TCNICA INMUNOHISTOQUIMICA

Conjunto de tcnicas que hacen uso de anticuerpos. Los anticuerpos estn formados por
dos cadenas pesadas y dos ligeras, que se agrupan en una molcula en forma de Y, con
dos sitios de unin para antgeno

Existen varios tipos de anticuerpos, de los cuales los IgG son los ms abundantes en
suero y los que ms utilidad tienen en tcnicas de laboratorio.

Antgeno es la molcula a la cual se une el anticuerpo. Son de muy distinta naturaleza.

Fundamentalmente los Anticuerpos (Ac) reconocen protenas, pero tambin se sintetizan
Ac contra carbohidratos, lpidos, cidos nucleicos, compuestos orgnicos sintticos, etc.
La regin de la molcula a la cual se une el anticuerpo se denomina eptopo. Los
eptopos pueden estar formados por regiones contiguas o no en la secuencia de
aminocidos de una protena.
La unin antgeno-anticuerpo es una unin reversible y de alta afinidad. La produccin
de anticuerpos consiste bsicamente en:
a) Preparacin del antgeno,
b) Inyeccin de este a un animal y
c) Obtencin del suero del suero del animal.

MARCAJE DE ANTICUERPOS:

Los anticuerpos se pueden marcar para permitir su deteccin, lo cual implica la unin
covalente al dominio Fc de molculas o tomos fcilmente detectables, tales como:

-125I emisor se detecta con contador de centelleo o autoradiografia.

- Enzimas se le pegan enz completas a la regin Fc: peroxidasa de rbano, fosfatasa

alcalina, b-galactosidasa, etc.
Deteccin con:

* Sustratos que dan lugar a productos coloreados solubles, que se pueden medir en un
espectrofotmetro.

* Sustratos que dan lugar a productos coloreados insolubles, que forman un precipitado
en el lugar en el que se encuentra el anticuerpo, tiles por ejemplo en
inmunolocalizacin y western blots.

* Sustratos que producen luz (detectada con luminmetro o pelcula fotogrfica).

* Biotina, luego detectada con avidina/streptavidina (acopladas a algn otro tipo de
marcador). La afinidad avidina/streptavidina-biotina es la ms alta conocida la unin
es en la prctica irreversible.
* Fluorocromos (por ejemplo Fluorescena y Rhodamina). Deteccin con microscopio
de fluorescencia o espectrofluormetro.
 INMUNOHISTOQUCA DE FOSFATASA ALCALINA EN SECCIONES
DE PARAFINA

Material: embriones de ratn

Fijacin: Paraformaldehido

Protocolo

Sesin 1

En esta primera sesin realizaremos hasta el paso 6.

1.- Desparafinizacin del tejido en Xileno 3 veces durante 5 minutos cada

uno de ellas
2.- Hidratacin del tejido mediante una cadena decreciente de alcoholes
durante 3 minutos en cada alcohol 100%-90%-80%-70%-50%
3.- Lavar el tejido en PBS durante 5minutos
4.- Incubar las muestras en TENG-T durante 15 minutos
5.- Lavar de nuevo en PBS limpio durante 5 minutos
6.- Aadir el anticuerpo primario diluido en TENG-T durante toda la noche

El paso 7 y 8 ser realizado por el becario encargado de las prcticas

7.- Para quitar el exceso de anticuerpo primario lavar en PBS limpio 2 veces
durante 5 minutos cada vez
8.- Aadir el anticuerpo secundario correspondiente diluido en TENG-T e
incubar durante 1 hora y 30 minutos

Sesin 2

En esta ltima sesin sern realizados todos los pasos. Al final el alumno

tendr que observar su muestra al microscopio y determinar si la tcnica ha

funcionado correctamente as como realizar un pequeo resumen del

marcaje del anticuerpo usado

9.- Retirar el exceso de anticuerpo secundario lavando en PBS 2 veces

durante 5 minutos cada vez
10.- Incubar en una estufa a 55C durante 35 minutos para inhibir la
fosfatasa alcalina endgena del tejido
11.- Lavar de nuevo en PBS 2 veces durante 5 minutos
12.- Revelar con NBT/BCIP diluido en NTMT ha una dilucin de 1:50 durante
20 minutos
13.- Lavar en PBS
14.- Deshidratar el tejido mediante una cadena creciente de alcoholes de
forma rpida
15.- Poner en Xileno las muestras 3 veces durante 5 minutos cada vez
16.- Pegar el cubre al porta con le tejido para su conservacin con medio de
montaje DPX.

Reactivos

PBS
1.- Solucin A: 0.5M NaH2PO4
Solucin B: 0.5M Na2HPO4
2.- Se aade solucin A a la solucin B hasta que el pH sea de 7.4 (PB)
3.- Diluimos el PB 5 veces con agua bidestilada para alcanzar una
concentracin final de 0.1M
4.- Disolvemos 1.5M NaCl por litro de PB 0.1M (PBS 10x)
5.- para hacer PBS 1x diluimos 10 veces la solucin PBS 10x

TENG-T NTMT
-10 mM Tris-HCl pH: 8 -100 mM NaCl
- 5 mM EDTA pH:8 -100 mM Tris-HCl pH: 9.5
-150 mM NaCl -50 mM MgCl 2
-0.25% Gelatina -0.1% Tween 20
-0.05% Tween 20 - Agua Bidestilada

-pH Final: 9