Sunteți pe pagina 1din 25

Lucrarea de laborator nr.

20

TEMA: MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR CAUZATE DE


BACILI GRAM-NEGATIVI (ENTEROBACTERII I NONENTEROBACTERII)

1. Caracteristica general a becteriilor din familia ENTEROBACTERIACEAE. Clasificarea.


Caracterele morfobiologice.

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Peste 30 genuri cu peste 150 specii
Habitat: intestinul omului, animalelor. Pot fi intalnite pe sol, plante, in apa, etc
Martori de contaminare fecal a mediului
Majoritatea fac parte din microflora normal (comensal) intestinal

CLASIFICAREA
N FUNCIE DE PATOGENITATE:
Enterobacterii patogene: genurile Shigella, Salmonella, Yersinia, unele variante ale speciei Escherichia coli;
Enterobacterii condiionat patogene: genurile Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella,
Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella, etc.

CARACTERE MORFOBIOLOGICE
Caractere morfologice: bastonae G-,
1 - 6 m x 0,3 - 1 m, mobile peritriche (Shigella, Klebsiella, Yersinia pestis imobile), nesporogene,
formeaz microcapsule (Klebsiella capsulat), posed fimbrii.

Caractere de cultur:
Anaerobe facultativ
Temperatura optim 37 grade C (limite 18 45 grade)
Nepretenioase nutritiv
Colonii S, apar dup 18-24 h de incubare, 2 - 3 mm (dup repicri pot apare colonii R), Klebsiella colonii
M (mucoide), Proteus invadeaz suprafaa mediului

MEDII DE CULTUR
De transport: glicerin 30%, soluie salin 3%, soluie tampon-fosfat
De mbogire a bacteriilor patogene: Kauffmann, Muller, bulion selenit, etc
Diferenial-diagnostice:
De izolare a culturii pure
- ENDO, LEVIN, PLOSKIREV
Componena: baz nutritiv, lactoz, indicator
Coloniile L+ : colorate Coloniile L- : incolore (frecvent flora patogen)
- Mediul Wilson-Blair cu sulfit de Bi (Salmonella reduce sulfitul n sulfur de Bi colonii negre pe mediul
verde)

II. De acumulare i identificare preliminar (medii multitest)


Russel, Kligler (glucoz, lactoz, sruri de Fe, indicator)
Olkeniki (glucoz, lactoz, zaharoz, uree, sruri de Fe, indicator)
III. De identificare final (medii cu citrat, malonat, irul Hiss, medii cu aminoacizi, gelatina, etc)
CARACTERE ANTIGENICE
Ag O, de perete, LPZ, termostabil i rezistent la alcool, sensibil la formol, specificitate de gen, specie, grup.
Stimuleaza producerea Ig M.
Ag H, flagelar, proteic, termolabil i inactivat de alcool, rezistent la formol, specificitate de tip (variant).
Stimuleaza producerea Ig G.
Ag K, superficial, capsular, termovariabil, specificitate de specie, tip. Mascheaz Ag O, inaglutinabilitate cu
seruri anti-O. Variante L, A, B la E.coli, Vi la Salmonella i Citrobacter
Ag F, fimbrial, termolabil, nespecific
ECA (Enterobacterial Common Antigen) antigen comun fam. Enterobacteriaceae (interes taxonomic)
Ag Kunin

Genul Escherichia. Diagnosticul de laborator al escherichiozelor


Genul Escherichia
Spp.: E.coli, E.blattae, E.fergusonii, E.vulneris, E.hermanii
Habitat: intestinul omului i animalelor (80% din flora aerob intestinal), 107-109 bacterii/gram fecale.
Contamineaz solul i apele de suprafa. Prezena E.coli - indicator de contaminare fecal

Rolul E.coli n fiziologia uman


1. Manifest activitate antagonist fa de alte bacterii, inclusiv cele patogene
2. Stimuleaz dezvoltarea esutului limfoid prin intermediul Ag sale
3. Particip la procesele de digestie, inclusiv n metabolismul colesterolului i acizilor biliari
4. Asigur organismul cu vitamine, sintetiznd vitamine B, K, acid nicotinic, acid folic, etc.
CARACTERE MORFOBIOLOGICE
E.coli enterobacterie tipic, mobil, lactoza+ (colonii colorate pe medii DD), fermenteaz glucoza cu
formare de AG (teste primare: MR +, mobilitate +, LDC+, celelalte teste sunt negative)
Structura antigenic
Ag O 180 tipuri (O1, O2, O3,......O180)
Ag H 60 tipuri (H1, H2, etc)
Ag K 100 tipuri
Din combinaii rezult serovariante:
ex.: O55:H2:K1

FACTORI DE PATOGENITATE
Capsula (antifagocitar, Ag K1 camuflaj imunologic datorit epitopilor comuni cu polisialozil-glicopeptide
cerebrale la nou-nscui)
Proteine din ME i LPZ (anti-complement, protecie de factorii bactericizi ai sngelui, adeziune, invazie)
Fimbrii: pili manozo-sensibili/rezistenti, pili CFA, pili P (adeziune la mucoasa intestinala si alte substrate)
Toxine (endotoxina, enterotoxine termostabile - ST i termolabile LT (codificate plasmidic), citotoxine
Shiga-like toxine (SLT-1, SLT-2), codificate bacteriofagic
Hemolizina
Siderofori (sisteme de captare a Fe)

GENUL SHIGELLA.
Shigelele strict umane. Cauzeaz infecii intestinale - igeloze, cea mai grav formdizenteria bacterian.
Clasificarea genului Shigella (biochimic i antigenic):
A Shigella dysenteriae (12 s/v, 12 b/v) Manitol -
B Shigella flexneri (6 s/v, 14 ss/v, 23 b/v)
C Shigella boydii (18 s/v)
D Shigella sonnei (7 b/v)
Subgrupele B, C, D manitol +
CARACTERE MORFOBIOLOGICE
Enterobacteriaceea tipice, imobile, lactoza-negative (colonii incolore pe medii DD), scindeaz glucoza pana
la acizi (testul MR+), celelalte teste primare sunt negative.
Factori de patogenitate:
Factori de adeziune la mucoasa colonului (fimbrii, LPZ)
Microcapsula (antifagocitar)
Factori de penetrare i multiplicare intracelular
Toxine:
Toxina Shiga, de origine cromosomial. Inhiba sinteza proteinelor in celula gazda. Manifesta activitate
neurotoxic, enterotoxic, citotoxic elaborat de S.dysenteriae 1. 2.
Citotoxine (Shiga-like toxine (SLT), verotoxine), codificate de bacteriofagi. Efect similar cu cel al toxinei
Shiga.
Endotoxina

Structura antigenic: Ag O i K cu specificitate de gen, specie, subspecie, variant

Rezistena n mediul extern:


S.dysenteriae - foarte sensibil (1-2 ore)
S.flexneri persist 1-3 sptmni n ap, 2 luni n lactate
S.sonnei persist i se multiplic n lactate

CLASIFICARE

Genul: Salmonella (Daniel Elmer Salmon, veterinar american, care a descoperit bacteria n 1885)
Specii: Salmonella enterica, Salmonella bongori (Salmonella subterranea (din 2004))
Subspecii ale speciei S.enterica: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica
Majoritatea tulpinilor izolate din patologii umane (99,5%) aparin ss S.enterica enterica cu peste 2500 de
serovariante: S. London, S. Enteritidis, S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, etc

Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhi


sau
Salmonella Typhi

CLASIFICAREA KAUFFMANN-WHITE (conform structurii antigenice)


Ag O 67 varieti antigenice (O1, O2, O3, ... O65, etc), permite repartizarea salmonelelor n serogrupe (A,
B, C, D, E,...Z, O51,...)
Fracii antigenice majore desemneaz grupa:
O2 grupa A; O4 B, O6 C, O9 D, etc
Fracii antigenice minore O1, O12 - sunt comune
Ag H definete serovariante n cadrul grupei. Structura flagelinei este determinat de 2 gene cromozomiale
diferite, care se exprim simultan sau alternativ (variaie de faz, frecvena 10-4)
Ag H faza 1 (specific) Ha; Hb; Hc; Hd; Hg,m
Ag H faza 2 (nespecific) H1,2; H1,5; H1,7;

Serovar monofazic: O1,2,12:Ha (S.Paratyphi A)


Serovar difazic: O1,4,12:HbH1,2 (S.Paratyphi B)
Ag Vi (K), poliozidic, termolabil, prezent la S.Typhi, S.Paratyphi C, S.Dublin. Este concentrat la polii
bacteriei. Mascheaza Ag O.
S. Typhi O9,12:Hd:Vi+ / O9,12:Hd:Vi-
Conform patogenitii pentru gazd se disting:
Salmonele monopatogene (umane) (S.Typhi, S.Paratyphi A, S.Paratyphi B)
Salmonele bipatogene (patogene pentru om i animale, ubicvitare) - majoritatea

Caractere de cultur
Medii de mbogire : Muller, Kauffmann (medii cu bil, tetrationat), bulion cu selenit de Na
Medii DD de izolare a culturii pure: Endo, Levin , Ploskirev (colonii S, lactozo-); mediul cu sulfit de bismut
Wilson-Blair (colonii negre)
Medii DD de acumulare i difereniere: Olkeniki, Kligler (glucoza AG, lactoza-, H2S+, ureaza-)
Teste primare: utilizeaz citratul de Na, produc H2S, MR+, LDC+, mobilitate+, celelalte teste negative.
Teste secundare: scindeaz glucidele AG, indol-, ornitindecarboxilaza+, etc
EXCEPIE: S.Typhi citrat-, H2S-, scindeaz glucoza pn la acid;
S.Paratyphi A H2S+/-, LDC-

FACTORI DE PATOGENITATE
Fimbrii (adeziune)
Capacitatea de a penetra n celule i de multiplicare intracelular (Macrofage, celule epitel)
Endotoxina
Citotoxine (SLT) inhib sinteza proteic (necroz)
Enterotoxine (LT, ST) activeaz adenilat/guanilatciclazele membranare (diaree)
Siderofori (captarea Fe)
Ag Vi (antifagocitar, inhib activarea C, rezisten la activitatea bactericid a serului)

Majoritatea salmonelelor (98%) sunt sensibile la bacteriofagul O1. Exist bacteriofagi cu specificitate de
specie i variant.
Habitat: intestinul omului, animalelor, psrilor, reptilelor.
Rezistena n mediul extern: salmonelele rezist la 70C 30 min., rezistente la frig i concentraii mari de
sare. Se nmulesc n produse alimentare la temperatura camerei.

2. Testele-cheie ale familiei. Testele primare i secundare de identificare a genurilor si speciilor.

TESTE-CHEIE ALE FAMILIEI


Bacterii (bastonae) gramnegative
Nesporogene
Mobile-peritriche sau imobile
Facultativ-anaerobe
Fermenteaz glucoza pn la acid (A) sau acid i gaz (AG)
Catalaza-pozitive
Oxidaza-negative
Reduc nitraii n nitrii
TESTE PRIMARE (identificarea genurilor)
Utilizarea citratului de Na (mediul Simmons)
Utilizarea malonatului de Na
Hidroliza ureei (testul Preus)
Decarboxilarea lizinei (LDC)
Dezaminarea fenilalaninei (FAD)
Producere de H2S n mediul multitest (ex.: Kligler)
Fermentarea glucozei pn la acizi (testul MR)
Fermentarea glucozei pn la acetoin (testul VP)
Mobilitatea (n geloz semilichid)
TESTE SECUNDARE (identificarea speciilor/variantelor)
Teste biochimice (fermentarea glucidelor, decarboxilarea aminoacizilor (arginin, ornitin), producerea
indolului, etc)
Fagoidentificarea i lizotipia
Colicinogenotipia
Seroidentificarea
Antibiograma
3. Habitatul natural al enterobacteriilor i rolul lor n patologia uman.

ROLUL E. COLI N PATOLOGIA UMAN


FENOTIPURI DIAREIGENE
Tulpini enteropatogene: EPEC (O26, O55, O111, O125, O142, etc). Responsabile de gastro-enterite infantile
(infecii salmoneliforme). Ader la mucoasa intestinului subire printr-o protein din membrana
extern fr a penetra intracelular, distrug microvilozitatile, perturba procesele de secretie si absorbtie
intestinala.
Tulpini enteroinvazive: EIEC (O28, O124, O143, etc). Responsabile de sindrom dizenteric (infectie
dizenteriforma) cu invazia mucoasei colonului, penetrare intracelular, ulceraii. Factori de
patogenitate: adezine, citotoxine (SLT).

Tulpini enterotoxigene: ETEC (O6, O8, O20, O25, O115, etc). Responsabile de diareea cltorului,
sindrom holeriform. Adeziunea la enterocitele intestinului subire este asigurat de pili (CFA
colonization factor antigen sau CSF coli surface factors). Elaboreaz toxine enterotoxine ST
i/sau LT. Activeaz adenilat- respectiv guanilat ciclaza enterocitelor cu acumulare de AMPc
intracelular sau GMPc, provocnd o secreie sporit a ionilor de Cl- i inhibiia absorbiei ionilor de
Na+, antrennd o pierdere hidric important.

Tulpini enterohemoragice: EHEC (O157:H7; O26, O111). Responsabile de colite hemoragice cu sindrom
uremic-hemolitic (anemie hemolitic + trombocitopenie+insuficien renal). Posed factori de
adeziune i produc citotoxine capabile de difuzie n organism (Shiga-like toxine SLT 1 i SLT 2).
Produc frecvent hemolizin.
Tulpini enteroagregative: EAggEC (O111:H12). Posed adezine, hemolizine i SLT. Provoac diaree
persistent (peste 14 zile) la copii si adulti cu imunosupresie (HIV). Ader agregativ la suprafaa
culturilor de celule.
Tulpini enteroadezive: EAEC. Ader difuz la celulele intestinale i culturile de celule. Provoac sindroame
diareice.

FENOTIPURI UROPATOGENE (O1, O2, O4, O6) Posed afinitate pentru mucoasa uro-genital (fimbrii
tipul P sau 1, Ag O i K specifice, hemolizine, etc )

FENOTIPURI BACTERIEMICE

Alte forme clinice provocate de E.coli:


oc endotoxinic
Meningite la nou-nscui (preponderent tulpini cu Ag K1)
Infecii ale plgilor (frecvent de origine nosocomial)
Colecistite, peritonite, salpingite, etc.
Toxiinfecii alimentare

PATOGENEZA DIZENTERIEI BACTERIENE(SIGELLA)


Sursa de infecie: bolnav, reconvalescent, purttor
Transmiterea fecal-oral:
Contact direct (mini murdare)
Alimentar (alimente, ap)
Doza infectant: 10-102 bacterii
Bacteriile patrund n intestin, colonizeaz epiteliul colonului i macrofagele din foliculii limfoizi, penetreaz
intracelular (prin macropinocitoz dirijat). Bacteriile se propag intra- i intercelular graie
polimerizrii actinei la un pol al celulei (caracter determinat plasmidic).
Urmeaz multiplicarea local intracelular cu invazia celulelor vecine provocnd moartea lor. Aceasta duce
la inflamaie fibrinoas intens a colonului, micro-abcese i ulceraii, cu apariia mucusului, puroiului
i sngelui n materiile fecale.
Perioada de incubaie 2 - 4 zile
Semne clinice febr, dureri abdominale, tenesme (spasme rectale), scaune lichide muco-sanguinolente
frecvente.
Vindecarea n 2-5 zile (clinic, apoi microbiologic)
Forme cronice sau portaj sunt posibile

ROLUL SALMONELELOR N PATOLOGIA UMAN


SALMONELOZE:
Febre tifo-paratifoide (S.Typhi, S.Paratyphi A, B, (C)
Salmoneloze digestive (toxi-infecii alimentare, gastro-enterite)
Manifestri extra-digestive:
- bacteriemii nontifoidice
- infecii pleuro-pulmonare
- afeciuni osteo-articulare (osteite, osteomielite, artrite septice, etc)
- infecii nozocomiale
- infecii cardio-vasculare (pericardite, arterite)
- infecii urinare
- infecii abdominale (colecistite, abces al ficatului, splinei)
- infecii ale SNC (meningite, abces al creierului, abces epidural, etc)

FEBRELE TIFO-PARATIFOIDE
Agenii cauzali S.Typhi, S.Paratyphi A, B, (C)
Sursa de infecie omul bolnav, purttorul
Contaminarea fecal-oral (ap, alimente), contact direct
Doza infectant 105 bacterii
PATOGENEZA
Traversarea epiteliului intestinal intact
Invazia i multiplicarea intracelular la nivelul plcilor Peyer i esutului limfoid al tubului digestiv (perioada
de incubaie)
Ptrunderea n ganglionii limfatici mezenterici cu multiplicarea salmonelelor (perioada prodromal)

I sptmn de boal (bacteriemie). Invadarea fluxului sangvin, via sistemul limfatic (diseminarea
germenilor cu eliberarea endotoxinei). Endotoxina pe cale sangvin parvine la centrii neurovegetativi
ai ventriculului 3, determinnd febr, stare de tifos, colaps cardio-vascular, leziuni intestinale
II sptmn de boal (difuzie parenchimatoas)
Bacteriile sunt fixate n organele SRE i se multiplic n ficat, splin, mduv osoas, esut limfoid, etc
Din aceast perioad ncepe eliminarea salmonelelor cu saliva, materiile fecale, urina, bila, etc.
III-IV sptmn de boal (faza alergic). Din ficat salmonelele ptrund n cile biliare, apoi iari n
intestin. La nivelul plcilor Peyer se dezvolt o reacie de hipersensibilitate tip 4 - necroz, ulceraii

Manifestri clinice
Perioada de incubaie - 1-3 sptmni
Perioada prodromal (de invazie) 1-3 zile
Perioada de stare. Debut brutal, cu frison, febr 39-41 grade, cefalee, stupoare, somnolen, delir, com.
Erupii cutanate (rozeole) apar pe abdomen, torace, spate n ziua a 8-9 de boal (embolii
limfatice cu bacterii). Diaree, constipaie, tulburri cardiovasculare. Durata 7-10 zile
Complicaii: hemoragii intestinale, perforarea intestinului, peritonit, miocardit, meningit,
psihoz etc.
Perioada de reconvalescen (1-3-6 luni)

Imunitatea celular, umoral


5-10% convalesceni purttori pn la 3 luni (cu depistarea salmonelelor n bil sau/i urin)
3-5% convalesceni (cu litiaz biliar) purttori cronici (1-10 ani toat viaa)
Recidive sunt posibile (descrcri bacteriemice din focare profunde, forme L), se caracterizeaz prin
simptome atenuate i evoluie de scurt durat
SALMONELOZE DIGESTIVE
(gastro-enterite, toxi-infecii alimentare)
Consecutive consumului de alimente contaminate cu salmonele (ou, maionez, patiserie cu crem, carne,
lactate, etc).
Agenii cauzali: salmonele bipatogene
Gr. B (S. Typhimurium, S. Paratyphi B, S. Heidelberg, S. Derbi)
Gr. C (S. Choleraesuis, S. Newport, S. Paratyphi C)
Gr. D (S. Enteritidis, S. Dublin)
Gr. E (S. Anatum)

PATOGENEZA GASTROENTERITELOR
Sursa de infecie: animalele domestice i psrile (bolnave sau purttori cronici)
Transmiterea pe cale alimentar (alimente contaminate direct de la surs sau pe parcursul procesului
tehnologic), prin ap sau contact direct.
Doza infectant 105-1010 microorganisme (n funcie de receptivitatea gazdei, vrst, utilizarea AB, inocul,
etc)
Salmonelele colonizeaz mucoasa intestinului subire, penetrnd si multiplicandu-se n enterocite, celulele M
i macrofage. Urmeaz o reacie inflamatoare intens (gastroenterit, gastroenterocolit acut).
Enterotoxina provoac diaree (activeaz adenilatciclaza sau guanilatciclaza enterocitelor), endotoxina
absorbit acioneaz asupra SNC semne de intoxicaie.
Gastroenteritele pot fi urmate de bacteriemii.

Manifestri clinice:
Perioada de incubaie 8 - 48 ore
Debut brusc i evoluie acut (1-3 zile) cu diaree, vom, febr, cefalee, stare de ru.
Evoluie sever la sugari, btrni, imunodeprimai (n special bolnavi cu SIDA).

TOXIINFECII ALIMENTARE
Survin ca urmare a ingestiei unui aliment n care s-au acumulat cantiti mari de mi/o (105 107). Nimerind
n intestin, bacteriile se distrug, iar endotoxina eliberat provoac semnele clinice de intoxicare.
Alte forme de salmoneloze (septicemii, meningite, infecii urinare, etc) se dezvolt la persoane cu rezistena
sczut

4. Diagnosticul difereial al infeciilor provocate de m/o din familia Enterobacteriaceae.

DIAGNOSTIC DE LABORATOR AL ECHIRECHIOZELOR


Prelevate n funcie de forma clinic: materii fecale, urin, snge, LCR, puroi, etc
Metode de diagnostic
Examenul microscopic de orientare (frotiu Gram n infecii extra-intestinale, RIF)
Examenul bacteriologic (de baz, cantitativ) detalii in Ghid !!!!!
Examenul serologic (retrospectiv, de confirmare)
- RA cu autotulpini (titru diagnostic 1:200)

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEI (SIGELLA)


Prelevate: probe de scaun (elementele muco-sanguinolente), apa, alimente, lavaje de pe suprafee
Metode de diagnostic
Examenul microscopic RIF
Examenul bacteriologic
I. Izolarea culturii pure pe medii DD (Endo, Levin, Ploskirev) sau mbogirea ighelelor n bulion selenit
II. Coloniile L- sunt repicate pe mediile Olkeniki, Kligler pentru acumularea culturii pure i identificare
preliminar
(lactoza/zaharoza -, glucoza A, ureea -, H2S -)
III. Identificarea definitiv a culturii pure
- Caractere morfotinctoriale
Caractere de cultur
Caractere biochimice (teste primare, secundare)
Caractere antigenice (seroidentificarea prin RA pe lam cu seruri imune anti-Shigella poli- i monovalente)
Fagoidentificarea
Virulena (testul Sereny la cobai)
Antibiograma
IV. Analiza rezultatelor i formularea rspunsului

3. Diagnosticul serologic (din a 5-7 zi de boal)


- RA, RHAI (aduli 1:400 (S.flexneri)
1:200 (S.sonnei)
copii 1:100
coproanticorpi (Ig A 1:80)
ELISA
RIFI

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL FEBRELOR TIFO-PARATIFOIDE


PRELEVATE: snge (perioada febril, n special I sptmn de boal), urin (ncepnd cu a II sptmn),
materii fecale (II-III sptmn de boal), exsudat din rozeole, ser sangvin (din ziua a 7-ea), bil,
mduv osoas

METODE DE DIAGNOSTIC
Examenul microscopic RIF, Gram

Identificarea final - n baza studiului caracterelor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, antigenice (RA
pe lam cu seruri imune polivalente ABCDE, seruri monovalente anti-O de grup (O2, O4, O6, O9, etc)
, seruri monospecifice anti-H (de variant), seruri anti-Vi, sensibilitatea la bacteriofagi).
Rezultatul definitiv negativ n ziua a 11.

Rozeolocultura (exsudatul din rozeole se ntroduce n 3-5 ml bulion biliat)


Mielocultura (0,5 ml mduva osoas din stern n 3-5 ml bulion biliat)
Bilicultura (dup 3-6 luni de la vindecare, 5-10 ml bil se ntroduc n BP)
Se examineaz ca i hemocultura
Coprocultura (din spt. 2) 3-5 g materii fecale se nsmneaz direct pe medii DD i pe medii de
mbogire.
Urocultura (10 ml urin se centrifugheaz, sedimentul se examineaz ulterior ca i coprocultura)

Serodiagnostic (din II sptmn)


1. RA Widal (la diluii ale serului bolnavului se adaug diagnosticuri OH din S.Typhi, Paratyphi A i B).
Titrul diagnostic 1/200 sau creterea n dinamic a titrului
2. RA modificarea Felix (utilizarea separat a diagnosticurilor O i H).
Anticorpii anti-O (Ig M) apar primii (ncepnd cu ziua 7-8) i dispar dup 2-3 luni (maximum spt. II-III).
Anticorpii anti-H (Ig M, apoi Ig G) apar mai trziu (10-12 zi) i persist o durat mai lung. n debut de
reconvalescen (sptmna a IV) titrul Ac anti-O i anti-H se egaleaz.
3. RHAI (cu diagnosticuri eritrocitare O)
INVESTIGAREA PURTTORILOR
Coproculturi repetate
Urocultura
Bilicultura
Serodiagnostic
Reacia de Vi-aglutinare (eritrocite sensibilizate cu Ag Vi). Titrul diagnostic - 1/40
Reacia de latex-aglutinare
Determinarea claselor de imunoglobuline Ig M sau Ig G

Diagnosticul de laborator al salmonelozelor digestive


Prelevate: mase fecale, mase vomitive, snge, splturi gastrice, urin, puroi, resturi de alimente suspecte.
Metode de diagnostic:
Examenul bacteriologic de baz (coprocultur, hemocultur, urocultur...)
RIF pentru diagnostic rapid
Serodiagnostic - RHAI

5. Imunitatea. Profilaxia i tratamentul specific al infeciilor cauzate de m/o din familia


Enterobacteriaceae.

TRATAMENTUL I PROFILAXIA FEBREI TIFOIDE


Tratament:
Fluorochinolone
Cefalosporine de generaia III
Cloramfenicol
Ampicilin
Cotrimoxazol
Profilaxia specific: vaccinarea selectiv (zone endemice, militari, personal medical, etc)
Vaccinul chimic TABTe
Vaccinul atenuat Ty2 (administrare oral, imunitate local sIg A), contraindicat gravidelor, copiilor,
imunodeprimailor
- Vaccinul subunitar din Ag Vi (areactogen, imunitate 3-5 ani)

TRATAMENTUL I PROFILAXIA SALMONELOZELOR DIGESTIVE

Profilaxia salmonelozelor nespecific


Tratamentul simptomatic, antibioterapie la necesitate, n forme grave de infecie

TRATAMENTUL I PROFILAXIA DEZINTERIEI

Imunitate: specific de tip, 1-2 ani, umoral (IgA)


Profilaxie: vaccinuri ribosomale, inactivate, atenuate (imunitate de scurt durat)
Tratament: antibiotice (trimetoprim, sulfamide, tetraciclin, ampicilina, etc), eubiotice, bacteriofagi, vaccin
inactivat (dizenteria cronic)

TRATAMENTUL I PROFILAXIA ECHERICHIOZELOR

Tratamentul escherichiozelor
Antibiotice (conform antibiogramei)
Eubiotice (colibacterin, lactobacterin, bifidumbacterin, bificol, etc)

Profilaxia escherichiozelor - nespecific

6. Familia VIBRIONACEAE. Clasificarea. Habitatul i rolul n patologia uman.


FAMILIA VIBRIONACEAE
Familia: Vibrionaceae
Genuri: Vibrio
Photobacterium
Salinivibrio
Aliivibrio (Allomonas)
Enterovibrio
Grimontia
Caractere generale (cheie) ale familiei: bastonae G-, drepte sau ncurbate, mobile, reduc nitraii n nitrii,
fermenteaz glucoza, oxidaza+, catalaza+

7. Genul Vibrio. Clasificarea. Caracterele morfobiologice ale vibrionilor. Grupele de vibrioni


Heiberg. Biovariantele speciei V.cholerae.

GENUL VIBRIO
Bastonae G-, ncurbate, polimorfe, 2-3 m / 0,5-0,8 m, nesporogene, necapsulate, mobile monotriche
(flagel polar unic)

Clasificarea:
Vibrioni halotolerani - Vibrio cholerae (agenii holerei i diareilor holeriforme)
Vibrioni halofili V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.anguillarum, V.vulnificus, V.metschnikovii
(oportuniti, pot cauza toxiinfecii alimentare, septicemii, meningite, supuraii)
Vibrioni free life (saprofii)

VIBRIO CHOLERAE
Clasificare :
Serogrupuri: Vibrio cholerae O1, O2, ... O155
V.cholerae O1, agent cauzal al holerei
- V.cholerae O139 Bengal (descris in 1992, mutant al Ag O, biovarul El Tor) agent cauzal al holerei
- V.cholerae non O1/non O139 (O2, O3,... etc, vibrioni NAG) responsabili de sindrom holeriform, diaree,
toxiinfecii alimentare, gastro-enterite

Serovariante ale V.cholerae O1 - Ogawa, Inaba, Hikojima


Biovariante ale V.cholerae O1 :
V.cholerae cholerae (clasic) n 1883 izolat n cultur pur de ctre R. Koch, a cauzat 6 pandemii
V.cholerae El Tor izolat n 1905 ntr-o staie de carantin din El Tor (peninsula Sinai), n 1961 determin
pandemia a VII

Caractere morfotinctoriale (vezi caracteristica genului)


Caractere de cultur
Anaerob facultativ, temperatura optim de cultivare -- 37 grade. Crete pe medii simple, dar prefer pH
alcalin (7,6 - 9,6). Halotolerant (0,5 - 7% NaCl, optimal 3%). Sensibil la pH acid
Mediu de mbogire Apa peptonat alcalin 1% (AP)
Medii de izolare a culturii pure:
Geloza alcalin (GA) - mediu electiv-selectiv
- Mediul TCBS (tiosulfat-citrat-bil-zaharoz) DD i selectiv

Manifestarea creterii
AP peste 3-6 ore de incubare vl fin la suprafaa mediului
GA peste 12 ore colonii S (R atipice), plate, transparente, cu nuan albstruie
TCBS peste 12 ore colonii S, opace, galbene (fermentarea zaharozei)
Caractere biochimice: V.cholerae este catalaza+ i oxidaza+, reduce nitraii n nitrii, produce indol, posed
gelatinaz, LCD i ODC, fermenteaz i oxideaz glucoza pn la acid (testul Hugh-Leifson), lactoza -
.

Conform activitii glicolitice V.cholerae aparine grupului I Heiberg (fermenteaz zaharoza i manoza, nu
fermenteaz arabinoza)- testul ZAM
Se disting 2 biotipuri (variante) de V.cholerae: clasic (V.cholerae cholerae) i El Tor (V.cholerae El Tor),
identice morfologic i antigenic.

8. Structura antigenic a vibrionilo, Serogrupurile i serovariantele implicate n patologia umana.

STRUCTURA ANTIGENIC
A VIBRIO CHOLERAE
Antigenul O somatic, LPZ, termostabil (peste 155 serogrupe - O1, O2....O155)
Ag O1 este constituit din 3 fracii - A,B,C
Respectiv se disting 3 serovariante ale V.cholerae O1: Ogawa (A,B), Inaba (A, C) i Hikojima (A; B; C)
Ag H, proteic, termolabil, comun pentru V.cholerae

FACTORI DE PATOGENITATE
Factori de adeziune (pili - Toxin Coregulated Pilus (TCP), LPZ, glicocalixul)
Enzime de patogenitate (mucinaza, neuraminidaza, LDC, lecitinaza)
Enterotoxina (toxina holeric, holeragen), constituit dintr-o subunitate A (A1, A2) i 5 subuniti B. Codat
de genele ctxAB ale unui bacteriofag filamentos.
Endotoxina

9. Holera. Sursa de infectie, caile de transmitere i patogeneza.

PATOGENEZA HOLEREI I MANIFESTRILE CLINICE


HOLERA gastroenterit acut, strict uman.
Agentul cauzal V.cholerae O1/O139
Sursa de infecie bolnav, convalescent, purttor sntos
Mecanismul de transmitere fecal-oral
Alimentar (ap, alimente, fructe de mare)
Contact direct (manual)
Doza infectant 109 - 1011 UFC (104 pentru persoane cu hipoaciditate gastric)

Vibrionii care au supravieuit ajung n intestinul subire. Local mucinaza descompune mucusul, asigurnd
adeziunea vibrionilor la enterocite, colonizarea i producerea toxinei. Neuraminidaza transform di i
trisialogangliozidele membranare n GM1, ce permite fixarea toxinei i penetrarea ei.

Evoluia clinic a holerei:


I - Perioada de incubaie (2-5 zile)
II Enterita holeric (scaune frecvente, afecale, apoase, constituite din lichid clar cu flocoane albe - aspect
zeam de orez)
III Gastro-enterita (scaune frecvente 10 - 50 ori pe zi i vome abundente). Consecine deshidratare (3-
20 litri eliminai n 24 ore), carene de sruri, acidoz, hipoxie tisular, hipotensiune, contracii
(crampe) musculare.

IV - Algida holeric (stare extrem de grav, hipotermie, asfixie, anurie, colaps, com, deces)

Imunitatea umoral (sIgA, IgG), antibacterian i antitoxic, de scurt durat (2 ani), reinfecii sunt
posibile

10. Diagnosticul de laborator al holerei:a) prelevatele, regulile de recoltare i transportare n


laborator. b) metodele de diagnostic: microscopic - determinarea speciei, a serovarului i a
biovarului; Serologic: RA, RHAI, determinarea anticorpilor vibriocizi; metodele rapide: RIF,
reactia de imobilizare a vibrionilor cu bacteriofagi, reactia de imobilizare i microaglutinare cu
serul O1.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HOLEREI


Prelevate: mase vomitive, materii fecale, bil (purttori), de la cadavru 3 fragmente din intestinul subire i
vezica biliar, prelevate din mediul extern (apa, alimente)
Metode de diagnostic
1. Diagnosticul rapid
Frotiu Gram (bacterii G-, ncurbate)
Studierea mobilitii (preparate native bacterii mobile, grupate n bancuri de peti
Imobilizarea i aglutinarea vibrionilor cu serul anti-O1
Imobilizarea vibrionilor cu bacteriofagi C i ET
RIF

2. Examenul bacteriologic (de baz)


Prelevatele se nsmneaz n AP I (mbogire) i GA I / TCBS (izolarea culturii pure) termostat, 37
grade C
Peste 6 ore se examineaz cultura din AP (vl la suprafa?), utilizat pentru diagnosticul rapid, apoi se
rensmneaz pe AP II i GA II.

Peste 12 ore se examineaz coloniile de pe GA I sau TCBS. Coloniile suspecte (plate i transparente cu
nuan albstruie pe GA, galbene pe TCBS) sunt expuse diagnosticului rapid (5 teste), apoi repicate pe
mediul cu lactoz i zaharoz pentru acumularea culturii pure i difereniere primar. AP II poate fi
utilizat pentru efectuarea testelor rapide i nsmnare pe GA III
Culturile lactoza-/zaharoza+ sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, serologic (cu ser O1 sau RO
(colonii atipice), apoi cu seruri monospecifice Ogawa i Inaba). Se efectueaz fagoidentificarea i
diferenierea biovariantelor

3. Depistarea toxinei
In vivo (ansa ligaturat la iepure, culturi de celule)
In vitro (ELISA, cu utilizarea gangliozidului GM1; latexaglutinarea)
Tehnici de biologie moleculara (PCR, etc)
4. Serodiagnostic (retrospectiv)
Anticorpii (aglutinine, vibriocine, antitoxine) apar dup 10-15 zile de boal
RA (serul bolnavului + diagnostic din V.cholerae O1 (titrul diagnostic 1/80)
RHAI (serul bolnavului + diagnostic eritrocitar)
Reacia de vibrioliz (serul bolnavului + cultur de vibrioni + complement). Titrul diagnostic 10-4
Dozarea antitoxinelor (ELISA, RHAI)
11. Imunitatea. Profilaxia specific i tratamentul holerei.

TRATAMENTUL I PROFILAXIA HOLEREI


Tratament
Rehidratare
Antibiotice (tetraciclin, sulfanilamide, doxiciclin)
Tratament simptomatic
Profilaxie
Igiena individual i colectiv
Vaccinarea (vaccin inactivat, vaccin subunitar, holeragen-anatoxin)
Imunitatea pn la 6 luni
Vaccinul viu este n proces de studiu

SENSIBILITATE LA AB
Eritromicina este antibioticul de elecie n tratamentul campilobacteriozelor digestive.
Alte antibiotice: tetraciclina, aminoside, cloramfenicol, ampicilina

TEMA 22: MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL E LABORATOR AL INFECIILOR PROVOCATE


DE MICROORGANISME CU PARAZITARE INTRACELULAR

1. RICKETTSIILE. HABITATUL NATURAL. CLASIFICAREA RICKETTSIILOR. ROLUL LOR


N PATOLOGIA UMAN.

- m/o polimorfe (betisoare, ovale, haltere, bacili cu capete retezate, etc), se multiplic exclusiv n celule
(citoplasm i nucleu)
- foarte mici
- la animale, om, vectori
- asporogene, acapsulate, imobile
- se coloreaz prin metoda Romanovski-giemsa, Ziehl-neelsen
- GRAM -
- Rickettsii patogene: Richettsia, Rochalimaea, Coxiella

Rickettsiaceae:
-Rickettsieae
-Rickettsia
-Grupul tifosului: R.prowazekii (provacica), R.typhi (mooseri) - febra, eruptii pe piele, iar la r.typhi
eruptii pe palme i tlpi (rozeole, apoi papule)
-Grupul febrelor ptate: R.rickettsii, R.conorii, R. Australis, R. sibirica, R. akari
-Grupul tifosului de lstri: R.tsutsugamushi
-Rochalimaea
-Coxiella
-Ehrlichieae

Habitatul natural
-la ectoparaziti hematofagi (pduchi) pduchile de corp
-r.typhi - purice de la obolani
-care cu febra patat - cpue
-trece la om
2. CARACTERELE MORFOBIOLOGICE. METODELE DE CULTIVARE. STRUCTURA
ANTIGENIC

Agentul patogen al tifosului exantimatic

R. prowazeka
-form de halter
-au o capsula foarte subire vzuta doar la microscopia electronica
- se inmulesc la temp 25 grade n embrionul oului de gain
- este posibil de folosit i culturi de celule pe care se cultiv virui
- au exotoxin
- 2 antigene:
1) termolabil specific pentu r.prowazeka
2) termostabil comun pentru r.prowazeka i r.typhi
3) asemntor cu al lui Proteus OX19 (se aglutineaza in prezenta serului bolnavului cu tifos exantimatic)
- sensibili oarecii albi i cobaii

Agentul patogen al tifosului exantimatic murin (oareci)

R.typhi (moosi)
-mai putin polimorfe
-se cultiva pe ou de gaina embrionat
-la masculi cobai - fenomen scrotal

Agentul patogen al Febrei Q

R.burnetti
-forma lancelata (dar poate fi cocoid, bacilar, filamentar)
-imobile
-Gram -
colorare R-G
-cultivare in sacul vitelin la oul de gaina embrionat la 35 grade
-rezistent in mediul extern (la temp joase, radiatie UV, la temp de 90 grade 1 ora, la suc gastric, la formalina
0.5% 4 zile)
-antigen corpuscular cu specificacitate de specie
-nu aglutineaza proteos ox19

3. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL RICKETTSIOZELOR.

Diagnosticul de laborator al tifosului exantimatic

- la baz st metoda serologic:


RA (reactia Weil - Felix) n eprubete (ntrun interval de timp, titrul creste cel putin de 4 ori aglutininelor) -
tot cu proteus ox19
microaglutinare pe sticl (cu proteus ox19) - pentru orientare mai mult folosit
RFC - cautam anticorpi - cu antigen rickettsian total, anticorpii dupa 6-7zile, C% max la saptama 3-4,
importanta diagnostica este ca creste de 4 ori titrul
RIF - cutam antigen - rar utilizat

Diagnosticul de laborator al tifosului exantimatic murin (endemic)

proba biologica
-inoculare la cobai masculi, se urmareste fenomenul scrotal
metoda serologica
-RA, RFC cu Ag respectiv
cresterea titrului de 4 ori de anticorpi

Diagnosticul de laborator al Febrei Q

1) RA cu AG specific si serul bolnavului, titrul maximal de anticorpi in saptaman a 3-a numa mai jos 1:8,
1:16 deja pozitiv
2) RFC cu Ag specific de R.burnetti
3) proba alergic cutanat

4. IMUNITATEA, PROFILAXIA SPECIFIC I TRATAMENTUL RICKETTSIOZELOR.

Tifos exantimatic

-imunitate celular, umoral


-repetarea bolii - recidiv din prima imbolnvire - Boala Brill (anume se formeaza IgG - spre deosebire de
IgM din boala primar)
-tratamentul - tetracicline, levomicetin - CONTRAINDICAT SULFAMIDELE
-profilaxia:
1) diagnosticul timpuriu, izolarea, spitalizarea
2) tratamentul sanitar n focar
3) evidenta, promovarea luptei cu pediculoza
4) vaccinarea cu vaccin chimic contra tifocului exantimatic (ag de la prowazekii purificat, concentrat)

Tifosul murin

-imunitate celular, umoral


-tratamentul: levomicitin
-profilaxia: vaccin specific

FEBRA Q

imunitate durabila i tenace


profilaxie: fierberea se ferbe, spitalizarea bolnavilor, imunizarea cu vaccin din R.burnetti
tratamentul: tetraciclina, levomicitina. remedii patogenetice (glicozide cardiace, transfuzii de singe)

5. CHLAMIDIILE. REPERE TAXONOMICE. HABITAT. CARACTERE MORFOBIOLOGICE.


INFECII DETERMINATE DE CHLAMIDII.
Genul Chlamydia
Familia Chlamydiaceae
speciile patogene: C. Trachomatis, C. Psittaci, C. Pneumonie

Habitat
-om (trachomatis, pneumonie), mamimere i psri (Psittaci)

-cocoide
-nu cultiv pe medii artificiale
-crete inoculat n ou de gain embrionat
-coloratie R-G in albastru/violet
C. Trachomatis

-paraziteaza in citoplasma cel epiteliale ale conjunctivei (la maimu) - TRAHOM


-unele tulpini se cultiv pe oareci i cobai

C. Psittaci

-boala la pasari (papagali, porumbei, puide gaina) - ORNITOZA apoi se transmite la om


-coloratie R-G
-se dezolva in sacul vitelin embrionului de gaina sau in organismul soarecilor albi i n culturil de esuturi
- 2 antigene - termo la bil si stabil
- rezistent la mediul exterior
- la om:
bronhomneumonie (fara tusa i durere i dispnee)

6. MICOPLASMELE. REPERE TOXONOMICE. HABITAT. CARACTERE


MORFOBIOLOGICE. INFECII DETERMINATE DE MICOPLASME.
-bacterii
-lipsite de perete celular
-foarte mici si polimorfe
-pe medii acelulare, cultura este inhibata de anticorpii specifici
-rezistente la penicilina (nu au perete celular)

Familia Micoplasmataceae
Genul Micoplasma
Ureaplasma (utilizeazaz ureea ca sursa de energie)
Habitat
-la om (gura, faringe, tractul urogenital, caile respiratorii)
-colonii in forma ochi de ou
-anaerobe
-fermenteaza glucoa - pneumonie, ginitalis
-scindeaza uree - urealiticum

7. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC AL CHLAMIDIOZELOR I MICOPLASMOZELOR.

Trahomatis
prelevat - epiteliul conjunctivei
-bacterioscopia cu coloratia R-G
RIF
RFC (titrul 4 ori)
RMicroIF

Psittaci
prelevate: sputa, singe
bacterioscopia
RFC
proba biologica

m. pneumonie
Diagnosticul bacteriologic este rareori practicat datorit necesitilor deosebite de cretere ale
acestor microorganisme (mediile de cultur selective, cretere lent, condiii de anaerobioz,
identificare laborioas).
Diagnosticul serologic este cel mai des folosit. Depistarea anticorpilor circulani (IgM i IgG) se face prin
metodele:
RFC
ELISA
hemaglutinare indirect
imunofluorescen direct
O nou perspectiv n diagnosticul direct o reprezint PCR-ul (metod foarte specific, dar inaccesibil
nc majoritii laboratoarelor).

8. IMUNITATEA, PROFILAXIA SPECIFICP I TRATAMENTUL CHLAMIDIOZELOR I


MICOPLASMOZELOR.

Trahomatis
tramament - ab (tertraciclina, eritromicina, sulfanilamidele)
profilaxia

Psittaci
tratament - tetracicline
profilaxia - dezinfeectia in focar, pasarile se oamoara
nu-i vaccina
imunitate - efemera

m. pneumonie
Tratament
Toate tulpinile sunt sensibile la tetraciclina, fluorochinolone i macrolide. Rezistena la eritromicin
este exceptional. Datorit efectelor sale adverse, tetraciclina este utilizat doar la aduli.
Nu au fost nc introduse n practic metode standard de testare a sensibilitii la chimioterapice, n
prezent fiind folosit metoda diluiilor.
Profilaxie
Profilaxia este nespecific, vaccinurile inactivate sau vii atenuate nu i-au dovedit eficiena pn n
prezent.

micoplasme genitale
Tratament
Antibioticele de elecie sunt ciclinele i macrolidele. S-au depistat 5% tulpini rezistente la
tetraciclin. Rezistena la eritromicin este excepional.
n cazul tulpinilor rezistente, o alternativ terapeutic ar putea fi reprezentat de fluoroquinolone.

TEMA 23: PRINCIPIILE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR AL INFECIILOR DE ETIOLOGIE


VIRAL

1. Virusurile. Natura. Particularitile biologice. Taxonomia i clasificarea.

Reprezint structuri acelulare cu potenial infecios


Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)
Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN)
Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari
Nu cresc i nu se divid, se reproduc n celule vii
Nu cultiv pe medii artificiale, numai pe celule vii
Rezisten natural la antibiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILOR
Dup tipul AN (cu genom ARN/ADN)
Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm)
Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt)
Dup compozitia chimic (simple, complexe)
Dup gazd (om, animal, insect, bacterie)
Dup sensibilitatea n mediul extern, substane chimice, etc

Order (-virales)
Family (-viridae)
Subfamily (-virinae)
Genus (-virus)
Species (-virus)

Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae


Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae
Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae,
Filoviridae
Virusuri ARNd.c. : Reoviridae
Virion unitate structural infecioas a virusului
Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante
Prion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul
Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

2. Forma, compoziia chimic i structura virionului. Noiuni generale de viroizi i prioni.

COMPOZIIA CHIMIC I
STRUCTURA VIRIONULUI
Virusurile simple acid nucleic (AN) i nveli proteic capsida (ansamblu numit nucleocapsid)
Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos)
Acidul Nucleic ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, liniar, circular sau fragmentat.
ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, funcie de ARNm) sau ARN- (caten fr sens, este necesar
prezena enzimei polimeraza)
Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteinelor virale

I: Double-stranded DNA (e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses)


II: Single-stranded (+) sense DNA (e.g. Parvoviruses)
III: Double-stranded RNA (e.g. Reoviruses)
IV: Single-stranded (+) sense RNA (e.g. Picornaviruses, Togaviruses)
V: Single-stranded (-) sense RNA (e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses)
VI: Single-stranded (+) sense RNA with DNA intermediate in life-cycle (e.g. Retroviruses)
VII: Double-stranded DNA with RNA intermediate (e.g. Hepadnaviruses)

Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric.


Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastona
Simetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un icosaedru (poliedru regulat
cu 20 fee triunghiulare i 12 vrfuri), eikos=20
Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile)
Funcia capsidei protecia AN, rol antigenic, adeziune

Supercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd. Lipidele provin din
membrana celular, iar glicoproteinele sunt de origine viral (ex.: hemaglutinina, neuraminidaza)
Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziune
Unele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc.

Aciunea factorilor fizici, chimici


Virusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, raze UV. Detergenii i solvenii inactiveaz virusurile cu
supercapsid.
Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80C

3. Multiplicarea (replicarea virusurilor). Fazele i etapele ciclului replicativ viral.

REPRODUCEREA VIRUSURILOR
I ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism)
II PENETRAREA virusului n celul
Pinocitoz (viropexis)
Fuziunea membranelor
Translocare
Injectarea AN n citoplasm (bacteriofagii)
III DECAPSIDAREA ( cu enzime celulare). Din acest moment urmeaz faza de eclips.
IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN)
Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau n nucleul celulei (virusuri cu ADN)
Biosinteza virusurilor ADN
ADNdc -> transcrierea ARNm -> replicarea, translaia (precoce, tardiv) -> sinteza proteic
Biosinteza virusurilor ARN
ARN+ -> replicare, translaie -> sinteza proteic
ARN- -> transcriere ARNm -> replicare, translaie -> sinteza proteic
Retrovirusuri (ARN+) -> transcriere -> ADN- -> ADNdc -> transcriere -> ARNm ->
replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom)

V. MORFOGENEZA (asamblarea) i maturizarea virionilor


Proteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (n nucleu sau citoplasm) iar glicoproteinele sunt
inserate n MCP, substituind proteinele celulare. n aceast faz apar incluziunile virale sau corpusculii
elementari.
VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz). Nr lor poate atinge 100.000 per/celul
Ciclul reproductiv viral are durata variabil de la cteva ore pn la cteva zile (ex.: 8h poliovirus, 72h
citomegalovirus).
Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este
inhibat (virus interferat / virus interferent)

RELAII VIRUS-CELULA GAZD


Infecie viral productiv, citocid
Virusul este infecios iar celula permisiv (receptiv). La nivelul ma/o corespunde infeciilor acute, aparente
sau inaparente (grip, rujeol ...)
Infecii virale persistente
Celulele infectate supravieuiesc, cu producerea permanent sau intermitent a virusului.
1. Infecii abortive (cu virioni defectivi) infecia nu se exprim, are loc transformarea celulelor prin
proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, T-limfocite) n cursul unor infecii
cronice (PESS post-rujeolic)

2. Infecii integrate (virusuri ADN sau copii de ADN ale Retrovirusurilor). Consecine:
Transformarea malign a celulei gazd
Infecii lente - manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia integral a
genomului viral (ex.: HIV-SIDA)
Infecii latente - reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a informaiei genetice
virale (ex.: infecia herpetic)
Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n absena
simptomelor (ex.: hepatita viral B)

4. Metodele de cultivare a virusurilor: pe animale de laborator. Selectarea animalelor, cile de


infectare. Avantajele i dezavantajele metodei; n ou embrionate de gin. Structura oului
embrionat de gain. Metodele de inoculare (nchis i deschis). Avantajele i dezavantajele
metodei; n culturi celulare. Tipurile de culturi de celule. Infectarea culturilor de celule.

CULTIVAREA VIRUSURILOR
Virusurile sunt cultivate pentru:
Stabilirea diagnosticului etiologic
Testarea infeciozitii virusurilor
Testarea preparatelor antivirale
Producerea vaccinurilor
SISTEME DE CULTIVARE
Culturi de celule
Ou embrionat de gin
Animale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor, cost avansat). Se
recurge numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare
sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai
obolani, cobai, maimue, etc.
Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din
infeciile bacteriene.

Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril
i lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.:
gripal)
- Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur.
Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana
chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis).
Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37C timp de 48-72 ore

Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins).


Celule provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale. Plasate ntr-un mediu adecvat
(nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n
monostrat celular.
Tipurile de culturi de celule (CC):
Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau
uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri)
Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii
Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.
HeLa carcinom de col uterin
KB tumoare a rinofaringelui
Hep-2 tumoare canceroas a laringelui

Obinera culturilor de celule primar tripsinizate:


Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu)
Fragmentarea i splarea cu sol. fiziologic
Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice (tripsina)
Separarea celulelor prin centrifugare
Dozarea suspensiei - 105 106 celule/ml
ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterile
Incubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact)
Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou cultivare (pasaj)
Mediile de cultur pentru culturi de celule (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumin, etc), conin AA,
Vit, factori de cretere, sruri minerale, rou fenol pentru monitorizarea pH (vireaz n galben n
mediu acid)
Mediile de cretere (pentru cultivarea CC) sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal)
Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul reproducerii virale. Nu
conin ser.
CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare.

Inocularea CC
Se aleg tuburi cu monostrat bine format
Se nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks
Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat
Peste 30-60 min n tuburi se toarn cte
1 ml mediu de ntreinere
Se ntroduc n termostat la temperatura adecvat 3 - 4 zile
5. Metodele de diagnostic ale infeciilor cauzate de virusuri (viroze)

METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR


METODE DIRECTE
Examenul virusoscopic (evidenierea direct a virionului sau a componentelor lui n prelevate)
Examenul virusologic (izolarea i identificarea virusului)
Detectarea Ag virale n prelevat
Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic PCR)
METODE INDIRECTE
- Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori a titrului Ac n dinamic)
EXAMENUL VIRUSOSCOPIC
Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol,
Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-
amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom
Microscopia electronic
Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus Ac
Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

6. Materialele de examinare (prelevate) de la pacieni. Regulile de recoltare i ambalare, condiiile de


transportare n laborator.

7. Metoda virusoscopic de examinare a prelevatelor n viroze.

EXAMENUL VIRUSOSCOPIC
Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol,
Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-
amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom
Microscopia electronic
Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus Ac
Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

8. Metoda virusologic n diagnosticul virozelor. Pregtirea probelor pentru examinarea n metoda


virusologic.

EXAMENUL VIRUSOLOGIC
Prelucrarea prealabil a prelevatelor:
Omogenizarea (dup necesitate)
nlturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)
Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creterii bacteriilor i fungilor contaminani (penicilin - 500
UA/ml, streptomicin
500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml)

9. Izolarea virusului de culturi de celule, ou embrionate de gin, animale de laborator; indicarea


virusului de culturi de celule (incluzii, ECP, proba de culoare, RHA, RHAds, proba plajelor), n
oul embrionat (RHA, decesul embrionului, modificri pe MCA), pe animalele de laborator
(simptome clinice, deces, RHA, modificri histopatologice); identificarea virusului (definirea
genului, speciei).

ETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC


Izolarea virusului
Evidenierea (indicarea) reproducerii virale
Identificarea virusului
Izolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator,
embrionilor de gin sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaz n
funcie de particularitile biologice ale agentului etiologic probabil i posibilitile laboratorului.
Indicarea virusului
n culturi de celule
ECP modificri degenerative i distrugere celular, rezultat al multiplicrii virale (rotunjire sau retracie
celular, citoliz, apariia vacuolelor sau granulelor n citoplasm, picnoza nucleului, fuziunea
membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu
hematoxilin-eozin, Giemsa, fluorocrom.

3. Incluziuni virale
Reprezint acumulri paracristaline de virioni sau de componente virale n aria de replicare i asamblare a
virusurilor (citoplasm, nucleu). Coloraia Giemsa, hem-eozin, fluorocrom. Localizarea, forma i
afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt particulariti diagnostice pentru unele viroze.

4. Hemaglutinarea (Reacia de HA)


Unele virusuri posed n componena capsidei, n special a supercapsidei, glicoproteine care pot adera la
suprafaa hematiilor hemaglutinine (HA).
RHA este caracteristic pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de ntreinere. n acest caz mediul de
ntreinere aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau psri.
5. Hemadsorbia (Reacia de HAd) RHAd este caracteristic virusurilor cu HA n poziie intracelular. n
procesul asamblrii acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate n MCP la nivelul viitorului mugure.
Dac la aceast etap n recipientul cu monostrat celular se adaug suspensie de hematii i se menine 15-
20 min la t caracteristic fiecrui virus, la microscop pot fi urmrite hematiile fixate la suprafaa celulelor
infectate (RHAd).
6. Proba culorii
- Metabolismul celular neafectat virajul culorii mediului din rou n galben (pH acid)
Metabolismul celular inhibat culoarea mediului nu se modific
7. Interferena
Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen. Pentru detectarea V.rubeolei se
infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui virus confirm prezena V.rubeolic

Indicarea virusului n oul embrionat de gin


Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se taie coaja, se
recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se ntroduc n cutii Petri sterile.
Se observ:
Moartea embrionului
Apariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCA
Acumularea de HA n lichide

Indicarea virusului pe animale de laborator


Boala manifest a animalului, deces
Urmrirea virusului n organele-int:
Hemaglutinare
Infeciozitatea omogenatelor
Examene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babe-Negri n
neuronii infectai cu V.rabic, etc)
Identificarea virusurilor
Determinarea genului, speciei i serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice.
Se efectueaz cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale n diferite reacii serologice:
RN
RIHA/RIHAd
RFC
RIF
RIE (ELISA)
ARI, etc

10. Metoda serologic - recoltarea, pstrarea, examinarea serurilor perechi n RIHA, RIHAds, RPG,
RIF, RFC, RN, AIE. Citirea i interpretarea rezultatelor.

DETECTAREA AG VIRALE N PRELEVATE


Avantaje: simplitatea i rapiditatea examenului, nu necesit meninerea infeciozitii virusului
Dezavantaje: sensibilitate direct proporional cu cantitatea virusului din prelevat
Se utilizeaz Ac policlonali de origine uman (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murin)
Reacii: RHAI, RLA, RIF, RIE (ELISA), Western-blot, ARI, etc.

11. Identificarea genomului viral prin tehnici de biologie molecular.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL


(punerea n eviden a AN virali din prelevate n cursul infeciilor virale acute sau cronice i monitorizarea
tratamentului).
Pot fi examinate toate esuturile i lichidele biologice.
Hibridizarea acizilor nucleici fr amplificare
Hibridizarea dup amplificare (PCR i variantele ei)
DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Esena: depistarea Ac sintetizai de gazd n rspuns la o infecie viral.
Dup o primo-infecie are loc inducerea formrii Ac, iar dup o reinfecie sau reactivare titrul Ac crete n
dinamic.
n serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav (seruri-perechi): prima
prelevat la debutul bolii, a doua prelevat peste 15 zile.

Ac sunt depistai n ser, uneori n LCR, exsudate, lichid articular, etc.


Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de referin (suspensie viral inactivat, proteine virale native
sau recombinante, oligopeptide sintetice).
Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc.
Semnificaie diagnostic prezint trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecie) sau
creterea titrului Ac de cel puin 4 ori n cursul infeciei. Ambele seruri vor fi testate n aceeai zi, prin
tehnici identice i n acelai laborator.

TERAPIA ANTIVIRAL
Dificulti:
Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr afectarea celulei!)
Apariia mutantelor rezistente
Activitate asupra virusului n faz de multiplicare
Costul avansat al tratamentului
Primele preparate antivirale anticanceroase.
Preparatele antivirale contemporane:
- Nu manifest activitate virucid, doar inhib reproducerea viral
Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

Adeziunea virusului la celul


Mecanismul blocarea receptorilor celulari (HIV-oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4 solubili)
Dificulti: afinitate redus, degradare rapid
Fuziunea, penetrarea
Reprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu membrana
celular (dificultate injecii s/c zilnice)
Decapsidarea
Amantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal A
Utilizare limitat dezvoltarea rezistenei

Replicarea
Mecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze)
Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazd
Analogi nucleozidici
Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei purinice sau
pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN n curs de formare.
Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin)
Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc)
Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare)

2. Analogi nucleotidici
Cidofovir - CMV, HSV
Adefovir - HIV, HBV, HSV, CMV
Tenofovir HIV, HBV
3. Analog al pirofosfatului
Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?)
4. Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz)

Blocarea activitii polimerazelor virale se realizeaz prin:


Competiie cu substratul natural al enzimei
ngrmdirea steric a centrului activ al enzimei
Incorporarea n catena de ADN n curs de sintez
Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul
su artificial

Asamblarea, eliberarea
Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc)
toxicitate, rezisten
Inhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei A i B (efect
preventiv, curativ, rezisten rar)

INTERFERONII (IFN)
IFN ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infecie viral.
IFN tip 1 (clasic, antiviral):
IFN-alfa (leucocitar)
IFN-beta (fibroblastic)
Inductori ai IFN 1: virusuri, LPS, ARN bicatenar
IFN-gamma, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoare

IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interaciunea IFN-alfa cu
receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultnd o activitate antiviral
(blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibil i blocarea asamblrii i
nmuguririi virusului (HIV)
IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gamma i a celor de clasa II
IFN mresc activitatea macrofagelor i manifest activitate antiproliferativ
IFN-gamma activeaz celulele NK

Utilizarea terapeutic a IFN hepatite B i C cronice, infecii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemii
Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.

TERAPIA CELULAR (CMV, EBV)


Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe.
Prelevarea sngelui de la bolnav
Izolarea CTL specifice
Clonarea i proliferarea CTL in vitro
Reinjectarea la pacient
VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un anticorp antiviral)