TEMA 4. CINTICA E INHIBICIN ENZIMTICA.

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.

 CINETICA ENZIMATICA: CONCEPTOS BASICOS
V
Vmax + SATURACION CON EL SUSTRATO
+ FORMACION COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO

K1 K2
E+S ES E+P
K-1
[s]
K2 ETAPA LIMITANTE DEL PROCESO K2 << K1
A PARTIR DE LAS RELACIONES

ET = E + ES , V 0 = K2 ES , Vmax = K2 ET

Y EN CONDICIONES DE ESTADO ESTACIONARIO

K1 ( ET - ES ). S = (K2 + K-1) ES
Ecuacion de Michaelis-Menten
K-1 + K2
Vmax. [s] Siendo Km =
v 0 = Km + [s] K1
 SI K -1 ES MUCHO MAYOR QUE K2 KM = K -1/K1

K1
LA ECUACIN CINTICA SERA: E+S ES KDISOCIACION =[E].[S]/[ES] =k -1/K1 = KM
K -1
POR TANTO, KM ES LA CONSTANTE DE DISOCIACIN DEL COMPLEJO ES
UNA KM BAJA INDICA UNA UNIN FUERTE (K -1 <<< K1)
UNA KM ALTA INDICA UNA UNIN DBIL (K -1 >>>K1)

NUMERICAMENTE LA KM PUEDE DEFINIRSE COMO LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO QUE

PROPORCIONA A LA ENZIMA UNA VELOCIDAD MITAD DE LA Vmax.
V0

Vmax ....
2 . Vmax. [s] Si [S] = Km V=Vmax/2
.
.
v =
.
.
Km + [s] Si [S] >> Km V=Vmax
.
.
.
KM KM [S]

EN TERMINOS DE AFINIDAD: UNA KM ELEVADA INDICA QUE SE NECESITA MS SUSTRATO

PARA QUE LA VELOCIDAD SEA LA MITAD DE LA MXIMA Y UNA KM BAJA INDICA MENOR
CANTIDAD DE SUSTRATO PARA QUE LA VELOCIDAD SEA LA MITAD DE LA MXIMA.
EN TERMINOS DE EFICACIA CATALITICA: LA Km NO ES UN BUEN INDICADOR DE EFICACIA
CATALITICA.
 LA Vmax PERMITE DETERMINAR LA Kcat

KCAT ES EL NMERO DE MOLCULAS DE SUSTRATO CONVERTIDAS

EN PRODUCTO POR UNIDAD DE TIEMPO POR UNA MOLCULA DE
ENZIMA CUANDO EST TOTALMENTE SATURADA DE SUSTRATO (O
SEA EN CONDICIONES DONDE [S] >>>KM). A ESTA CONSTANTE SE
LE DENOMINA TAMBIN NMERO DE RECAMBIO Y ES LA CONSTANTE
CINTICA K2.
K2 = Vmax/[ET]
EN CONDICIONES FISIOLOGICAS [S]<<KM. COMO Vo =k2 [ES] Y
k1[E][S] /[ES]=(k-1+k2)k1 = KM DEDUCIMOS QUE Vo =(kcat/KM)[E][S]
Y COMO [E] [E]T PODEMOS EXPRESAR LA VELOCIDAD INCIAL COMO:
Vo =(kcat/KM)[E][S]T
SIENDO kcat/KM UNA CONSTANTE DE VELOCIDAD DE LA INTERACCION
ENTRE S Y E, QUE PUEDE UTILIZARSE COMO INDICADOR DE LA
EFI CACI A CATALI TI CA DE LA ENZIMA.
DETERMINACIN DE LOS PARAMETROS CINETICOS KM Y Vmax
 E
S P
COMPROBACION DE QUE Vmax = k2[E]T
 Vmax
SI [S]<<KM V= [S] Cintica de primer orden: Y = a X
KM

Vmax [S]
SI [S]>>KM V= =Vmax Cintica de orden 0: Independiente de [S]
[S]
SON SUSTANCIAS QUE NO SON TRANSFORMADAS POR LA ENZIMA PERO QUE SON
CAPACES DE DISMINUIR LA CAPACIDAD DE LA ENZIMA DE TRANSFORMAR EL
SUSTRATO EN PRODUCTO.
INHIBICIN IRREVERSIBLE EL INHIBIDOR QUEDA COVALENTEMENTE O NO, UNIDO AL
ENZIMA O LIGADO TAN FUERTEMENTE A ELLA QUE SU DISOCIACIN ES MUY LENTA.
INHIBICIN REVERSIBLE SE CARACTERIZA POR LA RPIDA DISOCIACIN DEL
COMPLEJO ENZIMA-INHIBIDOR

INHIBIDOR COMPETITIVO: SE UNE AL MISMO SITIO QUE LO HACE EL

SUSTRATO E IMPIDE LA UNIN DEL MISMO.

INHIBIDOR ANCOMPETITIVO: SE UNE UNICAMENTE AL COMPLEJO

ENZIMA-SUSTRATO

INHIBIDOR NO COMPETITIVO: SE UNE A LA ENZIMA EN UN SITIO

DISTINTO DEL CENTRO ACTIVO, NO IMPIDIENDO LA UNIN DEL
SUSTRATO
v = Vmax. [s] 1 Km
. 1 1
Km + [s] v
= Vmax [s]
+ Vmax

Km = Km ( 1+ [I] )
Ki
 CINETICA ENZIMATICA: CONCEPTOS BSICOS

K1 K2 K3
E+S ES E+P E+I EI
K-1 K-3

v = Vmax. [s] 1 Km
. 1 1
Km + [s] v
= Vmax [s]
+ Vmax

Km = Km ( 1+ [I] ) Sin inhibidor

Ki Con inhibidor
GRAFICAMENTE
v 1/v

1 1/ [s]
-
[s] Km ( 1 + [I] )
Ki
UN INHIBIDOR COMPETITIVO AUMENTA
LA Km SIN AFECTAR A LA Vmax.
v = Vmax. [s] 1 Km
. 1 1
Km + [s] v
= Vmax [s]
+
Vmax
Vmax
Vmax =
1 + [I]
Ki
 CINETICA ENZIMATICA: CONCEPTOS BSICOS
K1 K2
E+S ES E+P
+ K-1 +
I I
K-3 K3 K-3 K3
K1
EI + S ESI
K-1

v = Vmax. [s] 1 Km
. 1 1
Km + [s] v
= Vmax [s]
+
Vmax
Vmax
Vmax =
1 + [I]
GRAFICAMENTE Ki
Vmax 1/v
v
UN INHIBIDOR NO
Vmax COMPETITIVO DISMI-
NUYE LA Vmax SIN
AFECTAR A LA Km.

Km [s] -1/km 1/[s]

 Vmax Km
v = Vmax. [s] Vmax = Km =
Km + [s] 1+ [I] 1 + [I]
Ki [I] Ki
Km 1 1+ Ki
1 .
v
= Vmax [s] +
Vmax
 CINETICA ENZIMATICA: CONCEPTOS BSICOS
K1 K2
E+S ES E+P
K-1 +
I
K-3 K3
ESI

Vmax Km
v = Vmax. [s] Vmax = Km =
Km + [s] 1+ [I] 1 + [I]
Ki [I] Ki
Km 1 1+ Ki
1 .
v
= Vmax [s] +
Vmax

GRAFICAMENTE 1/v UN INHIBIDOR

v
ACOMPETITIVO DISMINUYE
LA Vmax Y LA Km.

Sin inhibidor
Con inhibidor
[s] 1/[s]
Nota tcnica: ESPECTROFOTOMETRIA

Io
I

I A= absorbancia
Ley de Lambert-Beer A= =cl = coeficiente de extincion molar (M-1cm-1)
Io l= paso de luz (1 cm)
 CASO PRCTICO
Determinacin de los parmetros cinticos (KM, Vmax y Kcat) de una reaccin enzimtica
Problema 1
La penicilina se hidroliza por accin de la lactamasa, una enzima de 29 600D de peso molecular. Se midi la velocidad de catlisis de la
enzima como la cantidad de penicilina hidrolizada por la lactamasa en un minuto, obteniendo los siguientes resultados:
[Producto]
[Penicilina] (M) (nmoles/min)
1 0,11
3 0,25
5 0,34
10 0,45
30 0,58
50 0,61
Determinar los parmetros cinticos : KM, Vmax y nmero de recambio (Kcat) suponiendo que la enzima solo posee un centro activo.

Procedimiento:
La determinacin del valor de Km y Vmax se realiza a partir de la
representacin grfica los inversos de los valores de
velocidad, frente a los inversos de las concentraciones de
sustrato y determinando el punto de corte con los ejes X (-1/KM) e
Y (1/Vmax).
 [Producto] 1/[Producto]
[Penicilina] (M) (nmoles/min) 1/[Penicilina] (M)-1 (nmoles/min)-1
1 0,11 1,00 9,09
3 0,25 0,33 4,00
5 0,34 0,20 2,94
10 0,45 0,10 2,22
30 0,58 0,03 1,72
50 0,61 0,02 1,64
10,00
0,7 9,00 y = 7,622x + 1,460
8,00
0,6
Producto (n moles/min)

1/V (nmoles/min)-1
7,00
0,5
6,00
0,4 5,00
0,3 4,00
3,00
0,2
2,00
0,1
1,00
0 0,00
0 10 20 30 40 50 60 -0,30 -0,10 0,10 0,30 0,50 0,70 0,90 1,10
[Penicilina] M 1/[Penicilina] (M)-1

Si el tratamiento de los datos se realiza mediante hoja de calculo, se determina la ecuacin de la recta y se calculan
los puntos de corte:
para X = 0, Y = 1,460. Por tanto 1/Vmax = 1,460, luego Vmax = 0,684 nmoles/min.
para Y = 0, X = -0,1915. Por tanto -1/KM = - 0,1915, luego KM = 1/0,1915 = 5,22 x 10-6M

Se pueden determinar los valores de los puntos de corte por lectura directa de los puntos de interseccin con los ejes
X e Y representando los datos en papel milimetrado.

Calculo del nmero de recambio (Kcat):

Kcat = Vmax/[E] = (0,68 x 10-9 moles/min)/(10-9/29600 moles) = 2012 min-1 = 33,54 s-1
 Problema 2
Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de sustrato, en ausencia y presencia de un inhibidor (I)
a una concentracin de 2mM. A partir de los datos de la tabla determinar:
a) Los valores de Km y Vmax en ausencia y presencia de inhibidor.
b) El tipo de inhibicin.
c) La constante de unin (ki) del inhibidor.
[S] M V(mol/min) (-I) V(mol/min) (+I 2mM)
3,00 10,40 4,10
5,00 14,50 6,40
10,00 22,50 11,30
30,00 33,80 22,60
90,00 40,50 33,80
Resolucin:
-a) Clculo de los valores inversos de las concentraciones de sustrato y las velocidades obtenidas en presencia y ausencia de inhibidor.
1/[S] M 1/V(mol/min) (-I) 1/V(mol/min) (+I 2mM) 0,60
0,33 0,10 0,24
0,20 0,07 0,16 0,50
y = 1,108x + 0,112
0,10 0,04 0,09
0,03 0,03 0,04 0,40

1/V (mol/min)
0,01 0,02 0,03
0,30
-Representar grficamente los valores obtenidos y determinar Sin I
los puntos de corte con X e Y.
0,20 Con I 2mM
Km en ausencia de inhibidor: Para Y = 0, X = -0,098 M,
luego Km = 1/0,098 = 10,20 M
Vmax en ausencia de inhibidor: Para X = 0, Y = 0,022 mol/min, luego 0,10 y = 0,224x + 0,022
Vmax = 1/0,022 = 45,45 mol/min
Km en presencia de inhibidor: Para Y = 0, X= -0,033 M; 0,00
Km = 1/0,033 = 30,30 M -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40
Vmax en presencia de I: Para X = 0, Y = 0,022 mol/min; 1/[S] M
Vmax = 1/0,022 = 45,45 mol/min
b) Inhibicin COMPETITIVA
c) Cte de unin siendo [I]= 2mM =2000mM: Al ser una inhibicin competitiva Km ap = Km ( 1+(I/Ki)), luego: 10,20 = 30,30 (1+(2000/Ki)) Ki = 1 mM
Problema 3
Se mide la cintica de la enzima del problema 2 como funcin de la concentracin de sustrato, en ausencia y
presencia de un inhibidor diferente, que se encuentra a una concentracin de 100 M.
A partir de los datos de la tabla determinar: [S] M V(mol/min) (-I) V(mol/min) (+I 2mM)
a) Los valores de Km y Vmax en ausencia y 3,00 10,40 2,10
presencia de inhibidor. 5,00 14,50 2,90
b) El tipo de inhibicin.
10,00 22,50 4,50
c) La constante de disociacin del
30,00 33,80 6,80
inhibidor.
90,00 40,50 8,10
Resolucin

1/[S] M 1/V(mol/min) (-I) 1/V(mol/min) (+I 2mM)

0,33 0,10 0,48
0,20 0,07 0,34
0,60
0,10 0,04 0,22
0,03 0,03 0,15 0,50
y = 1,108x + 0,112
0,01 0,02 0,12
0,40

1/V (mol/min)
a)
Sin I
Km en ausencia de inhibidor: Para Y = 0, X = -0,098 M,
0,30
Km = 1/0,098 = 10,20 M Con I 0,1mM
Vmax en ausencia de inhibidor: Para X = 0, Y = 0,022 mol/min
0,20
Vmax = 1/0,022 = 45,45 mol/min
y = 0,224x + 0,022
0,10
km en presencia de inhibidor: Para Y = 0, X= -0,101 M
Km = 1/0,101 = 9,893 M
Vmax en presencia de inhibidor: Para X = 0, Y = 0,112 mol/min 0,00
Vmax = 1/0,112 = 8,93 mol/min -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40
b) 1/[S] M
Inhibicin no competitiva
c)
Al ser una inhibicin no competitiva Vmax ap = Vmax/ ( 1+(I/Ki)), luego:
8,93 = 45,45 /(1+(100/Ki))
Ki = 0,024 mM = 2,4 x 10-5 M