APLICAREA TEHNICILOR DE

BIOLOGIE MOLECULARA IN
SECTORUL ALIMENTAR, CA METODE
MODERNE DE ANALIZA SI CONTROL
Drd. ing. Oana Niculae
Drd. biol. Marian Adascalului
 Cateva metode bazate pe analiza acizilor
nucleici:

Real Time Quantitative polymerase chain reaction methods

(PCR)
Next Generation Sequencing
Oligonucleotide DNA microarrays
Nucleic acid sequence based amplification (NASBA)
Ligation detection reaction-universal arrays (LDR-UA)
Fragment analysis (PFGE, SSR, RAPD, iSSR etc)
loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
Molecula de ADN acid dezoxiribonucleic
 I.Organisme modificate genetic
OMG organisme (respectiv plante) al caror material genetic a fost
transformat prin aplicarea tehnicilor de recombinare ADN

Molecule de ADN din diferite surse sunt combinate in vitro intr-o

singura molecula. In general se urmareste obtinerea de noi gene/
combinatii de gene

Acest ADN transferat intr-un nou organism determina aparitia unor

noi trasaturi sau modificarea celor existente

Modificarea genetica presupune insertia unui segment de ADN

(insert), in genomul unui organism gazda
 Trasturi induse Plantelor Modificate
Genetic
Tolerana la erbicide: permite renuntarea la tratamentele
cu produse specifice, aplicabile cu restrictii severe

Rezistena la insecte: este obinut prin inseria de gene

care provin de la Bacillus thuringiensis

Rezistena la virusuri: este data de gene care codific

proteina nveliului viral, izolate de la virusurile care
genereaz respectivele maladii (virusul mozaicului, virusul
petelor inelare).
 Cum stim ca un produs este sau nu modificat genetic:

Identificarea fenotipic: - majoritatea OMG sunt identice cu formele

parentale

Metode bazate pe analiza - ADN sau ARN

aciziilor nucleici:

Metode bazate pe analiza - transformarea este insoit de producerea

de noi proteine care pot fi identificate
proteinelor: imunologic

Metode alternative: -Cromatografie, spectrofotometrie in

infrarosu
 Metode de detecie a OMG:

Prepararea probei (omogenizare)

Detecia, identificarea ELISA

Extracie Proteine i cuantificarea OMG

Detecie OMG PCR Calitativ

ADN/ARN Identificare OMG
Cuantificare OMG PCR Cantitativ
 Pregatire proba - omogenizare
In functie de natura produselor se
folosesc diferite metode de
pregatire a probei:

- produse uscate (fain, produse

de panificaie)

- produse cu umiditate ridicat

(pateu, tofu, iaurt, ingheat,
sosuri)

- produse lichide (lapte, ulei,

bere)

- Seminte (soia, porumb, gru)

 Extracia i purificarea ADN

Exista un numr foarte mare de metode de extracie

Cele mai des folosite sunt:
Metoda de extracie i purificare cu CTAB
Metoda Wizard Rezin sau alte metode pe baz de rini
Metoda de purificare ADN cu particule magnetice
 Metode de detecie i cuantificare a OMG
bazate pe analiza ADN
Principiul Real-Time PCR: monitorizarea n timp real a fluorescenei emise n
timpul reaciei ca un indicator al producerii de ampliconi n fiecare ciclu de PCR
Este extrem de sensibila si se poate realiza pe produse alimentare din depozitele
distribuitorilor sau produse din supermarket.
Avantajele Real-time PCR DEZAVANTAJE:
acurateea reaciei de amplificare Consumul de timp
amplificare monitorizat n timp real Posibilitatea contaminarii
metode de detecie mult mai sensibile
domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare
mai putine diluii ale probelor)
limita inferioar de detecie mult mbuntit
 Polymerase Chain Reaction (PCR)
compusul fluorescent SYBR green se leag la cavitatea minor a ADN dublu
catenar
fluorescena creste dup legarea la ADN

la nceputul amplificrii, amestecul de reacie conine ADN denaturat, primeri

i molecule SYBR green
moleculele nelegate produc un semnal fluorescent minim
Dupa legarea primerilor, cteva
molecule fluorescente se pot lega la ADN,
rezultnd o cretere a emiterii de
lumin de ctre moleculele SYBR green I

In timpul elongrii, din ce n ce

mai multe molecule se leag la
ADN nou sintetizat

Dac reacia este monitorizat continuu, se observ n timp real o

cretere a fluorescenei
 Reacia de polimerizare n lan Real Time -
PCR
Metoda este complet automatizat i necesit un thermocycler special, echipat cu
o camer sensibil care monitorizeaz fluorescena la intervale frecvente n timpul
reaciei RT-PCR.
 Reacia de polimerizare n lan Real Time -
PCR

Curb standard obinut din materiale cu

concentaie cunoscut;
Materiale de referin certificate;
Amplificarea a dou inte:
Transgena
Gena specific formei slbatice
 Procentul de material transgenic

Reprezint raportul dintre cantitatea de ADN transgenic i cantitatea de ADN

endogen

ADN transgenic % = gena int / gena de referin x100

 AUTENTICITATEA PRODUSELOR ALIMENTARE
Adulterri deliberate n scop economic le ntlnim:
- n industria lactatelor, ex: nlocuirea laptelui de oaie cu cel de vac;
- n industria crnii, ex: nlocuirea crnii de vita cu carne de cal;
- n cazul produselor cu denumire de origine controlata (reglementri
la nivel European)

Ce pot influena adulterrile produselor alimentare?

- Sntatea (alergeni)
- Dieta (valoare nutriional)
- Religia (absena porcului)
- Stilul de via (persoane vegetariene, preferine pentru produse bio)
 II.Detecia i identificara falsurilor din carne i produse din
carne.

Controlul calitii produselor alimentare de origine animal abordeaz

aspecte legate de calitatea crnii/produselor din carne din punct de vedere
al consumatorului, al societii i mbuntirea calitii i siguranei
alimentelor

O alt problem socio-economic, cu impact major n bugetele

familiale, n special n condiiile economice actuale, este garantarea unor
produse sigure i protecie mpotriva practicilor comerciale neloiale, a
fraudelor alimentare, care mbrac o importan capital pe piaa de retail.
 Detecia i identificara falsurilor din carne i produse din
carne.

n condiiile n care achiziionarea bunurilor alimentare absoarbe o

parte substanial din veniturile consumatorilor, n special a persoanelor
cu venituri mici care constituie grupa cea mai vulnerabil, asigurarea
unor alimente sigure, constituie o prioritate maxim, iar raportul
pre/calitate trebuie s fie n favoarea calitii.

Tehnicile de biologie molecular vin n ntmpinarea acestor

probleme, reprezentnd o metod de control a calitii produselor
alimentare.
 METODE UTILIZATE N IDENTIFICAREA DE SPECII

Anatomice
Histologice convenionale
Microscopice
Organoleptice

Imunologice
Electroforetice analitice
Cromatografice
 TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULAR

-Identificarea se realizeaz prin metode bazate pe ADN

-Mai sigure (ADN prezint stabilitate la temperaturi ridicate, presiune i

tratament chimic)

-Real Time PCR (cea mai popular metod)

-Reproductibilitate i specificitate mari

 TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULAR PERMIT
IDENTIFICAREA FALSURILOR CARE VIZEAZ:

-comercializarea altor specii dect cea declarat;

-substituirea, n conservele de carne, a unui tip de carne cu altul;

-substituirea crnii cu derivatele de soia i amidonuri peste limita

legal;

-coninutul de carne de bun calitate.

DETECIA ADN DE CAL DIN PRODUSE DE CARNE

Se poate realiza i pentru:

- Porc
- Vit
- Pui
- Curcan
- Mgar
- Catr, etc
 III. DETECTIA, IDENTIFICAREA SI
CUANTIFICAREA MICROORGANISMELOR PATOGENE
DIN PRODUSE ALIMENTARE
 ISTORIE:

La nceputul anilor 1900 mncarea, apa i laptele contaminate au fost

cauza multor boli;

Revoluie sanitar:
-Tratarea apei potabile (inclusiv canalizarea)
-Splatul pe mini
-Pasteurizarea laptelui- 1908
-Refrigerarea alimentelor la domiciliu- 1913
-Regului stricte n cazul procesrii carcaselor de animale din abatoare
-Legi referitoare la manipularea alimentelor
 Intoxicaia vs Infecia alimentar

Intoxicaia alimentar: cauzat de o endotoxin secretat de

bacteria prezent n alimentul contaminat

Infecia alimentar: cauzat de ingerarea bacteriei vii, care

colonizeaz tractul digestiv
Cele mai frecvente boli cauzate de microorganisme patogene:
- Botulism (Clostridium botulinum)

- Febra Tifoid (Salmonella typhi )

- Salmoneloze

- Shigeloze

- Holer (Vibrio cholerae)

- Boli asociate cu E. Coli

- Camphylobacterioze si helicobacterioze
 Metodele utilizate n detecia microorganismelor patogene
trebuie:

- S fie rapide

- S detecteze microorganismul patogen dorit

- S fie senzitive la o cantitate mic de microorganism

- S fie cantitative

- S fie capabile s detecteze mai mult de un contaminant n acelai timp

VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE !!!