UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CCQQ Y FARMACIA

ESCUELA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
DEPTO. DE FARMACOLOGÍA, FISIOLOGÍA Y LIPRONAT
CURSO ANATOMÍA Y FISIOPATOLOGÍA II
LICDA. IRMA LUCIA ARRIAGA

ANTICUERPOS MONOCLONALES
REVISIÓN BIBLIOGRAFICA

ANA ESCOBAR 200212174

PEDRO BARRIOS 200300000

LABORATORIO VIERNES

22 DE SEPTIEMBRE DE 2009
 ANTICUERPOS MONOCLONALES
Fall
2 08
INTRODUCCIÓN
Los anticuerpos monoclonales son una herramienta de gran
utilidad en el campo de la medicina, la bioquímica y la biología
molecular por su capacidad de reconocer moléculas con diferente
estructura química. Son empleados habitualmente tanto en el
diagnóstico como en el tratamiento de enfermedades.

El descubrimiento de los anticuerpos tuvo muchas mas

repercusiones que las que sus descubridores pudieron imaginar. Estas
repercusiones surgieron cuando se planeó la pregunta de por qué un
anticuerpo reconoce y neutraliza al microbio invasor pero no afecta al
paciente: en otras palabras, el origen de la especificidad de los
anticuerpos. Pasaron muchos años para que la respuesta se
conociera, y despertó la curiosidad de muchos científicos, puesto que
un animal inmunizado no sólo es capaz de producir anticuerpos
específicos sino que esos anticuerpos mejoran a medida que el
proceso de inmunización progresa. Mejoran porque la afinidad y
especificidad de los anticuerpos va aumentando mientras subsiste el
antígeno circulante, conocida comúnmente como maduración de la
respuesta inmune.(1)

El método actual, para producir anticuerpos monoclonales de

máxima pureza, fue ideado por en científico argentino César Milstein
junto a Georges Kohler en 1975. Debido a sus investigaciones, en
1984 recibieron el premio Nobel de Medicina y Farmacología.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en cultivos

celulares o en animales. Cuando las células de un hibridoma son
inyectadas en cultivos de tejidos como el peritoneo (cavidad
peritoneal), produce tumores que sintetizan un fluido rico en
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anticuerpos llamado líquido ascítico.

La tecnología necesaria para la producción de anticuerpos en

ausencia de inmunización del animal, es la denominada tecnología de
los anticuerpos recombinantes. Los avances en la tecnología génica
han facilitado en gran medida la manipulación genética, producción,
identificación y conjugación de fragmentos de anticuerpos
recombinantes, obteniéndose nuevos anticuerpos multivalentes y
multiespecíficos.

Estas tecnologías han permitido el desarrollo de la investigación

biomédica, como la identificación y clonación de genes, la
identificación y aislamiento de proteínas, la activación de enzimas,
conocimiento de la estructura molecular y morfogénesis. Además, es
una nueva técnica de diagnóstico, utilizándose en la monitorización de
drogas, detección de enfermedades infecciosas en microbiología,
detección de alergenos, siendo los anticuerpos monoclonales las
sustancias de diagnóstico mas utilizadas en los laboratorios de
diagnóstico de países industrializados.

Pero uno de sus usos mas importantes es en el campo de la

terapéutica, ya que son capaces de erradicar ciertas infecciones y
destruir células, incluidas las tumorales, mediante distintos
mecanismos. Por esta razón, son excelentes sustancias para el
tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes,
el cáncer o en trasplantes para evitar el rechazo.
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ANTICUERPOS MONOCLONALES
En 1975 George Kolher y César Milstein, que estaban trabajando en el
Laboratorio de Biología Molecular en Cambridge, descubrieron una técnica para producir
cantidades sin fin de anticuerpos con una especificidad definida y predecible. Esta técnica
ha revolucionado el estudio y la práctica de la inmunología y además ha proporcionado
herramientas de inmenso valor en muchas áreas de la Biología y de la Medicina. Es
preciso saber que los anticuerpos monoclonales no se diferencian estructuralmente de los
otros anticuerpos que se encuentran bajo condiciones naturales. La propiedad que los
hace únicos es que todas las moléculas de una preparación cualquiera son idénticas. Su
reacción con un antígeno definido, debe ser exactamente la misma todas las veces. Es
precisamente esta constancia en su preparación y en su efecto, lo que los hace tan útiles.

EL SISTEMA INMUNITARIO
Todos los animales superiores poseen la capacidad de reconocer moléculas
foráneas y potencialmente dañinas que entren en sus cuerpos. Realizan esfuerzos
encaminados a aislar o a expulsar tales moléculas foráneas. El sistema es el principal
mecanismo de defensa contra sustancias que han logrado penetrar. Una sustancia que es
capaz de provocar una tal reacción del sistema inmunitario, se dice que es un antígeno.
La reacción del cuerpo, es fabricar anticuerpos, que al reconocer a un antígeno, se une a
él mediante una serie de enlaces químicos, formando diferentes efectos por esta
interacción. (Ver anexos: tabla 1)

Los anticuerpos se hallan en la fracción globulínica de las proteínas que circulan

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en la sangre y se denominan inmunoglobulinas. Están divididas en cinco clases

principales sobre la base de sus características físicas, como el peso molecular, y se hace
referencia a ellas mediante una letra asociada a cada una de las clases, por ejemplo, IgG,
IgA, IgM, IgD. (Ver anexos: tabla 2) Además de producir anticuerpos, el sistema
inmunitario puede también responder a través de sus componentes celulares. Esta
inmunidad celular es en gran parte responsable del rechazo en los transplantes de
órganos, de las respuestas alérgicas retardadas y de la reacciones injerto-versus-
hospedador. (2)
INTERACCIÓN ANTICUERPO-ANTÍGENO
Muchas moléculas son capaces de dar origen a una respuesta inmunitaria. Es esta
forma la que da lugar a la especificidad de una reacción antígeno-anticuerpo. La
moléculas de mayor tamaño y más complejas pueden tener varias regiones diferentes,
cada una de las cuales es capaz de acomodar un anticuerpo. Tales regiones se conocen
con el nombre de determinantes antigénicos o epítopos. Una molécula antigénica puede
contener varios epítopos. Por el contrario los antígenos más pequeños pueden poseer
solamente un epítopo. La base de la interacción anticuerpo-antígeno es el acoplamiento
mutuo de dos moléuculas de forma complementaria. La forma del anticuerpo está
determinada por la estructura tridimensional de la molécula.. Todas las moléculas de
inmunoglobulina tienen una estructura básica que consta de dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras que se mantienen unidas entre sí mediante enlaces disulfuro.

Los anticuerpos tienen áreas en las cadenas pesadas y ligeras, que se conocen
como regiones variables, en las que la secuencia de aminoácidos de la cadena de proteína
varía de un anticuerpo a otro. Esta variación tiene lugar en el extremo-N de las cadenas
del péptido. Cada anticuerpo diferente tendrá, por tanto, una secuencia de aminoácidos
diferente y una ordenación espacial diferente. De acuerdo a la forma del antígeno, éste
puede ser acomodado por algún anticuerpo producido por el sistema inmunitario. (Ver
anexos: diagrama 3)

Los mecanismos mediante los cuales se genera tan diversa serie de proteínas a
partir de una cantidad limitada de información codificada en el ADN de un individuo,
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han sido muy estudiados durante los últimos años. Los genes que codifican las diferentes
cadenas están localizados en sitios diferentes del genoma. Además, dentro de cada
cadena existen dominios con regiones constantes y con regiones variables que se unen
entre sí a nivel genético durante la diferenciación de los linfocitos. Cada individuo posee
la capacidad de fabricar un antícuerpo que se combinará con cada uno de los antígenos
posibles.(2)

CÓMO SE FABRICA UN ANTICUERPO MONOCLONAL

EL ANTÍGENO

Pueden hacerse anticuerpos monoclonales contra cualquier sustancia que sea

reconocida como antígeno por las células del sistema inmunitario de un animal. Cuando
una sustancia o mezcla de sustancias se inyecta a un animal, se fabrica una serie de
anticuerpos que reconocen a ciertos componentes del antígeno. Estos componentes se
denominan determinantes antigénicos o epítopos. Los anticuerpos policlonales
producidos son una serie compleja de inmunoglobulinas que reconocen toda una gama de
epítopos diferentes. El primer paso para producir un anticuerpo monoclonal contra un
antígeno definido es hacer una preparación adecuada del antígeno que se va a usar para in
inmunización. En algunos casos será posible hacer una preparación completamente pura,
utilizando una técnica química. Un ejemplo será el desarrollo de un anticuerpo
monoclonal para valorar una droga tal como la digoxina. Esta es una droga que se usa
generalmente para tratar a pacientes con una enfermedad del corazón, Se puede utilizar
digoxina pura para inmunizar a los animales y, por tanto, se producen anticuerpos
antidigoxina.

En muchos casos sin embargo, no se puede utilizar una sustancia pura sino una
mezcla parcialmente purificada. Este era el caso en la preparación de anticuerpos
monoclonales contra el interferón, después de su purificación parcial. Una mezcla de
sustancias que contenían interferón se utilizaba para inmunizar animales y los anticuerpos
monoclonales correctos se seleccionaban por análisis después de un clonación. En
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algunos casos la situación es aún más compleja. Al intentar hacer anticuerpos

monoclonales frente a moléculas que únicamente están presentes en la superficie de
células cancerosas, se utilizan como inmunógenos células enteras del tumor
preparaciones de la superficie de tales células. Estas contienen una gama de moléculas
que también están presentes en las células normales. La finalidad de preparar anticuerpos
monoclonales es producir un reactivo que pueda distinguir aquellas moléculas que están
presentes únicamente sobre la célula cancerosa y no en la células normales y utilizar tales
anticuerpos para ayudar al tratamiento de pacientes con cáncer.
INMUNIZACIÓN
Los animales son inmunizados al serles inyectado el antígeno subcutáneamente o
bien en la cavidad peritoneal que rodea al intestino. Al mismo tiempo puede estimularse
el sistema inmunitario del animal inyectándole una mezcla de estimulantes
inmunológicos potentes. Los más comúnmente utilizado es el adyuvante de Freund. Esta
mezcla de organismos de la tuberculosis muertos, en una sustancia grasa, tiene el efecto
de estimular el sistema inmunitario haciendo que reconozca ávidamente cualquier
antígeno inyectado con la mezcla. Normalmente los animales son inyectados en varias
ocasiones, generalmente con intervalos de una semana, para asegurar una buena
estimulación inmunológica. Con una semana, para asegurar una buena estimulación
inmunológica. Con cada inmunización sucesiva se logra una mayor estimulación de los
clones de linfocitos B que hay dentro del animal y que responden al antígeno. El lote
final de antígeno se administra intravenosamente, en general tres días antes de recoger las
células del bazo, con el fin de asegurar que los clones de células B de interés, están
estimulados al máximo. Las células que mejor crecen después de la fusión son aquellas
que se dividen rápidamente. Se ha demostrado que el tiempote tasa máxima de
crecimiento de la células inmunitarias estimuladas es de 3 días después de la
inmunización. La razón por la que se administra la inyección intravenosa es dar una
elevada dosis de antígeno. De esta manera un gran número de células se estimulan
simultáneamente.

FUSIÓN
Después de matar al animal se le abre el abdomen, se extrae el bazo y se coloca en
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un fluido para el cultivo de tejidos. A partir de este momento, todo debe hacerse en
condiciones estériles para evitar que las placas de cultivo se contaminen con bacterias y
hongos que causen una infección. Para evitar esto, el fluido en el que se han puesto las
células contiene antibióticos, habitualmente penicilina y estreptomicina, para impedir el
crecimiento bacteriano. Los bazos se desmenuzan para que liberen los linfocitos que hay
en su interior. Los agregados de membranas se eliminan dejando que se sedimente la
suspensión de células de bazo y los restos de la superficie del bazo, quedando así en el
fluido una preparación de células aisladas.
El bazo contiene no sólo linfocitos sino también abundantes glóbulos rojos
sanguíneos. Estos pueden ser eliminados por centrifugaciones un fluido denso, Ficoll. El
Ficoll se coloca en un tubo de centrífuga y con cuidado, utilizando un pipeta Pasteur, se
depositan en la superficie de las células de bazo. Se centrifuga durante 20 minutos a poca
velocidad. La masa de glóbulos rojos se sumerge, y va al fondo junto con las células
muertas. Los linfocitos permanecen en la parte superior de Ficoll, formando una banda de
color blanco pálido. (Ver anexos: diagrama 4)

El fluido en el que fueron suspendidas la células del bazo queda situado por
encima de los linfocitos. Los linfocitos pueden recogerse utilizando un pipeta Pasteur y
se lavan por centrifugación. Estas células se mezclan ahora con un mieloma recién
preparado y dispuesto para la fusión. Como todas las células malignas, las células de
mieloma tienen una capacidad de replicación infinita. Existen varios tipos de líneas de
mieloma disponibles para la fusión, que han sido obtenidas a partir de ratones, de ratas o
de personas. Una característica vital de estas líneas de mieloma es un mecanismo
inherente de destrucción, de forma que las células de mieloma que no se han fusionado
pueden ser fácilmente destruidas después del proceso de fusión. Un número de células de
mieloma se mezcla con un número aproximadamente igual de linfocitos del bazo
procedentes del animal inmunizado, en presencia de polietilenglicol. Originalmente, en
este paso se utilizaba un virus, el llamado virus Sendai, pero resulta complicado
mantenerlo en el laboratorio y ha sido casi totalmente sustituido por el
polietilenglicol(PEG). El PEG es similar a las sustancias usadas en las soluciones
anticongelantes que se utilizan para los radiadores de los autos. Destruye las fuerzas de
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tensión superficial que normalmente hacen que las células se repelan entre sí cuando
están mezcladas en un tubo de ensayo. En presencia de PEG, las células pueden
mezclarse íntimamente. Sus membranas se fusionan, permitiendo que el núcleo de una
célula penetre en el citoplasma de su vecina.

Además se utiliza dimetilsulfóxido (DMSO), en la mezcla de fusión, junto con el

PEG, esto sirve para aumentar la proximidad del contacto entre las células durante la
fusión e incrementa las probabilidades de éxito. Ambas sustancias son muy venenosas
por lo que es crítico el tiempo de exposición de la células a estas sustancias. Durante el
tiempo do contacto la proximidad de las células aumenta, aglomerándolas suavemente
por centrifugación durante 5 minutos. La mezcla consta de células de mieloma que no se
han fusionado, linfocitos que no se han fusionado e hidromas que son las células híbridas
de linfocito y mieloma.

CLONACIÓN
Si todas las células de hibridoma que existen después de la fusión creciesen
juntas, se liberaría una mezcla de anticuerpos similar a la que se encuentra en el suero del
animal. El punto clave de la producción de anticuerpos monoclonales está en aislar
células independientes y permitirles que se desarrollen formando un clon, en el que cada
célula es una réplica exacta de las otras. De esta manera sólo se excretará una clase de
moléculas de inmunoglobulina. La mayor dificultad en el proceso de producción de
anticuerpos monoclonales está en obtener células aisladas para clonarlas, es decir, en que
se conviertan en muchas células por replicación. Una vez que la célula ya se ha dividido
unas cuantas veces, le resulta más fácil continuar su crecimiento. El principal problema
está en tener las primeras células. Esto se puede obtener añadiendo moléculas, factores
de crecimiento, que las células requieren para dividirse.

Existen diferentes técnicas que se utilizan para clonar células. Una de ellas es la
dilución limitante. La suspensión de híbridos se diluye y se distribuye sobre una serie de
pocillos estériles, habitualmente en placas de plástico. La dilución se calcula de tal
manera que el volumen de fluido que se coloca en cada pocillo contenga, sólo una célula.
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Puede darse el caso que, en algunos pocillos no se reciba ninguna célula y por lo tanto, no
haya crecimiento; o que se reciban varias células y lo que se produzca sea anticuerpos
oligoclonales. Otro método de clonación puede ser, el crecimiento en un medio sólido
tal como gel de agarosa, suero, y con factores apropiados como aminoácidos y
antibióticos. (2)

Luego de tener los cultivos, será necesario probar y seleccionar cada un de los
sobrenadante, en busca de la actividad del anticuerpo. Esto se realiza antes de la
clonación, con el fin de asegurarse de que sólo se están usando los pocillos que
contienen híbridos que secretan los anticuerpos correctos. Para esto pueden realizarse
diferentes tipos de ensayos:

- Ensayos de fijación: que dependen de la capacidad del anticuerpo monoclonal par

a unirse a su antígeno. Por medio de radioinmunoensayo con yodo 125,
marcando un anticuerpo.
- Ensayo ELISA, utilizando sustancia inmunoabsorbentes unidas a una enzima
(fosfatasa alcalina), por medio de un espectrofotómetro, determinando la cantidad
de inmunoglobulina que hay en los sobrenadantes de los hibridomas, que se une al
antígeno de interés.

Por ejemplo, actualmente se fabrican y se seleccionan anticuerpos contra células

de cáncer. Con ello, se desarrollan laboriosas técnicas de búsqueda para poder seleccionar
aquellos linfocitos B que produzcan el anticuerpo de interés. (Ver anexos: diagrama 5)
(2)
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TECNOLOGÍAS EN DESARROLLO
En el sistema inmune de vertebrados las células productoras de
anticuerpos (linfocitos-B) presentan entre sus características la
capacidad de producir dichas moléculas de manera específica,
sintetizando cada linfocito-B activado un único y particular tipo de
anticuerpo. Los tumores derivados de los linfocitos-B (mieloma,
plasmocitoma) también producen anticuerpos pero de especificidad
impredictible. Dado que todas las células tumorales se originan a partir
de una única célula transformada, todas las descendientes producirán
exactamente el mismo tipo de anticuerpo, con lo que éste se
considerará monoclonal.

La imposibilidad de obtener cultivos de clones celulares de

linfocitos-B normales que produzcan los anticuerpos de especificidad
deseada ha llevado a buscar las técnicas artificiales que emulen una
situación similar. Con tal fin, se pueden llevar a cabo dos
procedimientos:
- la transformación in vitro de los linfocitos B (p.e. mutagénesis
mediada por medio de virus oncogénicos) y
- la fusión de las células productoras de anticuerpos con células
de mieloma las cuales confieren inmortalidad a las células B.
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Algunos de los híbridos (heterocariontes formados por

recombinación genética) combinarán la capacidad de los linfocitos de
producir los anticuerpos deseados con la capacidad de proliferar
indefinidamente in vitro de las células de mieloma. Las células
mielomatosas, además, han de ser deficitarias en hipoxantina-guanina
fosforribosil transferasa (HGPT) o timidina-quinasa (TK), enzimas
necesarias para la vía silvestre de síntesis de precursores del DNA.
Tras la fusión, el genoma del linfocito compensa en el híbrido la
deficiencia enzimática que presentaba la célula de mieloma por sí sola.
Así, utilizando un medio de restricción adecuado se pueden eliminar
las células de mieloma no híbridas, que son aquellas que no habrán
compensado su carencia del enzima. (4)

Una vez obtenidos los híbridos que establecerán ya una línea

celular (hibridoma) se seleccionan aquellos que sean productores de
las inmunoglobulinas específicas deseadas y, tras diversas fases de
clonación para asegurar que las células obtenidas proceden de un
único clon, los clones seleccionados se conservan por criopreservación
en nitrógeno líquido y/o se expanden bien in vitro, en cultivo, bien in
vivo, por inoculación en cavidad peritoneal de ratón. Así, se pueden
obtener grandes cantidades de soluciones de medio de cultivo o de
líquido ascítico desde donde las inmunoglobulinas específicas pueden
purificarse por procedimientos convencionales.

El desarrollo de esta técnica ha permitido ir introduciendo

diferentes variedades metodológicas tales como:

- el uso de linfocitos esplénicos estimulados por inmunización in

vitro;
- la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (via fusión
de linfocitos humanos con mieloma murino);
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- producción, a partir de monoclonales, de anticuerpos

bifuncionales sintetizados químicamente (p.e. por agregación o
por reasociación química)
- por medio de la fusión, bien entre un hibridoma y un linfocito
procedente de una inmunización, bien entre dos hibridomas; y
aplicación de tecnologías de DNA recombinante sobre
hibridomas.

Así, se emplean en la actualidad en técnicas tales como la

detección de antígenos celulares de superficie, identificación de líneas
hematopoyéticas de células humanas, diagnóstico con aplicaciones
forenses sobre muestras de alimentos, bebidas y drogas ingeridas,
aplicaciones de diagnosis y terapéuticas sobre infecciones víricas o
bacterianas, aplicaciones en inmunoterapia y diagnosis de tumores in
vivo, aplicaciones en cromatografía de inmuno-afinidad para purificar
determinadas moléculas a partir de preparaciones mixtas,
inmunológicas para identificar aquellas moléculas que mejor puedan
confeccionarse como vacunas. (4)

BIBLIOGRAFÍA
1) MILSTEIN, C. Los anticuerpos monoclonales, la curiosidad como fuente de
riqueza. Conferencia dictada en el Aula Magna de la Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales de la UBA, 15 de diciembre de 1999. Universidad de Buenos
Aires, Argentina. www.bl.fcen.uba.ar/Milstein.pdf

2) SIKORA,K Y SMEDLEY,H Anticuerpos Monoclonales. Versión española pr

Isabel García. Serie de Biología. Editorial Reverté. Impreso en España. (1986)
Págs. 150

3) Anticuerpos monoclonales. Medicina molecular.

http://www.medmol.es/tecnica.cfm?id=12

4) ESTIVILL, G. Anticuerpos monoclonales, tecnologías en desarrollo. Encuentros

en la Biología. (1996) http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=277027
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ANEXOS
Tabla 1. Efectos de la interacción anticuerpo-antígeno

Tabla 2. Clases de inmunoglobulinas

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Diagrama 3. Diagrama esquemático que muestra la unión de un determinante antígénico

en un sitio de unión situado en el extremo N-terminal de una molécula de anticuerpo.

Diagrama 4. Utilización del Ficoll para separar linfocitos viables, a partir de una
suspensión de células de bazo que contiene glóbulos rojos y plaquetas.
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Diagrama 5. Pasos en la fabricación de un anticuerpo monoclonal.