FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

DEPARTAMENTO DE INGENIERA AMBIENTAL

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

Prof. Nelson Vega

ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA

(Lactuca sativa L.)

1. INTRODUCCIN

El efecto txico o la respuesta txica es cualquier cambio en el funcionamiento normal

del organismo que ha sido producido por la exposicin a una sustancia txica, para
este efecto se consideran solamente los cambios irreversibles o que permanecen un
periodo prolongado despus de la exposicin. Para el efecto de toxicologa ambiental
las exposiciones se clasifican en exposiciones crnicas, subcrnicas y agudas. Las
exposiciones crnicas duran entre el 10 % y el 100% de la vida del organismo, las
exposiciones crnicas son menores al 10% del periodo vital y las exposiciones agudas
suceden en un solo evento y abarcan periodos cortos como de 24 a 120 horas (1). El
objetivo de realizar pruebas de toxicidad aguda es identificar el potencial toxicolgico
de compuestos qumicos ya sean comerciales o presentes en el ambiente. Este tipo de
pruebas son ms factibles de hacer debido a que el tiempo de exposicin es corto.

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba

esttica de toxicidad aguda (120 horas de exposicin) en el que se pueden evaluar
los efectos fitotxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de
germinacin de las semillas y en el desarrollo de las plntulas durante los primeros
das de crecimiento. Como puntos finales para la evaluacin de los efectos fitotxicos,
se determina la inhibicin en la germinacin y la inhibicin en la elongacin de la
radcula y del hipocotilo (Figura 1). Es importante destacar que durante el perodo de
germinacin y los primeros das de desarrollo de la plntula ocurren numerosos
procesos fisiolgicos en los que la presencia de una sustancia txica puede interferir
alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una
etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas
de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayora de las
semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la
aplicacin de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en
semillas o plntulas en general. El xito o aptitud de una plntula para establecerse en
un ambiente determinado es de gran importancia para garantizar la supervivencia de
la especie. La evaluacin del desarrollo de la radcula y del hipocotilo, constituyen
indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y
desarrollo de la planta.
A diferencia de la prueba tradicional de germinacin de semillas, la evaluacin del
efecto en la elongacin de la radcula y del hipocotilo de las plntulas permite ponderar
el efecto txico de compuestos solubles presentes en niveles de concentracin tan
bajos que no son suficientes para inhibir la germinacin, pero que sin embargo pueden
retardar o inhibir completamente los procesos de elongacin de la radcula o del
hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de accin del compuesto. De esta
manera, la inhibicin en la elongacin de la radcula e hipocotilo constituyen
indicadores subletales muy sensibles para la evaluacin de efectos biolgicos en
vegetales, aportando informacin complementaria a la proporcionada al estudiar el
efecto en la germinacin. Este ensayo puede ser aplicado para la evaluacin de la
toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ros), aguas
subterrneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domsticas e
industriales, adems de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices
slidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras
pruebas en las que se consideran algas o plantas acuticas sumergidas como
organismo de diagnstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de
muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de
filtracin previa, reducindose as las interferencias debidas al pretratamiento y
simplificando el procedimiento de prueba.

Figura 1. Proceso de germinacin y morfologa de la semilla y la plntula de lechuga

Lactuca sativa L.

2. OBJETIVO

Evaluar los efectos fitotxicos de una solucin que contiene un elemento

contaminante, en el proceso de germinacin de las semillas y en el desarrollo de las
plntulas de lechuga (Lactuca sativa L.) durante los primeros das de crecimiento.

3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

*Semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad mantecosa

Cajas Petri de 100 mm de dimetro
 Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumtricas de 1, 2, 5 y 10 mL
Regla u otro elemento de medicin
Pinzas
Toallas de papel
Bolsas plsticas
**Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de dimetro.

*Las semillas de lechuga se adquieren en establecimientos locales, procurando

que sean semillas sin ningn tratamiento (sin fungicidas o plaguicidas), con buen
poder germinativo y baja variabilidad en la elongacin de la radcula e hipocotilo.
**El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinacin debe tener las
siguientes caractersticas: trama amplia y porosa que asegure una buena
capacidad de retencin de lquido; resistencia de la fibra del papel para que las
radculas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situacin que dificultara la
remocin de las plntulas sin daarlas; ausencia de residuos txicos (por ejemplo,
blanqueadores; y que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las
semillas).

4. METODOLOGA

De acuerdo al esquema de la figura 2, el procedimiento del ensayo de toxicidad que

realizars, deber seguir los pasos enlistados:

Colocar en cada una de 6 cajas Petri numeradas (C1 ..C6) un disco de papel
filtro.
Colocar en las cajas 5ml de las siguientes diluciones:
(evitando que se formen bolsas de aire).
C1. Control negativo1: agua dura reconstituida
C2. Control negativo 2: agua de crecimiento.
C3. Control positivo: 15 mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C4. Solucin problema 1: 2,5mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C5. Solucin problema 2: 5mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C6. Solucin problema 3: 10 mg/l de CuSO4 o ZnCl2
Etiquetar cada caja con los siguientes datos: solucin, fecha y hora de inicio y
trmino, materia, grupo y equipo.
Con la ayuda de una pinza colocar 20 semillas en cada caja, uniformemente
distribuidas en toda la caja. Tapar las cajas.
 Colocar las cajas en bolsas de plstico negras, para evitar la prdida de agua
por evaporacin y para no inhibir la germinacin, debido a que las semillas son
fotoblsticas negativas.
Incubar a 22 C durante 120 horas.
Realizar 3 repeticiones para cada ensayo.

Figura 2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con

semillas de lechuga Lactuca sativa L.

Bibliografa:
Pea E. Carlos, Dean E. Carter y Ayala-Fierro Felix. 2001. Toxicologa Ambiental:
Evaluacin de Riesgos y Restauracin Ambiental. Distribuido en internet va
Southwest Hazardous Waste Program website
http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/.