UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CINCIAS NATURAIS E EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-
PS-GRADUAO EM QUMICA
Preparo de Amostra para a Determinao
de Compostos Orgnicos
Prof. Dr. Renato Zanella
LARP/UFSM
2011
Amostragem
Exemplos de Procedimentos No-destrutivos
Extrao com solvente
convencional (miniaturizado)
Soxhlet
Ultra-som (banho e sonda)
Extrao em fase slida (SPE)
SPE dispersiva (d-SPE)
Disperso da matriz em fase slida (MSPD)
Microextrao em fase slida (SPME)
Extrao acelerada com solvente (ASE) ou
Extrao com solvente pressurizado (PSE)
Extrao com fluido supercrtico (SFE)
Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE)
(Micro)dilise
Molecularly Imprinted Polymers (MIPs)
Headspace (HS) - esttico e dinmico
Purge&Trap (P&T)
1 2
Situao Atual da Produo de Alimentos
Resduos em alimentos - Definio do problema
Determinao de baixas concentraes em diferentes matrizes
(teor de gordura, aucar
aucar,, acidez, pigmentao ...)
3 4
1
 Anlise de Resduos de Compostos Orgnicos

Projetos Multidisciplinares
Qumica Analtica, Agronomia, Bioqumica, Biologia, Zootecnia Mtodos Multirresduo

Preparo de
GC-MS/MS
amostra
LC--MS/MS
LC
Amostragem
Cromatografia acoplada
QuEChERS
Espectrometria de Massas

5 6

Quantificao por GC-MS/MS Quantificao por GC-MS/MS

Replicates
M
33 3 3
Pirifenox
3 3 3

400

300

200
Peak Size

100

250 500 750 1000

Amount (ppb)

7 8

2
Quantificao por GC-MS/MS Quantificao por LC-MS/MS
Modo MRM

MCounts MCounts

100%
1.00

88106
1.00
Methomil 0.75
75%

0.50 50%
163

0.75
0.25 25%

0.00 0%
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
minutes 90 100 110 120 130 140 150 160 m/z

2A
1.00

100%
0.50 211
0.75
75%

Thiametoxan 0.50
50%
181 292
0.25
0.25
25%

0.00 0%
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
minutes 175 200 225 250 275 m/z

9 0.00
10
2.5 3.0 3.5 4.0 minutes

Quantificao por LC-MS/MS

Sistemas pouco prticos na rotina

SPE
Kuderna--Danish
Kuderna Cleanup
Rotaevaporador

11 12

3
 Incertezas para amostragem
feita no campo PREPARO DE AMOSTRA

Medidas incertezas Processo preliminar de separao com

objetivo de isolar os componentes de
mam sam mlab slab interesse de uma matriz complexa

Procedimento empregado para realizar o

stotal = sam +
2 2 slab2 clean--up de amostras
clean

Concentrao dos analitos de interesse a fim de

95% 5% atingir limites de deteco dos mtodos mais baixos

13 14

HOMOGENEIZAO DA AMOSTRA
Filtros
Mais usados: Nylon, PTFE ...
0,2 e 0,45 m porosidade

Membrana Ponteira
Ultraturrax 15 16

4
 Extrao com solvente Extrao Lquido-Lquido (LLE)
Procedimento freqentemente empregado
Miniaturizao
Tipos de sistemas
- aquecimento convencional
- soxhlet
Uso de ultra-som (banhos e sondas)
Reduo do tempo (1- 5 min)
Risco de contaminao

17 18

EXTRAO LQUIDO-LQUIDO (LLE)

um movimento dinmico se estabelece
"semelhante dissolve semelhante" entre as fases, e aps um determinado tempo,
quando um analito, inicialmente solubilizado em uma das fases, atinge--se um equilbrio termodinmico de
atinge
encontra-se em uma nova situao onde existem duas fases lquidas maneira que, a uma temperatura constante, as
imiscveis, h uma tendncia desta substncia dissolver-se em ambas as fases. s s
concentraes do analito dentro de cada uma
s
s
s das solues permanecem constantes
s

s O coeficiente de distribuio (KD) ser a

s constante de equilbrio para a reao:
s s s s
agitao s
s s
decantao s s
s s S (na superior) S (na fase inferior)
s

[S ]2
s s s
s s
ss aS 2
KD =
s s s
s

[S ]1
s
a S1
19 20
s = analito

5
LLE Exemplo: Extrao de cidos graxos de sabo LLE Extraes sucessivas
Para KD >> 1 (~1000), uma extrao suficiente!

Se 2 < KD < 10 EXTRAES SUCESSIVAS

C fase superior (ter)
KD = 2
C1 fase inferior (gua) Extraes com alquotas de menor volume e
um maior nmero de alquotas!

F Suponha que o analito S, solubilizado em V1 mL de solvente 1,

C H 2O
S c < S c
ter

K D = ter .Graxos .Graxos

extrado com V2 mL de solvente 2. Se m for o no total de moles
C H 2O H 2O
S sabo > S sabo
ter
no sistema, q ser a frao remanescente na fase 1 e (1-q) a frao
E
transferida para a fase 2.
KD >>1 para cidos graxos
KD << 1 para sabo KD =
[S ]2 =
(1 - q )m V2

21
[S ]1 qm V1
22

Qual ser a frao remanescente (q

(q) na fase 1 Exemplo:: Promover a extrao de 4,0 g de cido butrico, inicialmente
Exemplo
depois de uma extrao? solubilizado em 500 mL de H2O, com 500 mL de ter (K
(KD = 3)
1 extrao: C ter ( g L ) ( 4 ,0 - x ) 0 ,5
V1 KD = = 3,0 = x = 1, 0 \ m ter = 3 , 0
q= E aps duas, trs,.... n extraes? C H 2O ( g L ) x 0 ,5
V1 + K DV2
x a massa de soluto remanescente na soluo aquosa
2 extraes (usando 250 mL de ter em cada):
1.0 C ter ( g L ) ( 4 , 0 - x1 ) 0 , 25
KD = = 3 ,0 = x 1 = 1, 6 g
0.8
C H 2O ( g L ) x1 0 , 5
n \ m 1ter = 2 , 4 g

0.6
V1
F n = q =
Fn

+
0.4 Cter ( g L ) (1,6 - x2 ) 0,25
1
V K D 2
V KD = = 3,0 = x2 = 0,64 g Para 5 extraes
0.2 CH 2O ( g L ) x2 0,5 com 100 mL cada:
0.0
0 2 4 6 8 10
\ mter
2
= 0,96 g mter = 3,77 g
o
n extraes
23 Aps 2 extraes: m ter = 2,4 + 0,96 = 3,36 g 24

6
 EXTRAO SLIDO-LQUIDO (SLE)
EXTRAO LQUIDO-LQUIDO CONTNUA
Extrao de compostos orgnicos solveis de uma matriz slida
(solo, alimentos, fibras) usando um lquido como fase extratora
LLE CONTNUA C Vantagens
Exemplos: hidrocarbonetos de carvo mineral
J Instrumentao barata
alcalides de plantas
J Muito simples; No requer treinamento resduo de pesticidas em alimentos

Mtodos:
D Desvantagens Agitao mecnica pouco eficientes
requerem grande volume de solvente
Ultrassom
L Grande volume de solvente (50 - 500 mL) relativamente rpidos (< 1h)
comuns em extrao de pesticidas em solo
L processo demorado (12 - 48 h)
Soxhlet
L Concentrao da amostra (perda de volteis)
25
Extrao com Fluido Supercrtico (SFE) 26

SLE - EXTRAO POR SOXHLET

SLE
O extrator de Soxhlet foi inventado por Franz von Soxhlet em 1879 C Vantagens
J Eficiente (extrao exaustiva)
Tipicamente o slido contendo amostra embrulhado em
um cartucho feito com papel de filtro J Extrao relativamente fria permite
a anlise de compostos volteis e
O solvente de extrao aquecido causando sua evaporao termolbeis

Ao atingir o condensador, o solvente condensado e

D Desvantagens
amostra

lentamente ele pinga sobre amostra (solvente frio)

A cmara da amostra gradativamente preenchida com o

solvente at o momento em que ela esvaziada (sifonagem)
L Quantidade de solvente ( 500 mL)
L processo demorado (8-72 h)
O solvente contendo o extrato volta para o frasco original e o
processo repetido diversas vezes

27 28

7
Extrao por solvente Extrao por solvente com
com auxlio de ultra-som auxlio de microondas

Sonda
Banho

Riscos de degradao dos

analitos de interesse
29 30

Sistemas de evaporao Sistemas de evaporao

Kuderna--Danish
Kuderna Rotaevaporador

31 32

8
 Sistemas de evaporao de solvente EXTRAO EM FASE SLIDA (SPE)
por carreamento com gs (N2)

amostra seringa
Mecanismo: equilbrio de lquida
partio entre os analitos
e a fase extratora fritas de
(estacionria) suporte slido polietileno
a base de slica (~ 20 m)
Alternativa a LLE (~ 40 m)

Permite o aquecimento dos recipientes

33 34

Comparison of phase usage in SPE and HPLC

(LCGC North America, 2008)
EXTRAO EM FASE SLIDA (SPE)

Aplicaes tpicas
Pr-concentrao
Purificao de extratos (cleanup)
Remoo de sais
Troca de solvente
Conservao de amostra ou Estocagem
35 36

9
 SPE Caractersticas / Vantagens
Conveniente, mais rpido e barato que LLE
Usado para clean-up de amostras e/ou concentrao de analitos
Reduo significativa de solventes organoclorados
Grande variedade de formatos e fases comercialmente disponveis
um tipo para cada necessidade
37
Extrao em Fase Slida (SPE)
Sorventes
Suas propriedades fsico-qumicas definem as interaes e a
eficincia da extrao. Existem variados materiais:
Slicas para Fase Reversa:
Inicialmente obtidas a partir de terras diatomceas. Porm, em
funo das muitas impurezas metlicas, passaram a ser sintetizadas
em verses ultra-puras, sintetizadas a partir do tetraetxisilano
(TEOS) e ligadas a compostos apolares, como octadecilsilano (C18)
39
Extrao em Fase Slida (SPE)
Sorventes
Adsorventes Inorgnicos de Fase Normal:
Alumina, Florisil e Slica, compostos polares, permitem a
eluio fracionada de compostos das mais diversas polaridades
utilizando misturas de solventes de composio altamente
apolares (para eluir compostos mais apolares) cuja polaridade
acrescentada gradualmente, permitindo a separao de
compostos que se comportariam como interferentes em outras
condies
38
Extrao em Fase Slida (SPE)
Sorventes
Adsorventes a Base de Carbono:
Vrios tipos de carvo tiveram vrias aplicaes qumicas, mas,
justamente, em funo desta diversidade, induziam a uma
baixa reprodutibilidade. Atualmente, o Carbono Grafitizado
(GCB) tem sido aplicado em SPE em funo de suas
propriedades singulares de reteno dos analitos atravs
interaes - e hidrofbicas.
40
10
 Sorventes Polimricos

Extrao em Fase Slida (SPE)

Sorventes

Sorventes Polimricos:
Resinas baseadas em Poliestireno Divinil Benzeno (DS-DVB)
so usadas desde a dcada de 60, mas seguiram sofrendo
melhorias atingindo maior porosidade e rea superficial,
ligao com diversos tipos de grupos funcionais (acetil,
hidroximetil, sulfonil, o-carboxibenzoil), co-polimerizao com
monmeros polares (n-vinilpirrolidona NVP), ligao com
grupos lipoflicos (C8 e C18) e inicos (cido sulfnico, cido HLB: Hydrophilic-Lipophilic Balance Sorbent RP sorbent for all compounds (e.g. parent drug and its polar
metabolites). Water-wettable sorbent, no impact of sorbent drying.
carboxlico, dietilenotriamina)
MCX: Mixed-mode Cation-eXchange and RP sorbent for bases. High selectivity for basic compounds.
MAX: Mixed-mode Anion-eXchange and RP sorbent for acids. High selectivity for acidic compounds.
WCX: mixed-mode Weak Cation-eXchange and RP sorbent. Retain and release strong bases (e.g. quaternary amines).
41 42
WAX: mixed-mode Weak Anion-eXchange and RP sorbent. Retain and release strong acids (e.g. sulfonates).

SPE Mecanismos de Separao

ADSORO / NORMAL PHASE
Adsoro: regido pela interao do analito com a superfcie do Moderately polar to polar analytes are extracted
material slido adsorvente, que no apresenta filme lquido from nonpolar solutions onto polar sorbents
depositado na partcula (geralmente slica gel)
Adsorbents:
Partio: equilbrio de partio entre o analito e a fase Silica Gel (SiOH)
estacionria quimicamente ligada Florisil (Mg2Si03)
Fase normal Alumina (Al203)
Fase estacionria POLAR
Solvente para eluio APOLAR Bonded Phase Sorbents:
retm analitos polares e os apolares so eluidos Cyano (CN)
Fase reversa Diol (COHCOH)
Fase estacionria APOLAR Amino (NH2)
Solvente para eluio POLAR
retm analitos apolares e os polares so eluidos 43 44

11

REVERSED PHASE
Nonpolar to moderately polar analytes are extracted
from polar solutions onto nonpolar sorbents.
sorbents:
Octadecyl (C18)
Octyl (C8)
Cyclohexyl (C6H11)
Phenyl (C6H5)
ION EXCHANGE
Ionized analytes are extracted from solution
onto a sorbent of opposite charge.
Anion Exchange Sorbents:
Amino (NH2)
1.2-Amino (NH2/NH)
WP PEl (NH)
Quaternary Amine (N+)
Cation Exchange Sorbents:
Carboxylic Acid (COOH)
Aromatic Sulfonic Acid (C6H5SO3H)
Propyl Sulfonic Acid ((CH2)3SO3H)
WP Carboxylic Acid (COOH)
SPE Mecanismos de Separao
Pareamento Inico: fase apolar + matriz polar com analitos
inicos. Adio de contra-on neutraliza analito que retido
na fase apolar (mesmo mecanismo de fase reversa)
Troca Inica: fase modificada com funcionalidades inicas;
analito de carga oposta fase ser retido
trocadores aninicos fortes ou fracos
trocadores catinicos fortes ou fracos
45 46
SIZE EXCLUSION
Compounds differing significantly in MW are
extracted by a dextran gel which swells in water or
buffered aqueous solutions. The smaller molecules
(<10,000 MW) enter the pores of the hydrated
carbohydrate polymer and are significantly retarded
as they percolate through the gel. The higher MW
compounds are excluded from the gel and elute
through the gel in the void volume. The dextran gel
is often used to desalt protein solutions or for buffer
exchange.
Sorbent: Sephadex G-25
47 48
12
SPE Mecanismos de Separao MOLECULARLY IMPRINTED POLYMERS (MIPs)

Fases especiais e mecanismos mistos

Development of MIP membranes and SPE
materials for clinical and environmental
analysis
R
H HO _
_ R
OH + B O MIPs possess selective permeability for a
B HO template and that they can be used as
OH O H
HO HO R H membranes in separation and sensing we
R H are trying to keep a momentum by
developing new and more effective MIP
O membranes. A new grafting technique
CH3
O S OH N has been developed which allows the
Si O introduction of specific binding sites into
O
O
the commercial microporous filtration
Si
O O membranes without compromising their
O
Si O C O transport properties.
O
49 50

SPE Mecanismo de reteno SPE Mecanismo de reteno

I- Lquido
Lquido--Slido ou por ADSORO II-- Lquido
II Lquido--Lquido ou de PARTIO

baseada na interao do soluto com os centros Desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para a
ativos fixos de um adsorvente slido, finamente separao de vrios aminocidos;
dividido, que atua como FE.

Baseia-
Baseia-se na distribuio das molculas do soluto
ADSORVENTE entre duas fases lquidas imiscveis, de acordo
com as solubilidades relativas
relativas.. Os componentes
ELUENTE SOLUTO FM FE
mais solveis na FE so seletivamente retidos por
ela, enquanto os menos solveis so
Soluto e eluente so atrados pelos stios polares da FE transportados mais rapidamente pela FM FM;;
51 52

13
 SPE Mecanismo de reteno SPE Mecanismo de reteno

A separao do soluto baseada nas diferenas Lquida ligada em suporte slido:

relativas de solubilidade na FE e na FM
As fases quimicamente ligadas so as mais
importantes da HPLC
HPLC.. Todas elas se baseiam nas
possibilidades do grupo silanol reagir no
hidrognio ou por substituio da hidroxila
hidroxila..

FM FE

53 54

SPE Mecanismo de reteno SPE Mecanismo de reteno

Principais fases quimicamente ligadas

C18 (octadecilsilica ou octadecila
octadecila;; ODS, RP
RP--18
18)): para materiais
1. Fases apolares : os principais grupos no polares ou apolares ou moderadamente polares, tais como cidos
pouco polares ligados silica so
so:: graxos, PAH, steres, vitaminas lipossolveis, etc
etc..

a) Grupos alqulicos com cadeias de 2, 4, 8, 18 e 22

tomos de carbono
carbono..
C4 (butila)
(butila):: Tempo de reteno menor que as fases C8
e C18. Utilizada para separao de peptdios e
protenas..
protenas b) Grupos fenlicos
fenlicos:: so grupos fenila ou alquilfenila ligadas
slica.. Possuem poucas aplicaes
slica aplicaes.. Recomendada para
grupos moderadamente polares
polares..
C8 (octila)
(octila):: Recomendada para materiais ligeiramente
ou altamente polares como peptdios pequenos,
esterides, nucleosdeos, frmacos polares
polares..

55 56

14
 SPE Mecanismo de reteno SPE Mecanismo de reteno

III - Excluso por tamanho (SEC)

2. Fases polares : neste caso os grupos ligados
slica so polares
polares.. Exemplos
Exemplos:: Efetua a separao de acordo com
o tamanho efetivo das molculas
molculas..
A coluna recheada com material
Amino (NH2) com poros de tamanho controlado
controlado..
Fases Estacionrias
poliestireno poroso
slica - poros controlados
Ciano (CN) gel - base orgnica ou aquosa
Fases Mveis
aquosa - filtrao em gel
orgnica - permeao em gel
Aplicaes::
Aplicaes
Diol Separaes de polmeros, protenas,
Gorduras, ... por tamanho
tamanho.. Molculas
maiores eluem primeiro
primeiro..
57 58

SPE Mecanismo de reteno SPE Mecanismo de reteno

V - Par Inico
IV - Troca Inica O pr
pr--requisito que o contra
contra--on forme um on par com caractersticas
hidrofbicas e seja atrado pela FE apolar
apolar..
Determinao de ctions e nions
Para separaes que no so adequadas por FR ou troca inica
inica..
Resinas trocadoras de ons ons:: As modernas resinas
trocadoras de ons so fabricadas a partir de polmeros
porosos com superfcie modificada com grupos Mecanismo
trocadores inicos
inicos.. + Um composto inico
Trocadores catinicos
catinicos:: on do soluto que forma um par inico
Contra-on com um componente da
Forte: sulfnico
Forte: FE amostra, de carga
Intermedirio: fosfnico oposta, adicionado
Fraco: carboxlico FM.. Este par inico,
FM
um sal, que se comporta
Trocadores aninicos: como uma molcula
Forte: amnio quaternrio
Forte: orgnica neutra, que
Intermedirio: dietilamino pode ser separada por
cromatografia em fase
Fraco: p-
p-amino carboxlico
reversa..
reversa

59 60

15
 Extrao em Fase Slida (SPE)
Desenvolvimento de Mtodos Extrao em Fase Slida (SPE)
De modo geral, obedece aos mesmos parmetros gerais do desenvolvimento
de mtodos para qualquer procedimento analtico: Formatos
Tempo, dinheiro e necessidade
SPE uma tcnica que pode ser encontrada nos mais
Fatores qumicos que devem ser levados em considerao so: diferentes formatos:
Mecanismos de reteno, estrutura qumica dos analitos, composio da amostra
A semelhana da SPE com a cromatografia lquida prov muita informao
til nesta etapa: Cartucho Tradicional ou Sep-Pak:
Propriedades de fases estacionrias e interaes fsico-qumicas Composto de polipropileno ou vidro, a camada de sorvente
est contida entre duas fritas geralmente feitas de
Mecanismos de Interao polietilieno ou PTFE

So precisamente os mesmos da cromatografia lquida. A reteno e a

separao dependem da natureza das fases estacionria e lquida e dos analitos
As interaes sorvente-analito podem ser classificadas como:
Hidrofbica, polar e inica
Baseadas nestas interaes pode-se ter:
61 62
SPE de fase normal, fase reversa ou troca inica

Extrao em Fase Slida (SPE) Extrao em Fase Slida (SPE)

Formatos
Formatos Miniaturizao:
A necessidade de menor consumo de solventes e de maior
sensibilidade dos instrumentos analticos propiciou a
Disco de SPE: miniaturizao, tanto do SPE em cartucho, quanto em disco;
Consiste de uma membrana suporte de PTFE poroso ou fibra Desenvolveu-se discos com sorvente polimrico
de vidro, sendo esta mais rgida, com sorvente incorporado acoplados a seringas de agulhas;
Sistemas 96-well plates, que equipados com 96
cartuchos miniaturizados
Ponteiras de pipetas contendo partculas de
sorvente entre duas fritas

96 WELL PLATE

63 64

16
 SPE Instrumentao
SPE Instrumentao

F Automatizao off-line F Automatizao on-line

analito coletado em um
frasco e ento transferido
para o cromatgrafo; o
tubo no est conectado
diretamente no fluxo
analtico
cartucho de SPE
colocado em linha com o
sistema analtico e os
analitos eluidos so
transferidos diretamente
para o cromatgrafo

65 66

volume da amostra volumes variam de mL a L

SPE Rotina de uso
grau de contaminao
seletividade da matriz
1) Seleo do tubo apropriado
nmero de analitos
fora da matriz como solvente
fora da interao analito/matriz
SPE Rotina de uso
(volumes excessivos reduzem a
eficincia da concentrao)
3) Adio da amostra ajustes de pH, fora inica e
presena de solvente orgnico pode
ser realizados
fluxo pode afetar a eficincia

dependente da aplicao e do eluio de material no desejado

material de recheio
etapa necessria para a
2) Condicionamento do catucho
ativao da fase
nunca permitir que o material
seque durante o procedimento
ou no retido. Lavagem com o
mesmo solvente da amostra (~ 1
4) Clean-up da amostra volume)
passando um solvente + forte
que da amostra pode remover
67
algumas impurezas indesejveis 68

17
 SPE Rotina de uso eluio com pequeno volume
de solvente adequado (forte)
5) Eluio dos compostos de duas alquotas pequenas so
interesse mais eficientes do que uma grande
SPE Resumo
Reter compostos de interesse e deixar as
impurezas passar pelo tubo
l contaminantes m analitos

interao por vrios segundos

aumentam a eficincia da extrao

condicionamento adio amostra lavagem eluio

69 70

SPE Resumo Extrao em Fase Slida - SPE

(i) extrao e remoo de interferentes

(ii) slica como adsorvente (modificao: grupos quelantes, inicos,
polares ou apolares)
(iii) uso de sistema pressurizado, vcuo ou centrifugao

MeOH H2O Analito 5% MeOH + MeOH

Impurezas H2O

Impurezas Analitos
H2O +MeOH eluidos

1. CONDICIONAMENTO 2. RETENO 3. LIMPEZA 4. ELUIO

71 72

18
 Mecanismo Sorvente Analito Matriz Eluente

SPE Aplicaes
Extrao no C18, C8, C2, grupos solues solventes
polar (fase fenil, funcionais polares polares;
Drogas e frmacos reversa ciclohexil, apolares; (tampes metanol,
cianopropil alquilas e aquosos) acetonitrila e
Aflatoxinas fenilas gua
Extrao polar slica, diol, grupo solventes solventes
Inseticidas
Inseticidas,, herbicidas e fungicidas (fase normal ciano, amino, funcional polar; no polares, apolares;
ligada ou diaminos amina e leos hexano e
adsoro) hidroxilas diclorometano
PCBs e dioxinas Troca trocador forte grupos aquosa, tampes
catinica (c. sulfonico) funcionais baixa fora como acetato,
Fenis ou fraco (c. positivamente inica citrato, e
carboxlico) carregados; fosfato
Metais pesados aminas
Troca aninica trocador forte grupos aquosa, tampes
(tetraalquil funcionais baixa fora como fosfato
amnio) ou negativamente inica e acetato
fraco (amina) carregados;
cidos
73 orgnicos 74

Influencia do pH da soluo para alguns compostos Influencia do pH da soluo para alguns compostos

Procedimento
O experimento visa enfatizar a facilidade do emprego de cartuchos C-18 na separao por fase
reversa de componentes de corantes.

Preparo da amostra: (1) Pesar 0,2 g de corante alimentcio verde e dissolver em 10 mL de gua
purificada. Ajustar em pH 12 com soluo aquosa de KOH.
Condicionamento: (1) Colocar um cartucho SPE no suporte; (2) Adicionar 1,0 mL de metanol;
(3) Adicionar 1,0 mL de gua purificada.
Aplicao da amostra: (1) Adicione 3,0 mL da amostra no cartucho SPE; (2) Aplicar vcuo e
coletar o eluato em um tubo.
Lavagem: (1) Adicionar 2,0 mL de gua purificada; (2) Aplicar vcuo e descartar o eluato.
Eluio: (1) Colocar o cartucho SPE no suporte; (2) Adicionar 2,0 mL de metanol; (3) Aplicar
vcuo e coletar o eluato em um segundo tubo. Observar a colorao.

75 76

19
 Dioxin in milk Semi-Solid samples
Extraction on C-18 and Extraction with PLE and
clean up on silica and carbon clean up on silica and alumina

77 78

Exemplo de aplicao: pesticidas em guas subterrneas

Fase: ENVI-Carb SPE (base de carbono)

Protocolo usado:
Condicionamento: (3 mL, 250 mg fase)
- 5 mL DCM:metanol, 4:1
- 2 mL metanol + 10 mL 2% cido actico
Amostragem: 400 mL gua subterrnea
Lavagem: 10 mL gua pura
Secagem: purga com N2 seco por 5 min
Eluio e Fracionamento:
Pesticidas Bsicos e Neutros Pesticidas cidos
- 1 mL metanol - 2 2 mL DCM:metanol, 3:2
- 2 2 mL DCM:metanol, 4:1 (basificado com 0,016 mol/L KOH)
- coletar as fraes no mesmo frasco
- adicionar 350 mL de TFA 2% Limites de deteco: 0,1-5,0 g L-1
29 pesticidas (bsico/neutros e cidos) Recuperao: ~ 92%
Secar as fraes e redissolver em 1 mL de metanol, filtrar e analisar! 79 80

20
 SPE - Comparao da eficincia de recuperao de
Parmetros sugeridos para trabalho em SPE compostos orgnicos com diferentes caractersticas
empregando diferentes materiais adsorventes
Volume do cartucho Quantidade de Sorvente Volume de eluio
mL mg L

1 100 2 x 100
3 200 2 x 200
3 500 2 x 500
6 500 2 x 500
6 1000 2 x 1000

81 82

SPE Clean-up de extratos

SPE
Clean-up

83 84

21
Outras formas de executar a extrao em fase slida
Automated SPE

Empore
disk ASPEC XL4
ASPEC XLi

96 well-plate

85 86

Determinao de Pesticidas em Alimentos

Artigos de reviso
] Mtodo QuEChERS

Quick
Easy
Cheap
Effective
Rugged
Safe
Seguro
Robusto
Efetivo
Barato
Fcil
Rpido M. Anastassiades et al., 2003, J. AOAC Int, 86:412431
87 88

22
 Determinao de Pesticidas em Alimentos

] QuEChERS Method

10 g Amostra + 10 mL Acetonitrila

4 g MgSO4 + 1 g NaCl
1 min (Vortex)

centrifugao 1 min (3450 rpm)

1 mL extrato
+ 25 mg PSA + 150 mg MgSO4
20 s (Vortex)
centrifugao 1 min (3450 rpm)

M. Anastassiades et al., 2003, J. AOAC Int, 86:412431 89 90

Fluxograma do mtodo QuEChERS modificado utilizado para

extrao multirresduo de 50 pesticidas em tomate
E
X L
T I
R M
A P
E
Z
O A

agitar (1 min)

P
A
R
T
I antes depois
limpeza
limpeza

O
agitar (1 min) / centrifugar
ANLISE CROMATOGRFICA 91 92

23
 Dispersive SPE

Dispersive SPE Varian Bondesil PSA purification is based on:

Polar primary interactions
Anion Exchange primary interactions
Chelating primary interactions
Non-Polar secondary interactions
Cation Exchange silanol activity interactions

93 94

95 96

24
Matrix Solid Phase Dispersion:

97 98

EXTRAO ACELERADA POR SOLVENTE

Extrao acelerada com solvente - ASE ou
Extrao com solvente pressurizado - PSE introduo da
amostra

adio de
princpio semelhante ao da extrao convencional solvente

presso e temperatura elevadas aquecimento e

pressurizao

tenso superficial, taxa de difuso, solubilidade do extrao

analito e capacidade de penetrao (viscosidade passagem de

solvente
do solvente e molhabilidade da amostra)
purga com N2

extrato

99 100

25
 Extrao acelerada com solvente - ASE
- temperatura (50 a 200 C) e presso (at 3.000 psi
- menor quantidade de solvente (12 a 15 mL)
- o aumento da temperatura acelera a extrao
devido aos seguintes fatores:
para cada 10 C incrementados na temperatura,
a velocidade de extrao dobra;
Aumento de temperatura = aumento de
solubilidade;
maior temperatura e maior presso menor
viscosidade, melhor penetrao na amostra;

Principais caractersticas
Totamente automatizado;
Extrao Sequencial;
Extrator comercial (Mod. ASE200, Dionex) T 24 amostras; volumes: 11, 22 e 33 mL;
Extrato automaticamente filtrado;
Sensores para temperatura, presso e
vazamento de solventes

101 102

Comparao entre tcnicas de extrao (Micro)dilise

Amostras slidas

103 104

26
Preparao de amostras empregando dilise Pr-concentrao on-line

105 106

Extrao com Fluido Supercrtico - SFE

Extrao com Fluido Supercrtico - SFE
Pode ser aplicada para extrao de compostos
(i) princpio semelhante ao da extrao
orgnicos de amostras complexas
convencional
(ii) gases acima da T e P crticas
(iii) difuso pela amostra como gases poder de
solubilizao como lquidos
(iv) CO2 o mais amplamente empregado:
- menor toxicidade, no inflamvel, T e P crticas
so relativamente baixas com relao a outros;
- mudanas na constante dieltrica: apolar em P e
T normais, CD semelhante a de substncias
polares em P elevadas
(v) modificao com solventes (1 10%)

107 108

27
 Extrao com Fluido Supercrtico - SFE

Sistema SFE Ca. 75 mL, em ao inoxidvel,

at 40 MPa (6000psi) e 238C

Coletor Bomba para lquidos, de alta

presso, 46-460 mL h-1
Extrator
Coletor com 100 mL

Bomba

109 110

EXTRAO COM FLUIDO SUPERCRTICO (SFE)

Extrao com Fluido Supercrtico - SFE
Conceitos Bsicos
SFE vs. mtodos tradicionais de extrao
(soxhlet, LLE, SPE e sonicao): Diagrama de Fases
- reduo nos tempos de extrao;
P SF Condio final independente do
- facilidade de eliminao do solvente; 2 3
- uso de solventes no-txicos, de baixo custo caminho tomado
e no inflamveis, p. ex. CO2; Pc L Tanto gases como lquidos
- possibilidade de extrao seletiva por classe
de compostos;
S 1 podem ser usados como fluido
- custo e despesa operacional; G
No existe distino de fases
- no permanncia solvente residual nos 1 2
extratos obtidos.
Tc T
111 112

28
 Comparao entre algumas propriedades dos
P FSC
diferentes estados da matria
Lquido GS FSC LQUIDO
Densidade 0,6 2 10-3 0,2 1,5 0,6 2
(g cm-3)
Difuso 1 4 10-1 10-3 10-4 0,2 2 10-5
(cm2 s-1)
Viscosidade 1 3 10-4 1 3 10-4 0,2 3 10-2
(g cm-1 s-1)

Relaes Importantes
Gs
-D
T - Transferncia massa
113
h 114

Propriedades de alguns FSC mais comumente empregados

Fluido Tc Pc rc r400 Sistemas
( C)
CO2 - o mais usado!

(atm) (g mL-1) (g mL-1)

CO2 31,3 72,9 0,47 0,96 Comerciais

N2O 36,5 71,7 0,45 0,94

NH3 132 112,5 0,24 0,40
n-C5 196,6 33,3 0,23 0,62
MeOH 240,5 78,9 0,27 0,50
Tm o poder de solvatar molculas orgnicas de alta MM (dCO2 ~ dPy)
Fcil recuperao dos analitos
Evita degradao trmica
Barato e atxico
115 116
Permite o uso de modificadores de polaridade

29
 Intrumentao
C Vantagens
cela de extrao J Rpido; alta razo de transferncia de massas entre
vlvula vlvula matriz e o fluido extrator
restritor
J Fcil ajuste da fora do solvente; pode ser ajustado
forno
pela presso e temperatura (permite otimizao de
tanque condies)
bomba
CO2 seringa J Fcil recuperao de analtos
J Alguns SF so baratos, inertes e no txico

SFE Esttico SFE Dinmico

117 118

Exemplos de aplicaes de SFE Extrao de HPA de Solos com SFE

Material Analito Fluido Tempo modo

Extrator Supelco modelo SFE 400
solo pesticidas CO2 20 off
sedimentos HPAs CO2/5% MeOH 120 off Fluido extrator: dixido de carbono (CO2)
poluio HPAs CO2 15 on Restritor: capilar de slica fundida (30 cm 50 m)
atmosfrica
alimentos gorduras CO2/MeOH 12 off
Amostra: 10 g solo contaminado com hidrocarbonetos
especiarias aromas & CO2 10 on
fragrncias polinucleares aromticos
tecidos animais resduos de CO2 9 off
drogas Extrao: 15 min a 100 C e 4000 psi (modo dinmico)
carvo PCBs & CO2 15 on
dioxinas Solvente de coleta: 4 mL de diclorometano
polmeros aditivos & CO2 15 on
monmeros

119 120

30
Extrao com Fluido Supercrtico (SFE) Extrao com Fluido Supercrtico (SFE)

121 122

Microextrao em Fase Slida (SPME)

123 124

31
 Suportes paras as fibras de SPME SPME - Detalhes
A principal limitao da SPME a pequena quantidade relativa de sorvente disponvel
na fibra, tipicamente na ordem de 0,5 L em 100 m de fibra. Assim, para um
volume de amostra aquosa de 10 mL, um analito com um valor de Kgua/fibra de
20.000 (bastante alto) ser extrado com uma recuperao de cerca de 50%.

Recobrimentos das fibras - Podem ser classificados em dois grupos:

Lquido polimrico puro: ex. polidimetilsiloxano (PDMS) e poliacrilato (PA)
Misto (lquido polimrico e partculas slidas): ex. Carboxen-PDMS; DVB-PDMS;
Carbowax-DVB e DVB-Carboxen-PDMS. Combina Partio + Adsoro

Fibras Aplicaes
PDMS 100 m Volteis
30 m Apolares semi-volteis
7 m Apolares de alto PM
PA Polares semi-volteis
PDMS-DVB Volteis, aminas, nitroaromticos
Carbowax-DVB Compostos polares
Carboxen-PDMS Gases e compostos de baixo PM
125 DVB-Carboxen-PDMS Volteis e semi-volteis aromas e odores 126

Diferentes formas de coleta com SPME

SPME - Respostas de diferentes HPAs em funo do tempo de extrao

Na soluo No headspace

127 128

32
Microextrao em Fase Slida (SPME) MICROEXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
consiste de um amostrador (uma espcie de seringa) com uma
fibra de slica fundida revestida com um filme fino de um
polmero ou de um adsorvente slido

129 130

SPME Princpios Bsicos SPME Princpios Bsicos

No equilbrio, o nmero de moles do

A SPME um processo de analito absorvido pela fibra est
frasco equilbrio (partio) entre fases:
frasco linearmente relacionado com a
aquosa (amostra), polimrica concentrao inicial do analito presente
amostra (fibra) e gasosa amostra na amostra, permitindo assim, a anlise
quantitativa
Durante a extrao em um
filme sistema trifsico, os analitos
filme K fmV f Vm Co
n=
polimrico migram entre as trs fases at polimrico K fmV f + K hmVh + V m
que o equilbrio de partio seja
K fm; K hm: constante de distribuio
atingido fibra/matriz e headspace/matriz
respectivamente.
V f; V m; V h: volumes da fibra, matriz e
headspace respectivamente.
131
Co: Concentrao inicial do analito na matriz. 132

33
SPME Otimizao dos parmetros de extrao SPME - Fibras e fases comercialmente disponveis

tipo de recobrimento (fase extratora) Fibras no polares

poli(dimetil siloxano) (PDMS): 7; 30 e 100 m
modo de extrao: direto ou headspace
Fibras polares
pH da amostra (de acordo com pKa do analito)
85 m poli(acrilato)
tempo de extrao 65 m Carbowax-divinilbenzeno (CW-DVB)
temperatura de extrao 50 m Carbowax-resina moldada (HPLC)

fora inica Fibras bi-polares

65 m PDMS-DVB
velocidade de agitao
75 m Carboxen-PDMS
tempo e temperatura de dessoro
60 m PDMS-DVB

133 134

SPME Modos de extrao SPME Modos de extrao

Extrao Direta fase vapor

Extrao em Fase Vapor
agitao constante e homognea amostra

diminui o tempo requerido atingir o

filme
equilbrio polimrico
filme
Facilita a transferncia de massa
polimrico
amostra
[ A] f
KD =
[ A]s
135 136

34
 Extrao em Fase Vapor Consideraes gerais SPME Dessoro GC
Analitos devem ser volteis Dessoro trmica - diretamente no injetor do GC
Auxilia a conservar o filme contra a adsoro irreversvel de
compostos no volteis presentes na matriz
Permite modificar a matriz sem prejudicar a fibra
Volteis so preferencialmente extrados da fase vapor

n
B
A volatilidade de cada
componente afeta o tempo de A C
extrao
D

0 20 40 60 80 100 t (s)
Volatilidade
A > B > C >> D 137 138

SPME Dessoro LC C Vantagens D Desvantagens

Off-line On-line (interface) J No necessita instrumentao L Alto custo das fibras
sofisticada extratoras

J Permite anlises quantitativas L Interferentes (plasma)

J Reduzidissmo consumo de
solventes

J Dessoro trmica para GC

J Fibras podem ser reutilizadas

(10-100 vezes)

139 140

35
SPME Aplicaes SPME Aplicaes:
Anlises de cannabinoids em cabelo usando SPME/GC-MS
Amostra: 50 mg cabelo descontaminado
(ter de petrleo)
Preparo da amostra: hidrlise com
NaOH (90 C, 10 min), neutralizado
com HCl, tampo fosfato pH = 7,5
Padro interno: 50 ng THC-d3
Extrao: direta, 200 L amostra,
t = 15 min
Fibra: PDMS (30 m)
Injetor: 260 C - 2 min
Detector: GC-MS
Limite de deteco: 0,1 ng/mg de cannabinol e
141 tetrahidrocannabinol, 0,2 ng/mg de cannabidiol 142

Aplicao: Anlise de antidepressivos tricclicos (ADT) por SPME/HPLC-UV

SPME Aplicaes: Anlise de explosivos por SPME/HPLC-UV

ADT
3 mL de tampo
1 mL de plasma
carbonato de sdio 0,05 mol L-1
pH = 10

6 40 min 1200
143 65 C 144
RPM
Temperatura Agitao

36
Alicao: Anlise de antidepressivos tricclicos (ADT) por SPME/HPLC-UV

amostra

IMI

AMI
filme
polimrico

NOR
DES
fase vapor

filme
polimrico
amostra

145 146

Extrao Sortiva com Barras de Agitao (SBSE)

Extrao Sortiva com Barra de Agitao
Breve histrico:
(Stir Bar Sorptive Extraction - SBSE)
6 Fim 1990s SBSE desenvolvida pelo grupo do Prof. Dr. Pat
Sandra (Blgica)

6 1999 Primeira publicao E. Baltussen, P. Sandra, F.

David, e C. Cramers, J. Microcolumn Sep., 11, 737 (1999).

6 Comercializado pela Gerstel-Agilent(antiga HP) - Twister

147 148

37
SBSE Princpio de funcionamento
SBSE Comparao com a SPME
Soro na fase extratora de recobrimento
Similar SPME (Microextrao em Fase Slida) SPME PDMS (fibra mais utilizada)
Tcnica no exaustiva Volume fase extratora: 0,5 mL
Fase extratora (SBSE): 25 - 250 mL
Baseada em equilbrio
de partio (para Sensibilidade analtica 50 a 250 maior
filmes lquidos de
recobrimento PDMS)

SBSE X SPME

149 150

SBSE Comparao com a SPME SBSE Barra de agitao

151 152

38
 SBSE Barra de agitao
SBSE - Equipamento

153 154

SBSE Twister SBSE Otimizao dos parmetros de extrao

tipo de recobrimento (fase extratora) Condicionar: 4 h a

300C, solvente orgnico
pH da amostra (de acordo com pKa
do analito) Aps extrao lavar
tempo de extrao barra PDMS com gua e
enxugar eliminao de
temperatura de extrao material no voltil
fora inica dessoro trmica

velocidade de agitao
tempo e temperatura de dessoro
dimenses da barra
155 156

39
SBSE Dessoro Solvente HPLC/HRGC C Vantagens D Desvantagens
Trmica - HRGC J Limites de deteco at L Dificuldade para
1000 vezes inferiores a SPME automao total

J Quantitativa, com largo L Eficincia altamente

intervalo de linearidade afetada pela presena de
interferentes (protenas do
J Reduzidissmo consumo de plasma, por exemplo)
solventes
J Dessoro trmica L Reduzida variedade de
automatizada para HRGC barras comercializadas
Temperatura: 150
150C a 300
300C
Tempo: 5-
5-15 min (depende do tipo de instrumento)
Solvente orgnico ou fase mvel L Alto custo
Vazo gs de arraste (He): Otimizar temperatura e tempo J Barras reutilizadas: 30
10--50 mL/min
10 de dessoro
vezes
157 158

SBSE Exemplo de aplicaes SBSE Exemplo de aplicaes

Cromatograma referente anlise
SBSE/HPLC da amostra de plasma
enriquecida com os antidepressivos
RAM/SBSE
na concentrao de 500 ng mL-1.
1: moclobemida
2: mirtazapina
3: citalopram Precipitao de
protenas
4: paroxetina
5: nortriptilina
6: imipramina
7: fluoxetina
8: sertralina e
9: padro interno
159 160

40
SBSE Exemplo de aplicaes SBSE Exemplo de aplicaes

161 162

SBSE Exemplo de aplicaes Microextrao Lquido-Lquido Dispersiva (DLLME)

163 164
Anal. Bioanal. Chem. (2002) 73:46-55

41
 Microextrao Lquido-Lquido Dispersiva (DLLME)
Headspace (Esttico e Dinmico)
O princpio bsico da tcnica DLLME desenvolvida em 2006 por Rezaee et al. Dynamic Headspace (DHS) can be used for a wide range of environmental applications. Pollutants
a disperso de um solvente extrator (imiscvel com gua) e um solvente can be detected in drinking water, river water, and waste water. These matrixes include chemicals
dispersor (miscvel em gua e no solvente extrator) em uma soluo aquosa o of different polarity, volatility, such as chlorinated hidrocarbons, aromatics, oxygenates, etc.
Dynamic Headspace also can be used for further applications:
que proporciona uma grande rea de contato entre a fase aquosa e o solvente - characterization of spices, herbs, foods, soaps
extrator. Uma mistura dos solventes dispersor e extrator injetada rapidamente - residual monomer and other VOC in polymers
na soluo aquosa. Aps leve agitao, uma soluo turva com microgotas - residual solvents in food packaging
formada contendo o solvente extrator com os analitos. Aps centrifugao ocorre - "green label" product testing
- OVIs in pharmaceutical products
a sedimentao da microgota que retirada com o auxlio de uma seringa. - trace impurities in active pharmaceuticals ingredients
Aplicao: extrao de compostos orgnicos como plastificantes, frmacos, - metabolites in biological fluids (aromatic hydrocarbons in urine, benzene in blood)
pesticidas e compostos inorgnicos.
A extrao DLLME influenciada pelo volume e tipo de solvente extrator e HS Esttico
HS Dinmico
solvente dispersor, tempo de extrao, fora inica e pH.
O solvente extrator deve ser selecionado dentre os que apresentarem maior
densidade que a gua, capacidade de extrao dos compostos e bom
comportamento cromatogrfico. Os mais utilizados so os clorados (ex.:
clorobenzeno, tetracloreto de carbono e tetracloroetileno). So utilizados, em
geral, entre 15 e 100 L.
Solvente dispersor: a principal caracterstica a ser considerada a
miscibilidade na fase orgnica (solvente extrator) e na fase aquosa. Mais
utilizados: metanol, acetonitrila, acetona e tetrahidrofurano (THF). Os volumes
variam entre 500 e 2000 L. 165 166

Headspace Dinmico (DHS)

Sistema Purge&Trap

The DHS station provides sample thermostating and agitation combined with purging of the sample
headspace with a controlled flow of inert gas. Extracted compounds are trapped and concentrated
on a replaceable adsorbent-filled trap, which is subsequently thermally desorbed in the GC.
Samples are stored in vials at ambient temperature or at controlled temperatures (4 to 200 C).
During extraction, samples can be agitated to enhance and speed up the extraction process. The
temperature of the adsorbent tube during the DHS process can be independently controlled from
20 to 70 C for optimal trapping of the analytes of interest.
The adsorbent tube can be dry purged for water removal to ensure the best possible
chromatography and MS stability. 167 168

42
 Adsorventes

Trap
Unidade de dessoro trmica

169 170

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)

Comparison of gas phase extraction techniques
Lab. de Anlises de Resduos de Pesticidas (LARP)
Analysis of coffee powder using DHS, HS-SPME and Static Headspace Prof. Dr. Renato Zanella e Profa. Dra. Martha B. Adaime
100 mg samples of a ground coffee were analyzed using static headspace, headspace-SPME and DHS.
Comparable extraction conditions were chosen:

It can be seen from the sample chromatograms and the bar graph showing relative peak areas
(DHS response normalized to 100%), that DHS provided the highest response.
For most analytes, DHS provided RSD < 5%.

LARP

renatozanella@pq.cnpq.br
171 http://www.ufsm.br/larp 172

43
http://www.ufsm.br/ppgq

Conceito 7 CAPES

173

44