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Prof. Menira
O vrus um microrganismo intracelular obrigatrio, uma partcula que
se auto replica. Ele usa a clula (uma quinase celular) para fazer
cpias dele mesmo, no se fala em reproduo viral, fala-se em
replicao viral. Tem que ter uma clula viva, vivel e suscetvel. O
vrus tem que entrar na clula, ento para isso ele tem que ligar/fazer
adsoro que feito por uma molcula, geralmente uma protena que vai
se associar de forma especfica com uma molcula na superfcie da
clula, essa molcula da superfcie da clula tem que ser reconhecida
por esse anti-receptor viral, esse encontro casual, por coliso e de
cada 100000 colises ocorre 1 adsoro. Inicialmente ela reversvel
mas depois que ocorre a ligao ela irreversvel.
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aquela sequencia voc vai analisando o que que aquilo, muitos vrus
esto sendo descobertos. O estudo da virologia muito dinmico e sempre
tem que estar estudando, porque sempre vai descobrindo novos vrus,
analisando mutaes, estudando os vrus que podem ser patognicos.
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Porque diagnosticar? Para tratar e tambm para prevenir e entender
melhor a doena, entender os mecanismos de preveno, entender a
patognese do vrus. Por exemplo, vrus que so transmitidos por vias
respiratrias sabe-se que para prevenir no deve-se espirrar nas mos,
virus que so gastroentericos
deve-se larvar bem as mos e
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Todo o diagnostico comea pela coleta, geralmente faz a coleta do sangue
(pesquisa de anticorpos de fase aguda ou crnica), mas se tiver o
sintoma no sitio da doena a pode coletar material daquele local (por
exemplo: sintomas respiratrios... faz uma coleta com aspirado
nasofaringeano ou com swab para fazer a pesquisa do virus. Diarreia...
coleta-se fezes e faz a pesquisa de rotavrus e rinovirus por exemplo).
Se o paciente procura o atendimento durante os sintomas a plausvel a
procura do vrus. Se o paciente est febril, dores no corpo, dores nas
juntas pode-se coletar o sangue e fazer a pesquisa de protenas e
anticorpos da fase aguda para dengue por exemplo. Ento, dependendo da
fase do curso da infeco, do momento em que o paciente procura o
servio e coletada essa amostra que vai saber qual o tipo de tcnica
vai ser feita e qual tipo de material vai ser coletado. Se o paciente
ficou doente h trs semanas atrs e resolveu procurar hoje um
atendimento para saber o que ele tinha e a vai ter que ser coletado
soro e buscar IgG, mas se fosse uma fase aguda iriamos pesquisar IgM
junto com busca de antgeno viral.
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A cultura de clulas bastante
importante na descoberta de novos
vrus, caracterizao dos vrus e
tambm para amplificar o nmero de
vrus.
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tudo quanto tipo de bicho). Tem interferncia de outros vrus do
animal, ainda mais se ele no for germ-free. Os animais so muito
utilizados em vrus que no se replicam em cultura de clulas, vrus que
no se consegue estudar muito bem e nem diagnosticar. Quando um novo
vrus e a no se faz um ensaio clinico de cara e tambm quando se quer
entender a patogenia do vrus.
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tem que fazer algum mtodo especfico como elisa, imunofluorescencia ou
pcr, pois um meio de obter informaes sobre o virus mas no
confirmatrio para o diagnostico.
Tem as dificuldades pois tem que ser muito cuidadoso, tem que ser feito
no fluxo, tomar cuidado para no contaminar. Uma aplicabilidade a
produo de vacinas, outra a produo de kits (montar um elisa) com
antgeno viral e observar o efeito citoptico. A partir da cultura de
clulas podemos observar o que o vrus fez na clula e ter uma ideia
de qual vrus que , pode pesquisar antgeno ou acido nucleico viral e
pode tambm fixar, corar e identificar por microscopia eletrnica e
olhar a morfologia, tamanho e etc.
Quando voc tem o swab a amostra com clulas voc fixa com acetona ou
formaldedo, eles fazem microporos na membrana da clula, com isso o
anticorpo consegue penetrar e chegar no antgeno la dentro da clula e
ligar, depois que liga ele no desliga (a voc pode at lavar que no
desliga, uma ligao estvel), incuba a lamina com anticorpo, lava,
adiciona uma gota de glicerol e coloca no microscpio com luz uv, a
clula fica brilhante, o fluorocromo mais utilizado o FITC
(Isotiocianato de fluorescena) ele verde fluorescente. Existem vrios
outros e eles vo emitir no espectro de fluorescncia um comprimento de
onda diferente, o legal que voc pode fazer um painel e ao mesmo tempo
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detectar e pesquisar vrios vrus naquela amostra, se voc marcar cada
anticorpo com um fluorocromo diferente.
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(tetrametilbenzeno) com o peroxido de hidrognio. A colorao formada
diretamente proporcional a concentrao do antgeno. Com a absorvancia
voc faz o calculo do cut-off. O principio do elisa a formao de um
complexo anticorpo e antigeno revelado por uma enzima.
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Inibio da hemaglutinao: avalia a capacidade dos anticorpos
antivirais presentes na amostra de bloquear a hemaglutinao induzida
por antgenos virais.
Tem vrus que voc s estuda por biologia molecular, que no replica em
cultura de clula, faz elisa e no consegue detectar, a voc faz um pcr
com primers genricos e a consegue sequenciar e identificar qual que .
Tem que ter vrios cuidados no laboratrio tem um lugar para extrair o
acido nucleico, uma sala para fazer o pcr limpo, outra sala para fazer a
inoculao, outra para fazer a eletroforese, trocando inclusive de
jaleco em cada um desses lugares. Em cada sala/cada etapa usa-se pipetas
e ponteiras que s ficam naquela sala para evitar contaminar. Um pcr
negativo ser que negativo mesmo?! Faz-se sempre com os controles e
sempre tem que fazer controles internos para no obter falso negativo.
Alm de diagnosticar voc pode caracterizar o gentipo/variante do vrus
(saber que tipo de gentipo naquele virus), isso importante para
caracterizar os vrus circulantes. Consegue tambm avaliar a carga viral
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da amostra, podendo assim ajudar pacientes que esto fazendo o uso de
retrovirais e saber se a teraputica esta funcionando.
Outra tcnica molecular a hibridizao, voc tem que ter uma suspeita
do genoma do vrus que esta na amostra porque tem que fazer uma sonda (a
sonda uma sequencia de bases complementar a aquela do vrus que voc
esta pesquisando). Vo fazer pontes de hidrognio e a sonda vai grudar
se tiver o genoma do vrus. Inicialmente fixa-se o tecido, trata com
proteases para tirar as protenas, faz um aquecimento para abrir o cido
nucleico, incuba com a sonda, se a sonda for para aquele vrus que
estamos procurando ela vai fazer pontes de hidrognio de forma
complementar. Geralmente essa sonda est marcada com fluorocromo e
aquele tecido fica corado e a voc identifica o vrus.
Southern blot e Northern blot (no faz o genoma completo do vrus que
voc est procurando) geralmente usa-se enzimas de restrio que vai
clivar o genoma do vrus em determinados locais usa o padro no gel e
padro de peso molecular, a voc compara as bandas, da voc sabe que
aquele tamanho de banda especfico de um vrus. Faz a transferncia
para uma membrana de imunocromatografia e usa-se uma sonda marcada e
depois expe ao raio x ou pode usar uma sonda marcada com enzima e
substrato. O Southern blot usa-se para DNA e Northern para RNA. ***no
entendi quase nada do que ela falou sobre esses mtodos, ela falou muito
confuso***
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O que um PCR? Voc vai usar uma enzima que vai pegar primers que so
complementares a sequencia do genoma alvo e vai copiar esse genoma
milhares de vezes, no final vai usar um gel para detectar essa banda
correspondente ao tamanho do genoma que voc amplificou. uma reao de
sntese de regies especificas de um dna alvo, voc programa os ciclos
na maquina e no final voce tem o produto da pcr. Voce tem uma regio pre
determinada pq tem que mandar desenhar os primers para no ficar sem
regio. Se voce no sabe qual virus que pode-se usar primers
randmicos que uma mistura de todos os primers que existem, vai ligar
em qualquer genoma e amplificar qualquer coisa mas tem um problema
porque depois voce vai ter que sequenciar e jogar no Gen bank ) para
pesquisar qual virus que . O pcr comea com a extrao do DNA alvo onde
voce vai usar uma substancia quimiotropica que para protenas (pode
ser fenol ou isotiocianato de alguma coisa que no deu para entender),
vai clivar essa protena/capsdeo viral liberando o acido nucleico do
virus eai faz o pcr. Voce precisa de um tampo para enzimas,
nucleotdeos especficos, dntp que atuam como tijolos para enzima copiar
o genoma, primers, e a enzima, termociclador (que voce controla o tempo
e a temperatura) e depois identificar com o gel. No final tem que
precipitar o acido nucleico e ai vai solubilizar em agua ou tampo, tem
que lembrar que aquele material clinico vai ter outros genomas (o
prprio do paciente e bactrias por exemplo), o genoma do virus tem
baixo peso molecular. No tubinho de pcr voc tem ento o pedreiro que
a dna polimerase, o ajudante que o magnsio, dntps (tijolos) e os
primers.
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Os primers so sequencias de bases que voc manda fazer para determinado
virus, tem o comprimento certo, ele delimita a rea que vai amplificar,
um ponto de apoio para a enzima comear a polimerizao. A enzima
sempre atua no sentido 5---3. Ele tem que anelar em uma nica
sequencia, no pode ter complementariedade das extremidades pq se no
vo se auto anelar.
O PCR pra quando o alvo DNA. RT-PCR pra quando o alvo RNA, a
voc converte o rna para dna complementar (a sim faz o pcr), antes tem
que usar uma transcriptase reversa para fazer a converso e depois taq
para amplificar. O Nested PCR pra quando voc quer amplificar a regio
muitas vezes ou quer aumentar a sensibilidade ou j genotipar.
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