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UNAD
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TABLA DE CONTENIDO
Leccin 9 : Biorreactores 41
Leccin 10. Transferencia de O2 43
Leccin 11: Caractersticas de la fermentacin en gran escala 44
Actividades: 46
UNIDAD 3: BIOTECNOLOGA ENZIMTICA 47
CAPITULO 1: BIOQUIMICA Y BIOCATLISIS 47
Leccin 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza protenica 47
Leccin 2 : Naturaleza de las enzimas 47
Leccin 3 : Cofactores 49
CAPITULO 2. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIN DE ENZIMAS 50
Leccin 1: Clasificacin de las enzimas segn la naturaleza de la reaccin 51
CAPITULO 3 : CINETICA ENZIMATICA 54
Leccin 1 Enzimas Michaelianas 54
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CAPITULO 4: PRODUCCIN DE ENZIMAS 59
Leccin 1. Enzimas de Origen Vegetal 59
Leccin 2 : Enzimas de origen animal 60
Leccin 3 : Enzimas de Origen Microbiano 60
Leccin 4 : Produccin Industrial de enzimas 61
Leccin 5: Inmovilizacin de enzimas 66
UNIDAD 4: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA 70
CAPITULO 1: TECNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIN GENTICA IN VITRO. 71
Leccin 1: Tecnologa del ADN recombinante 72
Leccin 2: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR) 78
CAPITULO 2: OTRAS TCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGIA : 81
Leccin 1: Mutagnesis 81
Leccin 2: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos 81
Leccin 3 : Mutagnesis en Casette o interrupcin gnica 83
CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 83
Leccin 4: Animales transgnicos 83
Leccin 5: Plantas Transgnicas 84
Leccin 6: Alimentos genticamente modificados 86
UNIDAD 5 : PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO 88
CAPITULO 1: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS 88
DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.
Leccin 1: Bebidas alcohlicas 88
Leccin 2: Biologa de las fermentaciones con levaduras 88
Leccin 3: Condiciones de la fermentacin 89
Leccin 4 : Compuestos organolpticos 91
Leccin 5 : Alimentos basados en soja fermentada 92
Leccin 6 : Productos crnicos fermentados 94
Leccin 7 : Vinagre 95
leccin 8 : acido Lctico 96
leccin 9: acido Actico 96
CAPITULO 2: COMPUESTOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA PRODUCCIN DEL METABOLISMO 97
SECUNDARIO.
Leccin 1 : Produccin de acido ctrico 97
CAPITULO 3 : PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO SINTTICOS 101
Leccin 1 : Polisacridos microbianos y PHAs 101
Actividades: 103
BIBLIOGRAFIA 104
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UNIDAD 1: ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA.
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En conclusin, la biotecnologa surge como un espacio de recombinacin de conocimiento de
diversas reas del conocimiento que pretende dar soluciones a los problemas relacionados con la
medicina, la agronoma, zootecnia, la agroindustria, la ingeniera de alimentos, problemas
ambientales, entre otros campos. Es as entonces, que el aporte de la biotecnologa se produce en
dos etapas, en la primera, la investigacin cientfica bsica que se coloca por delante de la
innovacin tecnolgica, exponiendo todo su valor predictivo y transformador, adems de su
capacidad explicativa. No hay desarrollo en esta rama sin investigacin cientfica. La segunda fase,
se caracteriza por el desarrollo de un sistema estandarizado de mtodos secuenciales entre los
cuales se identifican claramente las relaciones y procedimientos operacionales que condicionan el
xito del proceso.
Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad se utilizaron los seres
vivos o productos derivados de ellos para atender las necesidades del hombre tales como el vino y
el pan, entre otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de procesos
biotecnolgicos, puesto que en este estadio de desarrollo las fermentaciones son procesos
naturales que no involucran la manipulacin de los sistemas biolgicos para modificar o controlar
las propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga etapa de prembulo
caracterizada por las ideas vitalistas o animistas que desde un enfoque dialctico motivan el
desarrollo de mtodos experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los fenmenos
biolgicos para obtencin de bienes y servicios, que finaliza con la consolidacin de la moderna
Biotecnologa en el siglo XX I.
Primera poca o era precientfica: corresponde a la poca anterior a Pasteur y sus comienzos
se confunden con los de la humanidad. En esta poca, se realizan prcticas empricas de
seleccin de plantas y animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para preservar y
enriquecer el contenido protenico de los alimentos. Este perodo se extiende hasta la segunda
mitad del siglo XIX y se caracteriza como la aplicacin artesanal de una experiencia resultante de
la prctica diaria. Era tecnologa sin ciencia subyacente en su acepcin moderna. Como ejemplos
concretos cabe mencionar las aplicaciones en :
Las civilizaciones Sumeria y Babilnica (6000 aos a.C.) ya conocan cmo elaborar
cerveza.
Los egipcios ya saban fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.
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Antes de la escritura del libro del Gnesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recurdese
que, segn la Biblia, No "sufri" (o disfrut) accidentalmente los efectos de la fermentacin
espontnea del mosto de la uva (primera borrachera con vino)
Se podra afirmar que esta era pre-cientfica termina en el siglo XVIII cuando cobra cuerpo la idea
de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es decir, usando el mtodo
experimental, con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias errneas de que
"la vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que an daran sus
ltimos estertores casi al final del siglo XIX.
Segunda poca
El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII),
facilit un par de siglos ms tarde, la comprensin, de la verdadera importancia de las clulas
procariticas y eucariticas, en procesos relacionados con la fermentacin y en el origen de las
enfermedades infecciosas.
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prcticas no empricas emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX eminentes bilogos como
Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y
destileras.
Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en 1897 Buchner obtuvo, a
partir de levaduras, una preparacin enzimtica (zimasa) que era capaz de realizar la misma
transformacin de "fermentacin" que las clulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las
propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y
biolgico: las fermentaciones eran procesos qumicos catalizados por enzimas presentes dentro de
clulas vivas, que podan ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica, nacida
como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena especializando en la enzimologa, encontr
una alianza fructfera y duradera con la joven Microbiologa, estableciendo las bases enzimticas y
metablicas de muchos procesos de fermentacin. De esta forma se desarrollaron procedimientos
industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente
descubrimiento por parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extradas de las levaduras,
de convertir azcares en alcohol.
Tercera poca
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(incluyendo temperatura, pH, aireacin), entre otros. A partir de entonces se disearon estrategias
para mejorar genticamente las cepas microbianas industriales.
Desde esa poca, las tcnicas de ingeniera qumica, aliadas a la microbiologa y a la bioqumica,
permiten la produccin masiva de antibiticos, cidos orgnicos, esteroides, polisacridos y
vacunas.
Cuarta poca.
Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial del cido "deoxi-
ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953, seguido por los procesos que permiten la
inmovilizacin de las enzimas, los primeros experimentos de ingeniera gentica realizados por
Cohen y Boyer en 1973 y aplicacin en 1975 de la tcnica del "hibridoma" para la produccin de
anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes
descubrimientos han dado lugar a numerosos trabajos de mejoramiento gentico tanto en plantas
como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de clulas madre, y el importante
acontecimiento de la aparicin de la oveja Dolli en el contexto cientfico, que dio un vuelco total al
concepto de Biotecnologa.
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3. procesamiento del material, consistente en separar y eventualmente purificar el
material biolgico producido: quizs esta es el rea ms desconocida y compleja,
el procesamiento de la biomasa o de la sustancia producida: separacin de las
clulas respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperacin eficiente
del producto buscado, purificacin, entre otros procedimientos.
Aunque estos tres grupos se complementan entre s, existe una diferencia fundamental entre los
dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el conocimiento de las caractersticas y
comportamiento de los microorganismos y en el uso deliberado de estas caractersticas (de cada
organismo en particular), para el logro de objetivos especficos como la obtencin de nuevos
productos o procesos. La enorme potencialidad del ltimo grupo se deriva de la capacidad de
manipular, las caractersticas estructurales y funcionales de los organismos y de aplicacin prctica
de esta capacidad para superar ciertos lmites naturales en el desarrollo de nuevos productos o
procesos.
A diferencia de la primera clasificacin, que seala las tcnicas propiamente tales, la segunda se
refiere tambin a las actividades econmicas en las que se hace uso de dichas tecnologas. La
nueva biotecnologa crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas reas de la economa.
Como estos procesos se basan en los mismos principios, ya sea que se apliquen en un sector
econmico o en otro, ello introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre
diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentacin pueden aplicarse para la
produccin, en gran escala, de alcohol o de antibiticos como la penicilina, o en escalas menores
para la produccin de aminocidos en la industria farmacutica. Esto facilita la, movilidad de
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factores productivos y tiene impacto sobre la calificacin de la mano de obra, la cual, aun cuando
deber adaptarse a este nuevo perfil tecnolgico (tanto en trminos, cuantitativos como
cualitativos) posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.
Leccin 4: Tipos de Biotecnologa: Dependiendo del campo de aplicacin del servicio o producto
obtenido la biotecnologa se ha clasificado en:
La microbiologa industrial comenz con los procesos de fermentacin alcohlica por ej. La
fermentacin del vino y de la cerveza. Ms tarde se desarrollaron los procesos microbianos para la
produccin de agentes farmacuticos como los antibiticos, la produccin de aditivos alimentarios
como los amino cidos, para la produccin de enzimas y sustancias qumicas industriales como el
butanol, el acido ctrico, entre otros.
En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnologa microbiana con el advenimiento de la
tecnologa de genes. La tecnologa gentica permite que un microorganismo procesado
genticamente fabrique sustancias que normalmente no sera capaz de producir, es as como
utilizando ingeniera gentica se ha podido producir insulina por una bacteria introduciendo el gen
de la insulina humana en la bacteria Escherichia coli.
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y control de malezas ahora pueden ser tratados genticamente en lugar del uso de qumicos. Una
planta modificada por ingeniera gentica, que contiene ADN de una fuente externa, es un
organismo transgnico. Un ejemplo de planta transgnica es el tomate que permite mantenerse
durante mas tiempo en los almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados
Algunos pases desarrollados como Estados Unidos y a sus multinacionales, defienden el uso de
la biotecnologa y pone de relieve la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de
trabajo y fomenta la innovacin tecnolgica y podra acabar con el hambre del mundo. En Europa,
los casos de Soja y Maz transgnicos resultan de especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a
60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, alimentos dietticos e infantiles, cerveza, etc.
Espaa importa de EEUU 15 millones de toneladas, el cuarto pas importador detrs de Japn,
Taiwan y Holanda.
La comercializacin del maz transgnico est autorizada en EEUU, Canad, Japn y tambin en
la Unin Europea desde Enero de 1997.
China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos en la mitad de todas sus
tierras de labor (500.000 kilmetros cuadrados) en el plazo de cinco aos. Sus investigadores
analizaron el efecto de los pimientos y los tomates transgnicos en ratas de laboratorio,
comparando el peso y el estado de los mismos con los de otros no alimentados, y no observaron
diferencias significativas.
Para profundizar en este tema haga clic aqu: La biotecnologa en la alimentacin y la agricultura
Biotecnologa animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en las ltimas dcadas. Las
aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas diagnsticos, nuevas vacunas y
drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento, entre otros
procedimientos. Los animales transgnicos como el "ratn oncognico" han sido muy tiles en
trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas.
Existen tres reas diferentes en las cuales la biotecnologa puede influir sobre la produccin
animal:
-Nuevas vacunas y
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rganos, por ejemplo el uso de animales para la produccin de protenas sanguneas humanas o
anticuerpos.
Biotecnologa Humana Las tcnicas del ADN estn siendo utilizadas para determinar relaciones
familiares en litigios de paternidad, para confrontar donantes de rganos con receptores en
programas de trasplante, unir sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del crimen
(biotecnologa forense).
El primer tratamiento exitoso en terapia gnica fue en 1990, cuando se trat una enfermedad del
sistema inmune de nios llamada "Deficiencia de ADA". Clulas sanguneas con los genes
correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes clulas
normales que permitieron mejorar el sistema inmune.
Hoy, la terapia gnica esta tratando enfermedades tales como tumores cerebrales malignos,
fibrosis qustica y HIV. Con esta tcnica se pretende tambin reparar rganos, como por ejemplo
un hgado cirrtico a partir de las pocas clulas sanas que le quedan, un par de ventrculos nuevos
para reemplazar los efectos devastadores de un infarto, la regeneracin de una mano amputada o
disponer de una fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de enfermedades tan
graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.
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farmacutico, est determinado por su novedad y especificidad de uso en consumo humano.
(Osorio,1995)
En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del tratamiento de aguas
residuales industriales como lodos activados y biofiltros, mtodos de descontaminacin de los
derramamientos de petrleo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados
genticamente. Algunos trabajos de investigacin cientfica se estn realizando sobre
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biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todava
discreto.
La diversidad biolgica de Colombia es una ventaja comparativa que al ser usada sosteniblemente
puede apoyar el desarrollo del sector productivo. As mismo constituye una respuesta a problemas
de seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, as como un elemento de
negociacin poltica internacional y fortalecimiento de la soberana. Por estas razones, su
conocimiento, conservacin y uso sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el
estado de la biotecnologa en Colombia, los avances en estos campos son muy pequeos
comparativamente con otros pases de Amrica Latina como Costa Rica, Brasil y otros del mundo .
Con relacin a los bio-recursos, Colombia es un pas privilegiado ya que se encuentra entre uno de
los pases de mayor diversidad biolgica del planeta por rea . Sin embargo, para aprovechar ese
potencial, el pas debe desarrollar la capacidad cientfica y tcnica que le permita explorar,
conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar esos biorrecursos como un patrimonio
altamente productivo y no simplemente como una diversidad ecolgica, social y econmicamente
improductiva.
A nivel mundial el inters por la biotecnologa es indudable, como se ve a travs del, frecuente
abordaje de tales temas en los peridicos, libros y medios de comunicacin.
Algunos descubrimientos tiles sern una consecuencia directa del uso de las tcnicas de
ingeniera gentica que logren transferir determinados genes (a veces incluso genes humanos) a
un determinado microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente requerido
en el mercado. Determinadas protenas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se
conseguirn de esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, sern el resultado de la
fabricacin mediante tcnicas de fermentacin, de anticuerpos especficos para, fines analticos y
teraputicos. Estos anticuerpos monoclonales se producirn mediante el uso de microorganismos
en grandes fermentadores, como por ejemplo la produccin de antibiticos como la penicilina.
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sociedad, atractivos para la industria por motivos comerciales y en algunos casos recibirn el
apoyo de los respectivos gobiernos.
Sin embargo, pareciera ms correcto considerar ambos actores, el inherente proceso cientfico-
tecnolgico y aqul que corresponde a incentivos eonmicos, como complementarios. As, en el
caso de la biotecnologa, aun cuando sta nace e el mbito de la I y D, de las muchas aplicaciones
posibles, las que se desarrollan primero son aquellas que ofrecen expectativas de importantes
beneficios econmicos en un plazo ms menos breve.
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Un desarrollo paralelo es la produccin de pesticidas (insecticidas, herbicidas y fungicidas)
microbianos. Las tcnicas que ya se emplean, o que estn desarrollndose, van desde los cultivos
de tejidos, la fusin protoplasmtica, el cultivo in vitro de "meristemas", la produccin de ndulos de
"rhizobium" y "micorizas", hasta la ingeniera gentica para la obtencin de plantas de mayor
capacidad fotosinttica, que puedan fijar directamente nitrgeno, resistentes a plagas y pestes,
etc. El cultivo de tejidos consiste en la regeneracin de plantas completas a partir de una masa
amorfa, de clulas, que se denomina "callo".
En su forma ms general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro", desde simples unidades
indiferenciadas hasta complejos multicelulares y rganos. El proceso consiste en la incubacin, en
condiciones controladas y aspticas, de una clula o parte de un tejido vegetal (hoja, tallo, raz,
embrin, semilla, "meristema", polen, etc.) en un medio que contiene elementos nutritivos,
vitaminas y factores de crecimiento (Osorio, 2005)
La magnitud del mercado potencial agrcola para la biotecnologa es, en gran medida materia de
especulacin debido precisamente a la falta de un conocimiento detallado de muchas de estas
condiciones locales. En este campo, la biotecnologa est orientada a la utilizacin en gran escala
de "biomasa" para la produccin de materias primas orgnicas, que actualmente se obtienen
mediante procesos qumicos convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso
altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran parte esta constitudo por residuos y
desechos de plantaciones forestales y de cultivos en gran escala. Es adems un recurso
renovable. Las principales fuentes potencialmente disponibles para la produccin tanto de etanol
como de otros productos qumicos a granel son (aparte de las melazas de la caa) cultivos como la
yuca, el sorgo, las papas y el maz; los sueros de la industria de la leche; los residuos de las
plantaciones de caf y, en general, todo tipo de residuo celuloso.
A pesar que en el siglo XX, cuando la Gentica haba resuelto el misterio de la naturaleza del
material de la herencia, las posibilidades que haba para actuar sobre dicho material eran limitadas:
cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), seleccin de los
individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con
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agentes fsicos (rayos UV, rayos X) o qumicos, con ulterior bsqueda (seleccin o rastreo -
screening) de alguna variante de inters (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.
Debimos esperar a la dcada de los 70 para que surja un conjunto de tcnicas de laboratorio
revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la
vida. Son tcnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseos
previos y objetivos concretos (de ah el nombre popular de Ingeniera Gentica).
La Ingeniera Gentica (I.G.), mejor llamada tecnologa del ADN recombinante in vitro, se
caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos
distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que
ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro
provecho.
Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias cientficas mundiales a todos los
niveles y clasificacin de la Biotecnologa, se han concentrado en seis aspectos:
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ciertos organismos en la elaboracin de productos especficos, ya sean estos enzimas,
hormonas o cualquier otro tipo de protena u organismo.
A todo esto tenemos que aadir que un factor importantsimo en el desarrollo de la biotecnologa
es la evaluacin de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos segn normativas
nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en
limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnolgicos.
Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan ms de lo que la
evidencia cientfica sugiere, manteniendo en todo momento la preservacin de la salud y el medio
ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepcin pblica de los riesgos y promesas de la
biotecnologa. Por ejemplo, hoy en Europa la percepcin pblica ha logrado prcticamente una
parada en las plantas transgnicas, a pesar de los informes cientficos que dicen que en la mayor
parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creacin o
elaboracin de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del pas, de los intereses
polticos del mismo y del grado de presin que ejerzan las grandes industrias privadas del sector.
Hay un gran debate en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.
Habr que llegar a un dilogo racional entre los diversos actores (cientficos, empresas,
consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto empleo de estas tecnologas, que
por un lado no impida aplicaciones benficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente
aquellos mbitos donde las dudas razonables hagan recomendables ms restricciones. El ideal
sera permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte
imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presin que pueden esconder agendas polticas
ocultas.
ACTIVIDADES
Lectura 1. Aplicando el mtodo de Lectura Auto regulada IPLER ; Realice un ensayo de la
siguiente lectura.
Proteccin del medio ambiente. Los cientficos lograron que algunos alimentos, como la papaya y
la papa, sean ms resistentes a las plagas. Estos cultivos necesitan ahora menos productos
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qumicos para estar protegidos de insectos o virus dainos, lo que es mucho mejor para el agua y
la vida silvestre. Otros cultivos estn protegidos de los herbicidas que se usan para controlar a las
malezas. El mejor control de las malezas permite que los agricultores conserven el suelo ya que no
tienen que arar la tierra con tanta frecuencia.
Mayores rendimientos. Los agricultores tambin usan la biotecnologa para ayudar a las plantas a
sobrevivir. Por ejemplo, las nuevas variedades de maz y algodn rechazan a los insectos dainos,
y la soya mejorada puede tolerar los herbicidas. Los agricultores pueden esperar mayores
rendimientos de la cosecha en estas plantas ms resistentes.
Alimentos con mejor sabor y ms frescos. Pimientos ms dulces y tomates que maduran ms
despacio son slo dos ejemplos de cmo la biotecnologa puede producir alimentos ms frescos y
de mejor sabor.
El futuro de la biotecnologa
Mantener alimentos que sean seguros para comer. Los cientficos podrn detectar con mayor
precisin cules son los virus y bacterias dainas que pueden hallarse en los alimentos. Por lo
tanto, correremos menos riesgos de contraer enfermedades transmitidas por los alimentos.
Obtener alimentos ms saludables. Mejorar algunos alimentos por medio de la biotecnologa nos
podr ayudar a disminuir nuestro riesgo de contraer enfermedades crnicas como el cncer y
afecciones cardacas. Por ejemplo:
Mantener seguros los alimentos para los animales. Algunos tipos de hongos que se hallan en las
sustancias que libera el maz pueden daar a los animales que lo consumen. Estas sustancias ya
estn reguladas en los Estados Unidos y la biotecnologa representa otra herramienta que ayudar
a reducir la cantidad de estas sustancias presentes en el maz.
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Elecciones: Arroz enriquecido
Muchas de las personas que viven en los pases en desarrollo raramente consumen las vitaminas
que necesitan. Por lo tanto, es posible que tengan problemas de salud. Por ejemplo, la falta de
Vitamina A causa ceguera, y la falta de hierro puede ser daina para la salud de las mujeres y los
nios. Sin embargo, gracias a la biotecnologa, los cientficos han descubierto una manera de
agregar mayores cantidades de Vitamina A y hierro al arroz. En los pases en que el arroz es uno
de los alimentos principales de la dieta, esta nueva variedad del cereal puede llegar a proteger a la
poblacin de la ceguera y de otros problemas de salud.
La Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA) revisa la seguridad de todos los alimentos que
estn en el mercado. La FDA, la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA), el Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la comunidad cientfica en general estn de acuerdo
en afirmar que los alimentos producidos aplicando la biotecnologa son seguros. Los alimentos
producidos utilizando mtodos biotecnolgicos o convencionales deben satisfacer los mismos
estndares de seguridad.
La FDA regula los alimentos desarrollados utilizando la biotecnologa de la misma manera en que
regula los alimentos producidos por otros mtodos.
El maz mejorado biotecnolgicamente para que contenga menos fitato, uno de sus componentes
del mas, ayudar a reducir el impacto que tienen los animales de granja en el medio ambiente. El
maz con bajo contenido de fitato puede reducir la cantidad de fsforo no deseado en las
deposiciones de los animales, lo que representa una potencial amenaza para la calidad del agua.
Para ms informacin:
Usted puede obtener ms informacin sobre los alimentos y cmo se producen de los
profesionales de la salud, dietistas, nutrilogos, agentes de informacin, agricultores locales y
21
programas universitarios que se dedican a estos temas.En los sitios de Internet que se mencionan
a continuacin hallar la informacin que necesita:
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UNIDAD 2. BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES
Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con fines energticos
o plsticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en
los diferentes medios de cultivo.
Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que son requeridos en
grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de crecimiento que lo son solamente en
pequeas cantidades. Empezaremos por los macronutrientes mayoritarios: carbono y nitrgeno.
1.1 Macronutrientes:
Prcticamente la totalidad de la masa celular est formada por sustancias con cuatro tipos de
tomos: Carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto
de las macromolculas as como las molculas orgnicas pequeas.
La mayora de los procariotas requieren un compuesto orgnico de algn tipo como fuente de
carbono. Estudios nutricionales han demostrado que muchas bacterias pueden asimilar varios
compuestos de carbono orgnico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable nmero
de compuestos tales como animocidos, cidos grasos, y compuestos aromticos pueden ser
usados por una bacteria u otra. En peso seco, una clula tpica consta de aproximadamente 50%
de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las macromolculas.
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N2. La mayora de las bacterias pueden utilizar amonaco y muchas adems nitrato. El nitrgeno
molecular (gas), sin embargo, puede ser fuente de nitrgeno para un reducido grupo de bacterias
(bacterias fijadoras de nitrgeno).
24
1.5. Medios de cultivo
En microbiologa industrial se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: Los qumicamente
definidos y los indefinidos (complejos). Los medios qumicamente definidos se preparan
aadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos
altamente purificados. Por ellos se conoce la composicin qumica exacta .En muchos casos, sin
embargo, el conocimiento exacto de la composicin qumica no es crtico. En estas ocasiones los
medios complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre los definidos. Los
medios complejos emplean lisados de casena (protena de la leche), de carne, de soja, de
levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (qumicamente indefinida): Tales lisados
estn disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rpidamente y
disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se utilizan medio
complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la composicin de nutrientes.
El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes pero
ntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energtico) que es la suma de
reacciones exergnicas que permiten liberar la energa contenida en los nutrientes o estratos y ser
acumulada en forma de ATP u otros compuestos, el anfibolismo o metabolismo intermediario, que
es el conjunto de reacciones en que los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos
nutrientes son transformados en cidos orgnicos , steres fosfricos y otros compuestos como
aminocidos; el anabolismo o metabolismo biosinttico que es la parte del metabolismo implicado
en la sntesis de macromolculas-cidos nucleicos, protenas sustancias de reserva y otros, todas
Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:
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Leccin 2: Metabolismo energtico
Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de oxidacin
reduccin que implican compuestos orgnicos, pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1)
Fermentacin, en que los procesos de oxido reduccin ocurren en ausencia de aceptores
terminales de electrones aadidos; y (2) respiracin, en que el oxgeno molecular u otros
oxidantes sirven como aceptores terminales de electrones.
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Un ejemplo de fermentacin es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del cido lctico:
Glucosa
2 lactatos +2 H+
Ntese que sta es una reaccin balanceada y que los productos, lactato ms protones, tienen la
misma proporcin de tomos de hidrgeno y oxgeno que la glucosa. Esta reaccin puede
analizarse desde tres puntos de vista: Termodinmicamente, por la energa de enlace y por el
metabolismo intermediario.
Desde el punto de vista termodinmico, las fermentaciones se caracterizan por ser una suma de
reacciones, al final de las cuales los productos poseen un contenido energtico menor que el
inicial.
Existen tres rutas bsicas empleadas por los microorganismo para el aprovechamiento energtico
de los sustratos.
Cada una de estas vas tiene funciones y unidades especficas para los microorganismos. Las dos
primeras vas son comunes tanto a organismos respiratorios como fermentativos, procariontes o
eucariontes. La tercera se halla restringida a procariontes. Al existir diferentes vas de fermentacin
se obtienen tambin diferentes productos: Algunos productos derivados de la fermentacin se
observan en la siguiente tabla
27
Tipo de fermentacin Producto(s)
28
La mayor parte de peso seco de la bacteria est constituidos por macromolculas de cuatro tipos:
cidos nucleicos, protenas, polisacridos y lpidos complejos. Estas macromolculas son
polmeros formados por unidades estructurales debajo peso molecular que tiene que formarse
como precursores. Ya sabemos que las subunidades estructurales de los cidos nucleicos son 8
tipos distinto de nucletidos, las de las protenas 20 aminocidos diferentes, las de los
polisacridos, unos 15 azucares diferentes, y que para la formacin de los lpidos se requieren
cidos grasos, polialcoholes, azcares, aminas y aminocios que constituyen tambin unos 20
tipos diferentes de molculas orgnicas. Adems se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y
transportadores de electrones.
29
celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento
bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y a escala
poblacional. Para efectos prcticos, esta seccin nos centraremos al estudio del crecimiento
poblacional. El cual en cultivo cerrado atraviesa por las siguientes fases:
1) Fase de latencia: Es el perodo de tiempo durante el que el inculo se adapta a las condiciones
del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su
duracin depende de varios factores:
30
Si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la
fase de latencia se hace ms larga, porque las bacterias necesitan un tiempo
adicional para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban
reprimidas en el medio rico.
El valor del tiempo de generacin (g) depende de: composicin del medio, temperatura, pH,
osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos, ricos,
que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes
de carbono. Algunos microorganismos tienen, a su temperatura ptima tiempos de generacin muy
cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen ms lentamente, con tiempos de generacin
que pueden ser de varias horas o incluso das.
5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace
nulo ( = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con
las muertes celulares.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin negativa) puede
ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a
aminocidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).
6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a
agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas,
distorsionadas (formas fantasmas, ghost). La pendiente de esta parte de la curva depende de
las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms
acentuada).
31
poblacin microbiana y establecer relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los
productos de biosntesis.
En los organismos unicelulares la clula se divide por fisin binaria dando lugar a dos clulas hijas,
cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos clulas nuevas, por lo que en cada
periodo e divisin la poblacin se duplica. Esta multiplicacin representa una progresin
geomtrica en la cual hay una relacin directa entre el nmero de clulas iniciales y la cantidad de
clulas en otro tiempo determinado. La expresin matemptica que representa esta relacin es:
n
N = No2 Donde:
N= numero final de clulas,
No = nmero inicial de clulas
N = nmero de generaciones
Para explicar la anterior ecuacin en trminos de n se aplica una transformacin logartmica cuyo
resultado es:
donde,
Una expresin alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la velocidad de incremento en la
masa celular o densidad celular (dx/dt) en un tiempo (t) es proporcional a la densidad celular en
dicho tiempo. Por consiguiente:
de donde:
Integrando se obtiene:
ln X1 = ln Xo + t
t
X1 = Xoe
32
X1 = 2Xo por tanto, la duplicacin de la poblacin celular se puede expresar as:
entonces:
= 0.693/td
1) Fermentacin discontinua Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada
como un sistema cerrado. A tiempo cero t = 0, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de
fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de
aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de
cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en
33
forma continua como resultado del metabolismo de las clulas. Despus de la inoculacin de una
solucin nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiolgicas se observan
cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de
muerte
Puesto que generalmente no es posible medir la concentracin del substrato directa y continua-
mente durante la fermentacin a fin de controlar el proceso de alimentacin, tienen que ser
medidos parmetros indirectos que estn correlacionados con el metabolismo del substrato crtico.
Por ejemplo, en la produccin de cidos orgnicos, el valor del pH puede ser utilizado para
determinar la velocidad de alimentacin de la glucosa. En fermentaciones con valores osmticos
crticos la alimentacin puede ser regulada controlando el valor de pO2 o el contenido en CO2, en
los gases que se liberan.
3) Fermentacin continua.
En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade
continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con
los microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermenta-
ciones continuas pueden ser distinguidos dos tipos bsicos:
34
Figura 3 Fermentacin continua en quimiostato A), Turbidostato B) y Fermentador de flujo de tapn
b. Reactor de flujo de tapn. En este tipo de fermentacin continua la solucin de cultivo fluye a
travs de un reactor tubular sin mezclado. La composicin de la solucin de nutrientes, el nmero
de clulas, la transferencia de masa (suministro de O2) y la productividad varan en distintas
posiciones dentro del sistema (Fig. 3C). A la entrada del reactor las clulas deben aadirse
continuamente junto con la solucin de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una
desviacin desde la salida del fermentador o desde una segunda fermentacin continua).
En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la prdida de clulas debida al fluido que sale
debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo
La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumtrico (que entra y sale) a travs
del volumen del fermentador.
Utilizando la ecuacin de Monod que describe la dependencia de la velocidad especfica de
crecimiento sobre la concentracin de substrato limitante pueden ser determinados en el
biorreactor la constante de rendimiento biomasa/substrato (Y X/S), la densidad de las clulas (X) y la
concentracin de substrato (S).
35
A velocidad ms baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las clulas (S O).
La concentracin de clulas es entonces X = So/Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al
principio en forma lineal y luego a D = m cae bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al
principio y se aproxima a So a D = m. Cuando X es cero en la ecuacin que explica el sustrato (S),
se alcanza el punto de lavado Dm.
36
La velocidad especfica mxima de crecimiento en los procesos industriales se escoge de forma
que se obtenga el rendimiento ms alto en el volumen ms pequeo de fermentador y en el tiempo
ms corto.
37
se convierte en la fase continua (aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta
concentracin la productividad decrece.
P = D * X (g/l *h)
Cuando se utiliza la relacin de la ecuacin sobre sustrato (S) resulta la siguiente ecuacin
38
Figura 6. Productividad en relacin a la concentracin de cidos grasos en un proceso de
produccin de protena de origen unicelular.
39
La velocidad especfica de produccin qp deriva de la ecuacin 1 de la siguiente forma:
Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para caracterizar los procesos de fer-
mentacin, es decir las relaciones de las clulas producidas a los substratos individuales
convertidos o a la energa liberada o energa consumida. Sin embargo, los coeficientes de
rendimiento no son constantes, ya que dependen de parmetros biolgicos (X, ) y de parmetros
qumicos (pO2 relacin C/N, y contenido en fsforo del medio.
Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El primer grupo de coefi-
cientes (Ys Y02 Ykcal) da informacin acerca de los procesos tcnicos y por tanto acerca de la
economa. El segundo grupo (Yc Yp YN Yave) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.
El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de energa de las clulas
(Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben
ser propiamente designados, como muestra;
40
Capitulo 4: PRINCIPIOS DE BIOINGENIERA
Leccin 9: Biorreactores
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiologa industrial. Es el
recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseo debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y
adecuado para los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del
siguiente modo:
a) Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir
la sedimentacin o la flotacin.
b) Mantener constante y homognea la temperatura.
c) Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.
d) Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
e) El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido
esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado.
Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor est provisto de un
sistema de agitacin, a dems para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el
cultivo.
Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y
al "air lift". En el primero de ellos (Figura 7) la agitacin se realiza mecnicamente mediante un eje
provisto de turbinas accionado por un motor.
41
Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitacin mecnica.
El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee
pequeos orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es
"golpeado" por las paletas de la turbina inferior generndose de este modo miles de pequeas
burbujas de aire, desde las cuales difunde el O2 hacia el seno del lquido. El sistema de agitacin
se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento
circular que imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor
mezclado. El tanque est rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar
la temperatura. Para tanques mayores que 1000 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es
reemplazado por un serpentn que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse
en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo tambin lo es la cantidad de calor
generado, por lo que se hace necesario una mayor rea de refrigeracin. Los tanques son de
acero inoxidable y estn pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilizacin.
42
Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.
El aire que ingresa al biorreactor debe estar estril, lo que se consigue hacindolo pasar por un
filtro cuyo dimetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de microorganismos y
esporas. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que
promueve la agitacin. Bsicamente consiste en dos cilindros concntricos y por la base de uno de
ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulacin de lquido
ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el
mezclado.
43
Es til en este punto retomar el ejemplo visto al final del y calcular el KLa necesario para que la
velocidad de transferencia de 02 sea igual a la de consumo; esto significa que R02 deber ser igual
a 1,526 mg 1-1 h-1. Asumiendo que C* = 7,8 mg 1 -1 y C = 0,5 mg 1 -1, resulta Por tanto valores
de KLa iguales o superiores al calculado asegurarn, que el cultivo no est limitado por 02. Cuando
la velocidad de consumo del oxgeno vara con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo
"batch", el clculo de KLa necesario se realiza empleando el mximo valor de RO2 esperado, a fin
de asegurar un adecuado suministro de 02 durante todo el cultivo.
El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden variar en tamao de la
escala pequea de laboratorio 5-10 litros a la enorme escala industrial de 400.000 litros. Las
dimensiones dependen del proceso y de cmo opera. Los procesos manejados en lote o batch
requieren fermentadores ms grandes que los manejados en forma contnua o semicontnua.
44
microbiolgicos o bioqumicos. Las computadoras tambin permiten graficar los datos obtenidos
permitiendo al operador del fermentador tener una representacin visual del progreso de la
fermentacin. Finalmente la computadora nos permite almacenar los datos en forma legible de
modo que estos datos se puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.
Un uso mas sofisticado de las computadoras es el control inmediato del proceso de fermentacin
por ej. cambiando los parmetros ambientales a medida que la fermentacin progresa o agregando
un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente es
aadido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo sea metabolizado a
productos indeseables.
Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de fermentacin, para ello se
debe desarrollar un modelo matemtico del proceso de fermentacin, el cual incorpora ecuaciones
diferenciales para describir el crecimiento microbiano y la formacin del producto. El valor del uso
de una computadora para modelar el proceso de fermentacin es que se puede ensayar el efecto
de varios parmetros sobre el crecimiento y sobre la formacin del producto en forma rpida e
interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los parmetros para ver como afectan al
proceso. De esta forma se pueden estudiar con gran economa muchas variaciones de la
fermentacin en la Terminal de la computadora y no en forma ms costosa en la planta piloto o en
la planta industrial.
45
El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioqumico, quien esta
familiarizado con la transferencia de gases, la dinmica de fluidos y la termodinmica. El papel del
microbilogo industrial en el proceso de escalamiento es trabajar estrechamente con el ingeniero
bioqumico para asegurar que se han abarcado los parmetros necesarios para una fermentacin
exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentacin en gran
escala.
Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso
industrial son las siguientes:
1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicacin que es
posible un proceso de inters industrial.
3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aqu las
condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de
importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentacin y
un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo ms similares
a las del fermentador industrial.
Actividades:
Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden utilizarse como fuente de
Carbono, nitrgeno y fsforo. Enuncie sus caractersticas relacionadas en cuanto a produccin
mensual del sustrato, estabilidad del sustrato y concentracin de los nutrientes.
Investiga sobre mtodos de cuantificacin del crecimiento microbiano, realiza un foro con tus
compaeros y compara las diferentes tcnicas.
46
UNIDAD 3: BIOTECNOLOGA ENZIMTICA
Capitulo 1: BIOQUIMICA Y BIOCATLISIS
Leccin 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza protenica
Definicin:
El choque entre dos molculas produce energa que puede ser absorbida por las molculas
mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en el medio.
Si la energa absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear la barrera de potencial,
llamada energa de activacin, el substrato se puede transformar y conducir a la formacin de un
producto (P), es decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial.
Esta energa de activacin generalmente es elevada y no es compatible con las condiciones del
medio en el cual se deben desarrollar las reacciones del metabolismo de los organismos vivientes:
pH vecino de la neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40C, presin vecina a la presin
atmosfrica. Por tanto, la realizacin de esas reacciones necesita de catalizadores bioqumicos, las
enzimas cuya accin consiste, como la de todo catalizador abatir la energa de activacin lo que
tiene por efecto acelerar la reaccin, cuya velocidad se encuentra multiplicada por un factor del
orden de 1012-1020.
Al final de cada ciclo de reaccin, la enzima permanece inalterada.
E+S ES E+P
Las enzimas son pues, catalizadores biolgicos de naturaleza protdica que intervienen en todas
las reacciones metablicas energticamente posibles, que ellas aceleran por activacin especfica.
Permiten alcanzar rpidamente el estado de equilibrio de la reaccin sin modificarlo. Son las llaves
tiles de la biotecnologa y de la bioindustria. Son ellas las que en la ingeniera microbiolgica,
catalizan las reacciones metablicas puestas en juego y aseguran su regulacin. Son ellas
igualmente las que conducen la ingeniera gentica para realizar las modificaciones del
equipamiento enzimtico de ciertos microorganismos con vista a hacerlos aptos para la biosntesis
de metabolitos interesantes
El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades, as como de la cintica de
las reacciones que catalizan es fundamental en biotecnologa
47
Especificidad de la catlisis enzimtica sitio activo:
Especificidad de reaccin. Una enzima no puede catalizar sino un solo tipo de reaccin,
por ejemplo: hidrlisis de enlaces glucosdicos o hidrlisis de enlaces steres (liplisis), etc.
Esta especificidad sirve de base a la clasificacin de estos catalizadores bioqumicos.
En lo que concierne a las enzimas del tipo heteroprotenico, la fijacin al substrato se hace sobre
la parte protenica, la apoenzima, mientras que la catlisis de la reaccin es hecha por la parte no
protenica, el grupo prosttico o el cosubstrato.
La parte "apoenzima" de la molcula enzimtica que lleva el sitio de fijacin al substrato es por
consiguiente responsable de la especificidad en cuanto al substrato de esa enzima. Pero tambin
puede intervenir en la especificidad de la reaccin e inducir un tipo particular de reaccin. As es,
48
por ejemplo, que en el metabolismo de los cidos aminados, el fosfato depiridoxal puede, de
acuerdo a la apoenzima con la cual est combinado, catalizar reacciones, sean de transaminacin,
sean de descarboxilacin, de desaminacin, o de racemizacin.
Leccin 3: Cofactores
Las enzimas heteroprotenicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos son iones metlicos
(Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig. otros cofactores son orgnicos (heme, nicotinamida,
flavina, coenzima A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta diversas formas
de funcionamiento, lo que con frecuencia entraa una confusin en la terminologa de estos
cofactores. En efecto, algunos estn combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de
enlace covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les designa con el
nombre de grupos prostticos. Otros, por el contrario, son co-substratos; se fijan en un primer
tiempo sobre la apoenzima, provocando la transformacin del substrato sufriendo una modificacin
en su estructura qumica; despus se separan de la apoenzima: se les denomina coenzimas.
Regresan a su estado inicial en el transcurso de una segunda etapa enzimtica fijndose sobre
otra apoenzima.
Para ilustrar esta distincin, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la oxidacin de
cidos aminados: la L-aminocido-oxidasa y la glutamato deshidrogenada.
49
ADH:z. La enzima regresa a su estado inicial cediendo los dos hidrgenos, fijados transitoriamente,
a un segundo substrato, oxidante ms potente, que provoca la reoxidacin del F ADH:z a F AD.
A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una reaccin del mismo tipo, la
oxidacin del cido glutmico a cido 2-oxoglutrico con ayuda de la coenzima nicotinamida
adenina dinucletido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie de la apoenzima.
En seguida ser reoxidada a expensas de otro substrato que es reducido por otro sistema enzi-
mtico del medio. El NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.
La nomenclatura y la clasificacin de las enzimas han sido normalizadas por la Comisin sobre
Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica, creada en 1955 antes de solucionar la confusin
que haba y el-riesgo de que la situacin se agravara con el rpido progreso del conocimiento
acerca de las enzimas.
Los objetivos que fueron asignados a esa Comisin sobre Enzimas desde su creacin fueron:
Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas, precisando para cada
enzima la naturaleza exacta de la reaccin catalizada.
Establecer, a partir de este inventario, una clasificacin de las enzimas.
Definir, con base en esta Clasificacin, reglas de nomenclatura que permitan designar,
sin ambigedad, a una enzima dada, proporcionando la mayor informacin posible
sobre la naturaleza de la reaccin catalizada.
50
Y sobre todo su nmero de identificacin que define sin ninguna ambigedad, el lugar de la
enzima en la clasificacin normalizada. Este I nmero contiene 4 cifras o nmeros,
separados por puntos, cada uno de ellos corresponde a los elementos siguientes:
a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima. Estas clases, en nmero
de 6 se definen de acuerdo a la naturaleza general de la reaccin catalizada. Hay: l-
oxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-Hidrolasas, 4-Liasas, 5-Isomerasas, 6-Ligasas (o
sintetasas). I
b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la sub-sub- I clase, definiendo en
cada clase, segn ciertos criterios que se precisarn ms adelante.
c) La cuarta cifra da el nmero de orden de la enzima en la sub-clase considerada
La primera lleva el nombre del substrato; o en el caso de reacciones bimoleculares, los nombres de
los dos substratos separados por "dos puntos".
La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nombre de la clase puede.
Precisarse por un prefijo que precede al tipo exacto de reaccin catalizada.
OXIDORREDUCTASAS
Catalizan las reacciones de oxidorreduccin: transferencia de hidrgeno o de electrn(es) de un
donador, que est oxidado, a un receptor, que est reducido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la
cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y
peroxidasas.
Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshidrogenasa" o "receptor:
reductasa". El trmino oxidasa no se ha conservado salvo cuando el receptor es el oxgeno.
TRANSFERASAS
51
Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamientos (metilo, hidroximetilo,
carboxilo, acilo, glucosilo, amino, etc.).
En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas, fosforilasas, cinasas, entre otras
Las sub-clases se definen por la naturaleza del agrupamiento que es transferido (agrupamientos
de un carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.).
El nombre sistemtico est formado segn el modelo: donador: receptor o grupo transferido:
transferasa.
Fig. 4: TRANSFERASAS se
encargan de transferir grupos
funcionales
HIDROLASAS
Provocan la hidrlisis de diversos tipos de enlaces: ster, acetal (osdico), amida (peptdico), (Fig.
7)
Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es hidrolizado.
El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo "substrato hidrolasa", un prefijo que precisa
la naturaleza del grupo eliminado cuando la enzima es especfica para este enlace. -
El nombre comn que se recomienda es, en la mayor parte de los casos, formado por el nombre
del substrato al cual se adiciona el sufijo "asa". En general las hidrolasas son holoprotenas.
Algunas pueden tener un grupo prosttico, por ejemplo el fosfato de piridoxal.
Fig.5:
HIDROLASAS..Reacciones de
hidrlisis, transforman
polmetro en monmeros
LIASAS
Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algn otro, por medios diferentes a la
hidrlisis o a, la oxidacin, con formacin de un doble enlace en alguno de los dos fragmentos.
52
Cuando ellas actan en sentido inverso -condensacin de dos molculas con desaparicin de un
doble enlace se les designa con el nombre de sintetasas.
Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases precisan la identidad
de la fraccin eliminada: CO2, aldehdo, amoniaco, etc.
El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo, substrato: fraccin eliminada-liasa.
Fig. 6: Liasas.
Condensacin de
molculas con desaparicin
de doble enlace
ISOMERASAS
Catalizan las reacciones de isomerizacin: racemizacin, epimerizacin, isomerizacin cis-trans, o
tambin originan modificaciones intramoleculares tales que transfieren un agrupamiento o
producen oxidorreduccin.
Fig. 7: Ejemplo de
Isomerizacin
LIGASAS O SINTETASAS
Son enzimas que catalizan la reaccin de unin de dos molculas, acopladas a la ruptura, sin
intervencin del agua, de un enlace pirofosfrico en el ATP o eventualmente en un nucletido
trifosfrico del mismo tipo.
Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - , C - S, C - N, C - C) y la sub-
subclases se refieren a la naturaleza del producto formado (amida, pptido, etc.) o a la reaccin
que es catalizada.
El nombre sistemtico es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando ADP), X Y , son
los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir del nucletido trifosfrico
implicado .en la reaccin (ADP o AMP) se indica entre parntesis.
Para darle nombre comn se utiliza, en general, el nombre del producto formado seguido del
trmino "sintetasa".
53
Fig. 8: Ligazas
Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de preparaciones
enzimticas, ms o menos purificadas. Con frecuencia es interesante determinar la actividad
enzimtica de una cantidad unitaria de preparacin enzimtica no purificada o de una enzima
purificada. Se refiere entonces la actividad, sea a 1 kilogramo de protena, sea a una molcula
gramo, as se define una actividad especfica, katal por kg de protenas y una actividad molar, katal
por mol de enzima.
Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales de la cintica
enzimtica son:
a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario transitorio ES. Este
complejo resulta de una complementaria de la estructura entre el sitio activo de la enzima y la
molcula del substrato.
54
curva, P o S = f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzima o en substrato (fig.9),
y disminuye en funcin del tiempo debido a la desaparicin del substrato en el curso de desarrollo
de la reaccin.
Siempre, al principio de la reaccin, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde
con aqulla en que la velocidad permanece constante.
Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que
implica el trabajar a velocidades iniciales. En estas condiciones, al principio de la reaccin, la
concentracin en producto es muy dbil; puede despreciarse, as como la reaccin inversa de
transformacin del producto en substrato. Entonces se puede escribir
k1 k3
E + S ES E + P
k2
c) Por otra parte, para una concentracin dada de substrato, el estudio de las variaciones de la
velocidad inicial de reaccin en funcin de la concentracin de enzima (fig. 10) muestra que
esta variacin no es lineal. La curva presenta un trazo hiperblico correspondiente al hecho de
que para una cierta concentracin de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la
forma de complejo enzima-substrato;
Fuente: Scriban,
Biotecnologa, 1985
55
de lo que resulta que la velocidad inicial, funcin de la concentracin de este complejo, permanece
constante. Para los estudios cinticos, es necesario situarse en las condiciones que corresponden
al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentraciones bajas de enzimas.
En otros trminos, la cantidad de enzima debe ser pequea en comparacin a la concentracin del
substrato, de tal manera, que la formacin del complejo enzima-substrato, ES, no modifica, o
modifica poco la concentracin del substrato,
Hiptesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores consideraron que la hiptesis
de Michaelis-Menten es demasiado restrictiva y que es preferible postular un estado estacionario,
estado para el cual la velocidad de formacin del complejo ES es igual a su velocidad de
descomposicin en todas las direcciones (formacin de productos y aumento del substrato).
Velocidad de formacin de ES = k1 [E] [S]
Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de reaccin [ET] se reparte en
una fraccin libre [E], y una fraccin que forma un complejo [ES], se tiene:
[ET] = [E] + [ES]
Al sustituir E por su valor, se obtiene:
56
La velocidad de formacin del producto est dada por: v = k3 [ES], la ecuacin general es de la
forma:
Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas con un solo substrato
corroboran la validez de esta ecuacin.
Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hiptesis de Michaelis-Menten : [E] + [S] y [ES] estn en equilibrio
y la formacin del producto representa una ligera fuga. En este caso, Km puede ser asimilada a la
inversa de la afinidad de las enzimas por el substrato. Mientras ms pequea sea Km, mayor ser
la afinidad y viceversa.
57
Si kz < k3, la hiptesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no tiene relacin con la
afinidad de la enzima por el substrato. Tambin es preferible considerar Km como una constante
emprica igual a la concentracin del substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V m/2en
las condiciones experimentales definidas.
Figura 11 :
Representacin grfica
de Michaelis-Menten
58
Representacin grfica de la cintica michaeliana de un substrato: La representacin de Michaelis-
Menten, v en funcin de S.
La produccin mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares de millones de
dlares, 60% de ellos con utilizacin en las industrias agroalimentarias.
Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de una reglamentacin
estricta, en lo que concierne a su produccin, su pureza qumica y microbiolgica. En su
presentacin comercial, sea bajo la forma ms o menos diluida, fijada sobre soportes inertes, o
diluyentes estn tambin igualmente reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores utilizados en la
bioindustria o en otras diversas industrias (farmacia, textiles, pieles...) pueden provenir de varias
fuentes, especialmente:
Cada una de estas fuentes se estudiar tomando en cuenta slo algunos ejemplos.
Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden decreciente de inters
tecnolgico, una de las ms importantes enzimas vegetales de uso industrial se encuentran: la
papana que proviene de una planta ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extrada
de la pifia (Ananas comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).
59
Son numerosas las aplicaciones de la papana industrial (alrededor de 300 ton.), de las cuales se
usa 75% en la industria cervecera para la estabilizacin coloidal de la cerveza; 10% en la industria
de la carne (ablandamiento), 5% en la fabricacin de hidrolizados de pescado destinados a la
alimentacin animal, 2% en la industria farmacutica, entre otros. La tasa de utilizacin puede
variar seriamente en funcin de la legislacin alimentara de cada pas. El desarrollo de la papana
industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir fluctuaciones por razones
diversas (produccin, acontecimientos polticos, cambios de tecnologas). En los ltimos aos se
han introducido exigencias muy estrictas sobre la calidad del producto.
Desde que el desarrollo de la microbiologa ha permitido comprender mejor los sistemas que
condicionan la sntesis de enzima s en los microorganismos, la produccin industrial de enzimas se
ha orientado hacia los procesos de fermentacin. Las principales ventajas de las enzimas en la
fermentacin con relacin a las enzimas en la extraccin son las siguientes:
- Una produccin independiente de restricciones estacinales o geogrficas.
60
- La posibilidad de utilizacin de materias primas de fcil adquisicin.
- Los rendimientos en la produccin se pueden aumentar en proporcin importante al mejorar las
capas microbianas y aplicar las pti mas condiciones de fermentacin.
Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y
especificidades diversas.
Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las industrias de fermentacin
(fuertes inversiones, consumo de energa, riesgos de contaminacin...) y en el transcurso de los
ltimos treinta aos se han desarrollado un nmero importante de fermentaciones productoras de
enzimas.
Las principales producciones se presentan en el cuadro 1
En la produccin industrial de las enzimas se consideran las siguientes etapas . (Scriban, 1985)
A. Definicin de la enzima que se busca
La produccin de una enzima industrial que responda, en principio, a una exigencia potencial de
quienes la pueden utilizar, hace necesario determinar las propiedades que esta enzima pueda
tener. Prioritariamente, de acuerdo a Sicart (1980):
61
- La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas para la hidrlisis de
macromolculas complejas en las cuales los sitios de acoplamiento con, frecuencia se
desconocen, el efecto global que se busca involucra, generalmente, la utilizacin de un tipo preciso
de enzima. En ciertos casos, como sucede con la pectinasa, una enzima asocia tres actividades
diferentes, y se debe precisar estrechamente la relacin entre estas tres actividades de acuerdo al
producto que se vaya a tratar.
- El valor ptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable segn las enzimas; algunas de
ellas, como la proteasa alcalina an son activas a pH = 10, en tanto que las enzimas fngicas
funcionan an a pH = 3.
- El valor ptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se interesan en poder
disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan
en parte la esterilidad del medio de fermentacin.
62
Despus, es necesario definir el sistema que se adoptar para medir su actividad, pero conviene
disociar la nocin de actividad que se aplica a la cantidad de enzima presente en una preparacin,
la que se puede determinar mediante un mtodo de laboratorio, de la nocin de eficacia que
caracteriza el comportamiento de la misma preparacin colocada en las condiciones industriales en
las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).
Los mtodos de aislamiento que se utilizan son los mtodos clsicos, el ms importante es el
cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un medio selectivo. En el medio selectivo
ideal, el substrato de la enzima es la nica fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el
almidn como nica fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa.
Las tcnicas de difusin en agar se han desarrollado para la deteccin de la actividad enzimtica.
Esta prueba, en las condiciones estndar, puede dar informacin de orden cualitativo. Para que la
cepa aislada sea retenida definitivamente debe presentar algunas caractersticas, de acuerdo a
Aunstrup y col. (1979) y Sicart (1980):
- Producir el menor nmero posible de metabolitos secundarios, como antibiticos, por ejemplo.
Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneracin, la prdida de viabilidad y las
contaminaciones. Los medios ms seguros son la liofilizacin o la conservacin a temperatura del
nitrgeno lquido. Estas tcnicas permiten conservar las cepas casi indefinidamente.
63
Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo en superficie, en una
delgada capa de medio lquido o de medio semislido. Esta tcnica es an utilizada para algunas
producciones, en particular de enzimas de origen fngico, tales como las amilasas de Aspergillus,
las proteasas de Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de Penicillium. Pero existen varios
problemas en el control de la temperatura, de la aireacin y de la humedad, por ello se prefieren
los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio lquido, profundos,
agitados, son mejor adaptados a los diferentes controles mediante mtodos modernos y reducen
los riesgos de contaminacin. Adems se prestan mejor a las operaciones de extrapolacin y de
optimizacin necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador industrial.
Preparacin del inculo
En esta etapa de preparacin del inculo, la capacidad de produccin de la cepa debe
conservarse y eliminarse todo riesgo de contaminacin. Para ello es necesario evitar que haya
un nmero excesivamente grande de cultivos sucesivos. Es preferible el sembrar directamente
un matraz de medio gelosado, a partir de la cepa liofilizada, despus, a partir de este cultivo se
sembrar un nico fermentador que servir el mismo de inculo para el fermentador industrial. El
volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10% del volumen del fermentador de
produccin y la composicin del medio para la preparacin del inculo se aproxima bastante a la
del medio de produccin. El tiempo de permanencia en el fermentador vara de 10 a 80 horas
segn el procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, . . . (Aunstrup y col., 1979)
64
Los fermentadores estn equipados de una corona clsica de aereacin, ya que la mayor parte de
las fermentaciones productoras de enzimas tienen una fuerte demanda de oxgeno. Generalmente,
estas fermentaciones son conducidas en condiciones limitadas de oxigenacin. Para la
glucoamilasa, la productividad est limitada a la transferencia de oxgeno (Aunstrup y col., 1979).
Los equipos de medicin y de control del fermentador permiten seguir y regular los parmetros del
cultivo. Los controles se ejercen generalmente sobre el pR, la temperatura, el oxgeno disuelto, la
espuma y la evolucin de la concentracin de ciertos nutrientes. Adems la medicin de la apari-
cin de la actividad enzimtica se efecta a intervalos regulares por el laboratorio de control. An
no existen reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua. (Sicart, 1980). Esta
medicin es importante porque de ella depende la decisin de detener la fermentacin.
Para la produccin de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de asepsia, por una parte
para obtener un buen rendimiento, por otra parte para no tener el riesgo de secrecin de
substancias txicas como contaminantes. Esta asepsia es difcil de mantener, siendo el medio muy
rico y el pH cercano a la neutralidad.
Se necesita tomar precauciones a nivel de la construccin del fermentador y para la eleccin de las
instalaciones y los equipos colaterales. Durante toda la fermentacin, una ligera supresin de aire
en el fermentador impide la penetracin de contaminantes, esta precaucin la refuerzan las
protecciones de vapor en todos los puntos de comunicacin con el exterior (fig. 12).
An no se ha establecido el modelo cintico general para la sntesis de enzimas, pero, ya se ha
estudiado la regulacin de la formacin de algunas enzimas. Algunas enzimas se forman durante
la fase exponencial de crecimiento, pero la mayor parte aparecen en la fase postexponencial.
Segn sean las enzimas y los procedimientos, la fermentacin dura de 30 a 150 horas.
La cantidad de protena -enzima en el medio, al final de la fermentacin, representa de 1 a 5% de
la materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular puede alcanzar de 2 a 10%.
La calidad de las enzimas producidas est en estrecha relacin a la forma en que se condujo la
fermentacin. La seleccin de las materias primas, el mtodo de esterilizacin, el procedimiento
para regular la formacin de espuma, la aireacin y la agitacin, as como la duracin de la
fermentacin afectan, no solamente al rendimiento y al costo de produccin, sino tambin al color,
olor y a la estabilidad de la enzimas.
65
Fig. 12: Esquema para una produccin de fermentacin para la
produccin de enzimas (Aunstrup, 1979)
Desde 1916, Nelson y Griffin haban demostrado que la invertasa adsorbida sobre carbn
activo, conservaba su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la dcada de
los 50's para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta tcnica, en particular con los
trabajos de Grubhofer y Schleith.
Despus de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el impulso de los equipos de
Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales
de las enzimas inmovilizadas. En1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japn el
primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminocidos a partir de la correspondiente
mezcla racmica. Esta tcnica permitira, segn los autores, disminuir el precio de costo a menos
del 40% con relacin al procedimiento convencional.
66
La actividad de las enzimas est ligada al mantenimiento de la integridad de su conformacin
temaria, en particular al nivel de su sitio activo. Los procedimientos de inmovilizacin deben, por
consiguiente, ser mtodos suaves, bien regulados, que respeten la estructura nativa de la protena,
que los enlaces que se crean entre el soporte y la enzima, excluyan los cidos aminados
involucrados directamente en la reaccin cataltica..
Se han propuesto diversos tipos de mtodos y en 1971, en la primera conferencia de Ingeniera
Enzimtica de Henniker (E.U.A.) se defini una clasificacin de enzimas inmovilizadas, segn el
mtodo de fijacin utilizado.
Fig : 13 : Clasificacin de formas de obtencin de enzimas
En esta clasificacin, las enzimas inmovilizadas se consideran como un caso particular de las
enzimas modificadas. Despus apareci la tcnica de reticulacin (enlazamiento cruzado) en el
cual las molculas enzimticas son polimerizadas por intermedio de un ligando polifuncional.
67
- Medicin de la actividad
Las condiciones ptimas de accin de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las de las
enzimas en solucin y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de
interpretacin. As para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a
75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de 100% a pH 7.1.17
Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizacin entraa con frecuencia una prdida de
actividad, muy variable segn sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijacin; pero tambin se
han sealado algunos casos en los que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido
o en otro podran explicarse por una modificacin estrica del sitio activo de la enzima bajo el
efecto de un cambio de conformacin de la cadena polipeptdica.
68
TAREA:
1. Realice un Glosario, de la unidad estudiada:
2. Realice una investigacin bibliogrfica sobre las enzimas ms importantes en la industria
alimenticia, escoja una de ellas y realice un diagrama de flujo para la produccin de la misma.
3. Para mayor comprensin lea el articulo de Miguel Arroyo en el siguiente link: Inmovilizacin de
enzimas: Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Y realice una comparacin de los diferentes
mtodos teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas.
CIBERGRAFIA:
http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html. Sitio que incluye informacin acerca de las enzimas,
su funcin y caractersticas.
http://minnie.uab.es/~veteri/21264/t4_els_enzims.pdf. Las enzimas en los alimentos
Biotecnologa de los alimentos. Introduccin. ILSI International Life Sciences Institute. Serie de
monografas concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
Alimentos y tecnologa de modificacin gentica. Salud y seguridad en el consumidor. ILSI
International Life Sciences Institute. Serie de monografas concisas de ILSI Europa.
http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
69
UNIDAD 4: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA
La estructura y funcin bsica de los genes se conoca desde finales de los aos sesenta. Ms
an, la labor de los bioqumicos haba producido un gran cmulo de conocimientos respecto de los
conjuntos de reacciones qumicas que ocurren dentro de los seres vivos. Las vas metablicas
fundamentales para la generacin de energa y la biosntesis de la mayora de los compuestos
esenciales para la vida ya estaban establecidos. (Saberon , 1997)
Todas las vas metablicas, la expresin de anticuerpos, la actividad de los virus, en fin, todas las
manifestaciones del fenmeno viviente, estn, en ltima instancia, orquestados por la expresin
ordenada y regulada de los genes, por medio de la produccin de protenas especficas.
El extraordinario proceso por el cual una sola clula, el huevo fecundado, da origen a un organismo
complejo, es decir; las etapas de diferenciacin celular; constitua un reto extremadamente
atractivo, pero a la vez formidable. Un descubrimiento clave inici el cambio dramtico que
70
conocemos hoy como ingeniera gentica o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel
Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas,
que les vali el Premio Nobel de fisiologa o medicina, compartido con Werner Arber, en 1978.
Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos
sistemas, llamados de modificacin-restriccin, son anlogos a un sistema inmune, los cuales
probablemente evolucionaron como un mecanismo de proteccin de los microorganismos contra
infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados
bacterifagos, que inyectan su propio ADN en la clula bacteriana para despus controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios componentes, dando como
resultado final la ruptura de la clula y la liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas
bacterias el ADN propio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificacin se
desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo
GAATTC, introduce un pequeo grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima
de restriccin, tambin se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta
el ADN en esa posicin. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que
efectivamente es capaz de degradar el ADN extrao que puede entrar a la clula, sin alterar el
ADN propio.
Es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y corta esta secuencia,
llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble
cadena:
71
5G AATTC3
3CTTAA G5
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse
nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede
hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima. Los descubridores de las
primeras enzimas de restriccin pronto se dieron cuenta de que su accin sobre el ADN
(comnmente llamada "digestin") produca un conjunto definido de diferentes segmentos.
Sbitamente, el ADN dej de ser una sustancia montona y frgil, donde purificar un segmento
especfico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar segmentos especficos, con las
enzimas de restriccin, la molcula de la vida qued a merced del bilogo molecular y por lo tanto
nos facilit el camino para manipular la secuencia del ADN, de cualquier especie. Este, entonces
se convirti en la nueva herramienta de la Biologa moderna y por lo tanto de la BIOTECNOLOGA.
72
recombinacin Este procedimiento consite, entonces, en cortar el ADN en fragmentos especficos
utilizando enzimas llamadas endonucleasas de restriccin y ligar los fragmentos a un vector, es
decir, una molcula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada por la clula
hospedadora..
En resumen, los elementos esenciales de la tcnica de ADN recombinante (vase la figura 2): son
los siguientes
73
Fig. 2. Los procedimientos bsicos del ADN recombinante
El producto de la digestin del ADN con endonucleasas de restriccin est constituido por
muchos fragmentos especficos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros.
Estos fragmentos se ligan despus a un segmento especial de ADN, el vehculo de donacin
(usualmente un plsmido), que fue cortado con la misma enzima. Las molculas
recombinantes resultantes contienen un ADN vehculo o vector y un ADN pasajero,
constituyendo una nueva molcula circular continua.
74
A. Corte y ligadura del ADN
Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante enzima que permite ligar o
unir molculas de ADN. La investigacin sobre la fisiologa de los cidos nucleicos ha
proporcionado, adems, una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los
cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante de las herramientas del ADN
recombinante. Cada una de estas enzimas, al igual que las endonucleasas de restriccin, cumple
un papel dentro de la clula viva, para alterar el material gentico (por ejemplo, para repararlo,
replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se pueden usar estas enzimas, despus
de purificarlas de sus fuentes naturales, para efectuar transformaciones tiles a los propsitos del
experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos
virus para invadir el genoma de sus clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a
partir de sus ARN mensajeros
Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a su vez el desarrollo de
herramientas moleculares, hoy en da contamos con un enorme nmero de enzimas y reactivos
que permiten gran versatilidad en la manipulacion del ADN.
75
Adems de las enzimas que hacen posible la transformacin y manipulacin del DNA, hay otro
elemento indispensable para el trabajo del ingeniero gentico: los vectores. Los vectores no son
ms que los portadores del fragmento de DNA que se quiere aislar o clonar.
Plsmidos:
La replicacin de los plsmidos puede o no requerir de protenas codificadas por ellos y puede
o no estar sincronizada con la del cromosoma bacteriano.
Todos los plsmidos que se usan como vectores poseen tres caractersticas comunes:
76
1. Un sitio replicador
2. Un marcador de seleccin
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)
1. Sitio replicador:
El replicador es el segmento de DNA que contiene el sitio a partir del cual se comienza a
replicar el DNA usualmente llamado origen de replicacin: ORI. Este sitio incluye los genes
que codifican para las protenas y RNAs que se requieren para la replicacin.
El nmero de copias de un plsmido puede ser alto o bajo en dependencia del control al
que estn sometido los replicadores. Este control puede ser de dos tipos: relajado o
restringido
2. Marcadores de Seleccin:
Los marcadores de seleccin ms usados sobre todo en bacteria son genes que codifican
para la resistencia a determinados antibiticos. Los antibiticos son sustancias qumicas
que producen la muerte de los microrganismos pero son relativamente poco txicos a las
clulas eucariticas.
Los vectores plasmdicos o de fagos portan genes para la resistencia a estos antibiticos.
Estos genes son normalmente dominantes y por lo tanto las clulas que los contengan
pueden ser identificadas por su capacidad de crecer y formar colonias en presencia del
antibitico. Los plsmidos que contienen tales genes le confieren a las clulas donde son
isertados la capacidad de vivir en presencia de tales sustancias.
77
Los antibiticos se aaden usualmente a medio slido recien autoclaveado antes que la
temperatura haya disminuido por debajo de 50 oC. En casos de emergencia se pueden
aadir directamente a plcas ya preparadas, dando tiempo para que el antibitico pueda
o
difundir (~60 min). Se deben guerdar a 4 C pues los antibiticos pierden potencia a RT.
Algunos como la Tet y la Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles
a la luz
3. Sitio de Clonaje
En efecto hacia 1985 con el ADN recombinante ya plenamente establecido como una tcnica
aplicada rutinariamente por cientos de laboratorios en el mundo, Kary Mullis, quien a la sazn
trabajaba para la compaa Cetus, en San Francisco, California, tuvo una sbita inspiracin
mientras manejaba su auto y se diriga hacia una cabaa en la que se dispona descansar el fin de
semana. Como muchos otros investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para
los oligos sintticos. Concibi entonces la idea de que combinando el uso de los oligos con varios
ciclos de replicacin in vitro se poda amplificar, es decir; obtener en gran cantidad, un segmento
de ADN especfico (por ejemplo, un gene en particular).
En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa en la replicacin del ADN
(Ver fig. 3) . Para convertir una molcula de ADN de doble cadena en dos molculas idnticas, la
78
enzima requiere que las cadenas de la molcula inicial se separen, para as tener un molde
disponible.
Adems, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve para cebar o
iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos precursores. Si se colocan estos sustratos en un
tubo de ensayo, la ADN polimerasa puede incorporar uno por uno los nucletidos
correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en la cadena creciente; frente
a G, C, etc.
En realidad, ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se
concibiera la tcnica de la PCR. Lo original de la idea de la concepcin de Mullis fue pensar qu
sucedera si se aplica este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los
oligos sintticos, en virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos nucleicos, definen los
puntos de partida para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia
define los extremos de un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del
molde, previamente separadas, y se someten a una reaccin con ADN polimerasa, de lo que
resultarn dos molculas cuyos extremos estn definidos por los oligos y que corren en sentido
opuesto. Las cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de
molculas con la secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto s el proceso se replica
cclicamente entonces, la replicacin del ADN, ser exponencial. En el siguiente ciclo de
separacin de cadenas, hibridacin con los oligos y reaccin con ADN polimerasa, se obtendrn
cuatro molculas de la regin entre los oligos. Los ciclos subsiguientes generarn 8, 16, 32, 64
molculas, y as sucesivamente. (Fig. 3 )
79
Fuente : Raven, J. Biology, 2002
As, con la tcnica de la PCR se pueden amplificar segmentos especficos de ADN para crear
muchos millones de molculas a partir de unas cuantas, o incluso de una sola. Para esto se
requiri adaptar el concepto bsico haciendo uso de ADN polimerasas provenientes de
microorganismos termfilos (que crecen a temperaturas de ms de 70 grados en manantiales
termales). De otra manera, la enzima se inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para
separar las molculas del ADN molde. Hoy da un ciclo puede tomar cinco minutos o menos, por lo
80
que el proceso de amplificacin se lleva a cabo en menos de dos horas (normalmente 20 o 30
ciclos son suficientes).
La aplicacin de la PCR, en s misma, constituye un avance revolucionario en la investigacin
biolgica moderna.
La tecnologa del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de mutagnesis. Mientras
que los mutgenos convencionales actan al azar, mediante el uso de DNA sinttico y las tcnicas
del DNA recombinante es posible introducir mutaciones en sitos determinados con toda precisin
en los genes. Este proceso se denomina mutagnesis dirigida. Es de esperar que las protenas
fabricadas a partir de cepas que cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes de las protenas
de las cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al conocerse la estructura de la
protena. A continuacin se esquematiza los procedimientos bsicos utilizados en esta tcnica (Fig.
4)
MUTAGENESIS
81
Fif. 5 Mutagenensis dirigida, utilizando cortos fragmentos
de oligodesorribonucetido
82
Leccin 3: Mutagnesis en Casette o interrupcin gnica
Sin lugar a dudas, estas tcnicas han revolucionado la forma obtener productos y su
comercializacin, sin embargo existen todava muchos inconvenientes de costos y ticos que aun
no se han resuelto. Una de las mayores controversias se ha suscitado ha raz de la obtencin de
animales y vegetales transgenicos con fines teraputicos y /o alimenticios.
83
glndula mamaria, podemos pensar en manipular este sistema para que se elaboren en ella
productos diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros animales transgnicos
que producen protenas de inters mdico.
La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales producen leche protenas
de altsimo valor y utilidad es realmente un triunfo maysculo de la biotecnologa moderna.( Fig7).
Con gran seguridad, en pocos aos los enfermos con deficiencias de alguna de estas protenas,
por ejemplo los hemoflicos, dispondrn de una fuente relativamente barata para conseguirlas.
Recientemente se anunci ya la obtencin de vacas transgnicas.
Los animales transgnicos tambin pueden usarse para muchos otros propsitos.
Las posibilidades de beneficiarnos a travs del mejoramiento gentico de las plantas ya existentes
por medio del transplante de genes es enorme, puesto que uno de los problemas que se han
generado a partir del cultivo intensivo es el uso exagerado de fertilizantes y pesticidas. Debido a
84
esto, el desarrollo de bioinsecticidas ha recibido importante atencin en los ltimos tiempos. En
particular, el microorganismo, Bacillus thuringiensis, que naturalmente produce una protena txica
(toxina BT) para diversas especies de artrpodos (insectos y arcnidos, por ejemplo). Estas
bacterias pueden ser cultivadas y administradas a los cultivos, y constituyen un insecticida
biodegradable y seguro. El paso siguiente consisti en introducir el gene que codifica para esta
toxina a una planta de tabaco (por supuesto fusionado a una regin regulatoria que permitiera su
expresin en la planta, particularmente en las hojas). Las plantas transgnicas resultantes son
inmunes a las larvas de palomillas que normalmente merman este cultivo. Al cabo de consumir un
poco de la hoja, la larva se vuelve inactiva y muere, envenenada por la toxina BT. Es importante
resaltar que esta toxina es completamente inocua para otros animales, incluido, desde luego, el ser
humano.
Una caracterstica muy interesante del reino de las plantas es que para vivir se han adaptado a
ambientes extremos, ya que no pueden huir de ellos. As, encontrarnos plantas capaces de vivir en
condiciones de sequa, salinidad, etc. Tambin los vegetales han desarrollado funciones para
defenderse de ser ingeridas indiscriminadamente. Cada especie animal gusta slo de ciertas
plantas y las puede comer sin enfermarse.( Por encima de todo esto, los seres humanos tendemos
a ser muy selectivos en nuestra alimentacin. Algunos de nosotros slo compramos frijol "flor de
mayo", sin importarnos si nos resulta un poco ms caro, o si sus propiedades alimenticias no son
tan buenas como las de alguna otra variedad. As que no todas las caractersticas apreciadas se
encuentran juntas en la misma planta. Tpicamente encontraremos que unas variedades son
sabrosas, otras son nutritivas, otras ms, resistentes a las inclemencias del clima, etctera.)
La nueva biotecnologa de plantas permitir ir introduciendo, al principio uno por uno, los genes
que se vayan identificando como responsables de conferir ciertas caractersticas atractivas a las
variedades de plantas que son ms tiles. (Fig. 7)
85
Fig. 7 .Ejemplo de plantas genticamente modificas
esto permite efectuar la seleccin de un rasgo gentico especfico de un organismo e introducir ese
rasgo en el cdigo gentico del organismo fuente del alimento, por medio de tcnicas de ingeniera
gentica. esto ha hecho posible que se desarrollen cultivos para alimentacin con rasgos
ventajosos especficos u otros sin rasgos indeseables. Resumiendo, se puede decir que la
biotecnologa tiene un amplsimo rango de aplicacin en la industria alimenticia, ofreciendo los
medios para producir alimentos de mejor calidad en forma ms eficiente y segura para la salud y el
medio ambiente. una de las promesas de la biotecnologa es generar innovaciones y mejoras en
los alimentos conduciendo a prcticas agrcolas ms ecolgicas, contribuyendo a una agricultura
sustentable que utiliza con respecto los recursos del medioambiente.
86
El rea ms reciente y de mayor proyeccin dentro de la biotecnologa de alimentos est en el
desarrollo de alimentos genticamente modificados o transgnicos, cuyas principales ventajas se
ven en mejoras nutricionales, mayor productividad de cosechas y mayor proteccin
medioambiental. Adems, alimentos gm poseen hoy en da gran importancia en las soluciones de
graves problemas de escasez de alimentos, desnutricin y problemas de salud pblica en general
del mundo en vas de desarrollo.
Actividad: Organice un foro con sus compaeros sobre las ventajas y desventajas de los
alimentos gm en la alimentacin mundial, saque las conclusiones correspondientes y
presntelas en un informe. Para ello busque informacin en pginas Web.
87
UNIDAD 5: PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO
Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar los alimentos, y tanto stos
como las bebidas fermentadas constituyen un sector primario y extremadamente importante de la
industria aumentara. En este capitulo se describirn algunos procesos para la obtencin de
compuestos derivados del metabolismo energtico (fermentacin), metabolismo intermedio y
biosntesis
88
La envoltura de la clula de levadura incluye una membrana plasmtica, un espacio periplsmico y
una pared celular constituida principalmente por polisacridos y una pequea cantidad de pptidos.
La pared tiene una estructura semirrgida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una
considerable fuerza compresional y tensil. Los grupos carboxilo de los pptidos de la pared celular
confieren a las levaduras utilizadas en la elaboracin de cerveza una capacidad de floculacin
importante, lo que facilita la separacin slido-lquido despus de la fermentacin. Se cree que la
floculacin se debe a la formacin de puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos
carboxilo de la pared celular.
En la fermentacin las levaduras utilizadas para la elaboracin de cerveza (S. cerevisiae) utilizan
los azcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada
primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplsmico extracelular. Los azcares son
transportados a travs de la membrana celular por transporte activo o pasivo mediado por
permeasas producidas constitutivamente o inducibles. La maltosa y la maltotriosa son hidrolizadas
intracelularmente por la -glucosidasa, Saccharomyces uvarum (S. car/sbergensis) se distingue
taxonmicamente del S. cerevisiae en que tambin Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y
Kluyveromyces lactis, que a diferencia de S: cerevisiae pueden fermentar la lactosa, tienen un
sistema lactosa-permeasa para transportar la lactosa dentro de la clula, donde se hidroliza a
glucosa y galactosa, que entran en la gliclisis. Excepto los Saccharomyces diasraucus, que no
son adecuadas para la elaboracin de cerveza todas las levaduras Saccharomyces son incapaces
de hidrolizar el almidn y las dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en
almidn para la fermentacin alcohlica requieren la accin de enzimas exgenos como las y -
amilasas de la malta o enzimas microbianos como a-amilasa, amiloglucosidasa (glucoamilasa) y
pululanasa. Los azcares mayoritarios del mosto son la glucosa y la fructosa y puesto que el S.
cerevisiae metaboliza preferencialmente la glucosa; el azcar no fermentado que permanece en el
vino resultante es la fructosa. Por el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la
fructosa ms rpidamente que la glucosa.
El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19 aminocidos adems de otros
nutrientes. Estos aminocldos son asimilados a distintas velocidades durante la fermentacin. Un
aminocido permeasa general (GAP puede transportar todos los aminocidos bsicos y neutros
excepto la prolina. En las levaduras existen al menos otros 11 sistemas de transpone de
aminocidos ms especficos. La proln permeasa es inhibida por otros aminocidos: por el
amonaco.
Aunque !as fermentaciones alcohlicas son en gran medida anaerbicas. las levaduras necesitan
algo de oxgeno para sinterizar algunos esteroles y cidos grasas insaturados componentes de la
89
membrana. El mosto de la cerveza contiene normalmente niveles subptimos de esteroles y cidos
grasos insaturados. pero cuando el medio se suplementa con cido oleico u oleanoico, la
necesidad de oxgeno desaparece.
En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de las veces
favorables al crecimiento y actividad fermentara; esta ltima es mayor cuanto mayor sea el pH y
se produce una cada notable a valores de pH de 3-4. El pH influye en la formacin de
subproductos; por ejemplo, a valores de pH elevados se incrementa la formacin de glicerol. El
pH del mosto de uva est generalmente comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado
contenido de cidos (5-15 g/I), principalmente tartrico y mlico, de forma que, como la mayora
de las bacterias, con excepcin de las bacterias del cido actico y lctico prefieren pH ms
neutros, la susceptibilidad del mosto de vino a la contaminacin bacteriana es reducida.
Las temperaturas ptimas de la fermentacin, la respiracin de las levaduras y el crecimiento
celular son claramente diferentes. La velocidad de fermentacin aumenta. generalmente con la
temperatura entre los 15 y los 35C y los niveles d e glicerol, acetona, buteno-2,3-diol,
acetaldehdo, piruvato y 2-cetoglutarato se elevan en los caldos de fermentacin. La formacin
de niveles elevados de alcohol tambin depende de la temperatura. En los vinos blancos, la
menor temperatura de fermentacin da lugar a vinos ms frescos y afrutados, y el riesgo de
infeccin bacteriana y de produccin de cidos voltiles como resultado es reducido. Para la
90
produccin de vino tinto se utilizan temperaturas ms elevadas, de 22 a 30oC, y la fermentacin
con los hollejos conduce a la intensificacin del color y a la produccin de un rico aroma.
En la produccin de bebidas alcohlicas deben controlarse las fermentaciones de forma que, por
un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos
con aromas caractersticos y deseables, y por otro lado, se minimice la formacin de aromas y
sabores indeseables. Entre los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes
diferentes del etanol, steres, compuestos carbnicos, cidos orgnicos, compuestos azufrados,
aminas y fenoles.
Cuantitativamente, y en funcin de su papel en el aroma y sabor, los componentes ms
importantes presentes en las bebidas alcohlicas son los alcoholes superiores, denominados
tambin alcoholes de fusel o aceites de fusel, entre los cuales los ms significativos en la cerveza
Y el vino son el alcohol amlilico, el isoamlico y el 2-fenoetanol. El vino tinto tiene una
concentracin mayor de estos compuestos que el vino blanco. Las bebidas destiladas tienen un
espectro bastante diferente de alcoholes superiores, que incluyen butanoles y pemanoles. El
glicerol, alcohol polihdrico, est presente en casi todas las bebidas alcohlicas. En el vino, el
glicerol se encuentra a concentraciones de hasta el 1 % (peso/volumen) y confiere cuerpo a esta
bebida.
En muchas bebidas y licores, los steres constituyen un grupo importante de compuestos voltiles
debido a su penetrante aroma afrutado. Entre ellos, el acetato de etilo est presente en muchas
bebidas a concentraciones organolpticamente importantes. Otros steres importantes incluyen el
formiato de etilo y el acetato de isoamilo.
El acetaldehido, con propiedades organolpticas indeseables, se produce como un compuesto
intermedio durante las fermentaciones alcohlicas, obtenindose niveles altos por tasas de
levaduras elevadas o excesiva aireacin. El diacetilo y la pentano-2,3-diona, formados fuera de las
clulas de la levadura por decarboxilacin oxidativa del -acetolato y el -cetohidroxibmirato, tienen
aromas y sabores indeseables caractersticos. Las levaduras pueden reducir el diacetilo y la
pentano-2,3-diona. La presencia de exceso de diacetilo en la cerveza se produce cuando el -
acetolactato aparece en una etapa en la que las levaduras ya han sedimentado o han perdido su
capacidad para reducir el diacetilo a acetona o el exceso de diacetilo en la cerveza tambin puede
deberse a fa presencia de organismos que la deterioran, como Pediococcus y Lacrobacillus.
Durante la fermentacin primaria del mosto de la cerveza se producen cantidades considerables de
SH2 provenientes de la reduccin de los compuestos azufrados. Aunque en la cerveza pueden ser
aceptables cantidades pequeas de compuestos azufrados, y en la cerveza normal el SO2 est
usualmente presente a concentraciones por debajo de su umbral de sabor, el exceso produce
aromas y sabores. desagradables. El dixido de azufre influye positivamente en la fermentacin
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alcohlica, puesto que se une al acetaldehido y adems inhibe algunas de las reacciones de
oxidacin indeseables. En el mosto del vino, el SO2 inhibe algunos microorganismos indeseables,
entre ellos las bacterias del cido lctico y cido actico, as como algunas levaduras naturales que
producen un exceso de cidos voltiles, piruvato y -cetoglutarato. Adems la produccin del
desagradable sabor del cido actico tambin inhibe las fermentaciones de levaduras,
particularmente combinado con el etanol, Saccharomyces cerevisiae es ms susceptible a esta
inhibicin que Saccharomycoides ludwigii, Schizosaccharomyces pombe. En los mostos cuya
acidez total es baja, es muy til emplear S02 para inhibir la fermentacin malo-Ictica por las
bacterias del cido lctico, impidiendo la disminucin posterior del nivel de cido. Una concentra-
cin elevada de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentacin.
El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el crecimiento de las bacterias
del cido actico y del cido lctico, aunque la supervivencia de !as primeras sea usualmente corta
debido a las propiedades reductoras del medio. Las bacterias lcticas del vino son anaerobias
facultativas u organismos microflicos que son homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos
Lactobacillus producen cido lctico a partir de glucosa) y heterofermentivos (todos los
Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen cido lctico, etanol y CO2 a partir de la glucosa).
Las bacterias lcticas pueden metabolizar los cidos mlico y tartrico presentes en el vino a
concentraciones elevadas, as como al cido ctrico, presente en cantidades ms bajas. Existen
mtodos qumicos para reducir la acidez. La reduccin de los cidos puede impedir el deterioro de
los vinos de pH elevado. A pH 3,3-3,4, los Leuconostocoenus fermentan el cido mlico aunque los
Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los pH bajos y generalmente se
prefieren siempre que se desee una fermentacin malo-Ictica. Una fermentacin malo-lctica por
Pediococcus va con frecuencia acompaada de la formacin de diacetilo e histamina, indeseables.
92
Aunque existen diversos tipos de salsas de soja, la producida predominantemente en Japn,
denominada koikuchi, se obtiene por fermentacin de una mezcla de saja y trigo, que da lugar a
una salsa con fuerte aroma y color marrn-rojizo oscuro. El proceso consiste inicialmente en una
fermentacin primaria de una mezcla al 50 010 de saja cocida al vapor, empapada y trigo tostado y
triturado, con un nivel de humedad del 27 al 37 %, que se extiende en bandejas y se incuba con
Aspergillus oryzae, que tiene actividad amiloltica y proteoltica elevada, durante 2 3 das a 25-30
o
C. Despus de adherirle agua salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la
masa o moromi se transfiere a tinas grandes donde se produce la fermentacin secundaria, con
bacterias holofilicas y levaduras osmofilicas; el proceso tiene lugar a una temperatura de 35-40 oC,
con agitacin intermitente, y el tiempo de fermentacin oscila entre 2 y 12 meses. Al finalizar esta
fermentacin secundaria, se recupera la salsa lquida y se pasteriza. Los enzimas producidos en la
fermentacin primaria o fermentacin koji hidrolizan las protenas a pptidos y aminocidos
libres y convierten el almidn en azcares simples. Estos productos de ruptura son a su vez
metabolizados por otros microorganismos, produciendo diversos compuestos aromatizantes y
saborizantes. Utilizando inculos de levaduras, bacterias y hongos puros el proceso de
fermentacin se controla mejor y se obtiene un producto de calidad, aroma y sabor consistentes.
93
En Oriente, las pastas de soja fermentada se preparaban tradicionalmente en casa para su
utilizacin en sopas y salsas. En Japn, el producto, denominado misa, se elabora en la actualidad
a gran escala, mediante un proceso que implica inicialmente la fermentacin koji del arroz
empapado al vapor (o cebada, o soja, con menor frecuencia), que despus se extiende en
bandejas, se inocula con cepas seleccionadas de A. oryzae y se incuba a 28-35 oC durante apro-
ximadamente dos das. A continuacin el material se mezcla en recipientes con soja empapada y
cocida al vapor en una relacin 1:2, y se aade cloruro de sodio para dar una concentracin del 4
al 13 %, La mezcla se inocula con bacterias y levaduras y se deja fermentar entre 1 y 52 semanas.
Finalmente, el producto se amasa y se pasteriza, pudiendo obtener distintos tipos de miso con di-
ferentes grados de dulzura, salinidad y color, variando la materia prima koji, el contenido de sal, los
edulcorantes y la duracin de la fermentacin.
La produccin de tempeh se basa en una fermentacin en bandejas de soja remojada cocida al
o
vapor inoculada con Rhizopus oligosporus, e incubada a 30-38 C durante 24 horas. El producto,
que usualmente se corta en rebanadas, se sala y se consume frito, tiene una vida corta.
94
proceso, lo que dar lugar a productos de calidad y consistencia reproducibles y manteniendo
siempre las mayores condiciones de seguridad.
Leccin 7: Vinagre
El vinagre es una solucin acuosa de cido actico, se obtiene mediante la fermentacin por
oxidacin de una solucin diluida de etanol. El proceso metablico se basa en la conversin del
etanol, bajo la accin del alcohol deshidrogenasa, en acetaldehdo y del acetaldehdo hidratado en
cido actico por la accin de la acetaldehdo deshidrogenasa:
C2H5OHCH3CHO+H2OCH2CH OH2CH3COOH+H2O
La materia prima de la fermentacin del vinagre de alcohol (white spirit) consiste usualmente en
etanol purificado diluido. Los vinagres de vino, sidra, malta y arroz se obtienen por fermentacin
alcohlica de zumos de uva, manzana, cebada malteada y arroz, respectivamente. La
fermentacin del vinagre requiere tambin una fuente de nitrgeno y una combinacin apropiada
de minerales y con frecuencia es necesaria la suplementacin con nutrientes. Las modernas
fermentaciones de vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El acetator Frings
(Fig. 7.8), muy utilizado en la produccin comercial de vinagre, es un fermentador provisto de
deflectores, cuyo fondo contiene una turbina de cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya
rotacin hace que el aire sea succionado a travs del rotar hueco y se distribuya radialmente a lo
largo de toda la seccin trasversal del fermentador.
Los procesos comerciales tpicos, que producen cido actico del 12 al 15 OJo, se llevan a cabo
de forma semicontinua. Las concentraciones de alcohol y de cido actico al comienzo del ciclo
son del 7-10 % y del 5 1110 respectivamente;
la fermentacin se efecta entre 27 y 32 e hasta q ue la concentracin de alcohol desciende al 0,1-
0,3 %, momento en el cual se descarga una parte del vinagre (aproximadamente la tercera parte) y
el recipiente se vuelve a llenar con una mezcla que contiene del O al 2 % de cido actico y del 12
al 15 % de etanol y el ciclo se repite. Un alcalgrafo mide la concentracin de etanol y hace que las
operaciones de descarga y llenado se puedan llevar a cabo automticameme, sin interrupcin del
proceso de aireacin/mezclado de forma que impida el agotamiento total del etanol en el caldo de
fermentacin. El mezclado rpido continuo es esencial para minimizar los gradientes de
concentracin. Los tiempos del ciclo varan de 24 a 48 horas.
Las bacterias acidoacticas, que oxidan el etanol a cido actico y pueden existir a valores bajos
de pH, pertenecen a los gneros Acetobacter y Gluconobacter, estrechamente relacionados. Los
cultivos puros de estos organismos se caracterizan por su alto grado de variabilidad y en las
fermentaciones industriales se pueden desarrollar posteriormente cultivos mezclados a partir de
cultivos puros. Los cultivos industriales se seleccionan en funcin de que toleren una acidez
95
elevada y de que las velocidades de produccin de acetato sean altas. Estas bacterias son
extremadamente sensibles y se mueren en ausencia de oxgeno y etanol y tambin resultan
daadas a gradientes de concentracin de etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxgeno
aumenta a medida que lo hace la concentracin total de cido actico ms etanol. No obstante,
con una aireacin suficiente, puede conseguirse una utilizacin del 80 % de oxgeno sin producir
efectos adversos en la fermentacin. La sobreoxidacin, esto es la conversin de cido actico en
CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la concentracin de cido actico por encima del 6 % e
impidiendo el agotamiento total del etanol.
96
acidognesis, es imperativo suprimir los metangenos, asociados frecuentemente con los
formadores de cido en los cultivos mixtos, ya que convertiran el cido en metano y C02.
Aunque en el proceso aerobio pueden obtenerse concentraciones de acetato ms elevadas, el
rendimiento terico en el proceso de acidognesis anaerobio es de 1.0 comparado con el 0,66 de
aquel. Las dos molculas de C02 producidas durante la conversin de piruvato en acetil CoA se
asimilan justificando la tercera molcula de acetato formada a partir de glucosa (Fig. 8.5). Adems,
las necesidades energticas para el proceso anaerobio son menores y tambin es menor el valor
de los substratos, puesto que pueden emplearse desechos de destilera y desechos de plantas de
celulosa. En consecuencia., las fermentaciones acetognicas anaerobias pueden llegar a ser el
mtodo de eleccin para la produccin de acetato destinado a la industria qumica.
97
concentracin de 0,1-0,4 g 1 - l. La adicin de NH4- durante la fermentacin aumenta la produccin
de citrato.
98
manganeso del orden de 3 mg 1- 1. Por tanto, es necesario pretratar las molasas con agentes que
acomplejen o precipiten este metal. por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) o con cobre, que
contrarresta el efecto del manganeso al inhibir su absorcin por las clulas. Las condiciones
deficientes en manganeso tambin favorecen la produccin de pequeos grnu los micelianos con
superficies lisas y compactas, caractersticos de las buenas fermemaciones fngicas de citrato.
Cuando la concentracin de manganeso aumenta, la morfologa fngica se vuelve fijamentosa,
incrementando drsticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo rpidamente de forma
concomitante la tensin del oxgeno disuelto. Como la produccin de cido ctrico necesita
oxgeno, la velocidad de produccin de cido aumenta a medida que aumenta la cantidad de
oxgeno disuelto. Adems, una corta interrupcin del suministro d~ oxgeno puede conducir al cese
irreversible de la produccin de citrato. Para la biosntesis de citrato es esencial mantener el pH por
debajo de 2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula cido glucnico en vez de citrato.
La produccin de citrato con Candida gullermondi difiere en varios aspectos del proceso
sumergido con A. niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es un prerrequisito, siendo
innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar este metal del medio; el citrato se produce
a un pH superior (3,5-5,0). Adems, la limitacin de nitrgeno provoca la acumulacin de cido. La
principal ventaja del proceso que emplea Candida respecto al que emplea A. niger consiste en que
la productividad global de la fermentacin es superior, ya que se pueden utilizar concentraciones
de azcar ms altas debido a la naturaleza ms osmotolerante de los organismos y adems la
fermentacin es ms rpida.
99
citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida por el citrato, aunque esta inhibicin puede contra-
rrestarse con concentraciones intracelulares elevadas de NH4+
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los enzimas de la ruta de la
pentosa fosfato (que podran desviar las hexosas de la glicolisis y la produccin de citrato) y
tambin inhibe el ciclo del cido tricarboxilico, y adems perjudica el metabolismo anablico en
general, incluyendo el recambio de las protenas y los cidos nucleicos. Durante estas deficiencias,
se forma una proteasa cida y la reserva intracelular de cidos nucleicos y protenas disminuye con
+.
la produccin concomitante de pptidos, aminocidos y niveles elevados de NH4 Por tanto, en
conclusin, el principal efecto de la deficiencia de manganeso es su impacto en el recambio
proteico, haciendo que la concentracin de iones amonio se incremente en tanto que contrarreste
la inhibicin de la fosfofnlctoquinasa por el citrato.
Para la reoxidacin metablica del NADH durante la produccin de cido ctrico se necesita
oxgeno. Durante la acumulacin de citrato, un sistema respiratorio alternativo sensible al cido
salicilhidroxmico (SHAM), mantiene el sistema respiratorio con la reoxidacin del NADH, aunque
sin produccin concomitante de ATP (Fig.2). El hecho de que la acumulacin de cido ctrico est
fuertemente inhibida por el SHAM indica la importancia de este sistema. La respiracin sensible al
SHAM depende de una tensin elevada de oxgeno y el sistema se inactiva por una corta
interrupcin de la aireacin.
La produccin de cido glucnico con A. niger est catalizada por una glucosa oxidasa
extracelular, parcialmente unida al micelio, que se inactiva a pH inferiores a 2,0. A pH superiores,
se produce cido glucnico a partir de glucosa mediante la accin de A. niger. La glucosa induce
este enzima a pH superiores a 4,0, lo que hace necesario mantener en las fermentaciones para la
produccin de citrato un pH inferior a 2,0.
100
Fuente : Crueger, Manual de Microbiologa industrial, 1989
101
La goma xantano es el nico polisacrido microbiano obtenido por la fermentacin que representa
una parte significativa del mercado mundial. Su unidad repetitiva bsica consiste en un
pentasacrido que contiene glucosa, manosa, cido glucurnico, acetato y piruvato. Esta goma
tiene una viscosidad elevada a concentraciones bajas, que es estable en un amplio rango de pH y
es independiente de la temperatura y de la presencia de cationes. En solucin acuosa y combinada
con polisacridos de las plantas forma geles estables, por lo que se utiliza como estabilizante de
suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido a sus propiedades pseudoplsticas,
combinadas con su estabilidad frente a la temperatura ya los cationes, se emplea como lubricante.
Tambin se utiliza junto con surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperacin de aceites.
Los alginatos se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente est sujeta a una
gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel industrial el substituirlos por polisacridos
similares obtenidos por fermentacin, por ejemplo el polisacrido de Azotobacter vinelandii. Entre
otros polisacridos microbianos de inters comercial se incluyen el pululano, producido por
Aureobasidium pullulans, el seleroglucano, producido por especies de Selerotium y el gelano,
producido por Pseudomonas elodea.
102
- 1
concentracin final de xantano en los caldos de los fermentadores es de unos 50 g. 1 Y los
rendimientos, basados en la glucosa consumida, son del 50 al 60 %.
La mayora de las sntesis de exopolisacridos bacterianos se producen intracelularmente,
mediante la va de los azcares, activados con un nucletido. Los azcares se transfieren desde
el nucletido a un lpido transportador, activado por transferencia inicial de un azcar fosfato,
dando lugar a la formacin de la unidad repetitiva de azcar. El mtodo exacto de elongacin de
la cadena y de extensin del polisacrido es desconocido.
Actividades:
Investiga los procesos de produccin de cerveza y vino. Realice comparaciones relacionadas con:
Tipo de Microorganismos utilizados, Substratos y Procesos.
Investiga sobre metabolitos derivados del metabolismo intermedio y su aplicacin en la Industria
alimenticia.
Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes aplicaciones de la Biotecnologa
en la industria alimenticia
Consulte un proceso Biotecnolgico, y realice un estudio de casos, a partir del proceso que se
desarrolla y sustntelo ante sus compaeros.
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BIBLIOGRAFIA BASICA
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