El mtodo Hanahan para la preparacin y

transformacin de E.
coli competente :Transformacin de alta
eficiencia
1. Joseph Sambrook y
2. David W. Russell
Este protocolo fue adaptado de Molecular Cloning, 3ra edicin, por Joseph Sambrook y David W. Russell. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., 2001

Siguiente seccin
INTRODUCCIN
Este procedimiento genera cultivos competentes de E. coli que pueden transformarse a altas frecuencias (5 x
10 8 colonias transformadas / g de ADN plsmido superhelicoidal). IMPORTANTE Todos los pasos en este
protocolo deben llevarse a cabo de forma asptica.
Seccin anteriorSiguiente seccin
MATERIALES
Cepa de E. coli a transformar (material congelado)
La cepa debe almacenarse a -70 C en medio de congelacin.
DMSO
Solucin DnD
Plsmido de ADN (plsmido recombinante)
Construct usando uno de los mtodos descritos en direccional clonacin en vectores plasmdicos , Colocacin de
adaptadores para que resalta Termini , Blunt de composicin Clonacin en vectores plasmdicos , desfosforilacin
de ADN de plsmido , adicin de enlazadores sintticos de ADN para extremos romos y ligadura de plsmido y
Target ADN en Low Agarosa de temperatura de fusin .
Placas de agar SOB que contienen 20 mM de MgSO 4 y el antibitico apropiado
Medio SOB que contiene MgSO 4 20 mM
Medio SOC
Se necesita aproximadamente 1 ml de este medio para cada reaccin de transformacin.
Buffers de transformacin (consulte el Paso 1)
Seccin anteriorSiguiente seccin
MTODO
1. Prepare el buffer de transformacin.
El buffer de transformacin estndar (TFB) se utiliza para preparar clulas competentes para su
uso inmediato. El buffer de almacenamiento congelado (FSB) se utiliza para preparar stocks de
clulas competentes que se almacenan a -70 C.
Para preparar el buffer de transformacin estndar
i. Prepare 1 M MES disolviendo 19.52 g de MES en 80 ml de H 2 O puro (Milli-Q, o
equivalente). Ajuste el pH de la solucin a 6.3 con 5 M KOH, y agregue
H 2 O puro para llevar el volumen final a 100 ml. Esterilice la solucin por filtracin
a travs de un filtro desechable de Nalgene prerregistrado (tamao de poro de 0,45
m). Divida en alcuotas de 10 ml y almacene a -20 C.
ii. Prepare TFB disolviendo todos los solutos enumerados a continuacin en aprox. 500
ml de H 2 y O a continuacin, aadir 10 ml de tampn 1 M MES (pH 6,3). Ajuste el
volumen del TFB a 1 litro con H 2 O puro .

Cantidad Concentracin
Reactivo por litro final
 1 M MES (pH 6.3) 10 ml 10 mM

MnCL 2 4H 2 O 8.91 g 45 mM

CaC 2 2H 2 O 1,47 g 10 mM

KCl 7,46 g 100 mM

Cloruro de

Hexamminecobalt 0.80 g 3 mM

H2O a 1 litro
iii. Esterilice el TFB por filtracin a travs de un filtro desechable de Nalgene
prerregistrado (tamao de poro de 0,45 m). Divida la solucin en alcuotas de 40
ml en matraces de cultivo tisular (p. Ej., Corning o equivalente) y gurdelos a 4 C.
Para preparar el buffer de almacenamiento congelado
iv. Preparar acetato de potasio 1 M disolviendo 9,82 g de acetato de potasio en 90 ml
de H 2 O puro (Milli-Q o equivalente). Ajuste el pH de la solucin a 7.5 con cido
actico 2 M, agregue H 2 O puro para llevar el volumen final a 100 ml. Divida la
solucin en alcuotas y almacene a -20 C.
v. Prepare FSB disolviendo todos los solutos enumerados a continuacin en aprox. 500
ml de H 2 O puro . Despus de disolver los componentes, ajuste el pH de la solucin a
6.4 con 0.1 N HCl. Un pH demasiado alto no se puede ajustar agregando base; en su
lugar, deseche la solucin y comience nuevamente. Ajuste el volumen de la solucin
final a 1 litro con H 2 O puro .

Cantidad Concentracin

Reactivo por litro final

Acetato de potasio 1

M (pH 7,5) 10 ml 10 mM

MnCL 2 4H 2 O 8.91 g 45 mM

CaCl 2 2H 2 O 1,47 g 10 mM

KCl 7,46 g 10 mM

Cloruro de

Hexamminecobalt 0.80 g 100 mM

Glicerol 100 ml 10% (v / v)

H2O a 1 litro
vi. Esterilice la solucin por filtracin a travs de un filtro desechable de Nalgene
prerregistrado (tamao de poro de 0,45 m). Dispense la solucin en alcuotas de
40 ml y almacene las alcuotas en matraces de cultivo tisular (p. Ej., Corning, o
equivalente) a 4 C. Durante el almacenamiento, el pH de la solucin desciende hasta
un valor final de 6.1-6.2 pero luego se estabiliza.
 2. Use un asa de inoculacin para rastrear E. coli de la cepa deseada directamente desde un
material congelado sobre la superficie de una placa de agar SOB. Incubar la placa durante 16
horas a 37 C.
3. Transferencia de cuatro o cinco colonias bien aisladas en 1 ml de SOB que contiene 20 mM
MgSO 4 . Disperse las bacterias agitando en vrtex a velocidad moderada, y luego diluya el cultivo
en 30-100 ml de SOB que contiene MgSO 4 20 mM en un matraz de 1 litro.
4. Cultivar las clulas durante 2.5-3.0 horas a 37 C, controlando el crecimiento del cultivo.
5. Transfiera las clulas a tubos de polipropileno estriles, desechables y helados de 50 ml. Enfre
los cultivos a 0 C guardando los tubos en hielo durante 10 minutos.
6. Recupere las clulas por centrifugacin a 2700 g (4100 rpm en un rotor Sorvall GSA) durante
10 minutos a 4 C.
7. Decantar el medio de los grnulos de clulas. Coloque los tubos en una posicin invertida en
el banco durante 1 minuto para permitir que las ltimas trazas de medio se drenen.
8. Resuspenda los grnulos haciendo girar o agitando suavemente en vrtex aprox. 20 ml (por
tubo de 50 ml) de tampn de transformacin TFB o FSB helado. Almacene las clulas
resuspendidas en hielo durante 10 minutos.
9. Recupere las clulas por centrifugacin a 2700 g (4100 rpm en un rotor Sorvall GSA) durante
10 minutos a 4 C.
10. Decantar el buffer de los grnulos celulares. Coloque los tubos en una posicin invertida en
el banco durante 1 minuto para permitir que los ltimos restos de la solucin amortiguadora se
drenen.
11. Resuspenda los grnulos mediante agitacin o agitacin suave con vrtex en 4 ml (por tubo
de 50 ml) de TFB o FSB enfriados con hielo. Proceda con el paso 12a si las clulas competentes
se van a utilizar inmediatamente o con el paso 12b si las clulas competentes se almacenan a -
70 C y se utilizan en una fecha posterior.
12. Prepara clulas competentes para la transformacin.
Para preparar nuevas clulas competentes
i. Agregue 140 l de solucin de DnD en el centro de cada suspensin
celular. Inmediatamente mezcle girando suavemente, y luego almacene la
suspensin en hielo durante 15 minutos.
ii. Agregue 140 ul adicionales de solucin DnD a cada suspensin. Mezcle agitando
suavemente, y luego almacene la suspensin en hielo por otros 15 minutos.
iii. Distribuya alcuotas de las suspensiones en tubos estriles de polipropileno de 17 x
100 mm. Almacene los tubos en hielo.
Para preparar stocks congelados de clulas competentes
iv. Aada 140 l de DMSO por cada 4 ml de clulas resuspendidas. Mezcle suavemente
girando y guarde la suspensin en hielo durante 15 minutos.
v. Agregue 140 ul adicionales de DMSO a cada suspensin. Mezcle suavemente dando
vueltas, y luego devuelva las suspensiones a un bao de hielo.
vi. Trabajando rpidamente, dispensar alcuotas de las suspensiones en tubos de
microcentrfuga estriles refrigerados o viales de cultivo de tejidos. Inmediatamente
congele instantneamente las clulas competentes sumergiendo los tubos
hermticamente cerrados en un bao de nitrgeno lquido. Almacene los tubos a -
70 C hasta que sea necesario.
vii. Cuando sea necesario, retire un tubo de clulas competentes del congelador a -70
C. Descongele las clulas sosteniendo el tubo en la palma de la mano. Al igual que las
clulas se descongelan, transfiera el tubo a un bao de hielo. Almacene las clulas en
hielo durante 10 minutos.
viii. Utilice una punta de pipeta estril refrigerada para transferir las clulas
competentes a tubos de polipropileno refrigerados, estriles de 17 x 100
mm. Almacene las celdas en hielo.
12. Incluye todos los controles positivos y negativos apropiados.
13. Agregue el ADN transformante (hasta 25 ng por 50 l de clulas competentes) en un volumen
que no exceda el 5% del de las clulas competentes. Agite los tubos suavemente varias veces
para mezclar sus contenidos. Instale al menos dos tubos de control para cada experimento de
transformacin, incluido un tubo de bacterias competentes que reciba una cantidad conocida de
 una preparacin estndar de ADN plsmido superhelicoidal y un tubo de clulas que no reciba
ADN plasmdico en absoluto. Guarde los tubos en hielo durante 30 minutos.
14. Transfiera los tubos a un estante colocado en un bao de agua de circulacin precalentado a
42 C. Almacene los tubos en el estante durante exactamente 90 segundos. No sacuda los tubos.
15. Rpidamente transfiera los tubos a un bao de hielo. Permita que las clulas se enfren
durante 1-2 minutos.
16. Agregue 800 l de medio SOC a cada tubo. Caliente los cultivos a 37 C en un bao de agua, y
luego transfiera los tubos a una incubadora con agitacin ajustada a 37 C. Incubar los cultivos
durante 45 minutos para permitir que las bacterias se recuperen y para que expresen el
marcador de resistencia a antibiticos codificado por el plsmido.
17. Transferir el volumen apropiado (hasta 200 l por placa de 90 mm) de las clulas competentes
transformadas en un medio de agar SOB que contiene 20 mM MgSO 4 y el antibitico apropiado.
18. Guarde las placas a temperatura ambiente hasta que el lquido haya sido absorbido.
19. Invierta las placas e incbelas a 37 C. Las colonias transformadas deben aparecer en 12-16
horas.
Seccin previa

REFERENCIAS

1. Hanahan D. ,
2. Jessee J. ,
3. Bloom F.R.
( 1991 ) Transformacin de plsmidos de E. coli y otras bacterias. Mtodos Enzymol. 204 , 63 - 113 .

MedlineGoogle Scholar
2.
1. Hanahan D.
( 1983 ) Estudios sobre la transformacin de Escherichia coli con plsmidos . J.
Mol. Biol. 166 , 557 - 580 .

MedlineGoogle Scholar