Medicin del crecimiento microbiano

Recuento directo y densitometra

Aguilar Danny, Arratea Rosario, Gallegos Jacob, Guerra Rubn
Huaman Alex, Torpoco Elas, Nieto Patricia
EP Ingeniera Ambiental
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Per, DECANA DE AMRICA
Lima, Per

I. Introduccin cuya superficie de vidrio est marcada una rejilla con

En el pasado informe, se hizo un anlisis de
microorganismos para evaluar la calidad del agua. En
el presente paper, se ver el recuento de
microorganismos de muestras especficas, bajo
mtodos de cuantificacin aprobados.
En microbiologa, la palabra crecimiento se define
como un incremento en el nmero de clulas. La
clula microbiana tiene un perodo de vida finito y la
especie slo se mantiene como resultado del
crecimiento continuo de la poblacin. Adems de la
comprensin de aspectos bsicos del crecimiento
microbiano, muchas situaciones prcticas hacen
necesario el control del crecimiento microbiano. El
conocimiento de cmo las poblaciones bacterianas
crecen rpidamente es muy til para el diseo de
mtodos de control del crecimiento microbiano.
(Biologa de los microorganismos, 2009)
Existen diversos mtodos para evaluar el tamao
de la poblacin bacteriana presente en una muestra
determinada, adecuados para diferentes organismos o
diferentes situaciones. Algunos de ellos son directos y
otros indirectos, en funcin de que cuenten
microorganismos o calculen otros parmetros a partir
de los cuales se puede inducir la magnitud de la
poblacin microbiana. En esta ocasin, nos
enfocaremos en el recuento directo (mtodo directo) y
densitometra (mtodo indirecto).
El recuento directo es el ms frecuente para
determinar el nmero de clulas totales. El contaje
microscpico directo se puede hacer en muestras
secas sobre porta o en muestras lquidas. Las muestras
secas se pueden teir para aumentar el contraste entre
las clulas y el fondo. Con muestras lquidas se
emplean cmaras de recuento especiales, que en
esencia son portas excavados y modificados sobre
pequeos cuadrados de rea conocida. (Biologa de
los microorganismos, 2009)
El mtodo indirecto, en cambio, se basa en la
medida de algn parmetro de cultivo que nos permite
deducir la informacin sobre la evolucin del nmero
de microorganismos. Entre los mtodos indirectos,
uno de los ms utilizados es la medicin de turbidez
de los cultivos, o tambin llamado densitometra.
(Manual de Prcticas, laboratorio de Microbiologa
ambiental, 2004)
II. Descripcin del mtodo
A. Cmara de Neubauer
Se trata de una gruesa placa de cristal con forma
de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm de
grosor. En una cmara simple, la porcin central, que
es donde se realiza el conteo, est dividida en 3 partes.
En la parte central se encuentra grabada una retcula
cuadrangular. En el caso de cmaras dobles, que son
las ms comunes, existen 2 zonas de conteo, una
superior y otra inferior al eje longitudinal de la
cmara. La retcula completa mide 3 mm x 3 mm de
lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1mm de
lado cada uno.
Errores de hasta 20% y 30% son comunes con este
mtodo de recuento debido al pipeteo, a los errores
estadsticos por ser la muestra poco representativa,
errores del volumen de muestra realmente introducido
en la cmara, etc. Sin embargo, el hematocitmetro o
cmara de Neubauer sigue siendo uno de los mtodos
ms ampliamente utilizados en los laboratorios de
todo el mundo por ser econmico y de fcil
manipulacin. (Conteo celular con Hematocitmetro,
2015).

1. Materiales:
Microscopio
Muestra de chicha de morada determinado por los recuentos en placa.
Cmara de Neubauer
Laminilla
Pipeta Pasteur
2. Procedimiento:
Tomar una alcuota de la muestra con ayuda de la
pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota
evitando el exceso, cubrir con el cubre objetos,
dejando que se expanda sin la formacin de
burbujas. Dejar reposar unos minutos y colocarlo
bajo la cmara del microscopio.
Observamos en objetivo 10X ubicando el
cuadrado del centro de 1.0 mm, para luego pasar a
40X observando 25 cuadrados de 0.2 mm cada
uno que a su vez estn divididos en 16 cuadrados
de 0.05 mm.
La cuantificacin se realiza con el objetivo de
40X, contando el nmero de clulas que se
localizan en el cuadrado central 1x1 mm. Se
empieza a contar desde la parte superior hasta la
base. Si la clula toca los lmites superior o
izquierdo la clula debe contabilizarse, pero en
caso sea el lmite inferior o derecho, no se
contabiliza.
vacunas. En 1907, McFarland desarroll una serie de
soluciones de sulfato de bario para calcular
aproximadamente el nmero de bacterias en
soluciones de turbidez equivalente, segn lo
La realizacin de pruebas de sensibilidad requiere
el uso de inculos estndar. El patrn 0.5 de
McFarland se utiliza para la preparacin de inculos
en dilucin de agar estandarizado, procedimientos de
macro y microdilucin de caldo, de difusin en disco
y pruebas de sensibilidad para organismos anaerobios.
Las normas de turbidez se preparan mezclando
productos qumicos que generan precipitacin para
formar una solucin de turbidez reproducible. Los
patrones de McFarland se preparan aadiendo cido
sulfrico a una solucin acuosa de cloruro de bario
que produce la formacin de un precipitado de sulfato
de bario suspendido. (Patrn de turbidez BBL
preparado, 2005)
1. Materiales
Tubos de la escala de McFarland.
Tubos con cultivos para E. Coli.
Un cuadro con lneas de fondo, para ver la
turbidez.
Nmero de clulas cuantificadas 95
Nmero de cuadrado 0.2 x 0.2 mm 5
analizado
Volumen de cada cuadrado 0.2 x 0.04 ml
0.2 mm

2. Procedimiento

Tabla 2. Composicin de la turbidez estndar de McFarland

Nmero Cloruro de cido Densidad de
de la bario di sulfrico bacteria
turbidez hidratado (1%) aproximada
estndar (1,175%) correspondiente
0.5 0.5 mL 99.5 mL 1 x 108
1 0.1 mL 9.9 mL 3 x 108
2 0.2 mL 9.8 mL 6 x 108
B. Estndares de turbidez de McFarland 3 0.3 mL 9.7 mL 9 x 108
4 0.4 mL 9.6 mL 12 x 108
5 0.5 mL 9.5 mL 15 x 108
Los patrones de McFarland se utilizan como 6 0.6 mL 9.4 mL 18 x 108
patrones de turbidez en la preparacin de 7 0.7 mL 9.3 mL 21 x 108
suspensiones de microorganismos. 8 0.8 mL 9.2 mL 24 x 108
9 0.9 mL 9.1 mL 27 x 108
Uno de los primeros usos de la turbidez fue para 10 1.0 mL 9.0 mL 30 108
clculo de poblaciones bacterianas fue la preparacin
 El objetivo de este procedimiento es determinar el
nmero de bacterias por mL de fluido.
Se realiz una siembra de Escherichia Coli con
anterioridad, en un determinado agar favorable
para el crecimiento de esta bacteria.
Se determin por observaciones macroscpicas
(turbidez) la presencia del desarrollo de colonias
en el tubo de ensayo, donde se realiz el cultivo
de la bacteria E. Coli.
Luego de verificar que hubo desarrollo de
colonias, se pas a calcular la cantidad
aproximada de U.F.C./mL (unidades formadoras
de colonias por mililitro), a travs de una
comparacin de turbidez entre el tubo de E. Coli
y los tubos de McFarland.
Para realizar la comparacin, se recomienda que
sea de manera ordenada, ya sea ascendente o
descendente, es decir, compararlo desde el tubo
de menor turbidez hasta el tubo de mayor turbidez
o viceversa.
Finalmente, al concluir la comparacin, se revis
la escala de McFarland y se pudo obtener una
aproximacin de la densidad de bacterias que
haba en el tubo de E. Coli.
III. Resultados
A. Cmara de Neubauer
En el primer procedimiento de Cmara de
Neubauer, los resultados son los siguientes:
mtodo tiene algunas limitaciones el de no distinguir
( )=
9
( )=
.
( ) = . /
Con los resultados ya listos, podemos concluir que
la cantidad de levadura por ml de la chicha morada
fermentada aproximadamente por 3 semanas es de
.7 2 . Esta cifra no es del 100% segura. Si bien
esta tcnica es la ms usada, an existe un 20 o 30%
de error, especialmente al momento de contabilizar las
clulas o bien que la muestra usada no es
representativa (para lograr que fuera representativa,
homogenizamos antes de obtener el inculo). Adems
poseemos el nmero de levaduras, pero no obtenemos
el nmero de clulas viables.
B. Estndares de turbidez de McFarland
En el mtodo de estndares de turbidez
de McFarland, al final de todo el procedimiento, se
lleg a la conclusin de que el tubo de ensayo con E.
Coli, posea una suspensin bacteriana equivalente en
turbidez a la turbidez estndar de 0.5 de la escala de
McFarland, con lo cual podemos afirmar que contiene
aproximadamente 8 bacterias por mL. Esto es
compatible, con el documento presentado por la BD
de patrn de turbidez BBL preparado, en el que nos
dice, que el patrn de 0.5 de McFarland corresponde
aproximadamente a una suspensin homognea de
Escherichia coli de 1,5 x 108 clulas por mL3.
IV. Discusin grupal
Qu es un organismo viable? Ser posible su recuento
en la cmara de Neubauaer?
Un microorganismo viable es aquel microorganismo
vivo y cultivable en los medios de cultivo y en
condiciones ambientales especficas. (Reglamento
Tcnico Mercosur para productos de uso domisanitario a
base de bacterias, 2006).
El recuento de microorganismos viables no sera
posible en la cmara de Neubauer, ya que este es de
recuento directo. Segn guas de laboratorio, este
mtodo es tedioso pero es una forma rpida de estimar la
carga microbiana de una muestra. A pesar de ello el
clulas muertas y vivas. (Manual prctico de [6] MERCOSUR. (22 de Junio de 2006). Reglamento
microbiologa ambiental, 2007). Tcnico Mercosur para productos de uso
domisanitario a base de bacterias. Obtenido de:
Pero s se podra dar si se realiza previamente un
http://www.sice.oas.org/Trade/MRCSRS/Resoluti
mtodo de tincin de azul de metileno. Las clulas vivas
contienen enzimas capaces de reducir el azul de metileno a ons/Res2506.pdf
compuestos incoloros. Cuando las clulas estn inmersas
en azul de metileno, este penetra dentro de las clulas y las [7] Ramos M., & Chabela M.(2004). Manual de
enzimas de las clulas vivas lo decoloran. Las clulas Prcticas, laboratorio de Microbiologa
mueras, donde la enzima es inactiva, esto no ocurre y, por ambiental. Mxico: Universidad Autnoma
consiguiente, permanecen azul. Metropolitana.
Tambin existe la tincin por eritrosina. La eritrosina es
un colorante que puede ser utilizado en el recuento en
cmara en lugar del azul de metileno, que se usa
convencionalmente. Una de las ventajas de esta es su fcil
y rpida preparacin, no mancha los materiales ni el
microscopio, y permite observar mejores contrastes ente
clulas vivas y muertas. (Anlisis comparativo de
colorantes vitales en el estudio de la viabilidad de
levaduras, 2016).

V. Referencias

[1] Bastidas O. (2015). Conteo celular con

Hematocitmetro. Obtenido de:
http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Arti
cles/Conteo-Camara-Neubauer.pdf

[2] Becton, Dickinson and Company. (Febrero de

2005). Patrn de turbidez BBL preparado.
Obtenido de:
http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/
US/8808421%280205%29_es.pdf

[3] Madigan M., Martinko J., Dunlap, P., & Clark, D.

(2009). Biologa de los microorganismos. Madrid,
Espaa: PEARSON EDUCACIN.

[4] Manacorda, A., Cuadros P., & Alvarez A. (2007).

Manual prctico de Microbiologa Ambiental I.
Buenos Aires: Universidad Nacional del Comahue
- Escuela Superior de Salud y Ambiente.

[5] Martinez J., Crdenas G. & Gusils C. (Junio de

2016). Anlisis comparativo de colorantes vitales
en el estudio de la viabilidad de levaduras.
Obtenido de:
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_artt
ext&pid=S1851-30182016000100005