Protocolo Dosagem de Espcies Reativas de Oxignio (EROs)

Princpio da Tcnica:

A produo de EROs intracelular mensurada por meio do Kit Image-iT LIVE

Green Reactive Oxygen Species (Invitrogen), que permite a deteco de EROs
intracelular por fluorescncia. A tcnica utiliza um marcador fluorognico (5-ou-6)-
carboxy-2,7 dichlorodihydro fluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA), que quando
quebrado por esterases intracelulares no especficas gera a molcula carboxy-DCFH
que reage com as EROs tornando-se fluorescente.

Material Utilizado:

- 1 Garrafa mdia de clulas;

- Tripsina;
- Rodinho;
- Microtubos 0,6 mL novos e estreis;
- Ponteiras de 200L novas e estreis;
- Azul de Tripan;
- Cmara de Neubauer;
- Placa branca de poliestireno de 96 poos;
- Meio RPMI sem vermelho de fenol;
- Tampo HBSS;
-Tubos Falcons novos e estreis;
- Sonda carboxy-H2DCFDA;

- Controle Positivo: Hidroperxido tert-butil (TBHP- um indutor da produo de

EROs);
- Cochinho;
- Pipeta multicanal;
- Papel alumnio para envolver a placa.

Preparo do Tampo HBSS (Soluo Salina Equilibrada de Hanks):

- 0,2g- KCl
- 0,045g -Na2HPO4 . 7 H2O
- 0,03g - KH2PO4
- 0,07g- CaCl2
- 0,05g MgCl2 . 6 H2O
- 0,5g glicose
-0,175- NaHCO3
- 4g NaCl
H2O mili-q (q.s.p.) para 500mL
Ajustar o pH para 7,4 e esterilizar por filtrao.

Procedimento Experimental:
1) Contagem e viabilidade das clulas (para fazer o experimento necessrio que a
viabilidade celular seja > 70%).
*Considerar poos para CONTROLE DE CLULAS SEM SONDA (CC), CONTROLE DE
CLULAS COM SONDA (CS), CLULAS + VRUS + SONDA (VS), CLULAS + CP (CP),
RPMI SEM CLULAS (R) para os diferentes tempos analisados.

- Descartar o meio velho da garrafa;

- Lavar 1x com PBS 1x;
- Adicionar 3mL de DMEM normal, 5% SFB;
- Raspar com rodinho;
- Em um microtubo colocar 50L de clulas + 50L de Azul de Tripan
(Diluio 1:1);
- Contar na cmara de Neubauer o nmero de clulas e avaliar a viabilidade
(Clulas viveis - Transparentes/ Clulas no viveis - Azuis);
- Fazer o clculo do nmero de clulas necessrias para fazer o experimento,
considerando que so utilizadas 100L/ poo. Quantidade de clulas/ poo: 2,5x
104

Exemplo:
1) 1 poo 2,5 x 104 cel 2) Contou-se 385 clulas nos 4 quadrantes:
45 poos x 385/4 x 104 (Fator de correo da cmara) = 9,62 x 10 5 cel
x = 1,125 x 106 clulas 9,62 x 105 - 1mL
1,125 x 106 cel - x
x = 1,17 mL de clulas (3.330 mL DMEM 5% + 1,17 mL de clulas)

- Adicionar 100 L/poo e esperar 40 min para adeso superfcie da placa (37/
5%CO2);
2) Aps a aderncia, retirar o meio e lavar 2x com HBSS;

3) Adicionar o vrus nos poos destinados aos tempos 3, 6, 24 e 48 h e meio RPMI nos
demais poos (100L/ cada) (o tempo de 15h deve ser feito na parte da tarde, para ser lido
junto com o tempo de 24h);

Preparo do vrus:

Diluir o vrus 10x para que se reduza a quantidade de meio com vermelho de fenol =
450 L RPMI + 50 L MAYV.

MOI 5 = 5 vrus 1 clula

x -- 2,5 x 104 clulas
x = 1,25 x 105 vrus/poo

ttulo = 1 x 108 vrus 1000 microlitros

1,25 x 105 y
y = 1,25 L/poo = como o vrus foi diludo 10 x, deve-se colocar 10x
mais, ou seja, 12,5 L/poo.
Ex.: Para 10 poos = 100 L/poo = 1000 L de meio + vrus = 875 L RPMI +
125 L vrus.

4) A sonda deve ser colocada meia hora antes de cada tempo analisado e 1h antes de se
colocar a sonda deve-se adicionar o CP:
- Descarta-se o meio dos poos destinados ao CP, lava-se 1x e adiciona 100 L do CP.
Ex.: Para 10 poos = Diluir 1 L de TBHP estoque + 999 L estoque (homogeneizar
bem).

5) Os procedimentos a seguir devem ser feitos no escuro:

Meia hora antes da leitura, retirar o meio, lavar 1x, colocar 100 L da sonda nos
respectivos poos e 100 L de HBSS nos demais poos.

Diluio da Sonda

Soluo Estoque (SE) = 50L de DMSO + 1 potinho da Sonda (Concentrao final: 10

mM)

Soluo Trabalho (ST) = Diluir a SE 400x: Para 500L = 1,25L da SE em 498,75L

do HBSS.
Ex.: 105 poos com sonda = 10.500 mL = 26,25 L sonda + 10.473,75 mL HBSS.
6) Incubar a placa na estufa por 30 min, envolvida em papel alumnio;

7) Aps a incubao, descartar o meio de todos os poos, lavar 1x e adicionar RPMI em

todos os poos que ainda no tenham esse meio;

8) Fazer a leitura no Victor X3 Protocolo ROS-DCFDA (intensidade de fluorescncia

495/529 nm).