Practica 10: Identificacin

de Enterobacterias con
pruebas bioqumicas y
anlisis al microscopio
Microbiologa II
QFBT

Hernndez Bravo Karen Beatriz

Lemus Maldonado Linda Monserrath

Docente: Socorro Chvez

 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Objetivo
- Al finalizar esta prctica, el estudiante ser capaz de caracterizar, mediante
pruebas bioqumicas y observacin microscpica, una bacteria aislada de
alimentos o agua.

Introduccion
Las pruebas bioqumicas permiten determinar las caractersticas metablicas de
las bacterias objeto de identificacin.
Algunas de estas pruebas son tcnicas rpidas, ya que evalan la presencia de
una enzima preformada y su lectura vara entre unos segundos hasta unas pocas
horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo
con una incubacin previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayora de las
pruebas que detectan componentes metablicos o aquellas que determinan la
sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de
identificacin que contienen el sustrato a metabolizar.
La forma usual de detectar una enzima se basa en el principio de que si est
presente, utilizara un sustrato determinado que ha sido puesto adrede en el medio
de cultivo o en una prueba bioqumica determinada. Los productos terminales de
la accin enzimtica son detectados a travs de indicadores de PH o por el
aparecimiento de pigmentos que hacen virar el color del medio.
Funciones de los componentes bsicos de los medios de cultivos:

- Sustrato
Reacciona con la enzima especfica y da origen a productos terminales que
pueden ser cidos o alcalinos.
- Indicador de PH
Detecta productos terminales de la utilizacin del sustrato. Son colorantes
aadidos para indicar los cambios que hay en el medio durante el crecimiento de
los microorganismos. Estos indicadores son sensibles a los cambios de PH, por lo

2 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

tanto, los virajes de color de los mismos indican de manera indirecta la presencia
de productos terminales del empleo e sustrato.
- Nutrientes
La mayora de las bacterias no crecern solo con la presencia del sustrato bsico,
por lo que se requiere agregar diversos nutrientes que varan, dependiendo de los
requerimientos de cada bacteria.
- Inhibidores
Son utilizados ms en medios selectivos inciales, pero hay que tener en cuenta
que no todos los microorganismos deseados sern inhibidos y no todos los
deseados crecern.

1. Citrato de Simons:
Fundamento: Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato
como nica fuente de carbono.
Lectura e interpretacin: Un viraje de color verde al azul marino y crecimiento en la
superficie da una reaccin positiva, de lo contrario es negativa

2. Rojo de Metilo (RM) - VoguesProskauer (VP):

VP: Capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro, el
acetilmetilcarbinol (acetona), a partir de la fermentacin de la glucosa.
RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener
estables productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa.
Lectura e interpretacin: El RM es positivo si se observa un anillo de color rojo en
la superficie del medio al agregar 2gts de reactivo rojo de metilo.
El VP es positivo si se observa un anillo de color zapote intenso en la superficie
del medio. Al agregar 4gts de KOH al 40% y 6gts de alfa naftol.
(Robles, 2014)

3 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Materiales y Reactivos
Primera sesin
Leche bronca sin 1 micropipeta 50-100 L Gradilla
pasteurizar
Mechero Puntas amarillas para Agar Mc Conkey
micropipeta
2 cajas de petri Papel de estraza Peptona
1 matraz de 500 mL Pipeta de 1 o 5 y tambin Agua destilada
de 10 mL
1 matraz de 250 mL Propipeta Vortex
2 tubos con taparrosca 1 asa de Digrasky 1 vaso de precipitado de
50ml
1 bolsa para esterilizar Algodn Gasas
Papel aluminio Charola para pesar Esptula

Segunda sesin
Kit de limpieza 2 Pipetas Reactivo de Kovacs o
(5 y 10 mL). Ehrlich
Mechero de bunsen Propipeta Medio RM-VP
5 tubos con taparrosca 2 matraces 100 250 ml Agua destilada
Incubadora 1 charola para pesar Xilol (Xileno)
reactivos
Balanza 1 gradilla Rojo de metilo
Esptula Peptona KOH
Asa bacteriolgica Agar Citrato de Simmons Alcohol
-naftol H2O2 3 portaobjetos
Cubreobjetos Colorantes para Tincin Microscopio
de Gram

4 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Metodologa
Primera sesin
1. Se prepararn 20 mL de agua peptonada al 0.1% para cada equipo. Se
esterilizar a 121C por 15 minutos.
2. Se prepararn 50 mL de agar Mc Conkey para cada equipo y se
esterilizarn en autoclave.
3. Se realizarn 2 diluciones de la muestra de agua o leche bronca: o 10-1
para la cual se adicionarn, en un tubo con 9 mL de agua peptonada, 1 mL
de la muestra original. o 10-2 para la cual se a adicionarn, en un tubo con
9 mL de agua peptonada, 1 mL de la dilucin 10-1.
4. Se agita cada tubo ligeramente con el vrtex.
5. Vertir el agar a las cajas de Petri y se deja solidificar.
6. Posteriormente se colocan 200 microlitros de cada una de las diluciones a
cada caja de Petri y se distribuye lo ms uniformemente posible utilizando
el asa de Digralsky, previamente esterilizada.
7. Se permite que el medio absorba la muestra y se incuban las cajas de
manera invertida hasta el da lunes 17 de octubre.
8. Pasado el tiempo de incubacin, se realiza el conteo para establecer la
cantidad de microorganismos presentes en la muestra.

Segunda sesin

PRUEBA DE CATALASA

Detecta la presencia de la enzima catalasa, cuya funcin es descomponer el

perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Para analizar su presencia, se coloca
en un portaobjetos una asada del cultivo bacteriano y se adicionan 2-3 gotas de
perxido de hidrgeno y se observa si hay presencia de burbujas del oxgeno
liberado (catalasa +).

5 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

PRUEBAS IMVIC

Son un conjunto de cuatro pruebas bioqumicas que sirven para caracterizar

bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, las cuales son
indicadores biolgicos de contaminacin en alimentos y agua principalmente.
Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo, Voges - Proskauer y Citrato.

1. INDOL

Esta prueba permite determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir

de la molcula de triptfano a travs de la enzima triptofanasa.
El medio de cultivo para realizar este prueba es agua peptonada al 1% (rica en
triptofano). Se colocan en un tubo 3 mL y se esteriliza en autoclave durante 15
minutos a 121C. Se siembran los microorganismos por asada y se incuban a
37C durante 48 horas. Posteriormente a la incubacin se agregan al medio 3 5
gotas de reactivo de Kovacs o Ehrlich (deslizando por la pared del tubo) y se
analizar la coloracin. Si se usar reactivo de Ehrlich, adicionar previamente al
reactivo, 1 mL de xilol. Si se produce Indol, se formar un anillo de color rojo en la
superficie.

2. ROJO DE METILO

Con esta prueba se pretende conocer si el microorganismo tiene la capacidad de

producir y mantener estables los productos cidos de la fermentacin cido mixta
de la glucosa (cido actico, frmico, lctico y succnico).
Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo-Voges-Proskauer (RM-VP).
Este medio es lquido y se preparan 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en
autoclave a 121C durante 15 minutos. Se siembra una asada de
microorganismos al medio y se deja incubar por 48 horas a 37C. La lectura se
realiza agregando solucin de rojo de metilo, en solucin alcohlica al 0,2% (p/v).
Si el microorganismo ha producido cidos a partir de la glucosa, se mantendr rojo
el indicador.
3. VOGES-PROSKAUER

6 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

La reaccin de V.P. se basa en la deteccin de acetona a partir de la

fermentacin butanodilica de la glucosa. A partir del cido pirvico, una bacteria
puede seguir muchas vas segn su sistema enzimtico, una de stas es la
fermentacin butanodilica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la
acetona es el precursor.
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que para el rojo metilo. El
microorganismo se siembra e incuba por 48 horas. La lectura se realiza agregando
el cultivo crecido 6 a 8 gotas de una solucin de KOH y 1ml de solucin alcohlica
de alfa-naftol al 5% p/v. Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura,
tiempo en el cual se deja en estufa el cultivo con los reactivos agregados.

Formacin de un anillo rojizo ------------ Reaccin (+)

Formacin de un anillo incoloro --------- Reaccin (-)

4. CITRATO DE SIMMONS

Se busca determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica

fuente de carbono.
El medio a utilizar es el Citrato de Simmons (slido). Este contiene citrato como
nica fuente de carbono, sales de amonio inorgnicas como nica fuente de
nitrgeno, sales minerales y un indicador de pH, el azul de bromotimol. El agar se
prepara en pico de flauta y una vez solidificado se inocula la superficie con las
bacterias, dejando incubar al igual que en pruebas anteriores. En un principio, el
medio es de color verde y cuando el microorganismo utiliza el citrato vira a color
azul.
Color azul en el medio, prueba del citrato +
Color verde en el medio, prueba del citrato

TINCIN DE GRAM

Tomar una pequea asada de una colonia bacteriana y teirla segn la tcnica de
Gram mostrada a continuacin y observar al microscopio.

7 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Evidencias
Fig. 1: Muestra de Fig. 2: Muestra de
-1 -2
dilucin 10 dilucin 10

8 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Resultados
RESULTADO DE
LA REACCIN
PRUEBA IMAGEN DEL RESULTADO
(+/-)

Catalasa +

Indol +

9 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Rojo de
-
Metilo

Voges-
+
Proskauer

Citrato No se realiz

Tincin de
-
Gram 10x

10 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

Tincin de
-
Gram 40x

Tincin de
-
Gram 100x

Conclusion y Discusion
Esta prctica se llev a cabo en dos sesiones: en la primera sesin se prepararon
los agares Mc Conkey de doble capa (con la intencin de generar un ambiente
anaerobio para las enterobacterias, pues si estas se vean expuestas a la
presencia de O2 les resultara difcil el crecimiento), para posteriormente hacer 2
diluciones de leche bronca en agua peptonada y sembrar 200L en cada caja.
Despus de una semana de incubacin se obtuvieron cajas repletas de colonias
de enterobacterias, de tal manera que para ambas diluciones fueron incontables.
En la segunda sesin se prepararon pruebas bioqumicas y se sembr una colonia
de bacterias en cada prueba, las cuales se dejaron un fin de semana en el

11 Microbiologa II
 PRCTICA No. 10: IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS CON
PRUEBAS BIOQUMICAS Y ANLISIS AL MICROSCOPIO

refrigerador y posteriormente se les agregaron los reactivos necesarios a cada

prueba. La prueba de catalasa dio positiva al observarse la produccin de
burbujas despus de que las bacterias lograron descomponer el H2O2 en H2O y
O2, al igual que la prueba de indol y de Voges-Proskauer. Por otro lado, la prueba
de rojo de metilo, dio un resultado negativo, con esto podemos determinar que no
es una bacteria que haya producido cidos a partir de la glucosa. En la tincin de
Gram se pudieron observar bacilos y cocos negativos, principalmente bacilos que
pueden corresponder a enterobacterias como E. Coli, Shiguella, Salmonella,
Klebsiella, Proteus mirabilis.
En cuanto al citrato de simmons, fue una prueba que no se pudo realizar debido a
los inconvenientes que se tuvieron con la solidificacin del agar y por lo tanto no
se pudo sembrar nada.
Se puede concluir que las pruebas bioqumicas son de gran importancia para la
microbiologa, ya que con ellas se pueden identificar microorganismos con mayor
exactitud, tambin, permiten realizar un estudio ms profundo sobre el
comportamiento bacteriano.

Bibliografa
Robles, D. (09 de 08 de 2014). Pruebas bioqumicas para enterobacterias.
Recuperado el 25 de 10 de 2016, de Blogspot:
http://apuntesytrabajosdemicrobiologia.blogspot.mx/2014/08/pruebas-bioquimicas-
para-enterobacterias.html

12 Microbiologa II