1.

Biotecnologia microbiana: Conceitos e Aplicaes

A Biotecnologia apresenta carter inter e multidisciplinar, integrando diferentes conhecimentos e
conceitos fundamentais (PEREIRA, 2008). Nesse contexto, diferentes microrganismos so utilizados
para produo de substncias de interesse comercial, como: antibiticos, cidos orgnicos,
solventes, enzimas e biocombustveis por processos fermentativos. O produto pode ser ainda o
prprio microrganismo, como a produo de produtos lcteos fermentados utilizando probiticos
(WENDLING, 2013), ou as clulas microbianas podem ser utilizadas em processos de
biotransformao, como por exemplo, para a produo de esterides, aromas e fragrncias. Alm
da produo de bens de consumo, os microrganismos so tambm utilizados em processos de
tratamento de resduos, na recuperao de metais, tais como cobre, chumbo e urnio, ou em
processos de biorremediao de ambientes impactados (PEREIRA,2012). Todos os microrganismos
produzem uma grande variedade de enzimas intracelulares em pequenas quantidades, para a
catlise das suas reaes metablicas. As enzimas, tambm denominadas de biocatalisadores, so
catalisadores proticos com caractersticas particulares pela sua alta eficincia em condies
fisiolgicas e alta especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar reaes estereoespecficas.
Este potencial cataltico utilizado industrialmente no s nos clssicos processos fermentativos,
mas tambm em processos de biotransformaes microbianas para a catlise de reaes qumicas
de difcil ocorrncia e de grande importncia na indstria farmacutica (PEREIRA, 2008).

2. Bioprocessos
Um Bioprocesso caracterizado pelo estudo do desenvolvimento de alguma via metablica, ou
reaes mediadas por clulas que podem ser animais, vegetais ou microbianas e suas etapas
envolvidas. A substncia obtida a partir desse processo aplicvel, ou seja, possui algum valor de
interesse comercial.

O Bioprocesso pode ser dividido em duas etapas principais: A primeira, antes da produo, tambm
pode ser chamada de upstream, consiste na etapa de preparo do meio, esterilizao do meio de
cultura e de todo material que ser utilizado, bem como o desenvolvimento do inculo e formulao
do meio de cultura. A segunda etapa, denominada downstream, consiste na separao/purificao
do produto e das clulas.

Preservao do micro-organismo Noes de biosseparao:

Esterilizao -Separao slido-lquido

Formulao do meio de cultura -Concentrao

Desenvolvimento do inculo -Purificao

Algumas transformaes microbianas, analogamente s reaes qumicas, atingem rendimentos
prximos ao mximo estequiomtrico (produtos do metabolismo primrio), embora apresentando
taxas globais de produo baixas. Outras, como as do metabolismo secundrio, resultam em baixos
valores de rendimento e produtividade, havendo um enorme campo para avanos em ambos os
casos. Os progressos sero alcanados atravs de uma maior compreenso sobre a fisiologia celular
e da interao da clula com o ambiente qumico e fsico no biorreator. Algumas transformaes
microbianas, analogamente s reaes qumicas, atingem rendimentos prximos ao mximo
estequiomtrico (produtos do metabolismo primrio), embora apresentando taxas globais de
produo baixas. Outras, como as do metabolismo secundrio, resultam em baixos valores de
rendimento e produtividade, havendo um enorme campo para avanos em ambos os casos. esta
combinao, este binmio: clula (ou enzima)/meio ambiente (ou condies reacionais), que define
o xito de um Bioprocesso.

2.1 Caractersticas do microrganismo

Em processos de escala industrial, o agente biolgico deve ser selecionado em funo das seguintes
propriedades: elevada atividade, ou seja, ser capaz de converter rapidamente o substrato em
produto com altos rendimentos, conduzindo a altos valores de produtividade; estabilidade sob
condies ambientais extremas, ou ter uma ampla faixa de tolerncia, j que, em processos
industriais, no possvel a realizao de um ajuste preciso, havendo variaes em condies como
temperatura, presso e pH, por exemplo. Tambm se recomenda o uso de um agente tolerante e
resistente a substncias txicas, que podem ser geradas no processo de tratamento da matria-
prima ou encontradas em resduos e efluentes.

3. Esterilizao de Meios e Equipamentos

Existem Bioprocessos que exigem alto grau de assepsia dos meios de cultivo, havendo, tambm,
grande rigor no s no transporte do meio esterilizado ao biorreator, bem como no prprio sistema
reacional. O processo de esterilizao geralmente levado a cabo por agentes fsicos. Os mais
empregados so o calor (seco e mido), a filtrao atravs de membranas micro porosas e as
radiaes (especialmente a ultravioleta).

3.1 Meios de esterilizao com calor seco

O processo de esterilizao usando estufas de ar quente est entre os mais utilizados dentre os
mtodos de esterilizao por calor seco. Estes instrumentos so equipados com um termmetro
para indicar a temperatura do interior da cmara; um termostato, onde se programa a
temperatura desejada; uma lmpada que mostra a situao de aquecimento ou a estabilizao
da temperatura interna da cmara; algumas com um ventilador para promover a circulao do
ar, garantindo um aquecimento rpido e uniforme na cmara. No h um controlador de tempo,
este controle feito pelo operador do aparelho.
 3.2 Meios de esterilizao com calor mido
A utilizao de calor mido um dos mtodos mais eficazes no processo de esterilizao. A morte
das clulas microbianas por ao do calor mido ocorre pela desnaturao de protenas e da
desestabilizao da membrana citoplasmtica. Para esse tipo de esterilizao utilizada a autoclave.
O equipamento formado basicamente por uma cmara em ao inox, com uma ou duas portas,
como uma vlvula de segurana, manmetros de presso e um indicador de temperatura.

Na prtica industrial verifica-se o emprego da esterilizao de meios de cultivo em batelada e em

conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado sob presso atravs de serpentinas
ou jaquetas (aquecimento indireto), ou pela injeo de vapor saturado diretamente no meio
contaminado (aquecimento direto). Na esterilizao em batelada, o tempo total de esterilizao
relativamente grande, podendo dar origem a decomposio de nutrientes termo sensveis, como as
vitaminas, ou provocar reaes indesejveis entre os constituintes do meio, como por exemplo,
reaes entre aminocidos e acares (reao de Maillard) ou de caramelizao (decomposio dos
acares). Neste sentido, esta modalidade de esterilizao vem sendo substituda, sempre que
possvel, pela esterilizao contnua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes do
meio

4. Nutrio dos microrganismos

As necessidades nutricionais dos microrganismos so diversas, uma vez que estes apresentam
diferenas inerentes na sua capacidade de sintetizar os constituintes celulares a partir de nutrientes
simples. A demanda por gua, fontes de energia, carbono, nitrognio e elementos minerais, assim
como o acesso/utilizao de oxignio, entretanto, comum a todos os microrganismos.

4.1 Fontes de Carbono

Uma clula tpica contm cerca de 50% de sua massa seca em carbono. Sendo assim, o uso deste
elemento no meio extremamente necessrio, j que este se encontra no processo de biossntese
de diversos constituintes celulares, como carboidratos, protenas, lipdeos, cidos nuclicos etc. O
potencial para utilizar fontes de carbono para o metabolismo varia enormemente entre os
microrganismos. Desde os chamados compostos C1 (CO, CO2, formaldedo, metanol, metilamina),
at macromolculas complexas (glicognio, amido, protenas, celulose, cidos nuclicos),
praticamente todos os compostos orgnicos da natureza podem ser utilizados como fonte de
carbono e/ou energia por microrganismos, desde que estes possuam os sistemas enzimticos e de
transporte adequados a cada fonte.

4.2 Fatores de Crescimento

So denominados fatores de crescimento aqueles elementos indispensveis ao microrganismo, que

ele no capaz de sintetizar. importante destacar que j que existe uma exigncia por parte do
microrganismo ao composto, muitas vezes seu crescimento limitado por ele. Isso auxilia na
elaborao de meios de crescimento, com dosagens especficas.

5. Meios de cultura
 5.1 Tipos de meio

Para manuteno do microrganismo em condies de laboratrio, necessria a criao de um

meio que atenda s suas exigncias nutricionais, e para isso importante um conhecimento da
fisiologia do organismo em estudo. Existem basicamente dois tipos de meio: Os complexos e os
sintticos, sendo os primeiros de composio no conhecida, como extrato de leveduras e o
segundo tipo utilizado principalmente por microrganismos mais exigentes, com composio bem
conhecida. Os meios quimicamente definidos so formulados com compostos puros, tais como:
glicose, sulfato de amnio, fosfato mono ou dicido de potssio etc. Sua composio qumica
conhecida e reproduzvel, contendo fontes de cada elemento e dos nutrientes essenciais requeridos.

5.2 Consistncia do meio de Cultura

Para que as caractersticas de um microrganismo possam ser reconhecidas, ou para que a sua
atividade possa ser devidamente aproveitada, ele deve se encontrar em cultura pura, isto , no
deve ser misturado a outros. Para que possa separ-lo num material ou numa cultura lquida, h a
necessidade de seme-los na superfcie de um meio slido. Se o material foi adequadamente diludo
e o espalhamento bem feito, cada microrganismo estar separado do seu vizinho e, multiplicando-
se, formar uma colnia de microrganismos iguais a ele, visvel macroscopicamente e facilmente
transfervel para o novo meio, onde crescero em cultura pura (livro).

5.3 Tcnicas para organismos aerbios

Microrganismos anaerbios podem ser mantidos em jarras de anaerobiose, e alguns podem crescer
em meios de cultura apropriados, como o caso do meio Robertson, composto por carne, peptona e
cloreto de sdio o meio esterilizado por autoclavao e mantido em frascos com tampa de rosca.

Para os microrganismos aerbios, possvel a utilizao de tcnicas de aerao, sendo ela natural
ou forada. Na primeira modalidade, o oxignio fornecido pelo ambiente. Na aerao forada, o
ar esterilizado geralmente borbulhado para o seio do meio, onde se dissolve parte do oxignio
para o agente de transformao. Tambm utilizado o meio de agitao, que alm de facilitar a
incorporao do O2, facilita a disperso de metablitos, promove a homogeneizao do meio,
dentre outros fatores.

6. Desenvolvimento do Inculo
Para que seja feita a transferncia do microrganismo para o meio de produo, necessrio que ele
esteja no estado fisiolgico adequado, e isso encontrado essencialmente na fase exponencial de
crescimento. No crescimento em batelada, ou seja, onde no h acrscimo nem retirada de meio ou
de microrganismo, existem 4 fases de crescimento:

O crescimento microbiano pode ser medido por diversas formas:

a) Gravimetria ou anlise gravimtrica: A anlise gravimtrica um tipo de tcnica laboratorial

usada para determinar a massa ou concentrao de uma substncia, medindo alteraes na
massa. A substncia qumica que estamos tentando quantificar chamada tambm
de analito. A separao do constituinte pode ser efetuada por: precipitao qumica,
eletrodeposio, volatilizao ou extrao.
 b) Turbidimetria: uma medida indireta de crescimento e consiste na medida de turvao de
uma suspenso microbiana, aferindo a absorbncia em espectrofotmetro. um processo
extremamente simples, onde a amostra no destruda. Entretanto, no pode ser realizada
em certos tipos de meio, como por exemplo, em fungos que formam miclios ou que
contenham esporos. Para obteno dos resultados, necessria a construo de curvas de
calibrao:

Lei de Lambert-beer
- concentrao do composto na clula de fluxo
absortividade molar (coeficiente de extino molar) mede a intensidade de absoro.
- comprimento da clula de fluxo

Contagem de microrganismos:

O nmero de indivduos tambm pode ser contabilizado atravs de duas tcnicas principais. A
primeira a contagem de indivduos, independentemente de estarem vivos ou mortos. J a
contagem de microrganismos viveis o mtodo mais utilizado, onde geralmente so
realizadas uma srie de diluies da suspenso, semeando-se alquotas na superfcie de meio
slido. Aps um perodo de incubao, a contagem das colnias realizada. Para expressar os
resultados, utilizamos a unidade UFC/mL

Diluio

Utilizado para reduzir o nmero de microrganismos em uma amostra, este mtodo realizado
pipetando-se uma frao da amostra em um tubo contendo outro lquido, geralmente gua
destilada ou soluo salina isotnica (NaCl, 8,5g/L) esterilizadas. O clculo do fator de diluio
feito dividindo o volume inicial da amostra pelo volume total, aps a mistura da mesma com
o diluente. Assim:

7. Mtodo de quantificao do substrato e produto

A cromatografia uma tcnica fsico-qumica de separao de componentes de uma mistura atravs da
distribuio dos componentes entre duas fases que esto em contato entre si. Essa separao chamada
de diferencial, pois h migrao atravs dos poros de partculas esfricas da fase estacionria.

A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) um tipo de lquida que emprega pequenas colunas,
recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sobre altas
presses(COLLINS,1997). chamada de alta eficincia por possuir partculas reduzidas, perfeitamente
esfricas e com poros. Ela tem a capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas de uma grande
quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos,
com alta resoluo, eficincia e sensibilidade.
Neste tipo de cromatografia, utiliza-se uma coluna fechada, reaproveitvel, logo, centenas de separaes
individuais podem ser realizadas em uma mesma coluna. Apesar de serem muito eficazes, estas colunas
apresentam uma grande resistncia vazo da fase mvel, ou seja, sofre uma grande perda de carga. Por
isso, necessrio a aplicao de um sistema de bombas de alta presso, que fazem a fase mvel migrar a
uma velocidade razovel atravs da coluna(COLLINS,1997)

A cromatografia lquida de alta eficincia, bem como qualquer mtodo, apresenta vantagens e limitaes
(COLLINS,1997). A seguir, sero citadas abaixo algumas:

As bomba de alta presso apresenta as seguintes caractersticas:

Alta presso e fluxo constantes;

Vazes de 0,5 a 2mL/min
Eluio isocrtica ou gradiente
Reciprocidade

Referncias
BRUNO, Alessandra Nejar. Biotecnologia I: Princpios e Mtodos. Artmed Editora, 2014.
COLLINS, Carol H.; BRAGA, Gilberto Leite. Introduo a mtodos
PEREIRA JNIOR, N.; BON, EPS; FERRARA, M. A. Tecnologia de bioprocessos (Sries em Biotecnologia). v. 1,
Escola de Qumica/UFRJ. Rio de Janeiro: UFRJ Ed, 2008.
PEREIRA, Aline Ramalho Brando; DE FREITAS, Diego Antnio Frana. Uso de micro-organismos para a
biorremediao de ambientes impactados. Electronic Journal of Management, Education and
Environmental Technology (REGET), v. 6, n. 6, p. 995-1006, 2012.
WENDLING, Luana Katzuke; WESCHENFER, Simone. Probiticos e alimentos lcteos fermentados-uma
reviso. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes, v. 68, n. 395, p. 49-57, 2013.