fundamento: Es la medida del tiempo de coagulacin de un plasma citratado
en presencia de un exceso de tromboplastina tisular e calcio.
Esta prueba evala la eficiencia del mecanismo extrnseco de la coagulacin.
Es ms sensible a los defectos de los factores VII, X y V que a la deficiencia de
factor II. La presencia de heparina en concentraciones mayores a 150 g/mL,
niveles disminuidos de fibringeno (< 50 mg/mL) y productos de degradacin
de la fibrina por encima de 40 g/mL prolongan el valor del TP y modifican su
validez como prueba de screening de la va extrnseca del sistema de
coagulacin.
La sensibilidad de la prueba depende de la tromboplastina utilizada y las hay
de distintos orgenes (placenta, cerebro de conejo, recombinante). Las
tromboplastinas recombinantes desarrollan una cintica de activacin
demasiado rpida arrojando valores muy cortos de manera que no se detectan
variaciones muy pequeas en las actividades de los factores de coagulacin.
Procedimiento
Colocar un tubo de Kahn en bao a 37C y agregar los siguientes reactivos:
- 100 L del PPP normal o del paciente e incubar 1 minuto
- 200 L de tromboplastina clcica
Disparar el cronmetro cuando se adiciona el reactivo y registrar el tiempo de
coagulacin. La prueba se realiza por duplicado.
Resultados
El tiempo de protrombina (TP) puede ser expresado de diferentes maneras:
1. En segundos: los valores de referencia estn entre 11-14 segundos (con
tromboplastina humana o de conejo) segn la actividad de la
tromboplastina. Los duplicados no deben diferir en ms de 0,5 segundos
con tiempos cortos y no ms de 2-3 segundos en tiempos mayores de 30
segundos.
2. Concentracin o actividad protrombnica %: calculado en relacin a
curvas de referencia obtenidas por dilucin de plasmas normales en
solucin fisiolgica (ver ms adelante).
Valores de referencia: 70-120 %
Esta es la forma ms indicada de informar en los estudios de rutina.
3. Cociente o razn
TP del plasma del paciente
Razn=
TP promedio de los plasmas normales

Esta expresin ha mostrado ser la ms indicada para el control de la

anticoagulacin con antagonistas de la vitamina K (anticoagulantes orales), al
disminuir los efectos de las variaciones intra como interlaboratorio, si bien ello
no es suficiente para eliminar las variaciones debidas a la utilizacin de
reactivos de distinta sensibilidad.
 15

CURVA DE CALIBRACIN
Preparar diluciones de un pool de plasmas normales (mezcla en partes iguales
de plasma fresco citratado, de por lo menos 20 dadores normales) en solucin
fisiolgica, segn se indica en la tabla y determinar el TP para cada dilucin.
Realizar cada determinacin por duplicado. Al usar solucin fisiolgica como
diluyente, se produce una dilucin progresiva del fibringeno, que afecta la
formacin y visualizacin de la malla de fibrina. Por ello, se aconseja mover
lentamente el tubo para observar la formacin del cogulo, luego de
transcurrido un tiempo equivalente al tiempo de coagulacin de la dilucin
anterior.
TUBO SOLUCION POOL NORMAL CONCENTRACION
N FISIOLOGICA (mL) (mL) (%)
1 - 1 100
2 0,3 0,7 70
3 0,5 0,5 50
4 0,6 0,4 40
5 0,7 0,3 30
6 0,8 0,2 20
7 1,75 0,25 12,5

Graficar en papel milimetrado el tiempo promedio de cada dilucin, expresado

en segundos, en funcin del porcentaje de actividad. Trazar la hiprbola
correspondiente. Cuando se grafican logaritmos, la curva se transforma en una
recta.
TIEMPO DE COAGULACIN (SEG)

ACTIVIDAD PROTROMBNICA (%)

Resultados
Se expresan en porcentaje de actividad en relacin a la mezcla de plasmas
normales, al cual se asigna por definicin 100% de actividad. Obtenido el
tiempo de coagulacin, extrapolar en la curva de calibracin e informar la
actividad del plasma analizado.
La curva se debe realizar para cada lote de tromboplastina, para cada aparato
y metodologa utilizada (una curva para el mtodo manual y una curva para
cada coagulmetro).
 16

Valores de referencia: 70-120 %

Cada laboratorio debe establecer su rango de referencia determinando el TP
en por lo menos 20 individuos sanos que incluyan mujeres y varones, con
edad entre 14-70 aos.
La prolongacin del TP puede deberse a:
Sntesis disminuida por alteraciones en la funcin heptica.
Alteraciones en el ciclo de la vitamina K (alteracin en la actividad
procoagulante pero con sntesis normal).
Deficiencia congnita de alguno de los factores.
Presencia de un inhibidor adquirido que interfiera en la va extrnseca.
Observaciones
Cuando el plasma se diluye en solucin fisiolgica, todos los factores estn
igualmente reducidos, en cambio, en los pacientes tan slo uno o algunos de
estos factores pueden estar disminuidos; por lo tanto el porcentaje global
obtenido no es reflejo proporcional del defecto presente.
La expresin del TP en porcentaje es til en los pacientes sin anticoagulacin
oral y es la ms indicada en los estudios de rutina.

PRUEBA DE CORRECCIN CON PLASMA NORMAL

Un TP prolongado se debe corregir con plasma normal, en una relacin 1/1,
para evaluar si la alteracin es debida a un dficit de factores o a la presencia
de inhibidores.
Si la prolongacin de la prueba es debida al dficit de uno o ms factores
intervinientes en el TP, el valor obtenido en el TP de la mezcla (TPM) tendr un
valor igual o superior al TP terico calculado. Es decir, la prueba CORRIGE
porque el plasma normal aporta el o los factores ausentes en el plasma del
paciente.
TPM TPterico calculado CORRIGE

Se considera que la prueba de correccin NO CORRIGE cuando la misma

exhibe tiempos prolongados, sugiriendo la presencia de un inhibidor.

TPM < TPterico calculado NO CORRIGE

El TP terico se calcula de la siguiente manera:

TPP + TPN
TP P : paciente
TPterico calculado =
TP N : normal
2
Ejemplo:
TPP = 30 %
TPN = 100%
TP terico calculado = 65 %
Si el TPM obtenido es mayor o igual a 65% significa que la prueba corrige
(dficit de factores), mientras que si el valor obtenido es menor de 65%
significa que no corrige (presencia de un inhibidor).
 17

ESTANDARIZACIN DEL CONTROL DE LA TERAPUTICA CON

ANTICOAGULANTES ORALES
CALIBRACIN DE LAS TROMBOPLASTINAS
Introduccin
El tratamiento y la profilaxis de los trastornos trombticos se realiza mediante
la administracin oral de medicamentos anticoagulantes a base de cumarinas.
Estos interfieren en la produccin heptica de los factores de coagulacin
vitamina K dependientes.
La dosis adecuada de estos medicamentos se ajusta segn el resultado del
TP, en la cual se usa como reactivo la tromboplastina. Las diversas
tromboplastinas preparadas varan en su reaccin (sensibilidad) al efecto
anticoagulante de las cumarinas.
El uso de tromboplastinas calibradas permite relacionar, en una escala comn,
los TP obtenidos con diferentes tromboplastinas, y por lo tanto comparar el
efecto anticoagulante independientemente de la tromboplastina utilizada. De
esta manera se puede normalizar el control del tratamiento con
anticoagulantes orales.
Cada lote de tromboplastina debe ser calibrado contra una preparacin estable
de referencia, la que debe ser similar y del mismo origen (especie) que el lote
a calibrar. Existen preparaciones de referencia de origen humano, bovino y de
conejo
Tromboplastinas de origen humano
Primera preparacin de referencia primaria de tromboplastina humana
combinada (67/40).
Segunda preparacin internacional de referencia primaria de
tromboplastina simple (BCT 253).
Primer reactivo nacional argentino de referencia de tromboplastina de
cerebro humano (RNAT).
Primer reactivo nacional argentino de trabajo de tromboplastina de cerebro
humano.
En 1983 el Comit de expertos de la OMS modific el tratamiento estadstico
del modelo de calibracin propuesto por Biggs y Denson. La sensibilidad de un
lote de tromboplastina en relacin a la referencia internacional, se expresa
mediante el Indice de Sensibilidad Internacional (ISI) y los resultados del
control de anticoagulacin, en Razn Internacional Normatizada (RIN).

CLCULO DEL NDICE INTERNACIONAL DE SENSIBILIDAD (ISI)

1. Se determina el TP a 20 dadores normales y a 60 pacientes bajo tratamiento
anticoagulante por va oral, con ms de 3 meses de tratamiento y sin otro
trastorno de la hemostasia, utilizando la tromboplastina a calibrar y la de
referencia .
2. Graficar en escala doble logartmica los TP obtenidos con la preparacin de
referencia en funcin de los TP obtenidos con el lote a calibrar. Establecer
la recta de ajuste por el mtodo de regresin ortogonal. La pendiente de la
recta se denomina ndice de sensibilidad del lote (b) en relacin a la
referencia empleada. Conociendo el ISI de la referencia (ISI r) se calcula el
ISI del lote :
 18

ISI = b x ISIr

El ISI de la tromboplastina de referencia es = 1

No deben utilizarse tromboplastinas que tengan ISI superior a 1,2

Resultados
Expresin del control de la teraputica anticoagulante oral en Razn
Internacional Normatizada (RIN)
Primero se calcula el cociente r:

r = TP del plasma del paciente anticoagulado

TP promedio de los plasmas normales

Luego, conociendo el ISI de la tromboplastina usada en la determinacin, se

calcula el RIN mediante la frmula:

RIN = rISI

TIEMPO DE TROMBINA
Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado
en presencia de una cantidad fija de trombina. Permite evaluar la
transformacin del fibringeno en fibrina, excluyendo la participacin del
Factor XIII. Concentraciones de PDF/pdf mayores a 40 g/mL prolongan el
Tiempo de Trombina (TT), la prueba es alterada por trazas de heparina pero
con valores mayores de 60 segundos no se correlaciona con la heparinemia.
Reactivos y Procedimiento
 19

Solucin de trombina de origen humano o bovino (100 U/mL). Se diluye en

el momento de ser utilizada de modo tal que la prueba realizada con plasma
normal d un valor de 18 a 20 segundos (aproximadamente 5 U/mL).
En un tubo de vidrio previamente incubado durante 1 minuto en un bao de
agua a 37 C colocar:
- 200 L de PPP (normal o problema)
Incubar durante 30 segundos.
- 100 L de la solucin de trombina diluda.
A los 5 seg aproximadamente comenzar a investigar la formacin de la red de
fibrina y registrar el tiempo de coagulacin. Realizar la prueba por duplicado.
Resultados
Valores de referencia: entre 15-20 segundos.
Se informa el tiempo de coagulacin de la muestra expresado en segundos,
junto con el tiempo de trombina del plasma normal (control).
Esta prueba se ve alterada por anomalas cualitativas (el fibringeno fetal
presenta prolongacin de esta prueba por su contenido en cido silico) y
cuantitativas del fibringeno; inhibidores adquiridos del tipo antitrombina,
productos de degradacin de la fibrina y/o fibringeno; presencia de
paraprotenas. Si bien esta prueba se prolonga por la presencia de heparina,
no se utiliza para monitorear el tratamiento con este anticoagulante por su gran
sensibilidad. Los pacientes con tratamientos crnicos con dicumarnicos
presentan un TT 4 a 6 segundos mayor que el de referencia.

TIEMPO DE REPTILASA
Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado
por accin de una enzima derivada del veneno de vbora Bothrops atrox, la
reptilasa. La enzima promueve la transformacin del fibringeno en fibrina, por
su accin proteoltica semejante a la de la trombina. La reptilasa escinde el
fibrinopptido A de la molcula del fibringeno y no es inhibida por la
antitrombina, por lo que el tratamiento con heparina no interfiere o afecta su
actividad.
Procedimiento
En un tubo de vidrio, incubado durante 1 minuto en un bao de agua a 37C,
colocar:
- 150 L de PPP (normal o problema)
Incubar durante 1 minuto.
- 50 L de reactivo (extracto purificado del veneno de Bothrops atrox)
Registrar el tiempo de coagulacin. La prueba debe realizarse por duplicado.
Resultados
Valores de referencia: 15-22 segundos
Se informan los tiempos de coagulacin expresados en segundos del plasma
problema y del plasma normal. Se considerar prolongado cuando la
diferencia con el control resulte mayor de 5 segundos.
Esta prueba es de utilidad para el estudio de las disfibrinogenemias congnitas
y adquiridas (hepatopatas, macroglobulinemias). El Tiempo de reptilasa no se
altera por la presencia de heparina ni de hirudina, pero s por niveles elevados
de PDF/pdf.
 20

TIEMPO DE STYPVEN
Fundamento: El reactivo de Stypven (veneno de vbora de Rusell) contiene un
complejo enzimtico con actividad sobre los factores de la coagulacin. Ha
sido demostrado que los componentes del veneno activan directamente el FX
a FXa sin la participacin de otros factores de la coagulacin. Esta propiedad
es empleada para diferenciar una deficiencia del FVII de una deficiencia de
FX.
El tiempo de coagulacin del plasma, desencadenado por el agregado del
reactivo de Stypven, es independiente de la concentracin del Factor VII en la
muestra.
Procedimiento
Colocar en bao de agua a 37 C un tubo de vidrio y agregar los siguientes
reactivos:
- 100 L de PPP (normal o problema)
- 100 L de Stypven-cefalina.
Incubar 30 segundos exactamente y adicionar
- 100 L de CaCl2
Registrar el tiempo de coagulacin de la muestra.
Resultados
Valores de referencia: 10-17 segundos
Se informan los tiempos de coagulacin expresados en segundos del plasma
problema y del plasma normal.

DETERMINACIN DE LOS FACTORES DE COAGULACIN

El estudio de los factores de coagulacin comprende:
1. La determinacin funcional.
2. La determinacin inmunolgica.
La determinacin funcional se puede realizar dosando la actividad coagulante
de los factores empleando para ello un sistema coagulable. Adems, se puede
determinar la actividad amidoltica, mediante la utilizacin de pptidos
sintticos (sustratos cromognicos), cuya secuencia de aminocidos es
semejante a los sustratos naturales.
En general, existe correlacin entre la actividad coagulante y la actividad
amidoltica, excepto en ciertas alteraciones moleculares. Cuando este defecto
implica cambios estructurales que alteran la interaccin con el sustrato natural,
aunque no afecten el sitio activo, ello disminuye la actividad coagulante y, en
cambio, no afectan la interaccin con el sustrato sinttico, mantenindose la
actividad amidoltica.
En la determinacin inmunolgica de la concentracin de protena plasmtica
completa, se pueden usar diversas tcnicas: radioinmunoensayo,
enzimoinmunoensayo, inmunodifusin radial, electroinmunodifusin,
inmunoturbidimetra, inmunonefelometra, etc. El empleo de estas tcnicas ha
demostrado que factores con niveles antignicos normales (cantidad de
protena) pueden tener alteraciones moleculares de causa congnita o
adquirida, que disminuyen su actividad biolgica en los sistemas de
coagulacin o sustratos cromognicos. Estas modificaciones cualitativas de los
factores pueden ser evidenciadas por: inmunoelectroforesis cruzada, tcnicas
cromatogrficas, anlisis de secuencia de aminocidos, y otras.
 21

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE LOS

FACTORES VIII, IX, XI Y XII, PRECALICRENA Y QAPM
Introduccin
La prueba de eleccin para el anlisis del mecanismo intrnseco, por su
sensibilidad para detectar alteraciones de los factores de esta va, es el tiempo
de tromboplastina parcial activado (TTPA).
La cuantificacin de la actividad coagulante de los factores que pertenecen
exclusivamente a la va intrnseca se realiza mediante tcnicas en una etapa,
en un sistema de coagulacin similar a la prueba del TTPA utilizando como
sustratos, plasmas carentes de la actividad procoagulante del factor a
determinar. El tiempo de coagulacin ser inversamente proporcional a la
concentracin plasmtica del factor limitante.
Los factores VIII y IX tambin pueden ser determinados por tcnicas en dos
etapas, cuyo fundamento es la prueba de generacin de tromboplastina.
Ambas tcnicas presentan ventajas y desventajas. Los mtodos en una etapa
son rpidos, sencillos y los resultados tienen buena correlacin con la clnica y
con la respuesta luego de la teraputica sustitutiva. Como inconveniente est
la necesidad de contar con plasma humano deficiente como sustrato. En la
actualidad existen plasmas sustratos comerciales, los cuales fueron obtenidos
por adsorcin inmunolgica del factor en cuestin a partir de plasmas
normales. Estos mtodos se ven afectados por la presencia de inhibidores.
Los mtodos en dos etapas no requieren el uso de plasmas deficientes, son
ms precisos a bajas concentraciones del factor a determinar y no son
sensibles a la presencia de inhibidores. En cambio, son laboriosos y lentos.

DETERMINACIN DE FACTOR VIII.c: MTODO EN UNA ETAPA

Fundamento: El mtodo usa un sistema de coagulacin semejante al TTPA,
que aporta todos los factores excepto el Factor VIII. El tiempo de coagulacin
de este sistema es inversamente proporcional a la actividad coagulante del
FVIII del plasma del paciente.
Reactivos
Plasma humano deficiente en FVIII (plasma humano hemoflico A severo:
FVIII menor de 1 U/dL, sin inhibidor)
Reactivo cefalina-caoln
CaCl2 0,025 M
PPP
Tampn de dilucin: Tampn de Owren modificado pH 7,35 (Ver reactivos
de uso general)
Procedimiento
- 100 L de reactivo para FVIII diludo 1/2 en tampn de Owren modificado
pH 7,35.
- 100 L de PPP diludo 1/2 en tampn de Owren modificado pH 7,35.
- 100 L de reactivo cefalina-caoln.
Incubar 2 minutos a 37 C.
- 100 L 0,1 mL de CaCl2 0,025 M.
Registrar el tiempo de coagulacin.
 22

Resultados: Los resultados se expresan en unidades por mililitro (U/mL) o en

%, deducidos de una curva de valoracin construda utilizando una mezcla de
plasmas normales (estndar de trabajo) de actividad conocida (0.1 U/mL o
100%).
Curva de calibracin

DILUCIN DEL PLASMA %

DE REFERENCIA
1/2 100
1/4 50
1/8 25
1/20 10
1/40 5
1/80 1

Con cada una de estas diluciones se realiza el procedimiento antes explicado,

de tal manera que para cada concentracin se obtendr un tiempo en
segundos. La curva se construye en papel doble logartmico, anotando las
concentraciones (U/mL) sobre la abscisa y los tiempos de coagulacin
(segundos) sobre la ordenada. De la recta resultante, se deduce la
concentracin de FVIII:c del plasma problema.
Valores de referencia: 0.5-1.50 U/mL 50-150 %
Observaciones. Inicialmente se us plasma hemoflico sin dilur, pero la
dilucin 1/2 da resultados similares, por lo tanto se usa esta ltima para
ahorrar plasma.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE LOS FACTORES

II, V, VII Y X

Introduccin
La prueba del tiempo de Quick permite evidenciar la actividad del mecanismo
extrnseco de la coagulacin. La cuantificacin de la actividad coagulante de
los factores II, V, VII y X por mtodos en una etapa, se fundamenta en una
modificacin del tiempo de Quick, usando como sustrato un plasma deficiente
en el factor a investigar. El tiempo de coagulacin de este sistema es
inversamente proporcional a la actividad funcional (coagulante) del factor
presente en el plasma en estudio.

DETERMINACIN DEL FACTOR V

Mtodo en una etapa
Fundamento. El mtodo para dosar el FV utiliza como sustrato un plasma
artificialmente desprovisto de FV, que aporta los factores II, VII, X y
fibringeno. El tiempo de coagulacin de la mezcla del plasma problema
(diludo), el reactivo para FV, la tromboplastina y el calcio, depender de la
concentracin del FV en el plasma incgnita.
Reactivos
Plasma deficiente en FV
Tromboplastina de cerebro humano o de conejo
Cloruro de calcio 0,025 M
 23

Tampn de Michaelis pH 7,35 (ver reactivos) para realizar las diluciones

PPP
Procedimiento
Colocar en un bao de agua a 37C un tubo de vidrio y agregar los siguientes
reactivos:
- 100 L de plasma deficiente en FV
- 100 L de PPP diludo 1/10 en tampn de Michaelis
- 100 L de tromboplastina
Incubar exactamente 20 segundos
- 100 L de CaCl2 0,025 M
Registrar el tiempo de coagulacin de la mezcla.
Resultados
Los resultados se expresan en unidades por decilitro (U/dl en %) y se
deducen de una curva de calibracin construida empleando como calibrador
un plasma de referencia o un pool de plasmas normales. Cada nuevo lote de
reactivos debe ser controlado, trazando la curva correspondiente.
Curva de calibracin

DILUCIN DEL %
PLASMA CONTROL
1/10 100
1/20 50
1/40 25
1/80 12,5

Se grafica en papel doble logartmico, colocando sobre la abscisa las

concentraciones del factor (%) y los tiempos de coagulacin (segundos) sobre
la ordenada De la recta resultante, se deduce la concentracin de FV en el
plasma problema.
Valores de referencia: 0.7-1.2 U/dL 70-120 %
Observaciones
Se usa el plasma del paciente diludo porque aumenta la sensibilidad de la
tcnica.

DETERMINACIN DE FIBRINGENO: MTODO FUNCIONAL DE CLAUSS

Fundamento: El tiempo de coagulacin del plasma, por accin de un exceso
de trombina, es inversamente proporcional a la concentracin plasmtica de
fibringeno.
Reactivos
Tampn imidazol pH 7,5 (ver reactivos)
Solucin fisiolgica.
Solucin de trombina 100 U/mL en solucin fisiolgica.
PPP
Estndar de fibringeno.
Procedimiento
Colocar un tubo de vidrio en bao de agua a 37C y adicionar los siguientes
reactivos:
- 100 L de PPP diludo 1/10 en tampn imidazol pH 7,5.
Incubar durante 30 segundos.
 24

- 100 L de de la solucin de trombina (100 U/mL).

Mezclar suavemente y registrar el tiempo de coagulacin de la mezcla. La
prueba debe efectuarse por duplicado.
Resultados
Los resultados se expresan en gramos de fibringeno por 1itro de plasma La
concentracin se deduce de una curva, en escala logartmica, del tiempo de
coagulacin (segundos) en funcin de la concentracin de fibringeno (g/L).
Para realizar la curva se preparan diluciones (1/5, 1/10, 1/20, 1/40) del
estndar de fibringeno en tampn imidazol pH 7,5 y luego se determina el
tiempo de coagulacin por accin de la trombina para cada dilucin.
El tiempo de trombina de la muestra incgnita se interpola en la curva y se
obtiene la concentracin de fibringeno.
Valores de referencia: 1,7-4,0 g/L

Los siguientes algoritmos resultarn tiles en la interpretacin de las pruebas

de uso frecuente en el laboratorio de hemostasia.

Paciente con: TP alterado, APTT normal

Realizar TP en mezcla con plasma normal (1+1)

No corrige Corrige

Bsqueda de Inhibidor Dosaje de los factores

de la va extrnseca

Paciente con: APTT alterado, TP normal, TT normal

APTT con incubacin

Prolongada 20 min a 37C

Corrige No Corrige

Realizar APTT en mezcla

con plasma normal
Dosaje de
precalicrenas

Corrige No Corrige

Dosaje de factores Bsqueda de

de la va intrnseca inhibidor
 25

Paciente con: TT alterado, TP normal, APTT normal

Realizar TT en mezcla con

plasma normal (1+1)

Corrige No Corrige

Dosaje de Tiempo de Reptilasa

Fibringeno

Alterado Normal
Disminuido

Hipo o afibrinogenemia Disfrinogenemia Inhibidor tipo

Congnita o adquirida Congnita o adquirida heparina

BIBLIOGRAFA
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Trombosis (Grupo CLAHT). 1990.
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Guas de Trabajo Prctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia 1999.
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