Determinacin de la temperatura y pH ptimo del alfa- amilasa

Resumen

Con el objetivo de identificar el pH y temperatura ptima para la funcin cataltica

de la -Amilasa en la reaccin hidroltica del almidn, se realizaron los siguientes
ensayos y pruebas. Primero, a una temperatura constante de 37C los tubos 1,2 y
3 (que contienen mezclas de la solucin de amilasa y la solucin de almidn) se
sometieron a los pH 5,8; 7 y 8, respectivamente. Luego, los tubos 4, 5 y 6 (que
contienen mezclas de la solucin de amilasa y la solucin de almidn; excepto el
tubo 4, que no contiene la solucin de la enzima) en condiciones de pH7 se
sometieron a las temperatura de 37C, 80C y -5C, respectivamente.
Posteriormente, se realizaron las pruebas de Lugol y Biuret. En cuanto a la prueba
de Lugol, resulto solo ser negativa para los tubos 1, 2 y 6, lo que indica que hubo
actividad enzimtica por la hidrlisis del almidn; en los casos positivos (tubos 3,4,5)
ocurre lo contrario. En contraste, en la prueba de Biuret los tubos 1,2 y 6 resultaron
positivos, lo que significa que hay presencia de la enzima; mientras que en los tubos
3,4 5 el resultado fue negativo, ya que no hay presencia de enzima o se encuentra
desnaturalizada por las condiciones de las pruebas.

Materiales y reactivos

Material Cantidad Capacidad

Tubos de 11 _
ensayo

Plancha 2 ---

Termmetro 2 ---

Vaso 4 250 mL
qumico

Goteros 10 1 mL

Mortero 1 ---

Placa de 1 __
tincin
Reactivo Frmula Concent Cantidad Grado de toxicidad
racin

Almidn a Formula 50 mL de pH 5,94 Puede causar irritacin en la

pH 5,94, semidesarroll nariz, garganta y vas
6,68 y 8,05 ada: 150 mL de pH respiratorias. Puede causar
(C6H10O5)n 6,68 irritacin de ojos y piel.
50 mL de pH 8,05

Amortiguad 2 4+ HCl 20 mL de pH 5,04 Fosfato monobsico de

or de pH y 60 mL de pH potasio: puede causar
5,04 y 6,68 6,68 irritacin a la piel, ojos y vas
respiratorias. Puede ser nocivo
si se ingiere o se inhala.

El cido clorhdrico y
concentraciones altas de gas,
son altamente corrosivos a la
piel y membranas mucosas

Amortiguad 2 4 20 mL El hidrxido de sodio es

or de pH + irritante y corrosivo de los
8,04 tejidos. Los casos ms
comunes de accidente son por
contacto con la piel y ojos, as
como inhalacin de neblinas o
polvo.

Cloruro de NaCl 60 mL Sustancia no peligrosa segn

sodio reglamento. Puede causar
irritacin moderada de los ojos
y la piel.

Amilasa __ No es una sustancia peligrosa

salival

Lugol 2 Un par de gotas Este producto no se considera

peligroso ni toxico

Prueba de 4 6 mL Provoca irritacin cutnea y

biureth puede causar irritacin ocular
108 gotas grave
Discusin

La amilasa salival es la enzima utilizada para hidrolizar (romper enlaces agregando

agua) el almidn. Su actividad enzimtica se ve afectada por muchos factores, como
temperatura y pH. La disminucin de su actividad a valores por encima y debajo de
32-37 y de pH 6-7, se debe a la desnaturalizacin.

La amilasa salival o ptialina, rompe el almidn en maltosa y dextrina. El almidn es

un polisacrido muy abundante en los vegetales en los cuales se encuentra
generalmente en forma de pequeos grnulos microscpicos de estructura
cristalina. El grano de almidn est formado por amilosa y amilopectina. La
amilopectina se encuentra en la parte exterior del grano, es insoluble en agua y no
da coloracin con la solucin de lugol. La amilosa se encuentra en la parte interna
y da coloracin violeta en presencia de lugol. La amilasa, como otras enzimas
funciona como catalizador; es decir, cataliza la hidrlisis del almidn. Es necesario
siempre recordar que una enzima aumenta la velocidad de reaccin, interviene en
la misma pero se obtiene intacta al final; adems cualquier cambio en su
temperatura o pH optimo (generalmente un rango muy estrecho) hace que la enzima
pierda su estructura tridimensional y por consiguiente su funcin. En este
experimento cualitativo demostramos lo anteriormente explicado utilizando las
pruebas de lugol (solucin yodurada de yodo) y Biuret; es decir, confirmamos la
ausencia o presencia del almidn. En general, un azul oscuro confirma la presencia
de almidn.
La razn del uso del NaCl es que la alfa amilasa salival humana necesita los iones
Cl para su actividad; es decir, que la presencia de estos iones forma parte de sus
condiciones ptimas de funcionalidad.

Para la determinacin de la temperatura ptima utilizamos los tubos de ensayo 2,5

y 6. En este punto es importante establecer que la concentracin de la enzima, el
sustrato y el pH se mantuvieron constantes y lo que vari (variable independiente)
fue la temperatura. En el tubo 2 que tena pH= 7 y buffer tambin a pH 7 , enzima
con temperatura de 37 C; observamos una coloracin amarilla lo que indica reaccin
negativa para lugol. Esto nos dice que la enzima pudo funcionar correctamente a
esa temperatura y fue capaz de catalizar la hidrlisis del almidn. En los tubos 5 y
6 cuyas temperaturas fueron 80 C y -5 C, observamos una coloracin violeta en
ambas que indica presencia de almidn. El color que dan los polisacridos con el
lugol (solucin de I2 y de IK) se debe a que el I2 ocupa espacios vacos en las hlices
de la cadena de unidades de glucosa, formando un compuesto de inclusin que
altera las propiedades fsicas del polisacrido, especialmente la absorcin lumnica.
En estas dos condiciones de temperatura la enzima no pudo reaccionar
correctamente ya que se haba desnaturalizado. Estos resultados nos dicen que la
temperatura ptima para la amilasa es 37 C que corresponde a la temperatura
normal interna del organismo.
Para explicar esto, debemos hablar en trminos de velocidad de reaccin. En una
reaccin que no est catalizada, la velocidad de reaccin es proporcional a la
temperatura, es decir que si la temperatura aumenta la velocidad de reaccin
tambin. Esto no es cierto para una reaccin catalizada como la de nuestro
experimento. Lo que ocurrira se puede explicar mediante la siguiente grfica:

En esta grfica observamos que al empezar con una baja temperatura y luego ir
aumentando tambin va aumentando la velocidad de reaccin. Sin embargo, las
conformaciones de una protena son muy sensibles a los cambios de temperatura,
por esto al llegar a la temperatura ptima cualquier aumento subsiguiente de la
misma alterar la conformacin de la enzima. Esto significa que el sustrato no
encajar en el sitio activo de la protena (en la superficie de la enzima) por lo que la
velocidad de reaccin disminuye. Un pequeo cambio de la temperatura no afecta
drsticamente la enzima ya que entre un rango muy estrecho este proceso es
reversible y la protena puede volver a la conformacin que tena antes. Al salir de
este rango indudablemente la enzima sufrir desnaturalizacin, la cual es
irreversible. Esto significa que la enzima quedar completamente inactiva. Este
mismo principio es el que se aplica en la preservacin de alimentos a bajas
temperaturas por medio refrigeracin.
La mayora de bacterias y organismos superiores contienen enzimas cuya
temperatura optima est alrededor de 37 C. Sin embargo es importante conocer que
no se cumple con todos los organismos ya que en el suelo marino, algunas especies
tienen enzimas cuya temperatura ptima de funcionamiento es de 2 C.
En la determinacin del pH ptimo utilizamos 4 tubos de ensayo, mantuvimos la
temperatura en 37 C y variamos el pH del almidn y el buffer para ver el efecto que
tiene en la enzima. El tubo #4 era el control y no llevaba enzima.

A medida que el pH disminuye ciertos aminocidos como aspartato y glutamato se

protonan, causando que pierdan su carga negativa lo que se traduce en una
desnaturalizacin de la enzima. El pH ptimo de la amilasa salival va de 5,6 a 6,9
(Talwar & Srivastava, 2006) Entonces a pH como 4 la amilasa est en un ambiente
muy cido para su funcionamiento y a pH como por ejemplo 10 su estara en un
medio demasiado alcalino. A medida que el pH aumenta, ciertos aminocidos como
arginina y lisina se desprotonan, haciendo que pierdan su carga neta positiva que
tambin termina en la desnaturalizacin de la enzima. Estos cambios en la carga
alteran los enlaces inicos presentes en la estructura terciaria y cuaternaria,
cambiando la conformacin de las protenas y su actividad. Por esto la relacin pH
actividad de las enzimas es dependiente de la cadena de aminocidos presentes
en la enzima.
Segn esta explicacin es de esperar que los tubos de ensayo con almidn a pH
6,75 y a 5,82 dieran la prueba de lugol negativa ya que a estos dos pH la enzima
puede funcionar correctamente, mas no para el pH de 8,09 la cual s dio una
coloracin azul oscuro, propia de la presencia de almidn.
A modo de comparacin, la pepsina que se encuentra en el estmago tiene un pH
optimo de 2 y por eso es que el estmago produce HCl.

La prueba de Biuret est relacionada con la amilasa salival, que es una protena. Si
la prueba de biuret resulta negativa entonces la enzima se desnaturaliza por accin
de las condiciones de pH o temperatura.
Debemos fijarnos en el grupo control que es el tubo 4. Cualquiera que se acerque
a ese color ser negativo. Los resultados son inversos , lo que nos dio positivo para
lugol nos dio negativo para biuret. Es decir que los tubos 3,4 y 5 dieron negativo
para la prueba indicando que para esas condiciones pH 8 en tubo 3 y temperatura
de 80 C en el 5 la enzima se desnaturaliza.