MTODOS

UTILIZADOS EN
VIROLOGA
Capitulo 2, Virology Principles and Applications
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
Resaltar los mtodos utilizados para:
Cultivo de virus
Purificacin de virus
Deteccin de virus y sus componentes
Ensayos de infectividad
Investigacin de la funcin de los genes virales
Evaluar el valor del secuenciamiento de genomas virales
INTRODUCCIN
Se utilizan una gran variedad de mtodos en virologa.
Incluyen mtodos de biologa molecular y biologa
celular.
Diagnostico de virus en:
humanos,
animales y
plantas.
CULTIVO DE VIRUS
INTRODUCCIN
El cultivo de virus tambin puede llamarse propagacin y
crecimiento.
En la mayora de casos se necesita dar al virus clulas en las
cuales replicarse.
Los fagos crecern en cultivos bacterianos.
Virus de plantas en plantas cultivadas o en protoplastos.
Virus animales, en cultivos celulares y tambin en organismos
completos como ratones, embriones de pollo o larvas de
insectos.
CULTIVO DE CELULAS ANIMALES
Estn bien desarrolladas.
Lneas celulares continuas derivadas de humanos o de otras
especies animales.
HeLa: lnea celular derivada de carcinoma cervical a mediados
del siglo XX.
Se necesita buscar lneas celulares adecuadas para cada virus.
Virus de la hepatitis C: cultivada en lneas celulares de
hepatoma.
 CULTIVO DE CELULAS ANIMALES
Medios de cultivo con nutrientes:
suero animal promueve el
crecimiento celular.
Mantenimiento de presin osmtica
y pH de las clulas.
Cultivo de virus en clulas de viales
plsticos y medio apropiado.
Cultivo en monolayer.
Cultivo en medio liquido que debe
ser homogenizado.
CULTIVO DE CELULAS ANIMALES
Contaminacin con bacterias y hongos causan problemas.
Trabajar en un gabinete estril.
La mayora de medios contienen antibiticos.
Muchos tipos celulares requieren una concentracin elevada de
CO2, incubadora especial.
AISLAMIENTO DE
VIRUS
 Algunos virus se pueden aislar por formar placas visibles sobre las
clulas hospederas.
Inoculacin de capas confluentes de clulas con pequeas
concentraciones de virus.
Placas en cultivos de clulas animales con agarosa superpuesta.
Placas por fagos en cultivos bacterianos.
 Se asume que la placa es el resultado de la infeccin por un
virin simple.
Se puede referir como un clon aislado, si es distinto de otros,
entonces como una cepa.
Procesos de purificacin para asegurar que un virus se deriva de
una sola placa.
Al inicio la replicacin del virus es lenta, a medida que pasa el
tiempo se replica mas eficientemente.
Al ser pasado varias veces, puede ser diferente genticamente
al virus inicial, se transforma en una cepa de laboratorio.
 CENTRIFUGACION

Luego de la
propagacin de un virus
se necesitan remover los
restos celulares y otros
contaminantes.
Centrifugacin en tasa
diferencial.
Centrifugacin en
gradiente de densidad.
CENTRIFUGACION DIFERENCIAL
Involucra la alternancia de ciclos de baja velocidad (virus en el
sobrenadante) y alta velocidad (virus en el pellet).
 CENTRIFUGACION EN GRADIENTE
Involucra centrifugar partculas como
viriones o molculas como cidos
nucleicos en una solucin de
concentracin creciente, y por lo tanto
densidad creciente.
Los solutos deben ser altamente solubles
como la sucrosa.
Existen dos categoras mayores: tasa
zonal y de equilibrio o isopicnica.
 CENTRIFUGACION EN TASA ZONAL
La partcula se mueve a travs
del gradiente a una velocidad
determinada por su coeficiente
de sedimentacin, valor que
depende de su tamao.
Partculas homogneas como
viriones idnticos, se movern en
una sola banda que puede ser
colectada.
CENTRIFUGACION EN EQUILIBRIO
La concentracin del soluto se selecciona para asegurar que la
densidad al fondo de la gradiente es mayor que las partculas o
molculas purificadas.
La partcula o molcula se mueve a un punto donde el
gradiente de densidad es igual a su densidad.
Densidades en gradientes de cloruro de cesio se consideran
para caracterizar virus.
 INVESTIGACIN
ESTRUCTURAL DE
CLULAS Y VIRIONES
MICROSCOPIA DE LUZ

El tamao de los virus esta por debajo de

los limites de resolucin de los
microscopios de luz (1000X).
Se pueden detectar clulas infectadas por
virus.
Efectos citopaticos, fluorescencia unida a
anticuerpos.
La microscopia confocal es muy til.
MICROSCOPIA ELECTRONICA
Grandes aumentos se logran con la microscopia de transmisin
de electrones.
Tcnicas de tincin de contraste compuestos con metales
pesados: fosfotungstato de potasio, molibdato de amonio.
Tcnicas de tincin negativa: pueden provocar distorsin de las
estructuras.
Microscopia crioelectrnica: el espcimen se enfra a -160 oC. Se
pueden construir imgenes tridimensionales.
CRISTALOGRAFIA DE RAYOS X
Revela estructura tridimensional de viriones y de otras molculas.
Requiere la formacin de un cristal del virus que se desea
estudiar.
El cristal se coloca en un haz de rayos X, que se difracta
repitiendo los arreglos de los tomos/molculas en el cristal.
Anlisis de los patrones de difraccin permiten posicionar los
tomos/molculas.
Tambin se utiliza la RMN y la microscopia de fuerza atmica.
TECNICAS ELECTROFORETICAS
Mezclas de protenas y AN pueden separarse por electroforesis
en agarosa y poliacrilamida.
Se forma una banda en el gel.
El desplazamiento de la banda depende del peso molecular.
Se puede comparar con una escalera de pesos moleculares.
Geles SDS-PAGE.
Transferencia a membranas de celulosa. Southern blotting
(ADN), Northern blotting (ARN), Western blotting (proteinas).
DETECCION DE
VIRUS Y SUS
COMPONENTES
Se pueden clasificar 4 tipos de tcnicas para la deteccin:

1. Viriones
2. Infectividad e los virus
3. Antgenos virales
4. cidos nucleicos presentes en los virus
DETECCION DE VIRIONES
Deteccin por tincin negativa en microscopio electrnico.
Alto costo de equipos, sensibilidad limitada.
Carga viral detectable: 106 /mL.
Ejemplo: anlisis de heces de un paciente con gastroenteritis en
presencia de rotavirus.
DETECCION DE INFECTIVIDAD
No todos los viriones se pueden replicar en clulas hospederas.
Los que si lo pueden hacer se llaman: INFECTIVOS
Infectividad: capacidad de replicarse.
No infectivos: carecen parte del genoma o estn daados.
Se puede inocular en un cultivo celular u organismo hospedero.
Incubacin a temperatura adecuada.
Examen en microscopio ptico: clulas daadas o EFECTO
CITOPATICO
DETECCION DE ANTIGENOS VIRALES

Utilizando antisuero especifico al virus, o anticuerpos

monoclonales.
Mtodos directos e indirectos.
Anticuerpos: producidos al inyectar antgeno viral a una especie
animal.
Segundos anticuerpos: producida al inyectar inmunoglobulina
del primer animal al segundo animal.
Los marcadores en los anticuerpos pueden detectarse con una
diversidad de mtodos.
DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS
VIRALES
HIBRIDIZACION: mediante sondas apropiadas que llevan
marcadores.
Puede ocurrir en la superficie de una membrana por Southern
blotting o Northern blotting.
Secciones delgadas de tejidos pueden ser tambin utilizadas, se
conoce como hibridacin in situ.
DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS
VIRALES
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR: cuando una
muestra contienen un bajo numero de copias de AN, se
incrementa la posibilidad de deteccin utilizando PCR.
Se puede detectar ARN mediante RT PCR.
Gran cantidad de tcnicas de PCR como la qPCR.
 ENSAYOS DE
INFECTIVIDAD
 Un ensayo de infectividad mide el TITULO o concentracin de un
virus en un espcimen o preparacin.
Las muestras se inoculan en huspedes apropiados.
Animales, plantas, cultivos bacterianos, clulas de plantas o
animales.
Se pueden tener dos clases de ensayos de infectividad:
1. Cuantitativo
2. Cuantal
ENSAYOS CUANTITATIVOS
Aquellos en los cuales la respuesta de cada individuo puede ser una
de una serie de valores, como numero de placas.
Los ensayos de formacin de placas se reportan como unidades
formadoras de placas (ufp).
Se utilizan clulas en cajas Petri u otros contenedores.
Las clulas se inoculan con volmenes estndar de diluciones de virus.
Luego de incubar, las que recibieron altas diluciones pueden no tener
placas, las de diluciones bajas pueden tener altos nmeros de placas
o todas lisadas.
Se eligen aquellas entre 30 300.
Se reporta la concentracin de virus como ufp / mL.
ENSAYOS CUANTALES
Un sujeto inoculado responde o no responde.
Un cultivo celular inoculado desarrolla efectos citotxicos o no.
Un animal muere o permanece saludable.
El objetivo es encontrar la dosis que ocasiona una respuesta en
50% de los inoculados.
TCID50 (tissue culture infectious dose) la dosis que infecta al 50%
de los cultivos inoculados.
ID50 (infectious dose) para ensayos animales.
LD50 (lethal dose) la dosis letal para el 50% de animales
inoculados.
ENSAYOS CUANTALES
El resultado de TCID50 se puede utilizar para determinar el titulo
de virus en ufp:
1 TCID50 = 0,7 ufp
Existen numerosos mtodos para determinar el TCID50.
Ensayos para virus que producen lesiones discretas.
Poxvirus, causan pstulas luego de inocular en la membrana
corioalantoica del embrin de pollo.
Lesiones en plantas que han sido infectadas.
CURVA DE CRECIMIENTO DE UN PASO
Tipo de experimento que involucra el ensayo de la infectividad
de un virus, experimento de una sola rfaga.
Proporciona datos para una curva de crecimiento de un solo
paso.
En el periodo de eclipse, el titulo permanece constante.
El virus se ha replicado pero no es liberado de las clulas.
Cada clula origina una placa.
A medida que se liberan los virus, los ttulos se incrementan.
CURVA DE CRECIMIENTO DE UN PASO

El procedimiento es el siguiente:
Una suspensin de viriones se mezcla con una suspensin de
clulas hospederas. El numero de viriones debe exceder el de
clulas.
La tasa viriones/clulas se conoce como multiplicidad de
infeccin m.o.i. Se utiliza comnmente un valor de 5 a 10.
CURVA DE CRECIMIENTO DE UN PASO
El procedimiento es el siguiente:
Adsorcin de los viriones a las clulas por un periodo apropiado,
ejemplo 2 minutos, luego se detiene, ejemplo adicin de
antivirales.
Se toma una muestra de la suspensin a intervalos hasta que la
lisis sea completa. Para fagos se completa en menos de 1 hora.
Para virus animales toma horas o das.
Se realiza un ensayo de placa para cada muestra.
Se grafica el logaritmo del titulo de virus contra el tiempo para
obtener una curva de crecimiento de un paso.
CURVA DE CRECIMIENTO DE UN PASO
El experimento provee informacin valiosa sobre la replicacin
del virus.
El rendimiento medio del virus infeccioso por clula (tamao de
explosin) se puede calcular por la siguiente formula:
GENETICA DE LOS
VIRUS
SECUENCIAMIENTO DEL GENOMA
Secuenciamiento por el mtodo de Sanger.
Bioinformtica: Artemis y Blast.
Bsqueda de ORFs, funciones especificas, hidrofobicidad,
actividad enzimtica.
Promotores, enhancers.
Comparacin de secuencias, alineamiento.
Arboles filogenticos.
MANIPULACION DEL GENOMA
Aislamiento de fragmentos especficos.
Cortes con enzimas de restriccin.
Clonacin en plsmidos.
Introduccin de mutaciones especificas.
Produccin de nuevos genotipos virales.
INVESTIGACION DE FUNCION DE LOS
GENES Y EXPRESION
Creacin de virus con genes mutados.
Mutantes sensibles a temperaturas.
Induccin de mutacin en ADN.
Gentica reversa, de ARN a ADN.
Silenciamiento del ARN con ARNi.
Adicin de marcajes a protenas para investigar su distribucin.
Estudios de microarrays: genmica y transcriptomica tanto del
virus como del hospedero.
BIBLIOGRAFIA
VIROLOGY PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Chapter 1.