BIOQUIMICA AVANZADA Reporte de Evaluacin

Universidad Autnoma De Chihuahua

Facultad De Ciencias Qumicas

MAESTRIA EN BIOTECNOLOGIA
BIOQUIMICA AVANZADA

Evaluacion N o. 2
Amilasas

Titular: Dra. Ma. Rosario Peralta Prez

INTEGRANTE:

Luis Varela Rodrguez 199298

FECHA DE ENTREGA: 05 de Octubre de 2010

CALIF: 90

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INTRODUCCIN

El almidn es un polisacrido constituido principalmente por largas cadenas de glucosa, en su forma

nativa esta constituido por -amilasa y amilopectina. Es el principal polisacrido de reserva de origen
vegetal, es ms abundantemente en semillas de cereales y tubrculos. (Vargas y Silver, 2002).

Las amilasas son enzimas extracelulares que se encuentran ampliamente distribuidas en la

naturaleza, son las responsables de la hidrolisis del almidn, cortando cadenas de azucares en
cadenas mas cortas, actan sobre los enlaces -(1-4) y/o (1-6). Tiene una actividad enzimtica
que oscila entre 53-129 U/L, y un peso molecular que va de los 40 000 a 50 000 Da.
Se pueden dividir en tres grupos: a-amilasas (E.C. 3.2.1.1), las cuales rompen al azar los enlaces en
el interior del sustrato (endoamiladas); b-Amilasas (E.C.3.2.1.2) las cuales hidrolizan ordenadamente
unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores del sustrato (exoamilasas) y
glucoamilasas que liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores del sustrato.
(Vargas A y Silver L, 2002).

Las b-amilasas hidrolizan el almidn atacndolo nicamente por su extremo no reductor y produce
molculas de maltosa y dextrinas bsicamente; debido a que no hay una inmediata destruccin de la
estructura polimrica del almidn, la b-amilasa reduce la viscosidad de las dispersiones de almidn
en forma muy lenta, a las a-amilasa se la designa como enzima licuante ya que al hidrolizar los
enlaces qumicos del almidn en una forma al azar, reduce rpidamente la viscosidad de las
dispersiones de este polmero, el producto de esta hidrlisis son dextrinas, maltosa y glucosa, por lo
que el poder reductor de las dispersiones de almidn aumenta considerablemente.

1. Fuente donde se produce a gran escala.

Las amilasas pueden ser producidas por una gran variedad de seres vivos que incluyen a animales,
plantas, bacterias y hongos; Esta enzima tiene importancia en la industria alimentaria como en
cervecera, dulcera, cereales y panadera, y especficamente en la sacarificacin maltognica

Las enzimas de origen microbiano presentan mayores ventajas tcnico-econmicas industrialmente

ya que: poseen tiempos de generacin menores, tienen requerimientos de espacio menor por unidad
de enzima producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la disponibilidad de nuevas enzimas.
Por tanto, estos organismos son los ms importantes en la produccin a nivel industrial de amilasas.
(Castro, et al)

Las alfa-amilasas pueden obtenerse a partir de:

origen fngico. Se producen por fermentacin de una cepa del hongo Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae
Bacteriana. Se produce a partir de la bacteria Bacillus subtilis, y es muy resistente al calor
por lo que a temperaturas de 70 a 90 C alcanza su mxima velocidad de reaccin
de origen cereal (harina de malta). Su elaboracin consiste en la germinacin del trigo para
que se movilicen las alfa-amilasas naturales del grano.

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Las amilasas estn presentes en:

la mayora de las plantas superiores (trigo, malta de cebada, papa dulce y soya)
ausentes en los mamferos
existencia en microorganismos dudosa.

La Amiloglucosidasa (Glucoamilasa) se obtiene de:

Origen fngico. El Aspergillus rhizopus, y acta sobre las dextrinas produciendo glucosa, lo
que se traduce en una aceleracin de la fermentacin.

La industria del almidn es una de las principales usuarias de amilasas para la hidrlisis y
modificacin de esta materia prima con el fin de obtener glucosa, maltosa y oligosacridos, que
pueden ser convertidos en jarabes de fructosa y dextrosa. La glucosa obtenida, tambin puede ser
fermentada para producir etanol, aminocidos y cidos orgnicos.

La a-amilasa procedente de Aspergillus oryzae fue la primera enzima microbiana producida a escala
industrial y comercializada (Takamine, 1894).

En la actualidad el Aspergillus oryzae es el microorganismo ms ampliamente utilizado como fuente

productora de a-amilasa de origen fngico y bacterias del genero bacillus como bacillus subtilis
principalmente

2. Metodologa de purificacin

El desarrollo y comercializacin de nuevos productos a travs de la biotecnologa requiere una

adecuada coordinacin y disposicin de las operaciones unitarias con el fin de disear procesos
eficaces que permitan alcanzar los objetivos especficos planteados. De forma general, los objetivos
de un proceso son los de obtener productos de alto valor aadido a partir de materias primas
relativamente baratas.
La operacin central de un proceso biotecnolgico es la ocupada por el bioreactor, lugar donde se
transforman las materia primas en productos mediante biocattisis, fermentacin o cultivo celular.
Sin embargo, esta etapa no tendra utilidad prctica si se encontrase aislada.
Es necesario realizar una preparacin y un pre-tratamiento adecuado a las materias primas y una
posterior separacin y purificacin del producto o productos de valor generados en el bioreactor.

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Las operaciones unitarias de separacin basan su eficacia de trabajo en la explotacin de una

propiedad caracterstica diferenciadora entre el producto de inters y el resto de los componentes de
la mezcla. Los efluentes de los biorreactores suelen ser complejos, formados por un gran nmero de
sustancias con caractersticas similares. Esto hace necesario utilizar diferentes procedimientos en
serie para lograr la purificacin final del producto de inters. Comentario [VAC1]: Todo esto sale
Las operaciones unitarias de separacin habituales en procesos biotecnolgicos, son: sobrando, se pidi la metodologa de
purificacin nicamente

La produccin de una enzima, incluye dos etapas principales: la fermentacin, en la que se multiplica
el microorganismo productor de la enzima, y la de recuperacin y purificacin en la que se asla la
enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso.
La calidad de la enzima esta en funcin de la fermentacin, pues esta influye directamente en la
coloracin, olor y estabilidad de la enzima.

NOTA.- En la industria se utilizan ms los preparados enzimticos, pues la purificacin de la enzima

podra representar costos adicionales en la produccin de alimentos.

Las a-amilasas bacterianas, y en especial aquellas provenientes de bacterias del gnero Bacillus
como B. subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una
amplia aplicacin en los procesos industriales gracias a sus rangos de temperatura ptima (25-
90C), resistencia a pH extremos (1.0-11.5) y altos niveles de expresin en comparacin con las
procedentes de hongos filamentosos como aquellos del genero Aspergillus, por lo que ocupan un
lugar importante en la industria, siendo ms adecuadas que aquellas para determinadas
aplicaciones.

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Aislamiento e identificacin del hongo Aspergillus oryzae Qu tiene que ver eso con lo
solicitado?

Esta suele ser a partir de una muestra de suelo.

El aislamiento se realiza en medio PDA y su identificacin se basa en las caractersticas fenotpicas

reportadas para esta especie.

Obtencin del inoculo

El micelio de Aspergillus oryzae fue suspendido en agua estril, con agitacin constante durante 10
min. se filtr sobre gasa estril en condiciones aspticas para retirar el micelio sobrenadante, y se
realiz el conteo de esporas con un hemacitmetro. Una suspensin de 1x107 esporas/mL se utiliz
para inocular los medios de fermentacin.

Medio de fermentacin y produccin enzimtica

Los medios de fermentacin se prepararon tomando como referencia el medio Czapcek-Dox (9), y
se suplementaron con CaCl2. Se formularon dos medios, segn la fuente de carbono, almidn de
yuca o yuca rallada, y se realizaron dos tipos de fermentaciones, FFS y FLS, en condiciones
estticas.

Para las FFS el medio se prepar con 10 g de almidn 10 g de yuca rallada, humedecidos con 10
mL de solucin de sales. El medio para la FLS contena 3,0 g de almidn de yuca 3,0 g de yuca
rallada, suspendidos en 100 mL de solucin de sales diluda 1:10. La solucin de sales contena
(g/100 mL de agua destilada): (NH4)2SO4, 3,00; MgSO4, 0,50; KCl, 0,50; FeSO4, 0,01; K2HPO4, 1,00;
CaCl2, 0,15.

Los medios se esterilizaron a 121 C y 15 psi por 15 min, se inocularon con 1 mL de suspensin de
esporas de Aspergillus oryzae y se incubaron a 22 C. Se hizo seguimiento cada 24 horas de la
produccin de la enzima. Para la FLS se separ el hongo mediante centrifugacin por 30 min a 8
000 rpm, en una centrfuga MLW modelo T52; el sobrenadante constituy el extracto crudo. En el
caso de la FFS se adicionaron 50 mL de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0, se agit mecnicamente
durante 30 min en un agitador de placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscilaciones completas por
minuto, se filtr la solucin sobre algodn y se centrifug por 30 min a 8 000 rpm, el sobrenadante
constituy el extracto crudo. Se tomaron 10mL de cada extracto crudo y se dializaron contra agua
destilada para realizar medidas de concentracin de protena y actividad enzimtica.
El trabajo se continu empleando la FFS con yuca rallada, por ser el medio en el cual se obtuvo la
mayor produccin de enzima.

Produccin de la enzima por fermentacin en fase slida

Se emplearon bandejas de aluminio (22,50 cm X 16,50 cm X 2,50 cm), en cada una se puso una
capa de 1 cm de espesor aproximadamente de la mezcla de 100 g de yuca rallada y 100 mL de
solucin de sales. Las bandejas con el medio se esterilizarona121 Cy15psi durante 15 min y se
inocularon con 3 mL de la suspensin de esporas. La incubacin se realiz a 22 C durante siete
das. Para obtener el extracto crudo se aadieron 150 mL de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0, se agit
mecnicamente durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placa MLW modelo
Thys 2 a 80 oscilaciones completas por minuto, y se filtr la solucin sobre algodn para retirar los
slidos gruesos. Al residuo se le realiz una segunda extraccin bajo las mismas condiciones y se

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juntaron los dos extractos. El filtrado total se centrifug a 8 000 rpm por 30 min, en una centrifuga
MLW modelo T52, el precipitado se descart y se obtuvo un sobrenadante con un volumen de 2085
mL. De este sobrenadante se tomaron 100 mL para realizar ensayos preliminares de precipitacin
fraccionada con sulfato de amonio.

Determinacin de actividad enzimtica y cuantificacin de protenas

Para medir la actividad -amilasa se utiliz el mtodo de Nelson-Somogyi (12). La mezcla de
reaccin contiene 1 mL de solucin de almidn soluble al 1% (p/v), 200 ,L de una dilucin
apropiada de la muestra que contiene la enzima, y 800 ,L de CaCl2 5mM. Luego de 20 min de
reaccin a 37 C, se adicionan 500 ,L del reactivo de Somogyi y se lleva la mezcla a un bao Mara
a temperatura de ebullicin. Pasados 10 min, se retira la mezcla del bao y se adicionan 500 ,L del
reactivo de Nelson, se completa el volumen a 10 mL con agua destilada y se realiza la determinacin
colorimtrica a 500 nm (espectrofotmetro Genesys 5).

Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que libera 1,g de
glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo, 37 C, pH 6,0. La actividad especfica se define
como las unidades de actividad por miligramo de protena.
La concentracin de protenas fue determinada por el mtodo colorimtrico de Bradford (13),
empleando albmina srica bovina como protena patrn.

Purificacin de la enzima Comentario [VAC2]: Esto si es lo

pedido

Precipitacin con sulfato de amonio

El extracto crudo fue sometido a precipitacin fraccionada con sulfato de amonio. La fraccin con la
protena de inters precipit entre 50 y 80% de saturacin. Este precipitado se disolvi en el mnimo
volumen de agua destilada, se dializ 24 h contra agua destilada y se liofiliz.

Cromatografa de intercambio aninico

El liofilizado de la etapa anterior se disolvi en el mnimo volumen de buffer fosfato 50 mM, pH 6,0, y
se aplic a una columna de DEAE Sephadex A-50 (2,5 x 30,0 cm) equilibrada con el mismo buffer.
La elusin se realiz por medio de un gradiente discontinuo de fuerza inica (NaCl 0,1 a 0,5 M). La
velocidad de flujo fue de 30 mL/h. A cada fraccin (5 ml) se le midi la absorbancia a 280 nm y la
actividad enzimtica. Las fracciones que contenan la protena de inters, se mezclaron en un pool
(pool DEAE-pico II), que se dializ contra agua destilada y se liofiliz.

Cromatografa de filtracin por gel

El pool DEAE-pico II se disolvi en NaCl al 1% y fue sometido a cromatografa de filtracin por gel
sobre Sepha-dex G-75 (2,5 X 30,0 cm). La elusin de las protenas se realiz con NaCl al 1%. La
velocidad de flujo fue de 27 mL/h. A cada fraccin (4,5 mL) se le midi la absorbancia a 280 nm y la
actividad enzimtica. Las fracciones que mostraron mayor actividad enzimtica, se mezclaron en un
pool (pool G-75-pico II) que se dializ contra agua destilada y se concentr por liofilizacin.

Cromatografa de intercambio catinico

El pool G-75-pico II se disolvi en buffer fosfato0,05M,pH7,0yfue sometidoa cromatografa de
intercambio catinico sobre CM Sephadex C-50 (2,5 x 30,0 cm). La elusin se realiz por medio de
un gradiente discontinuo de fuerza inica (NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. A
cada fraccin (4,5 mL) se le midi la absorbancia a 280 nm y la actividad enzimtica. Las fracciones

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que contenan la protena de inters, se mezclaron en un pool (pool CM-pico I)? que se dializ
contra agua destilada y se liofiliz.

Caracterizacin de la enzima

Determinacin del peso molecular por electroforesis en condiciones desnaturalizantes

Se corrieron electroforesis SDS-PAGE (14), con geles de poliacrilamida al 12%, los cuales se tieron
con azul de Coomassie. Los marcadores de peso molecular empleados fueron de la marca Bio-Rad,
con las siguientes protenas como estndares: fosforilasa B (104 kDa), albmina de suero bovino (83
kDa), ovoalbmina (49 kDa), anhidrasa carbnica (37 kDa), inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa)
y lisozima (20 kDa).

Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de la enzima

El pH ptimo de la enzima fue determinado realizando medidas de actividad en un rango de pH entre
2,0 y 12,0 a 37 C. Para establecer el efecto del pH sobre la estabilidad, la enzima fue incubada a 37
C por 1 h en diferentes buffers en un rango de pH entre 2,0 y 12,0 y la actividad residual fue
determinada bajo las condiciones normales del ensayo. Se usaron buffers glicina-HCl, acetato-
actico, fosfato y glicina-NaOH, todos con concentracin 100 mM.

Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de la enzima

La temperatura ptima de la enzima fue determinada en un rango de temperatura entre 0 y 92 C en
buffer fosfato 100 mM, pH 6,0. El efecto de la temperatura sobre la estabilidad fue establecido
incubando por 1 h la enzima en buffer fosfato 100 mM, pH 6,0 en un rango de temperatura entre 40 y
92 C. La actividad residual fue determinada bajo las condiciones normales del ensayo.

Efecto de la concentracin de sustrato

Se utilizaron siete concentraciones diferentes de almidn soluble (0,2-1,4 mg/mL). Las mediciones
de actividad se realizaron bajo las condiciones normales del ensayo. La mezcla de reaccin contena
100 ,L de enzima purificada; 100 ,L de CaCl2 5 mM; 800,L de buffer fosfato 100 mM, pH 6,0, y 1
mL de solucin de almidn. La estimacin de Km y Vmx se realiz a partir de la linealizacin de Li-
neweaver-Burk.

Efecto de algunos iones metlicos, EDTA y SDS sobre la actividad enzimtica

Se utilizaron las siguientes sales: CuSO4.5H2O, CaCl2.2H2O, LiCl, FeCl3.6H2O, AgNO3, HgCl2, BaCl2
y CoCl2. La concentracin final de sal en la mezcla de reaccin para todos los casos fue 1,0 mM. La
enzima, previamente dializada contra agua destilada, se incub con la solucin de la sal durante 30
min a 37 C, luego se determin la actividad residual bajo las condiciones normales del ensayo. La
actividad sin adicin de los iones metlicos fue definida como de 100%. Para medir los efectos de
EDTA y SDS, la enzima fue incubada con el componente respectivo por 30 min a 37 C, luego se
realiz la medicin de actividad enzimtica residual bajo las condiciones normales del ensayo. La
concentracin final en la mezcla de reaccin para ambos compuestos fue 10 mM. La actividad en
ausencia de EDTA y SDS fue considerada como de 100%.

Capacidad para hidrolizar el almidn de yuca y productos de hidrlisis

Los productos finales de hidrlisis luego de 10, 20, 30 y 60 min de incubacin fueron evaluados
segn Hmidet et al. (15), mediante comparacin con patrones de glucosa y maltosa en una
cromatografa de capa delgada (silica gel 60 F254 Merck), la fase mvil fue cloroformo/actico/agua

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(70:60:10, v/v/v) y el revelado se hizo con H2SO4/metanol (5:95, v/v). Los productos de hidrlisis
fueron observados como manchas oscuras luego de adicionar el revelador y calentar a 120 C por 3
min.

Aislamiento e identificacin de la bacteria Bacillus spp. Y esta para que? Con una bien
analizada es suficiente. Tambien es un arte aprender a sintetizar la informacin, escribes muy
bien y analizas bien

Caracterizacin y cultivo del microorganismo

El microorganismo se asla a partir de una muestra de suelo y se caracteriza bioqumicamente con
una prueba API 50 CH (API, BioMerieux), O molecularmente con la secuenciacin del gen ribosomal
16S (16S ADNr ). La amplificacin de este gen se lleva a cabo mediante PCR, con los cebadores pA
(5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3) y pC5B (5TACCTTGTTACGACTT3). Posteriormente puede
buscarse La similitud con otras secuencias por medio de una bsqueda con un programa como
BLAST.

El anlisis de la secuencia del gen ribosomal 16S confirma que la bacteria pertenece al gnero
Bacillus pero no da claridad sobre la identidad de la bacteria a nivel de especie.
En el caso de especies B. subtilis o B. amyloliquefaciens, estos no pueden ser diferenciadas
fcilmente por mtodos bioqumicos, por lo que es necesario el anlisis de secuencias adicionales,
como la regin ITS 16S23S, para la determinacin a nivel de especie de estas bacterias.

El crecimiento del microorganismo se lleva a cabo en medio de cultivo LB, suplementado con 1% de
almidn soluble e inoculado con esporas previamente activadas (con 1% del volumen final del medio
de cultivo), en condiciones de 40C y 180 rpm durante 60 horas. El extracto enzimtico se obtiene
centrifugando por 20 minutos a 7000g.
Al crecer la bacteria en un medio solido con almidon al 1% y tincin con yodo se aprecia la presencia
de halos de degradacin caractersticos de la produccin de amilasas

Purificacin de la a-amilasa
La enzima se precipita a partir del extracto enzimtico que se obtiene mediante adicin de sulfato de
amonio hasta una saturacin del 40%, incubando en hielo por 20 minutos y colectando por
centrifugacin (20 minutos a 7000g, 4 C).
El pellet que se forma es re-suspendido en un volumen mnimo de tampn citrato (50 mM, pH 6.0) y
se pasa a travs de una columna Biogel P100 pre-equilibrada con una solucin de citrato. Se toman
fracciones de 1 ml y se seleccionan aquellas con actividad amiloltica. El grado de pureza es
evaluado mediante la relacin actividad/[Protena total] y electroforesis en Gel de poliacrilamida 10%
(SDSPAGE). El cual revela el peso aproximado de la enzima, que es de 77.6 kDa y el punto
isoelctrico inferior a 6.8, ya que esta migra como un anin en las condiciones de corrida
La concentracin de protena se estima mediante el mtodo de Bradford.

Prueba enzimtica
Se toman 700 ml de solucin de almidn soluble al 1% en tampn citrato (50 mM, pH
6.0), se adicionan 100 ml de extracto enzimtico y se incuba durante 45 minutos a la temperatura
establecida. Para detener la reaccin se toman 40 ml del extracto anterior y se adicionan a 1 ml de
HCl 0.1 N. A la mezcla anterior se le agrega 40 ml de yodo de Gram y se mide la absorbancia a 660
nm. Como estndar se utiliza una curva patrn con almidn soluble sin enzima. Las unidades de

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actividad se definen como el porcentaje de disminucin en la absorbancia respecto al control

negativo, as:
Actividad = (AC660A660)/ AC660.

Caracterizacin de la enzima
La temperatura ptima de la a-amilasa se estima mediante la prueba del lugol en un rango de
temperaturas entre 30 C y 90 C en tampn citrato almidn 1% a pH 6.0. As la termoestabilidad de
la enzima se estima mediante incubacin del extracto crudo en un rango de temperaturas entre 30C
y 90C por quince minutos y con medicin de la actividad residual. El pH ptimo de la a-amilasa se
determina mediante medicin de la actividad en un rango de acidez entre 2.0 y 13.0 utilizando los
siguientes tampones: BisTris/HCl (pH 5.5-7.0), Tris/HCl (pH 7.5-8.5) y glicina/NaOH (pH8.5-10.5).
El efecto de diferentes concentraciones de calcio y EDTA se evala en buffer citrato suplementado
con NaCl (50mM, 100mM, 200mM, 400mM y 800mM), CaCl2 (1 mM, 10 mM y 100 mM) y EDTA
(1mM, 10 mM y 100 mM).

Efecto del Calcio y EDTA

Una caracterstica de la a-amilasas es el requerimiento de iones de calcio para mantener la
integridad estructural y mejorar la estabilidad trmica
La remocin del calcio mediante la adicin de agentes quelantes tiene un efecto negativo sobre la
estabilidad y tasa cataltica de estas enzimas.

Una de las caractersticas ms interesantes en la amilasa de bacillus subtilis es su baja dependencia

del calcio para estimular su actividad. ya que a concentraciones de 200 ppm se logra observar una
leve mejora de la actividad respecto al control positivo. Eso se confirma con la incapacidad del EDTA
de disminuir la actividad cataltica. Las amilasas que no requieren calcio son bastante raras, siendo
una excepcin la amilasa aislada a partir de Bacillus sp. KSMK38 (Amyk38) la cual requiere iones de
sodio como sustituto. Sajedi et al. Reportaron una enzima con caractersticas similares a esta
aislada a partir de Bacillus sp. KR8104 (KRA), cuya actividad es independiente de la presencia de
iones Ca 2+ , es activa a bajo pH y presenta una alta resistencia a la adicin de EDTA.

El efecto de algunos iones metlicos, del EDTA y del SDS sobre la actividad enzimtica de la -
amilasa de Aspergillus oryzae se evidencia. Ya que Las -amilasas son protenas pequeas que
contienen por lo menos un in Ca2+ por molcula. La cantidad de iones Ca2+ puede variar de uno a
diez dependiendo del origen de la enzima. De acuerdo con Gupta, et al, para lograr una completa
remocin de los iones Ca2+ no basta con dializar contra agua destilada, se hace necesario tratar la
enzima con EDTA o EGTA. Adems, segn Nielsen, et al., de los tres iones calcio (CaI, CaII, CaIII)
que la -amilasa de Bacillus halmapalus contiene, es posible remover CaIII sin observar cambios
estructurales significativos, pero no CaI o CaII. Lo anterior justifica que luego de la dilisis contra
agua destilada no se genere prdida total de la actividad enzimtica y, por lo tanto, se pueda evaluar
el efecto de los iones escogidos, del EDTA y del SDS.

Como se puede notar, Ca2+,Ba2+ y Ag+ aumentan significativamente la actividad de la enzima, siendo
el in Ca2+ el que tiene el ms alto poder activador. El efecto activador del calcio puede estar
relacionado con interacciones adicionales favorables que contribuyen a la neutralizacin de las
cargas negativas en la de los dominios estructurales A y B de la enzima. Cu2+ no altera

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significativamente la actividad de la enzima, mientras que Li+ y Fe3+ la disminuyen ligeramente y

Co2+ y Hg2+ la disminuyen considerablemente.

La inhibicin por iones mercurio sugiere, tal como lo indican Li, et al., que residuos aminoacdicos
con grupos sulfihidrilo o imidazol son importantes en la funcin de la enzima. Esta afirmacin
concuerda con el hecho de que varios residuos de histidina (His210, His122, numeracin para Taka
amilasa) estn implicados en el mecanismo cataltico de las -amilasas. El agente quelante EDTA y
el surfactante SDS tambin mostraron accin inhibitoria sobre la actividad de la enzima. La inhibicin
que ocasiona el EDTA apoya la sugerencia de que la -amilasa de Aspergillus oryzae contiene
calcio, y que su actividad es dependiente de este in. En cuanto al SDS, se corrobora su efecto
sobre la estructura terciaria de la enzima, sin que se presente completa desnaturalizacin con la
concentracin ensayada.

3. Obtencin de los parmetros cinticos de la amilasa ( KM y Vmax)

En estos parmetros se ven pequeas diferencias no muy significativas de la afinidad de la enzima

por su sustrato, as como la velocidad mxima de reaccin, dependiendo del lugar donde procede la
enzima amilasa, al igual que el sustrato de almidn al cual este pertenece.

Cintica de la reaccin con alfa-amilasa BAN 480 de Bacillus amyloliquefaciens

A continuacin se presentan los datos obtenidos (Cuadro2) y el comportamiento del sustrato durante
la reaccin (Grfico 1).

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Teniendo en cuenta el sustrato disponible en todo momento para la hidrlisis, se efectu el anlisis
de la reaccin de la hidrlisis siguiendo la teora de Michaelis-Menten.
Para aplicar la teora cintica de Michaelis-Menten es necesario presuponer que nada del producto
se revierte al sustrato inicial.

Teniendo en cuenta que la velocidad cataltica es igual al producto de la concentracin del complejo
ES y k3; la velocidad de formacin de ES es igual al producto de E, S y k1; la velocidad de
descomposicin de ES es igual al producto ES por la suma de k2 y k3.
Bajo condiciones de estado estacionario, se igualan las expresiones y se obtiene:
[ES] = Km [E] [S]
Donde,
Km = ( k2 +k3 ) / k1

La velocidad mxima se obtiene cuando los centros de la enzima se encuentran saturados de

sustrato.
V = Vmx { [S] / ([S] + [Km ] ) }

En este momento la expresin {[S] / ([S] + [Km ] ) } se aproxima a 1. Del cuadro 2, se tiene que la
velocidad mxima es aproximadamente:
Vmx 218.77g / h

Si se tiene en cuenta que cuando Vmx / 2 se tiene [S] = Km entonces,

V= Vmx / 2 109.385 g / h
[S] = Km 96.4 g / l

Se determin entonces, que la reaccin es de primer orden, donde la velocidad es exactamente

proporcional a la concentracin de un reaccionante. De acuerdo con esto, se estableci que tiempo
de reaccin adecuado es de dos horas para obtener una concentracin de almidn remanente del
9.1% del almidn inicial.

Los datos obtenidos concuerdan con los reportados anteriormente por otros autores como los
ejemplos aqu citados:

Purificacin y caracterizacin bioqumica de las amilasas extracelular e intracelular de la cepa

identificada como Streptococcus bovis de pozol presenta una tpica cintica de Michaelis-Menten de
primer orden con una:
Vmax=0.05679 umol/ml min y una Km=3.5058 mg/ml. AMILASA EXTRACELULAR
Vmax=0.03751 umol/ml min y una Km=1.6697 mg/ml. AMILASA INTRACELULAR

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la amilasa sobre el almidn en presencia de Cl : KM de 0.4 por ciento

Purificacin y caracterizacin bioqumica de las amilasas extraida del maiz

Michaelis-Menten amilasa con una Vmax=0.05679 umol/ml min y una Km=3.5058 mg/ml

4. Inhibidores de amilasa y tipo de inhibicin.

Las amilasas presentan como inhibidores enzimticos los siguientes:

Amynostatin-A, polifenoles, extractos metanlicos de tres especies vegetales de los gneros
Adiantum, Artocarpus y Justicia,

Los cuales provocan una inhibicin del tipo no competitiva ya que las amilasas cuentan con grupos
sulfihidrilos que son esenciales para su actividad, por lo que la enzima se inactiva por
oxidacin, por los metales pesados y sus sales.

En este caso, el inhibidor bloquea loas sitios activos de la enzima de modo irreversible; en ocasiones
se trata de la desnaturalizacin de la enzima, como cuando se aaden aniones o cationes que
precipitan las protenas. En otros casos la combinacin irreversible se hace con sustancias que
actan de manera especfica sobre ciertos grupos activos de la enzima, o sobre la conformacin o
estructura completa de ella.

Existen algunos inhibidores no competitivos que muestran cierta especificidad, como los agentes
bloqueadores del radical sulfhidrilo, -SH, presente en las cadenas laterales del aminocido cistena,

Hay enzimas que contienen iones metlicos indispensables para su actividad y que son susceptibles
a la accin inespecfica de agentes que afectan dichos iones; tal es el caso de las amilasas

Las inhibiciones comunes de las amilasas suelen estar dadas por condiciones extremas, acidas
y basicas, la enzima se desactiva en gran medida en un intervalo muy estrecho de pH. Bajo
incubacin a pH cido, la inactivacin de la a-amilasa de A. oryzae sigue una cintica de primer
orden, cuya constante aumenta parablicamente con la disminucin de la concentracin de protones
en el medio (Cansen el al., 1996).

Estos mismos estudios indican que el proceso de reactivacin de a-amilasa desactivada por cido
sigue tambin una cintica de primer orden, aunque la recuperacin de actividad no es, en ningn
caso, total. Este mecanismo de inactivacin propuesto supone la existencia de dos formas inactivas
de a-amilasa, una de las cuales est en equilibrio reversible con la forma original activa cuando se
aumenta el pH hasta valores neutros. La otra forma corresponde a una a-amilasa irreversiblemente
inactiva (Cansen.1994).

Respecto a la inactivacin trmica de la a-amilasa, cuando la temperatura aumenta por encima de

un cierto nivel, las enzimas en disolucin acuosa sufren un desplegamiento parcial causado por la
ruptura, inducida trmicamente, del equilibrio de interacciones no covalentes que mantienen la
estructura nativa de la molcula (Tomazic y Klibanov, 198&b). Esta desactivacin, que supone la
prdida estructural del centro activo, es completamente reversible si la temperatura se disminuye

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rpidamente hasta valores de estabilidad. Para tiempos de incubacin ms prolongados, el grado de

recuperacin de la actividad enzimtica no es total, lo que pone de manifiesto la existencia de un
proceso irreversible de desactivacin. La causa de este proceso se debe, probablemente, a un
proceso monomolecular conformacional de formacin de estructuras terciarias incorrectas
acompaado, en funcin del pH, de oxidacin de los residuos de cisteina o de desaminacin de los
residuos que contienen grupos amido.

La termoinactivacin irreversible puede evitarse, parcialmente, por adicin de substrato (Tomazie y

Klibanov, 1988b). En el caso de la a-amilasa de A. oryzae, se ha estudiado la inactivacin trmica
cuando se encuentra inmovilizada sobre soportes de diferente naturaleza (Ulbrich et al., 1986). Para
este caso, se propone un mecanismo cualitativamente similar al mencionado anteriormente de la
desactivacin cida de esta misma enzima. En l, la enzima activa se puede convertir a una forma
inactiva final y en un intermedio inactivo que, en funcin de la evolucin de la temperatura, puede
revertir tanto a la forma inactiva final como a la molcula de enzima activa.

Otros muchos factores pueden afectar a la estabilidad de la enzima, incluyendo la pureza del
preparado (Hanzawa eta!., 1986), la presencia de calcio u otros iones (Vallee et al., 1959), la adicin
de substrato y otras sustancias estabilizantes (Janecek y Balaz, 1992; De Cordt et al., 1994), la
concentracin de la disolucin (Graber y Combes, 1990). La presencia de otras protenas, como la
seroalbmina bovina, acta como molcula estabilizadora, probablemente debido a que el aumento
de la concentracin de protenas es ventajoso cuando existen proteasas contaminantes de la
preparacin (Carsen, 1994).

La estabilizacin estructural y mantenimiento de la actividad cataltica de la a-amilasa por efecto de

iones Ca2~ ha sido parcialmente comentada en la descripcin de la estructura de dicha protena. La
de A. oryzae es, de todas las a-amilasa estudias, la que presenta una unin ms fuerte al
Ca2~ principal (Ka = 1012 - i~ M1) (Valee et al., 1959).

Mientras que la actividad hidroltica de las a-amilasas de otros orgenes se ve inhibida por la
presencia de un agente quelante como el etiln diamino tetraacetato (EDTA). la procedente de A.
oryzae mantiene prcticamente intacta la suya debido a que la unin es tan fuerte que no es capaz
de eliminar el Ca2~ principal de la enzima. Por otro lado, se ha comprobado que la existencia del ion
calcio protege a la a-amilasa de la accin de enzimas proteoliticas (Stein y Fiseher, 1958), indicando
la formacin de una estructura ms compacta. La existencia de otros iones pueden tener tambin
efecto sobre la estabilidad y actividad de la a-amilasa. As, la funcin del Ca2 puede sustituirse,
aunque con menor efectividad, con otros cationes divalentes como Sr2~, Mg2~, Ha2 o Zn2~ e
incluso algn catin monovalente, Na (Vihinen y Mntsla, 1989). La presencia de CF induce a un
leve cambio conformacional en a-antilasa de pncreas porcino que hace aumentar 30 veces la
magnitud de la constante cintica y la constante de unin al Ca2 principal en 240 (Levitzki y Steer,
1974). Otros aniones monovalentes producen este efecto aunque en menor medida segn aumentan
sus radios inicos. El Zn2 parece jugar un papel de centro de unin en la dimerizacin de la a-
amilasa procedente de S. subtilis (Valee et al.. 1959).

5. Obtencin de los parmetros optimos de trabajo de la amilasa ( T y pH)

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La actividad ptima de las amilasas se lleva acabo a un pH que oscila entre, aproximadamente, 2 y
10.5. Si bien las amilasas no cuentan con coenzimas, si cuentan con un in de calcio unido
covalentemente a cada una de sus molculas, dicho in es necesario para llevar acabo la catlisis.
(Vargas A y Silver L, 2002).

En la mayora de las a-amilasas producidas por microorganismos el intervalo ptimo de pH se

encuentra entre 4.5 y 6.5 como hongos de la especie Aspergillus, Y algunas bacterias procedentes
de Bacillus (puede haberlas tambin fuertemente acidlilos, encontrando su pH ptimo a valores
alrededor de 2 y otras alcalfilas a valores de pH iguales o superiores a 10) (Vihinen y Mntsl,
1989). (Piggott et al., 1984).

En el caso de las b-amilasas, Los pHs de mayor actividad estn en el rango entre 4.5-7 y el lmite de
temperatura est alrededor de 55 0C.

Caracterizacin de la Alfa-Amilasa

Comportamiento de la Actividad de la Enzima con la Variacin de pH

Se preparan 5 muestras cada una con 3

repeticiones de 10 ml al 30% en peso
(base hmeda) de almidn en agua; se
mantiene la temperatura a 60C. Se
agrega CaCl2 y Buffer fosfato o acetato
de sodio, para hacer variar el pH en un
rango de 5.0 - 7.0. Despus Se agrega
la enzima a-amilasa en una
concentracin 0.1% de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante.
Posteriormente, se toman muestras de la
solucin a los 90 min.
Para obtener la concentracin de
almidn realmente deseada. La cantidad
de almidn hidrolizado se divide sobre el
mximo terico hidrolizado (1.000 g de
almidn/g enzima). sta relacin se
multiplica por 100 y se llama % de actividad.

CARACTERIZACIN DE LAS ENZIMAS

Generalmente el diseo experimental que se usa para el anlisis de los datos obtenidos es
completamente al azar, por tratarse de un experimento de laboratorio donde las unidades
experimentales son homogneas y la variacin entre ellas suelen ser muy pequeas. Los datos
estadsticos son analizados en el paquete computacional (SAS), y se observa que los datos se
ajusten al diseo. Al realizar el anlisis de varianza y comparar el valor de F (Funcin de
probabilidad) calculado y F tabulado se debe observar que el F calculado es mayor que el F
tabulado, lo cual nos indicara que hay significancia. Para averiguar cual es el mejor tratamiento se

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aplican pruebas de significacin, usando el mtodo de anlisis de promedios DMS (diferencia

mnima significativa).

Caracterizacin de la Alfa-Amilasa

Comportamiento de la Actividad de la Enzima con la Variacin de pH

La alfa amilasa (BAN) presenta una mayor actividad a pH 6.0, como se muestra en la Tabla 3, de
acuerdo al DMS (Diferencia mnima significativa) se observo que los tratamiento a pH5.0 y pH6.0
son los que presentan mayor diferencia en actividad amilolitica.( grfico 1).

Comportamiento de la Actividad de la Enzima con la Variacin de Temperatura

La alfa amilasa fngica (BAN) logra su mayor actividad a una temperatura media de 70C, como se
muestra en la Tabla 4. El anlisis de promedios DMS se observo que los tratamientos a temperatura
70C y 55C son los que presentan mayor diferencia en actividad amilolitica, por encima de 70 C la
actividad disminuye, tomando la grafica un comportamiento Gaussiano (Grfico 2).

La tabla 7 resume las condiciones optimas de trabajo de las enzimas usadas para la hidrlisis
enzimtica de almidn de yuca.

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Conclusin

En general, la mayora de las a-amilasas son estables en los intervalos fisiolgicos habituales de
temperatura y pH. La estabilidad de las enzimas no solo depende de las condiciones de pH y
temperatura sino, tambin, de la composicin del medio en el que se encuentren. El intervalo de pH
en el que las enzimas son estables, se modifica en funcin de la temperatura y el tiempo de
incubacin en unas condiciones determinadas. En general, puede hablarse de una mayor
termoestabilidad de la a-amilasa procedentes de Bucillus. Algunas cepas de B. stearothermophilus
mantienen el 100% de la actividad tras una incubacin a 70 0C durante 24 horas (Manning y
Campbell, 1961; Manning et al., 1961).

La a-amilasa de A. oryzae es una enzima extremadamente estable en el intervalo de pH 5 - 8, no

detectndose desactivacin, de forma significativa, tras largos perodos de tiempo en estas
condiciones (Carsen, 1994).

BIBLIOGRAFIA:

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INDUSTRIALES. Universidad Granada, Espaa. Edicin tesis, 2005. ISBN: 84-338-3533-5
2. TINOCO, JUAN. PRODUCCIN, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUMICA DE LAS
AMILASAS EXTRACELULAR E INTRACELULAR DE STREPTOCOCCUS BOVIS Universidad
politcnica de madrid, Espaa, Primera edicin, 2003.
3. MERA, INGRID. OBTENCION DE GLUCOSA A PARTIR DE ALMIDON DE YUCA Manihot sculenta
Universidad de CAUCA, Espaa, Primera edicin, 2003.
4. ESPINEL, ESPERANZA. PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE -AMILASA DE
PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE FERMENTACIN EN FASE
SLIDA. Universidad Nacional de Colombia, Bogot, colombia. Edicin tesis, 2009.
Rev.Colomb.Quim. vol.38 no.2 Bogot
5. BAUTISTA, LUIS. PURIFICACIN DE cc-AMILASA DE Aspergillus oryzae POR ADSORCIN
Universidad politcnica de madrid, Espaa, Primera edicin, 1997.

PATENTES: exhibe una actividadnotablemente excelente dicha fraccion corresponde quecontienen el inhibidor
actividad inhibitoria dicha fraccion alfa actividad
Patentes: Inhibidor de la amilasa y preparacin microbianos de eso con el uso de las variedades del
diasticus de los streptomyces. Amylostaticus ID: US4010258

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