I.

INTRODUCCION
Los componentes de los medios para el cultivo de tejidos incluyen
macronutrientes, micronutrientes, un suplemento de hierro, vitaminas, una fuente
de carbono y usualmente, reguladores de crecimiento. Aparte del carbono,
hidrgeno y oxgeno los constituyentes esenciales requeridos en relativamente
grandes cantidades (macros) son el nitrgeno (N), fsforo (P), potasio (K), calcio
(Ca), magnesio (Mg) y azufre (S). Trazas de ciertos elementos
(micros) minerales son requeridos por todas las clulas vegetales, se incluyen el
hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), molibdeno (Mo),
cobalto (Co), nquel (Ni) y Cloruro.
Las vitaminas tienen funciones catalizadoras en ciertos sistemas enzimticos por
lo que tambin son necesarias en pequeas cantidades. La tiamina es la nica
vitamina esencial para todos los cultivos, pero el ac. nicotnico y la piridoxina
pueden tambin estimular el crecimiento. El ac. ascrbico (Vit. C) en combinacin
con el ac. ctrico es utilizado como antioxidante.
Todos los medios de cultivo requieren la presencia de una fuente de carbono y
energa. Una respuesta ptima de crecimiento es determinante cuando se utiliza
sacarosa o d-glucosa como fuente de carbn en el medio de cultivo, mientras que
con otros sacridos la respuesta es considerablemente variable.
La prctica se realiz en el laboratorio de tejido in vitro de la UNASAM donde se
observo paso a paso la preparacin detallada de un medio de cultivo, cuales es la
importancia, que criterios tomar y que precauciones para evitar alteraciones entre
otras cosas que ya mencionare con ms detalle ms adelante.
Objetivos
General
Capacitar al estudiante acerca de la preparacin de medios de cultivo
Especifico
Conocer la funcin que tienen los distintos componentes del medio de cultivo
Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes
II. MARCO TEORICO
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el
crecimiento de los microorganismos. La composicin precisa depender de la
especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varan
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien
en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que
necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
2.1.De acuerdo a su naturaleza
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus
constituyentes en:
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen
animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la
adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los
componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin
qumica
definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos
de investigacin.
2.2.De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento
de
un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de
microorganismos
de ese tipo. Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras
del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se quieren
cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser
medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos
especficos.
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos
derivados
de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo
de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas
fisiolgicas
de los microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de
sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos asequibles
comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el
uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el
trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
2.3.Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o
proveedores que suministren productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y
fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o
desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.
2.4.Almacenamiento de los medios de cultivo
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo
las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar
fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa.
Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o
vapor.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos. Cuando los envases de
estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe
tener la precaucin de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien
cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorcin de agua produce
cambios de pH, formacin de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual
indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios qumicos
o estar contaminados.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede
almacenarse a temperatura ambiente por un periodo mximo de 2 semanas
protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15C. Sin embargo, almacenados
bajo refrigeracin entre 2 y 8C se prolonga la vida til de los mismos, (nunca por
debajo de 0C porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se
deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin y
cuando se usa tapn de algodn, se debe colocar por encima una envoltura de
papel (Craft).
Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo
preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se
determinan sus propiedades fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y
microbiolgicas (esterilidad y promocin de crecimiento) verificando que
cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son
aptos para su uso.
2.5.Constituyentes habituales de los medios de cultivo
A continuacin, se da una idea general sobre algunos de los constituyentes
habituales de los medios de cultivo.
2.5.1. AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los
medios de
cultivo. En el agar bacteriolgico el componente dominante es un
polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la
indudable ventaja de que a excepcin de algunos microorganismos
marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se
licua alrededor de los 100C y se gelifica alrededor de los 40C,
dependiendo de su grado de pureza.
2.5.2. EXTRACTOS. Su preparacin consiste en que ciertos rganos o
tejidos animales o vegetales (carne, hgado, cerebro, semillas, etc.) son
extrados con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la
forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a
menudo empleados en la elaboracin de los medios de cultivo. Los ms
utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de malta.
2.5.3. PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos,
nitrogenados y sales minerales, que se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja casena
carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en ppticos y aminocidos,
pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales
minerales.
2.5.4. FLUIDOS CORPORALES. Con frecuencia es necesario aadir a los
medios de cultivo de algunas patgenas sustancias como sangre
completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo, sobre todo
para conseguir el primer aislamiento a partir del hospedador. La sangre
no puede ser esterilizada, y por tanto debe de ser obtenida en
condiciones aspticas
 directamente de un animal sano, y adicionada al medio de cultivo
despus de que este haya sido auto clavado. Los fluidos corporales no
solo aportan factores de crecimiento, sino que tambin aportan
sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas
bacterias. Un ejemplo podra ser la catalasa presente en las clulas
sanguneas destruye el perxido de hidrgeno que algunas bacterias
que no poseen este enzima acumulan como producto del metabolismo
del oxgeno.
2.5.5. SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para mantener el pH dentro del
rango optimo del crecimiento bacteriano a veces, es necesario aadir
algunos componentes al medio de cultivo. Debido a que la mayora de
de bacterias son neutrfilas, se suelen emplear sales del tipo de los
fosfatos disdicos dipotsicos u otras sustancias como las peptonas
para prevenir la desviacin del pH.
2.5.6. INDICADORES DE PH. Con el objeto de poder detectar variaciones
en el pH debido a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario
a veces aadir indicadores acido-base que nos lo indiquen.
2.5.7. AGENTES REDUCTORES. Con el objetivo de crear en los medios de
cultivo condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes
microaerfilos anaerobios se aaden estos agentes reductores siendo,
los ms empleados la cistena y el tioglicolato entre otros.
2.5.8. AGENTES SELECTIVOS. La adicin de determinadas sustancias a
un medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. As, por ejemplo,
la adicin de cristal violeta, sales biliares, acida sdica, telurio
potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada har que
acten como agentes selectivos frene a determinados
microorganismos.
III. MATERIALES Y METODOS
La prctica se realiz en el Laboratorio de Cultivos In Vitro de la Ciudad
Universitaria, Facultad de Ciencias Agrarias UNASAM.
3.1.Materiales
3.1.1. Materiales y reactivos
Agua destilada
Azcar blanca refinada
 Phytagel
Vaso precipitado
Probeta
Varilla de vidrio
Frascos
Plstico delgado
Ligas
3.1.2. Equipos
Cocinilla elctrica
Olla autoclave

3.2.Mtodos
La prctica se realiz el da 08 de noviembre del 2017, dirigido por los practicantes
de turno encargados del laboratorio de cultivo in vitro.
Ellos nos mostraron el proceso que se realiza para la preparacin de un medio de
cultivo, as mismo tambin nos mencionaron los criterios a tener en cuenta para
evitar deficiencias al momento del preparado; seguimos los siguientes pasos para
obtener nuestro medio de cultivo:
1. Se alistan los reactivos y materiales a utilizar
2. En un precipitado se llena 200 ml de agua destilada

3. Se adiciona el M.S. y 30 gr de sucrosa y se disuelve

4. En una probeta se enraza a un litro

5. Se mide el Ph para ver si nos encontramos dentro del rango establecido

6. Se utiliza dos reactivos para poder llegar al pH optimo

7. Se calienta el medio de cultivo en la cocinilla elctrica

8. Se aade el phytagel y se agita hasta que el color acuoso cambie a cristalino

9. Se dispensa el medio de cultivo en frascos y se sella colocando un plstico
delgado acompaado de una liga delgada

10. Se esteriliza en la olla autoclave a 15 libras de presin y 250 F durante 15

minutos
 11. Se lleva el medio al cuarto de transferencia para sembrar el material

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1.Resultados
El pH obtenido en el medio de cultivo fue de 5.65 que esta dentro de los rangos
para obtener un medio de cultivo optimo, en el proceso se tuvo que aadir
ambos reactivos para llegar al pH necesario.
4.2.Discusin
Por qu se necesita un pH de 5?6 a 5.7?
Porque de lo contrario ese medio de cultivo no seria apto para un cultivo in
vitro
Por qu se necesita esterilizar despus de preparar el medio de cultivo?
Porque con ello se elimina todo resto de contaminacin que podra haber
V. CONCLUSIONES
Se pudo observar que para la preparacin de un medio de cultivo los tcnicos
deben de tener la indumentaria apropiada y condiciones ptimas de asepsia.
Una buena preparacin de un medio de cultivo se obtiene siempre y cuando se
sigan los pasos requeridos y se tome las precauciones necesarias para evitar
contaminacin del medio.
El pH juega un papel importante en la preparacin de un medio de cultivo pues
depende de el si este medio de cultivo ser eficiente o si es que no sirve.
VI. RECOMENDACIONES
Se recomienda el uso de una indumentaria adecuada para evitar la
contaminacin del material
Se recomienda tener equipos necesarios dentro del laboratorio porque si
expones la preparacin al ambiente como en este caso lo hicimos para sacar el
pH, este podra alterarse.
Se recomienda que los tcnicos tengan conocimientos bsicos de los reactivos
a utilizar pues podran hacer que el medio de cultivo preparado se altere y
tenga que ser desechado
VII. BIBLIOGRAFIA
http://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/20.500.11799/63787/secme-
12254.pdf?sequence=1
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo
http://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/20.500.11799/63787/secme-
12254.pdf?sequence=1
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/1
0_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf