Sunteți pe pagina 1din 58

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IAŞI FACULTATEA DE FARMACIE

CERCETĂRI PRIVIND SINTEZA ȘI EVALUAREA BIOLOGICĂ A UNOR NOI COMPUȘI CU STRUCTURĂ SULFONAMIDICĂ

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC PROF. DR. Lenuța PROFIRE

DOCTORAND Oana-Maria PARASCA (DRAGOSTIN)

DR. Lenuța PROFIRE DOCTORAND Oana-Maria PARASCA (DRAGOSTIN) Investeşte în oameni ! Proiect cofinanţat din Fondul

Investeşte în oameni !

Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritară „Educatia si formarea profesională în sprijinul cresterii economice si dezvoltării societătii bazate pe cunoastere” Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale si post doctorale în sprijinul cercetării” Titlul proiectului: „Burse doctorale pentru cresterea competitivitatii in domeniul medical si farmaceutic” Numărul de identificare al contractului: POSDRU/88/1.5/S/58965 Beneficiar : Universitatea de Mdicina si Farmacie „Gr. T. Popa” Iasi Partener : Universitatea de Medicina si Farmacie „Iuliu Hatieganu” Cluj Napoca

2013

Comisia de doctorat are următoarea componenţă:

PREŞEDINTE: Decan Prof. Univ. Dr. Monica Hănceanu

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. Univ. Dr. Lenuţa Profire

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi

REFERENŢI OFICIALI:

Prof. Univ. Dr. Silvia Imre

Universitatea de Medicină şi Farmacie Tg. Mureş

Prof. Univ. Dr. Ovidiu Oniga

Universitatea de Medicină şi Farmacie Cluj

C.S.I. Dr. Cornelia Vasile

Institutul de Chimie Macromoleculară „Petru Poni” Iaşi

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

ABREVIERI STADIUL CUNOAȘTERII CAPITOLUL 1 SULFONAMIDE

iv

1

1.1.

STRUCTURĂ GENERALĂ. PROPRIETĂȚI FIZICO-CHIMICE

2

1.2.

METODE GENERALE DE SINTEZĂ

2

1.3.

APLICAȚII TERAPEUTICE

4

1.3.1.

SULFONAMIDE CA AGENŢI ANTIBACTERIENI

4

1.3.2.

SULFONAMIDE CA AGENŢI ANTIVIRALI

5

1.3.3.

SULFONAMIDE CA AGENȚI TUBERCULOSTATICI

6

1.3.4.

SULFONAMIDE CA AGENŢI ANTITUMORALI

6

1.3.5.

SULFONAMIDE CA AGENŢI ANTIGLAUCOMATOŞI

6

1.3.6.

SULFONAMIDE ÎN TRATAMENTUL BOLII ALZHEIMER

7

1.3.7.

SULFONAMIDE CA AGENŢI ANTICONVULSIVANŢI

7

1.3.8.

SULFONAMIDE CA INHIBITORI DE COX-2 ŞI LIPOXIGENAZĂ

8

1.3.9.

SULFONAMIDE CA AGENŢI HIPOGLICEMIANŢI

8

1.3.10. ALTE APLICAŢII ALE SULFONAMIDELOR

8

1.4.

ASPECTE FARMACOCINETICE

9

1.5.

MOD DE ADMINISTRARE

9

1.6.

FARMACOTOXICOLOGIE

10

1.7.

SULFONAMIDE LUATE ÎN STUDIU

10

1.7.1. Sulfametoxidiazina

10

1.7.2. Sulfadiazina

11

1.7.3. Sulfamerazina

12

1.7.4. Sulfadimetoxina

12

1.7.5. Sulfametoxazol

13

1.7.6. Sulfizoxazol

14

CAPITOLUL 2

 

BIOPOLIMERI CU APLICAȚII MEDICALE

15

2.1.

CHITOSANUL

16

2.1.1.

SCURT ISTORIC

16

2.1.2.

STRUCTURĂ CHIMICĂ, OBȚINERE

16

2.1.3.

PROPRIETĂȚI FIZICO-CHIMICE

16

2.1.4.

APLICAȚII BIOMEDICALE

17

2.1.5.

ALTE APLICAŢII

19

2.1.6.

DERIVATIZAREA CHITOSANULUI

20

2.2.

ACIDUL HIALURONIC

24

2.2.1.

SCURT ISTORIC

24

2.2.2.

STRUCTURĂ CHIMICĂ

24

2.2.3.

ROL FIZIOLOGIC

24

2.2.4.

MODULĂRI STRUCTURALE

24

2.2.5.

APLICAȚII BIOMEDICALE

25

2.3.

POLICAPROLACTONA (PCL)

25

2.3.1.

STRUCTURĂ GENERALĂ ŞI PROPRIETĂŢI FIZICO-CHIMICE

26

2.3.2.

BIODEGRADARE

26

2.3.3.

APLICAȚII BIOMEDICALE

26

2.4.

POLI(VINIL ALCOOL) (PVA)

27

2.4.1. STRUCTURĂ GENERALĂ ŞI PROPRIETĂŢI FIZICO-CHIMICE

27

2.4.2. APLICAȚII

 

27

i

CONTRIBUȚII PERSONALE CAPITOLUL 3 MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE CAPITOLUL 4

28

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A UNOR NOI COMPUȘI CU

31

STRUCTURĂ SULFONAMIDICĂ

31

4.1.

MATERIALE ȘI METODE

31

4.1.1.

Sinteza noilor compuşi cu structură sulfonamidică

31

4.1.1.1. Procedeu general pentru obținerea derivaților N-cloracetil sulfonamidici

32

4.1.1.2. Procedeu general pentru obținerea derivaților N-hidrazino-acetil sulfonamidici

32

4.1.1.3. Procedeu general pentru obținerea hidrazonelor cu structură sulfonamidică.

32

4.1.1.4. Procedeu general pentru obținerea azetidiononelor cu structură sulfonamidică

33

4.1.1.5. Procedeu general pentru obținerea derivaților de chitosan cu structură sulfonamidică

33

4.1.2.

Termogravimetria (TG) și termogravimetria derivată (DTG)

34

4.2.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

34

4.2.1.

Sinteza unor noi derivați de azetidinonă cu structură sulfonamidică

35

4.2.1.1. Sinteza derivaţilor N-cloracetil sulfonamidici

37

4.2.1.2. Sinteza unor noi derivați de hidrazină cu structură sulfonamidică

39

4.2.1.3. Sinteza unor noi hidrazone cu structură sulfonamidică

43

4.2.1.4. Sinteza unor noi azetidinone cu structură sulfonamidică

46

4.2.2.

Sinteza unor noi derivaţi de chitosan cu structură sulfonamidică

48

4.2.3.

Termogravimetria (TG) și termogravimetria derivată (TGA)

52

4.3.

CONCLUZII

CAPITOLUL 5

54

CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A COMPUŞILOR SINTETIZAŢI

54

5.1.

MATERIALE ȘI METODE

54

5.1.1. Analiza spectrală în infraroșu

55

5.1.2. Analiza spectrală de rezonanță magnetică nucleară

55

5.1.3. Analiza elementală

55

5.2.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

55

5.2.1.Analiza spectrală în infraroşu

55

5.2.1.1. Analiza spectrală în infraroşu a derivaților N-cloracetil sulfonamidici

57

5.2.1.2. Analiza spectrală în infraroşu a derivaților de hidrazină cu structură sulfonamidică

58

5.2.1.3. Analiza spectrală în infraroşu a hidrazonelor cu structură sulfonamidică

67

5.2.1.4. Analiza spectrală în infraroşu a azetidinonelor cu structură sulfonamidică

71

5.2.1.5. Analiza spectrală în infraroşu a derivaţilor de chitosan cu structură sulfonamidică

74

5.2.2.

Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară (RMN)

5.2.2.1

Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară a hidrazonelor cu structură

74

sulfonamidică

5.2.2.2

Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) a azetidinonelor cu

77

structură sulfonamidică

 

5.2.2.3.

Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) a derivaţilor de chitosan

85

cu structură sulfonamidică

88

5.2.3.

Analiza elementală a derivaţilor de chitosan cu structură sulfonamidică

88

5.3.

CONCLUZII

CAPITOLUL 6 PRELUCRAREA DERIVAŢILOR DE CHITOSAN CU STRUCTURĂ

90

SULFONAMIDICĂ ÎN VEDEREA OBŢINERII UNOR FORMULĂRI INOVATIVE

90

6.1.

MATERIALE ŞI METODE

90

6.1.1. Filme

91

6.1.2. Membrane multistratificate <onion like>

92

6.1.3. Spongi

92

6.1.4. Nano-fibre

93

6.1.5. Micro/nano-particule

ii

6.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII

94

 

6.2.1. Filme

94

6.2.2. Membrane multistratificate <onion like>

95

 

6.2.3. Spongi

96

6.2.4. Nano-fibre

98

6.2.5. Micro/nano-particule

100

6.3. CONCLUZII

102

CAPITOLUL 7 CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A MATRICILOR POLIMERICE OBȚINUTE PE BAZĂ DE CHITOSAN FUNCȚIONALIZAT

104

7.1.

MATERIALE ŞI METODE

104

7.1.1. Testul de porozitate

104

7.1.2. Testul de umflare

104

7.1.3. Metoda unghiului de contact

105

7.2.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

106

7.2.1. Testul de porozitate

107

7.2.2. Testul de umflare

107

7.2.3. Metoda unghiului de contact

110

7.3. CONCLUZII

112

CAPITOLUL 8 EVALUAREA BIOLOGICĂ A COMPUȘILOR CU STRUCTURĂ SULFONAMIDICĂ

113

8.1.

MATERIALE ŞI METODE

113

8.1.1.

Evaluarea acţiunii antimicrobiene in vitro

113

8.1.1.1. Determinarea concentraţiei minime inhibitorii

114

8.1.1.2. Determinarea diametrului zonei de inhibiție

115

8.1.2. Evaluarea potențialului antioxidant in vitro

115

8.1.3.

Evaluarea capacităţii de biodegradare in vitro

116

8.2.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

117

8.2.1.

Evaluarea acţiunii antimicrobiene in vitro

117

8.2.1.1. Determinarea concentrației minime inhibitorii

117

8.2.1.2. Determinarea diametrului zonei de inhibiție

120

8.2.2.

Evaluarea potențialului antioxidant in vitro

121

8.2.2.1.

Evaluarea potențialului antioxidant al derivaților de hidrazină cu structură

sulfonamidică

122

8.2.2.2. Evaluarea potențialului antioxidant al hidrazonelor cu structură sulfonamidică

124

8.2.2.3. Evaluarea potențialului antioxidant al azetidinonelor cu structură sulfonamidică

127

8.2.2.4. Evaluarea potențialului antioxidant al derivaţilor de chitosan cu structură

sulfonamidică

129

8.2.3.

Evaluarea capacităţii de biodegradare in vitro

132

8.2.3.1. Evaluarea capacităţii de biodegradare a spongilor

132

8.2.3.2. Evaluarea capacităţii de biodegradare a filmelor

134

8.3. CONCLUZII

135

CAPITOLUL 9 CONCLUZII GENERALE

136

BIBLIOGRAFIE

138

ANEXA 1- LISTA LUCRĂRILOR ȘTIINȚIFICE

147

ANEXA 2- CV

149

iii

ABREVIERI UTILIZATE

ADN

Acidul dezoxiribonucleic

AFM

Atomic force microscope (eng)

ARN

Acidul ribonucleic

ATP

Anenozintrifosfat

CAS

Clorura acidului p-acetilaminobenzensulfonic

CLMW

Chitosan low molecular weight (eng)

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute Antimicrobial Susceptibility Testing Standards (eng)

CMMW

Chitosan medium molecular weight (eng)

CMI

Concentrația minimă inhibitorie

CTA

Capacitatea totală antioxidantă

Da

Dalton (unit)

DA

Degree of acetylation (eng)

DCI

Denumire Comună Internațională

DLS

Dynamic Light Scattering (eng)

DMFA

Dimetilformamidă

DMSO

Dimetilsulfoxid

DPPH

1,1-difenil-2-picrilhidrazil

DS

Degree of substitution (eng)

DTG

Differential thermogravimetry (eng)

EC50

Effective concentration 50 (eng)

EUCAST

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (eng)

FT-IR

Fourier transform infrared spectroscopy (eng)

HA

Hyaluronic acid (eng)

HCV

Hepatitis C virus (eng)

HIV

Human Immunodeficiency Virus (eng)

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry (eng)

MSR

Membrane Swelling Ratio (eng)

NS5B

Nonstructural protein 5B (eng)

PABA

Acid para-aminobenzoic

PCL

Poli(caprolactona)

PEG

Poli(etilen-glicol)

PGA

Poliglicolida

PHEMA

Poli(hidroxi-etilmetacrilat)

PLA

Polilactida

PNIPAAm

Poli(N-isopropilacrilamida)

PU

Poliuretan

PVA

Poli(vinil-alcool)

rpm

Rotations per minute (eng)

SEM

Scanning electron microscopy (eng)

TCT

2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina

TG

Thermogravimetry (eng)

TPP

Tripolifosfat pentasodic

iv

Prezenta teză de doctorat este ilustrată prin 115 figuri și 50 tabele. Rezumatul include un număr limitat din totalul acestora, menținând numerotarea din teză.

Cercetările realizate în cadrul sudiilor doctorale au putut fi realizate şi datorită statutului de bursier în cadrul proiectul ”Burse doctorale pentru creşterea competitivităţii în domeniul medical şi farmaceutic” POSDRU/88/1.5/S/58965, pe care l-am avut în perioada 2009-2013.

Formarea mea ca cercetător, iniţiată în cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie ”Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de Farmacie, disciplina de Chimie farmaceutica fost completată prin stagiul de mobilitate transnaţională realizat la University of Ghent, Department of Organic Chemistry, Polymer Research Group, Belgium.

v

Sincere

profesională, pentru

mulțumiri

pentru

îndrumarea

pașilor

în

formarea

mea

Prof. Dr. Lenuța Profire Universitatea de Medicină și Farmacie ʺGrigore T. Popaʺ Iași

Prof. Dr. Peter Dubruel University of Ghent, Belgium

vi

INTRODUCERE

Sunt peste 60 de ani de la introducerea în terapeutică a antibioticelor, acest fapt devenind pe parcursul timpului strategia principală în controlul infecțiilor bacteriene. Cu toate acestea, încă din 1942 a fost evidențiat Staphylococcus aureus rezistent la penicilină și la scurt timp în 1961, după introducerea meticilinei, au fost evidențiate tulpini de Staphylococcus aureus meticilino-rezistente. În prezent majoritatea tulpinilor de Staphylococcus aureus, recunoscute ca fiind cei mai importanți agenți patogeni cauzatori de infecții nosocomiale din întreaga lume, s-au dovedit a fi rezistente la penicilină, meticilină sau oxacilină. Problema îngrijorătoare este legată de faptul că acestea prezintă în mod simultan rezistență la toate antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine și carbapeneme) dar și la o serie de alți compuși cu acțiune antimicrobiană precum aminoglicozide, fluorochinolone și macrolide. Descoperirea de noi molecule cu acțiune antimicrobiană, este deosebit de importantă, mai ales pentru a controla infecțiile intraspitalicești cu astfel de tulpini multirezistente. În acest context, chimia compușilor cu structură sulfonamidică stârnește un interes particular prin varietatea proprietăților biologice pe care le prezintă. Printre activitățile biologice care le-au fost asociate de-a lungul timpului se numără: acțiunea antimicrobiană, antivirală, antiinflamatorie, antitumorală, analgezică, diuretică, anticonvulsivantă, hipoglicemiantă. Pe de altă parte, în ultimii ani asistăm la o intensificare a cercetărilor privind proprietăţile terapeutice ale polimerilor, în special ale biopolimerilor. Printre biopolimeri un loc important îl ocupă chitosanul studiat la ora actuală pentru o gamă largă de aplicații biomedicale. Proprietățile, care fac din chitosan un polimer extrem de studiat, sunt non- toxicitatea, biodegradabilitatea, biocompatibilitatea, bioresorbabilitatea dar și efectele sale antimicrobiene și hemostatice.

1

CAPITOLUL 3. MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE

Compușii care conțin în moleculă gruparea sulfonamidică reprezintă o clasă importantă în terapeutică actuală dar și una din preocupările majore ale cercetătorilor. Având în vedre interesul deosebit acordat de-a lungul timpului acestei clase de compuşi, s-a urmărit sinteza unor noi derivați care să reunească în aceeaşi moleculă două entități structurale cu importantă activitate biologică: structura sulfonamidică şi ciclul azetidin-2-onă (beta- lactamic) pe de o parte, și pe de altă parte structura sulfonamidică grefată pe cea a chitosanului. Astfel prin derivatizarea unor sulfonamide clasice (sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametoxidiazina, sulfadimetoxina, sulfametoxazol și sulizoxazol), parcurgând o serie de etape intermediare, s-au obținut noi compuși heterociclici din clasa azetidinonelor cu structură sulfonamidică, ce prezintă premisele teoretice ale unui potențial terapeutic îmbunătățit; iar prin derivatizarea chitosanului la nivelul grupării amino primare cu introducerea unor derivați sulfonamidici funcționalizați s-a urmărit obținerea de noi compuși cu potențial antimicrobian și antioxidant îmbunătățit.

Obiectivele generale urmărite în cadrul cercetărilor personale au

fost:

Sinteza, caracterizarea şi evaluarea biologică a unor noi compuşi heterociclici cu structură sulfonamidică;urmărite în cadrul cercetărilor personale au fost: Sinteza, caracterizarea și evaluarea biologică a unor noi

Sinteza, caracterizarea și evaluarea biologică a unor noi derivaţi de chitosan cu structură sulfonamidică.noi compuşi heterociclici cu structură sulfonamidică; CAPITOLUL 4. SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO - CHIMICĂ A

CAPITOLUL 4. SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO- CHIMICĂ A UNOR NOI COMPUȘI CU STRUCTURĂ SULFONAMIDICĂ

4.1. MATERIALE ȘI METODE În vederea obținerii unor noi compuși cu structură sulfonamidică cu potențial biologic îmbunătățit au fost luate în studiu șase sulfoanamide clasice: sulfametoxidiazina, sulfadiazina, sulfadimetoxina, sulfametoxazol,

2

sulfamerazina, sulfizoxazol, cunoscute pentru acțiunea actimicrobiană, și au fost supuse unui proces de modulare structurală ce a urmărit, pe de o parte sinteza de noi azetidinone cu structură sulfonamidică, iar pe de altă parte funcționalizarea biopolimerului chitosan.

4.1.1. Sinteza noilor compuşi cu structură sulfonamidică

4.1.1.1. Procedeul general pentru obținerea derivaților N-cloracetil

sulfonamidici Derivatul sulfonamidic se dizolvă în acetonă anhidră, după care se adaugă clorura acidului monocloracetic și K 2 CO 3 anhidru. Amestecul de reacție se menține pe baia de apă, sub reflux 12 ore. Spre sfârșitul timpului de reacție în balon se observă precipitarea produsului brut.

4.1.1.2. Procedeul general pentru obținerea derivaților N-hidrazino-

acetil sulfonamidici Derivatul N-cloracetil-sulfoanamidic corespunzător se aduce în alcool etilic absolut. Peste suspensia obţinută se adaugă în picătură, hidrat de hidrazină, după care amestecul de reacţie se menţine pe baia de apă timp de 12 ore. Reziduul obținut se tratează cu apă distilată rece, sub agitare pe baie de gheață, când se obține un precipitat uşor de separat prin filtrare.

4.1.1.3. Procedeul general pentru obținerea hidrazonelor cu structură

sulfonamidică Derivatul N 4 -hidrazino-acetil sulfonamidic corespunzător se dizolvă în alcool etilic 50 c . Peste soluţia obţinută se adaugă benzaldehida

aromatică corespunzătoare (benzaldehida, 4-fluorbenzaldehida, 4- clorbenzaldehida, 4-brombenzaldehida, 4-hidroxibenzaldehida și 4- nitrobenzaldehida) și acid acetic glacial. Amestecul de reacţie se menţine pe baia de apă, sub reflux, timp de 8 ore. La sfârşitul timpului de reacție, suspensia rezultată se filtrează.

4.1.1.4. Procedeul general pentru obținerea azetidiononelor cu structură sulfonamidică Derivatul de hidrazonă corespunzător se dizolvă în dioxan anhidru, după care soluţia se aduce pe baie de gheaţă şi se adăugă în picătură

3

clorura acidului cloracetic şi trietilamina. Amestecul de reacţie se agită la temperatura camerei 3 ore, timp în care se observă apariţia unui precipitat fin de clorhidrat de trietilamină (TEA·HCl). După îndepărtarea clorhidratului de trietilamină, prin filtrare, soluţia rezultată se menţine pe baie de apă, la reflux, încă 5 ore iar la sfârşitul timpului se tratează cu apă distilată rece în vederea precipitării produsului de reacţie.

Compușii sintetizați, intermediari și finali, au fost caracterizați din punct de vedere fizico-chimic, determinându-se temperatura de topire, randamentul de reacție, formula moleculară, masa relativă și solubilitatea în diferiți solvenți organici. Obținerea compușilor a fost monitorizată prin cromatografie pe strat subţire (silicagel pe suport de aluminiu, 60 F254), iar vizualizarea spoturilor s-a realizat în lumină UV. Pentru determinarea temperaturii de topire s-a folosit aparatul Buchi M 565.

4.1.1.5. Procedeul general pentru obținerea derivaților de chitosan cu structură sulfonamidică Chitosanul (CMMW, CLMW) a fost dizolvat în acid acetic 2%, după care s-a adăugat în picătură, sub agitare magnetică derivatul cloracetil-sulfonamidic dizolvat în DMFA. Amestecul rezultat a fost supus agitării magnetice pentru 24 ore la temperatura camerei după care pH-ul a fost ajustat de la 4,5 la 9 prin adăugarea unei soluții de NaOH 15%. La această valoare a pH-ului, a precipitat produsul de reacție, care a fost separat, spălat de câteva ori cu apă distilată și apoi purificat prin dializă timp de 5 zile. Produsul final este uscat prin liofilizare.

4.1.2. Termogravimetria (TG) și termogravimetria derivată (DTG) Curbele TG/DTG s-au înregistrat în condiții dinamice, neizoterme, folosind derivatograful Paulik-Paulik-Erdey tip MOM-Budapesta, în următoarele condiții experimentale: rata de încălzire de 10 ºC/min, domeniul de temperatură 25 – 600 ºC, masa probei de analizat de aproximativ 20 mg, debit de aer de 100 cm3/min, creuzet de platină. Pentru fiecare etapă a analizei termogravimetrice s-au determinat următoarele caracteristici termice: temperatura pentru începerea procesului (Ti), temperatura corespunzătoare pierderii maxime de substanță (Tm), temperatura corespunzătoare sfârșitului fiecărei etape termogravimetrice

4

(Tf) (erorile în determinarea acestor parametri sunt de ± 2ºC), pierderea de masă (∆w, eroare ± 1 wt%).

4.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 4.2.1. Sinteza unor noi derivați de azetidinonă cu structură sulfonamidică Sinteza derivaților de azetidinona cu structură sulfoanmidică s-a realizat în mai multe etape, prin adaptarea unor metode similare de derivatizare a unor compuși cu grupări amino primare aromatice (119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128) (Fig. 4.2).

O O NH 2 NH C CH 2 Cl NH C CH 2 NH NH
O
O
NH
2
NH
C
CH 2
Cl
NH
C
CH 2
NH
NH 2
OHC
+
R 2
O
H 2 N
NH 2 . H 2 O
+
+
Cl
CH 2 C
Cl
O
O
O
S
NH
R 1
S
NH
S
NH
R 1
R 1
O
O
1a-f
2a-f
O
3a-f
O O H NH C CH 2 NH N CH NH C CH 2 NH
O
O
H
NH
C
CH 2
NH
N
CH
NH
C
CH 2
NH
N
C
R 2
O
Cl
+ Cl
CH 2
C
O
Cl
TEA
5a 1 -a 6
O
O
S
NH
R
R 1
2
S
NH
5c 1 -c 6
R 1
4a 1 -a 6
O
4d 1 -d 6
O
5f 1 -f 6
4b 1 -b 6
4e 1 -e 6
4c 1 -c 6
4f 1 -f 6
OCH 3
CH 3
H 3 C
CH 3
N
N
N
;
(c)
; (d)
; (f)
OCH 3
N
;
(b)
; (e)
(a)
O
R 1 =
N
N
O
N
N
N
N
OCH 3
CH 3

R 2 = (1) -H, (2) -F, (3) -Cl, (4) -Br, (5) -OH, (6) -NO 2

Fig. 4.2. Schema generală de obținere a azetidinonelor cu structură sulfonamidică.

4.2.1.1. Sinteza derivaţilor N-cloracetil sulfonamidici Compușii sintetizați se prezintă sub forma unor pulberi cristaline, cu nuanțe ce variază de la alb-gălbui la maro, foarte ușor solubile în DMSO, DMFA; parțial solubile în dioxan, cloroform, metanol, acetonă; insolubile în apă, alcool etilic, alcool propilic. În urma optimizării metodei de sinteză, aceştia s-au obținut în randamente bune ce variază între 68- 90%, iar prin purificare prin recristalizare din alcool etilic absolut se

5

topesc în intervale de maxim 3ºC.

4.2.1.2. Sinteza unor noi derivați de hidrazină cu structură

sulfonamidică Compușii sintetizați se prezintă sub forma unor pulberi cristaline, cu nuanțe ce variază de la galben la maro; foarte ușor solubile în DMSO, DMFA, alcool etilic 50 c ; parțial solubile în alcool etilic absolut, alcool propilic, metanol; insolubile în apă, eter etilic, dioxan, cloroform. În urma optimizării metodei de sinteză, aceştia s-au obţinut în randamente bune ce

variază între 63-85%, iar prin purificare prin recristalizare din alcoool etilic 50c se topesc în intervale de maxim 3ºC.

4.2.1.3. Sinteza unor noi hidrazone cu structură sulfonamidică

Compușii sintetizați se prezintă sub forma unor pulberi cristaline, cu nuanțe ce variază de la galben la roșu-maroniu, foarte ușor solubile în DMSO, DMFA; solubile în dioxan la cald; parțial solubile în alcool etilic, acetonă, cloroform; insolubile în apă, eter etilic, metanol. În urma optimizării metodei de sinteză, aceştia s-au obţinut în randamente bune ce variază între 50 - 93%, iar prin purificare prin recristalizare din alcoool

izopropilic, se topesc în intervale de maxim 3ºC.

4.2.1.4. Sinteza unor noi azetidinone cu structură sulfonamidică

Compușii sintetizați se prezintă sub forma unor pulberi cristaline, cu nuanțe ce variază de la galben-portocaliu la galben-verzui, solubile în DMFA, DMSO; foarte puțin solubile la cald în alcool etilic, metanol, acetonă; insolubile în apă distilată, dioxan, cloroform, propanol. În urma optimizării metodei de sinteză, aceştia s-au obținut în randamente bune ce variază între 50 - 89%, iar prin purificare prin recristalizare din solventul adecvat (alcool etilic absolut, alcoool izopropilic) se topesc în intervale de maxim 3ºC.

4.2.2. Sinteza unor noi derivaţi de chitosan cu structură sulfonamidică Schema generală de sinteză (Fig. 4.7) s-a dezvoltat prin adaptarea unor metode similare de derivatizare (42, 49, 54, 55).

6

CH 3 O C OH OH NH HO O HO O O O HO NH
CH 3
O C
OH
OH
NH
HO
O
HO
O
O
O
HO
NH 2
NH 2
OH

6 (CMMW)

7 (CLMW)

CH 3 O C OH OH NH HO O HO O O O HO NH
CH 3
O
C
OH
OH
NH
HO
O
HO
O
O
O
HO
NH
NH 2
OH
H
C
C
NH
2
8a-f
O
9a-f
O
S
NH
R 1
O

+

R 1 =

O NH C CH 2 Cl CH 3 COOH DMFA O S NH R 1
O
NH C
CH 2
Cl
CH 3 COOH
DMFA
O
S
NH
R 1
O
2a-f
N
N
N
;
(c)
;
OCH 3
(a)
;
(b)
N
N
N
CH 3
OCH 3
CH 3
H 3 C
CH 3
(d)
N
; (f)
; (e)
O
N
N
O
N
OCH 3

Fig. 4.7. Schema generală de obținere a derivaților de chitosan cu structură sulfonamidică (8a-f, 9a-f).

Utilizând analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară ( 1 H- RMN) pentru chitosan s-a deterimant gradul de acetilare iar pentru derivații de chitosan funcționalizați, gradul de substituție. Pentru chitosanul cu greutate moleculară medie (CMMW), s-a stabilit prin analiza spectrală RMN un grad de acetilare de 22,44% și de dezacetilare de 77,56%. Gradele de substituție pentru derivați de chitosan cu structură sulfonamidică sintetizați (8a-f) au variat între 9,61-34,24%. În cazul chitosanului cu greutate moleculară mică (CLMW), pentru care s-a stabilit un grad de acetilare de 19,67% și de dezacetilare de 80,33%, s-au obținut prin sinteză derivați de chitosan cu structură sulfonamidică (9a-f) cu grade de substituție ce variază între 13,29-33,78%.

4.2.3. Termogravimetria (TG) și termogravimetria derivată (TGA) Rezultatele obținute: temperatura pentru începerea procesului de descompunere (Ti), temperatura corespunzătoare vitezei maxime de pierdere de masă (Tm), temperatura corespunzătoare sfârșitului fiecărei etape termogravimetrice (Tf) și pierderea de masă (w) sunt prezentate în tabelul 4.13.

7

Tabel 4.13. Datele termogravimetrice (TG) pentru derivații de chitosan (CMMW) cu structură sulfoanmidică (8a-f)

Etapa

               

nr.

Date TG

CMMW

8a

8b

8c

8d

8e

8f

 

T i ( o C)

36

45

30

40

35

30

48

Etapa I

T m ( o C)

117

123

112

108

110

108

105

T f ( o C)

190

188

189

188

187

180

189

W I (wt%)

8.8

8.8

10.8

6.8

4.95

11.2

9.6

 

T i ( o C)

140

188

189

188

187

180

189

Etapa

T m ( o C)

295

265

275

265

212

267

240

II

T f ( o C)

385

487

382

395

393

410

405

W II (wt%)

51.4

46.6

43.8

40.2

50.6

54.2

42.2

 

T i ( o C)

385

427

425

395

393

410

415

Etapa

T m ( o C)

580

600

575

595

580

544

587

III

T f ( o C)

640

653

627

647

658

628

625

W III (wt%)

35.7

40.9

32.5

42.2

35.3

27.7

29.3

 

ΔW T (%)

95.9

96.3

87.1

89.2

90.8

93.1

81.1

 

ΔW r (%)

4.1

3.7

12.9

10.8

9.2

6.9

18.9

T i = temperatura initială de topire, T m = temperatura corespunzătoare vitezei maxime de pierdere de masă, T f = temperatura finală de topire, w=pierderea de masă

Luându-se în considerare pierderea de masă totală înregistrată pentru chitosan cu greutate moleculară medie comparativ cu derivații funcționalizați, se poate aprecia că, prin modularile structurale realizate se reduce stabilitatea compușilor, întrucât pierderile de masă sunt mai mari pentru derivații de chitosan.

8

Referitor la derivații de chitosan cu greutate moleculară mică se apreciază că prin modulările structurale realizate crește stabilitatea compușilor, întrucât pierderile de masă sunt mai mici comparativ cu chitosanul.

CAPITOLUL 5. CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A COMPUŞILOR SINTETIZAŢI

5.1. MATERIALE ȘI METODE Confirmarea structurii chimice a compușilor sintetizați s-a realizat

prin metode spectrale (spectroscopia în infraroșu, spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară) și prin analiza elementală.

5.1.1. Analiza spectrală în infraroșu

Spectrele în infraroşu ale compuşilor sintetizaţi au fost înregistrate utilizând un spectrometru FT-IR ABB Bomem MB-3000 (Canada), după 32 scanări pe o scară de la 4000-500 cm-1, cu o rezoluţie spectrală de 4 cm-1. Interpretarea spectrelor s-a realizat folosind programul Horizon

MBTM FTIR Software și GRAMS 32 Software (Galactic Industry Corporation, Salem, NH), Version 6.00.

5.1.2. Analiza spectrală de rezonanță magnetică nucleară

Spectrele de rezonanţă magnetică nucleară ( 1 H-RMN, 13 C-RMN) ale compuşilor sintetizaţi au fost înregistrate utilizând spectrometrul Bruker Avance DRX-400, în dimetilsulfoxid deuterat, DMSO-d 6 (grad de deuterare >99,5%) la 300 MHz. Ca referinţă s-a folosit tetrametilsilanul şi semnalul residual al solventului (δ=2,5 ppm).

5.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

5.2.1.Analiza spectrală în infraroşu 5.2.1.1. Analiza spectrală în infraroşu a derivaților N-cloracetil sulfonamidici Gruparea amidică, -HN-CO, rezultată în urma reacției dintre gruparea amino primară aromatică și clorura acidului cloracetic, se regăseşte în spectru prin benzile vibraţiilor de valenţă din domeniul 1609- 1640 cm -1 iar gruparea C=O prezintă vibraţii de valenţă în intervalul 1678-

9

1709

cm -1 .

Legătura

C-Cl

din

lanţul

cloracetil

este

confirmată

prin

vibraţiile de valenţă din domeniul 660-675 cm -1 .

5.2.1.2. Analiza spectrală în infraroşu a derivaților de hidrazină cu

structură sulfonamidică Din analiza datelor spectrale se observă că benzile de absorbție caracteristice pentru grupările C=O și NH-CO apar în domeniul 1670-1703 cm -1 , respectiv 1612-1628 cm -1 . Comparativ cu N-cloracetil derivații corespunzători (2a-f), se observă o deplasare a benzilor de absorbție, în funcție de compus, cuprinsă între 1-29 cm -1 pentru gruparea C=O și de 2- 12 cm -1 pentru gruparea NH-CO-. Aceste deplasări sunt datorate formării unei legături de hidrogen între gruparea C=O și hidrogenul azotului iminic din restul hidrazinic.

5.2.1.3. Analiza spectrală în infraroşu a hidrazonelor cu structură

sulfonamidică În spectrul IR al celor șase serii de hidrazone cu structură sulfonamidică (4a1-a6, 4b1-b6, 4c1-c6, 4d1-d6, 4f1-f6) s-a identificat gruparea funcțională azometinică (-N=CH-) prin apariția benzii de absorbție de intensitate mare în domeniul 1507-1539 cm-1. Apariția acestei benzi constituie un argument pentru reacția de condensare ce a avut loc între derivații de hidrazină corespunzători (3a-f) și aldehidele aromatice selectate pentru acest studiu (benzaldehida, 4-fluorbenzaldehida, 4-clorbenzaldehida, 4-brombenzaldehida, 4-hidroxi-benzaldehida și 4- nitrobenzaldehida).

5.2.1.4. Analiza spectrală în infraroşu a azetidinonelor cu structură

sulfonamidică Ciclizarea hidrazonelor din seriile sulfadiazinei (4a1-a6), sulfametoxidiazinei (4c1-c6) și sulfizoxazolului (4f1-f6) prin tratare cu clorura acidului cloracetic este confirmată prin apariția în spectru IR a benzii de absorbție caracteristice grupării C=O din ciclului azetidin-2-onă (ciclul beta-lactamic) în regiunea 1739-1760 cm -1 , diferită de gruparea C=O exociclică, situată în intervalul 1673-1704 cm -1 .

10

Pentru fiecare serie de compuși, în afară de gruparea funcțională specifică, s-au identificat toate celelalte elementele caracteristice structurii sulfonamidice și aromatice folosite la reacția de condensare.

5.2.1.5. Analiza spectrală în infraroşu a derivaţilor de chitosan cu structură sulfonamidică În spectrul chitosanului și derivaților săi funcționalizați (8a-f, 9a-f) au fost identificate benzile caracterictice grupării amidice, datorate vibraţiilor C=O (amida I) în domeniul 1629-1656 cm -1 (8a-f), respectiv 1645-1658 cm -1 (9a-f), și NH (amida II) în domeniul 1565-1598 cm -1 (8a- f) respectiv 1594-1598 cm -1 (9a-f). Totodată în regiunea 3320-3400 cm -1 s- a identificat o bandă largă atribuită vibrației de valență a grupărilor OH alcoolice. Componenta sulfonamidică este prezentă în spectru prin benzile de absorbție caracteritice grupării sulfonamidice, SO 2 -N în domeniile 1256- 1262 cm -1 şi 1163-1168 cm -1 (8a-f), respectiv benzile de absorbție din regiunea 1256-1260 cm -1 și 1162-1165 cm -1 (9a-f). Nucleul aromatic este prezent sub forma unor benzi multiple dintre care cele mai intense sunt cele din regiunea 1539-1548 cm -1 și 834-897 cm -1 (8a-f) respectiv 1542-1551 cm -1 și 893-897 cm -1 (9a-f).

5.2.2. Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) 5.2.2.1 Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară a hidrazonelor cu structură sulfonamidică Formarea hidrazonelor în urma reacției dintre gruparea amino primară a derivaților de hidrazină cu structură sulfonamidică (3a-f) și aldehidele aromatice (benzaldehida, 4-fluor-benzaldehida, 4- clorbenzaldehida, 4-brombenzaldehida, 4-hidroxibenzaldehida și 4-nitro- benzaldehida) este confirmată prin apariția în spectrul 1 H-RMN a protonului grupării azometinice (-N=CH-) ca singlet la = 8.06-8.22 ppm în funcție de derivatul corespunzător.

5.2.2.2 Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) a azetidinonelor cu structură sulfonamidică Formarea ciclului de azetidin-2-onă (beta-lactamic), rezultat prin tratarea hidrazonelor corespunzătoare cu clorura acidului cloracetic, este dovedită prin dispariția din spectrul 1 H-RMN a semnalului protonului grupării azometinice (-N=CH-) și apariția semnalelor corespunzătoare protonilor

11

ciclului beta-lactamic, CH-Ar și CH-Cl, ce apar ca dublete in regiunea 5.21-5.71 ppm respectiv 4.97-5.20 ppm. În spectrul 13 C-RMN, carbonii ciclului dr azetidin-2-onă au fost identificați prin semnalele din regiunea 160.3 -168.2 ppm (CO), 66.3-79.1 ppm (CH-Ar) și 60.2 – 67.1 ppm (CH-Cl). Prezenţa acestor semnale confirmă încă o dată ciclizarea hidrazonelor la azetidinonele corespunzătoare .

5.2.2.3. Analiza spectrală de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) a derivaţilor de chitosan cu structură sulfonamidică Spectrele de rezonanţă magnetică nucleară ale derivaţilor de chitosan, înregistrate în acid acetic 2% (amestec de acid acetic deuterat şi apă deuterată), prezintă semnalele caracteristice celor două părţi componente: restul glucozaminic și cel sulfonamidic. În cazul derivaților de chitosan cu greutate moleculară medie (8a- f) componenta glucozaminică se regăsește în spectrul 1 H-RMN prin protonii H-2 ce apar ca semnale în regiunea 3.133-3.668 ppm; H-3,4,5,6 ce apar ca semnale multiple în regiunea 3.519-4.534 ppm; H-1 ce apar ca semnale în regiunea 4.770-5.161 ppm; protonii grupării amino ce apar ca semnale în regiunea 2.815-3.35 ppm și protonii restului acetil din regiunea 2.178-2.680 ppm. Componenta sulfonamidică s-a identificat prin protonii ciclului aromatic din regiunea 6.817-7.718 ppm precum și din regiunea 7.653- 7.952 ppm; protonii ciclului pirimidinic (pentru compușii 8a, 8b, 8c, 8d) din regiunea 7.653-8.433 și protonul ciclului izoxazolic (pentru compusul 8e) cu semnal la 6.033 ppm. În cazul derivaților de chitosan cu greutate moleculară mică (9a-f) componenta glucozaminică se regăsește în spectrul 1 H-RMN prin protonii H-2 ce apar ca semnale în regiunea 3.133-3.668 ppm; H-3,4,5,6 ce apar ca semnale multiple în regiunea 3.155-3.347 ppm; H-1 ce apar ca semnale în regiunea 4.034-4.890 ppm; protonii grupării amino ce apar ca semnale în regiunea 2.743-3.058 ppm. Componenta sulfonamidică s-a identificat prin protonii ciclului aromatic din regiunea 6.650-7.783 ppm precum și din regiunea 7.484- 7.980 ppm; protonii ciclului pirimidinic (pentru compușii 9a, 9b, 9c, 9d) din regiunea 7.851-8.359 și protonul ciclului izoxazolic (pentru compusul 9e) cu semnal la 6.020 ppm.

12

CAPITOLUL 6. PRELUCRAREA DERIVAŢILOR DE CHITOSAN CU STRUCTURĂ SULFONAMIDICĂ ÎN VEDEREA OBŢINERII UNOR FORMULĂRI INOVATIVE

6.1. MATERIALE ŞI METODE

6.1.1. Filme

Obținerea filmelor de chitosan (CMMW, CLMMW) și derivați funcționalizați (8a-f, 9a-f) s-a realizat utilizând metode aplicate pentru alți

derivați polimerici (131, 132, 133). Compușii în concentraţie de 2% (m/v) s-au dizolvaţi în acid acetic diluat (2%, m/v), după care volume de 20 mL din fiecare soluţie astfel obţinută, au fost aduse în cutii Petri, cu diametrul de 9 cm şi lăsate la temperatura camerei timp de 48 de ore în vederea evaporării solventului. Filmele uscate rezultate au fost supuse procesului de reticulare cu o soluţie apoasă de tripolifosfat de sodiu (TPP) 5% cu scopul de a creşte hidrofobicitatea materialelor. Filmele reticulate au fost apoi spălate de câteva ori cu apă distilată pentru a îndepărta urmele de acid acetic precum şi excesul de TPP, şi uscate la temperatura camerei pentru încă de 24 de ore.

Morfologia filmelor obținute (CMMW, CLMW, 8a-f, 9a-f) s-a studiat cu ajutorul microscopului de forţă atomică (AFM) de tipul Digital Instruments USA.

6.1.2. Membrane multistratificate <onion like>

Membranele multistratificate “onion like” au fost obținute utilizând ca agent de reticulare tripolifosfatul de sodiu (TPP), conform tehnicii descrise în literatură (135). Membranele multistratificate sunt constituite din filme de chitosan, respectiv chitosan-sulfonamide, care au fost reticulate în prealabil cu o soluţie de TPP 5%. Astfel peste fiecare film obţinut conform tehnicii descrise anterior (6.1.1) se suprapune un alt volum de 20 mL soluţie derivat de chitosan care se evaporă până la obţinerea celui de-al doilea strat din structura membranei. Se reticulează şi acesta, se spală cu apă distilată şi se usucă din nou la temperatura camerei. Se repetă suprapunerea a n=6 straturi derivat de chitosan cu structură sulfonamidică. Morfologia multimembranelor obținute a fost analizată cu ajutorul

microsopului de scanare electronică (SEM) Fei Quanta 200F.

13

6.1.3.

Spongi

Prin adaptarea unor tehnici enunţate în literatura de specialitate, aplicate la alţi derivați polimerici (137, 138, 139), au fost obținuți două tipuri de spongi: spongi pe bază de chitosan/chitosan-sulfonamidă și spongi tip copolimer chitosan/chitosan-sulfonamidă – acid hialuronic. Tehnica de obținere a acestora are la bază procesul de congelare-liofilizare folosind ca și aparatură un liofilizator de tip Christ alpha 2-4-LSC. Spongi chitosan/chitosan – sulfonamidă. Volume de 20 ml soluţie de chitosan, respectiv chitosan-sulfonamidă, în acid acetic 2% (m/v), au fost aduse în cutii Petri, cu diametrul de 9 cm. Probele obținute au fost înghețate, după care au fost supuse tehnicii de evaporare totală a solventului prin liofilizare. Spongi tip copolimer chitosan/chitosan-sulfadiazină (8a, 9a) – acid hialuronic. Acidul hialuronic, în concentrație de 0,5% se dizolvă în apă distilată prin agitare magnetică la temperatura camerei timp de 24 de ore. Soluţia obţinută se aduce treptat sub agitare peste o soluţie de chitosan/chitosan-sulfadiazină (8a, 9a) în acid acetic 2%. Raportul final al celor două soluţii, de acid hialuronic şi chitosan/chitosan-sulfadiazină este de 1:1.

Volume de 20 ml amestec chitosan/chitosan-sulfadiazină – acid hialuronic, au fost aduse în cutii Petri, cu diametrul de 9 cm. Probele obținute au fost înghețate, după care au fost supuse tehnicii de evaporare totală a solventului prin liofilizare.

6.1.4. Nano-fibre

Nano-fibrele pe bază de chitosan-sulfadiazină (8a) au fost obținute conform metodelor citate în literatura de specialitate (108, 140), cu unele modificări:

A. Prima metodă constă în amestecarea soluţiilor de chitosan- sulfadiazină (8a) (de concentrație 2% (m/v) în acid acetic 2% (m/v) cu polivinilalcool (PVA) 10% (m/v) în apă distilată, în proporţie de 1:3 şi supunerea amestecurilor rezultate procesului de electrospinning. B. Cea de-a doua metodă constă în dizolvarea policaprolactonei în cloroform, cu obținerea unei soluții de concentrație 10% (m/v) și supunerea acestei soluții procesului de electrospinning pentru obținerea nanofibrelor de policaprolactonă. Fibrele de PCL astfel obținute au fost imersate de 1-3 ori în soluţii de acid acetic conţinând chitosan-sulfadiazină (8a) 2% (m/v). După fiecare etapă de imersare acestea sunt uscate,

14

reticulate cu TPP 5%, spălate cu apă distilată pentru a îndepărta urmele de acid acetic neevaporate precum şi excesul de TPP neconsumat, și menținute la temperatura camerei timp de 24 de ore.

6.1.5. Micro/nano-particule În vederea obținerii micro/nano particulelor s-a optimizat mai întâi metoda de preparare a acestora pe bază de chitosan pur (CMMW, CLMW), parametri stabiliți fiind utilizați ulterior la obținerea particulelor pe bază de chitosan-sulfonamidă. Acest proces s-a realizat conform tehnicilor citate şi în literatura de specialitate (141, 142), cu unele modificări. Pentru măsurarea dimensiunii microparticulelor s-a folosit microscopul optic Zeiss Axiotech iar pentru măsurarea dimensiunii nanoparticulelor s-a folosit spectrometrul de difuzie dinamică a luminii (Dynamic Light Scattering- DLS) Malvern Autosizer 4800.

Optimizarea metodei de prepare a microparticulelor pe bază de chitosan 1mL soluţie de chitosan 0,1% în acid acetic 2% a fost adusă în picătură (sub agitare la 700 rpm, timp de 24 de ore) într-un volum de 5 mL soluţie apoasă TPP, folosit ca agent de reticluare extern. Concentraţia şi volumul soluţiei de chitosan precum și volumul soluţiei de TPP s-au păstrat constante variindu-se doar concentraţia soluţiei de TPP de la 10% la 0,005%.

Obținerea microparticulelor pe bază de chitosan-sulfonamidă Metoda optimizată pentru prepararea microparticulelor pe bază de chitosan s-a folosit la prepararea microparticulelor pe bază de chitosan- sulfonamidă. Astfel, 1mL soluţie derivat de chitosan 0,1% a fost adus în picătură şi sub agitare la 700 rpm, într-un volum de 5 mL soluţie apoasă TPP 1%. Microparticulele obţinute au fost separate prin centrifugare şi uscate prin liofilizare.

15

Optimizarea metodei de preparea a nanoparticulelor pe bază de chitosan 1 mL soluţie de chitosan 0,1 % în acid acetic 2% se aduce în picătură (sub agitare la 700 rpm, timp de 24 de ore) într-o soluţie apoasă de TPP 0,005%. Concentraţia şi volumul soluţiei de chitosan precum şi concentraţia soluţiei de TPP s-au păstrat constante, variindu-se doar volumul soluţiei de TPP de la 1 la 10 mL.

Obţinerea nanoparticulelor pe bază de chitosan-sulfonamidă Metoda optimizată pentru prepararea nanoparticulelor pe bază de chitosan s-a folosit la prepararea nanoparticulelor pe bază de chitosan- sulfonamidă. Astfel, 1mL soluţie derivat de chitosan 0,1% a fost adus în picătură şi sub agitare la 700 rpm într-un volum de 10 mL soluţie apoasă TPP 0,005%.

6.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII 6.2.1. Filme Filmele obținute pe bază de chitosan-sulfonamide (8a-f, 9a-f), conform tehnicii descrise (6.1.1) sunt colorate de la galben deschis la portocaliu, spre deosebire de cele ale chitosanului pur (CMMW, CLMW) care sunt incolore şi au o grosime de aproximativ 0,1 mm. Conform imaginilor AFM (fig.6.6), se poate observa faptul că filmele obținute pe bază de chitosan-sulfoanmide au suprafaţa mai rugoasă spre deosebire de cea a chitosanului pur (CMMW, CLMW), observându-se totodată și o creştere a numărului şi a intensităţii picurilor comparativ cu chitosanul de plecare.

A)

totodată și o creştere a numărului şi a intensităţii picurilor comparativ cu chitosanul de plecare. A)

16

.
.

B)

B) Fig.6.6. Imagini AFM: A - Chitosan cu greutate moleculară mică ( CLMW ) B -

Fig.6.6. Imagini AFM: A- Chitosan cu greutate moleculară mică (CLMW) B- Chitosan- sulfametoxidiazina (9c).

6.2.2. Membrane multistratificate <onion like> Prin suprapunerea a șase straturi derivat de chitosan cu structură sulfonamidică (9c) se obţin multimembrane. În fig.6.8 sunt redate imagini SEM ale multimembranelor realizate cu ajutorul microscopului Fei Quanta

200F.

A

realizate cu ajutorul microscopului Fei Quanta 200F. A B C Fig.6.8. Imagini SEM ale multimembranelor A-

B

realizate cu ajutorul microscopului Fei Quanta 200F. A B C Fig.6.8. Imagini SEM ale multimembranelor A-
realizate cu ajutorul microscopului Fei Quanta 200F. A B C Fig.6.8. Imagini SEM ale multimembranelor A-

C

Fig.6.8. Imagini SEM ale multimembranelor A- 2 straturi (x1000), B- 3 straturi (x4000), C-6 straturi (x2400)

Conform imaginilor SEM, se poate observa influența TPP-ului asupra fiecărui nivel de compus derivat de chitosan (9c); acesta permite separarea fiecărei membrane și vizualizarea tuturor celor șase straturi (fig. 6.8- C).

17

6.2.3. Spongi Spongii obținuți prin prelucrarea derivaţilor de chitosan, obţinuţi conform tehnicii descrise la capitolul 6.1.3 sunt coloraţi de la alb la portocaliu, şi au o grosime de aproximativ 0,2 cm. Imaginile SEM, obținute cu ajutorul microscopului Fei Quanta 200F indică faptul că spongii obținuți de la derivații de chitosan cu greutate moleculară mică, funcționalizați cu N-cloracetil sulfonamidele corespunzătoare (9a-f), au dimensiunea porilor mai mare decât derivații de chitosan cu greutate moleculară medie corespunzători (8a-f) (fig.6.10 şi

fig.6.11).

A

medie corespunzător i ( 8a-f ) (fig.6.10 şi fig.6.11). A B C Fig.6.10. Imagini SEM ale

B

medie corespunzător i ( 8a-f ) (fig.6.10 şi fig.6.11). A B C Fig.6.10. Imagini SEM ale
medie corespunzător i ( 8a-f ) (fig.6.10 şi fig.6.11). A B C Fig.6.10. Imagini SEM ale

C

Fig.6.10. Imagini SEM ale spongilor derivaţilor de chitosan cu greutate moleculară mică 9a (A), 9b (B), 9c (C): x500.

În cazul spongilor obținuți pe bază de copolimeri chitosan (CMMW, CLMW) /chitosan-sulfadiazină (8a, 9a) - acid hialuronic, s-a observat că aceștia prezintă o flexibilitate dar şi o stabilitate mai mare comparativ cu spongii obținuți doar pe bază de acid hialuronic. Aceste caracteristici îmbunătățite sunt datorate chitosanului (CMMW, CLMW), respectiv chitosan-sulfadiazinei (8a, 9a), care pe lângă acţiunea biologică, prezintă și un important rol mecanic.

18

D

D E F Fig.6.11. Imagini SEM ale spongilor derivaţilor de chitos an cu greutate moleculară medie
D E F Fig.6.11. Imagini SEM ale spongilor derivaţilor de chitos an cu greutate moleculară medie

E

D E F Fig.6.11. Imagini SEM ale spongilor derivaţilor de chitos an cu greutate moleculară medie

F

Fig.6.11. Imagini SEM ale spongilor derivaţilor de chitosan cu greutate moleculară medie 8a (D), 8b (E), 8c (F): x500.

6.2.4. Nano-fibre Nanofibre de chitosan-sulfadiazină (8a)- polivinilalcool. Nanofibrele obținute prin electrospinningul amestecului chitosan-sulfadiazina (8a) polivinilalcool, au o dimensiune de 0,96 µm (fig. 6.12).

polivinilalcool, au o dimensiune de 0,96 µm (fig. 6.12). Fig.6.12. Imagini SEM ale nanofibrelor de

Fig.6.12. Imagini SEM ale nanofibrelor de chitosan-sulfadiazina (8a)- polivinilalcool

Dezavantajul acestei metode constă în faptul că fibrele obţinute sunt instabile şi uşor solubile în apă, motiv pentru care s-a apelat la cea de- a doua metodă ce folosește ca și polimer secundar, policaprolactona.

Nanofibre de chitosan-sulfadiazină (8a) –policaprolactonă. Nanofibrele obținute pe bază de policaprolactonă au fost imersate în soluția de chitosan-sulfadiazină (8a) conform tehnicii descrise la capitolul 6.1.4, rezultând fibre mono și tristratificate. Utilizarea nanofibrelor de policaprolactonă ca și suport pentru derivatul de chitosan 8a, prezintă

19

avantajul stabilității în timp precum și al faptului că acestea sunt insolubile în apă comparativ cu fibrele de chitosan-sulfadiazină – polivinilalcool obținute prin prima metodă. Din imaginile prezentate în fig. 6.13 se pot observa diferenţele care apar pe măsură ce sunt suprapuse mai multe straturi.

A

apar pe măsură ce sunt suprapuse mai multe straturi. A B C Fig.6.13. Imagini SEM (X1700)

B

apar pe măsură ce sunt suprapuse mai multe straturi. A B C Fig.6.13. Imagini SEM (X1700)
apar pe măsură ce sunt suprapuse mai multe straturi. A B C Fig.6.13. Imagini SEM (X1700)

C

Fig.6.13. Imagini SEM (X1700) ale fibrelor pe bază de policaprolactonă A - fibre de PCL; B- fibre de PCL monostratificate cu chitosan-sulfadiazină (8a); C- fibre de PCL tristratificate cu chitosan-sulfadiazină (8a).

6.2.5. Micro/nano-particule Optimizarea metodei de preparare a microparticulelor de chitosan (CMMW) Utilizarea de TPP în concentrație de 0,005% a condus la obținerea de nanoparticule, dimensiunea acestora fiind de ordinul a 620 nm, în timp ce concentraţii de TPP de ordinul 0,01%-10% permite obținerea de microparticule cu dimensiuni ce variază, dependent de concetrația folosită, de la 39,5 µm la 75,17 µm.

Obținerea microparticulelor pe bază de chitosan-sulfonamidă În cazul derivaților de chitosan (8a-f, 9a-f) dimensiunea microparticulelor (cuprinsă între 14,56 µm și 25,81 µm), obținute la o concentrație de TPP 1%, este mai mică comparativ cu cea obținută în cazul chitosanului pur (64,38 µm) la aceeași concentrație de TPP.

20

Optimizarea metodei de preparare a nanoparticulelor de chitosan (CMMW):

S-a observat ca cele mai mici dimensiuni (390,2 nm) au fost obținute în condițiile utilizării a 10 ml soluție de TPP 0,005 %, volum care ulterior a fost folosit pentru obținerea de nanoparticule de chitosan- sulfonamide.

Obținerea nanoparticulelor pe bază de chitosan-sulfonamidă:

Conform rezultatelor obținute în cazul nanoparticulelor, dimensiunea acestora pentru derivații de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f) este cuprinsă între 408,5 nm și 952,1 nm, în timp ce în cazul derivaților de chitosan cu greutate moleculară mică (9a-f) este cuprinsă între 256,6 nm și 622,2 nm.

CAPITOLUL 7. CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A MATRICILOR POLIMERICE OBȚINUTE PE BAZĂ DE CHITOSAN FUNCȚIONALIZAT Filmele şi spongii obținuți pe baza derivaților de chitosan- sulfonamide, conform tehnicilor descrise în capitolul 6, au fost caracterizaţi din punct de vedere al porozităţii, al capacităţii de umflare şi al caracterului hidrofil/hidrofob.

7.1. MATERIALE ŞI METODE 7.1.1. Testul de porozitate Spongii obţinuţi prin prelucrarea derivaţilor de chitosan funcționalizati cu N-cloracetil- sulfonamide, s-au studiat din punct de vedere al porozității, conform metodelor descrise în literatura de specialitate (147).

Într-o primă etapă, spongii sub formă de discuri au fost cântăriți și măsurați pentru a se stabili greutatea respectiv volumul inițial, după care au fost imersați în alcool etilic absolut, pentru saturare. După 24 de ore probele au fost recântărite iar porozitatea s-a determinat prin aplicarea următoarei formule de calcul:

P = (W2-W1)/ρ xV1 în care: W1 - greutatea probei înainte de imersie; W2 - greutatea probei după imersare; V 1 - volumul probei înainte de imersie; ρ - densitatea alcoolului etilic absolut.

21

(3)

Pentru fiecare probă, testul s-a realizat în triplicat.

7.1.2. Testul de umflare

S-a determinat gradul de umflare la echilibru, conform metodei descrise în literatura de specialitate (148) cu unele modificări. Membranele reticulate (spongi şi filme) au fost tăiate în fragmente de aproximativ aceeași dimensiune și s-a determinat greutatea în stare uscată (Wd), după care au fost imersate în apă distilată la temperatura camerei. La fiecare 15 minute, probele au fost scoase, uscate cu ajutorul

hârtiei de filtru și cântărite pentru a se determina greutatea în stare umedă (Ww). Operația s-a repetat până la stabilirea echilibrului termodinamic. Capacitatea de umflare, notată cu MSR (Membrane Swelling Ratio) a fost calculată folosind următoarea formula, de calcul:

MSR (%) = (Ww- Wd)/ Wd x 100 în care: Wd greutatea probei uscate; Ww greutatea probei umede la echilibru termodinamic.

(4)

7.1.3. Metoda unghiului de contact

Unghiul de contact al filmelor de chitosan (CMMW, CLMW) și chitosan-sulfonamide (8a-f, 9a-f) s-a determinat prin metoda picăturii (“sessile drop method”), cu ajutorul unui echipament de tipul System OCA

20.

Pe suprafața de sticlă ce conține filmul de chitosan (CMMW, CLMW)/ derivat de chitosan (8a-f, 9a-f) se depun picături de 1µL apă distilată, utilizând o seringă Halilton de 5 µL, „forma picăturii” fiind proiectată pe ecran. Se măsoară unghiul format între lichidul pur și suprafața solidă, pe parcursul a 30 de secunde, înregistrându-se câte o valoare la fiecare secundă. Pentru fircare compus s-a realizat o serie de câte trei experimente.

7.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

7.2.1. Testul de porozitate

În seria derivaților de chitosan-sulfonamidă cu greutate moleculară medie (8a-f), porozitatea spongilor este cuprinsă între 68,96% (derivatul 8e) și 94,49 % (derivatul 8a).

Pentru marea majoritate a derivaților porozitatea este mai mică comparativ cu cea a chitosanului pur CMMW (84,42%), exceptând

22

derivatul 8a (94,49%). În seria spongilor dezvoltați pe baza derivaților de chitosan- sulfonamidă cu greutate moleculară mică (9a-f), porozitatea este cuprinsă între 64,67% pentru derivatul 9d și 86,60% pentru derivatul 9a. Pentru marea majoritate a derivaților (9b-f) porozitatea este mai mică comparativ cu cea a chitosanului pur CLMW (81,77%).

7.2.2. Testul de umflare Capacitatea de umflare a filmelor În cazul chitosanului cu greutate moleculară medie (CMMW), echilibrul termodinamic se instalează după 60 min, capacitatea de umflare având valoarea de 190%. Capacitatea de umflare a filmelor derivaților de chitosan se menține în jurul valorii chitosanul pur, excepție făcând derivații 8a și 8c, ale căror valori sunt mai reduse (122%, respectiv 130%), reducere care poate fi explicată prin caracterul hidrofob al derivatului sulfonamidic utilizat la funcționalizarea chitosanului. În cazul chitosanului cu greutate moleculară mică (CLMW), echilibrul termodinamic s-a instalat după 60 de min cu o valoare a gradului de umflare de 138%. Comparativ cu chitosanul părinte, derivații 9a și 9e prezintă o capacitate de umflare mai mare (215% respectiv 162%), în timp ce pentru derivații 9(b,c,d,f) gradul de umflare a fost mai redus (între 99% și 131%)

Capacitatea de umflare a spongilor În cazul chitosanului pur (CMMW), echilibrul termodinamic se instalează după 60 de min cu o capacitate de umflare de 1800%. Exceptând compusul 8c (cu o capacitate de 1260%), toți ceilalți derivați de chitosan (8a, 8b, 8d, 8e, 8f) au prezentat un grad de umflare superior chitosanului pur (cuprins între 1850 și 2060%). În cazul chitosanului pur (CLMW), echilibrul termodinamic se instalează după 60 de min cu o capacitate de umflare de 2350%. Majoritatea derivaților de chitosan (9a-f) au o capacitate de umflare mai mică decât cea a chitosanului pur (cuprinsă între 1250-1620%), excepție făcând compusul 9e pentru care s-a înregistrat un grad de umflare de

3000%.

23

7.2.3. Metoda unghiului de contact În cazul chitosanului pur cu greutate moleculară medie (CMMW), valoarea unghiului de contact la momentul 0 (momentul în care are loc contactul inițial dintre picătura de apă şi probă), este de 75,06°, în timp ce pentru derivații de chitosan-sulfonamidă (8a-f), unghiul de contact la momentul 0 variază între 57,98° şi 87,84°, dependent de natura sulfonamidei cu care s-a realizat funcționalizarea chitosanului. Se poate astfel aprecia, că deși pentru unii derivați (8d, 8f) valoarea unghiului de contact înregistrată pe parcursul a 30 de secunde a fost ușor crescută comparativ cu valoarea înregistrată pentru chitosanul cu greutate moleculară medie, compușii rămân hidrofili, valoarea înregistrată fiind mai mică decât 90°. În cazul chitosanului cu greutate moleculară mică (CLMW) se realizează în secunda 0 un unghi de 94,89°, în timp ce in cazul derivaţilor săi cu structură sulfonamidică (9a-f), unghiurile formate au valori cuprinse între 38,03° şi 77,23°. Cu excepția compusului chitosan-sulfametoxidiazină (8c), toți derivații de chitosan cu greutate moleculară medie au o hidrofilie egală sau ușor mai redusă decât a chitosanului părinte. Modificările chimice realizate pe structura chitosanului cu greutate moleculară mică, duc însă la obţinerea unor derivaţi cu hidrofilie crescută spre deosebire de cea a chitosanului pur, cel mai hidrofil derivat fiind cel provenit de la sulfizoxazol (9f).

CAPITOLUL 8. EVALUAREA BIOLOGICĂ A COMPUȘILOR CU STRUCTURĂ SULFONAMIDICĂ Compușii cu structură sulfonamidică, derivați de azetidin-2-onă și chitosan, intermediari și finali, a căror sinteză este prezentată în capitolul 4, au fost evaluați din punct de vedere biologic, urmărindu-se determinarea potențialului antimicrobian și antioxidant. În plus, pentru matricile tip filme și spongi pe bază de chitosan-sulfonamide s-a evaluat capacitatea de biodegradare in vitro, utilizând teste enzimatice.

8.1. MATERIALE ŞI METODE

8.1.1. Evaluarea acţiunii antimicrobiene in vitro Potențialul antimicrobian al derivaților cu structură sulfonamidică s-a determinat pe tulpini bacteriene Gram pozitive (Staphylococcus,

24

Enterococcus) și Gram negative (Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Pseudomonas).

8.1.1.1. Determinarea Concentraţiei Minime Inhibitorii

Cuantificarea potențialei activităţi antimicrobiene a derivaților de azetidin-2-onă (intermediari și finali) s-a realizat prin stabilirea concentrației minime inhibitorii (CMI) folosind metoda diluţiilor seriale conform recomandărilor EUCAST DEF. 3.1 (157). S-au folosit următoarele tulpini bacteriene: Staphyloccoccus

aureus ATCC 6583; Staphyloccoccus epidermidis ATCC 12228; Enterococcus faecalis ATCC 25912; Klebsiella pneumoniae CIP 53153; Proteus vulgaris CIP 104989; Citrobacter freundii CIP 5732; Enterobacter cloacae CIP 103475; Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa CIP 82118. Sulfanilamida şi ampicilina au fost folosite ca martori pozitivi.

8.1.1.2. Determinarea diametrului zonei de inhibiție

Activitatea antimicrobiană și antifungică a derivaților de chitosan cu structură sulfonamidică (8a-f, 9a-f) s-a determinat prin metoda difuzimetrică conform protocolului CLSI 2012 (158). Activitatea antimicrobiană a fost testată pe următoarele tulpini bacteriene: Staphyloccoccus aureus ATCC 25923; Sarcina lutea ATCC 9341; Bacillus cereus ATCC 14579; Bacillus subtilis; Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa CIP 82118 Pentru determinarea acțiunii antifungice s-au folosit tulpinile:

Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata și Candida sake.

8.1.2. Evaluarea potențialului antioxidant in vitro Potențialul antioxidant al derivaților de azetidin-2-onă și al derivaților de chitosan cu structură sulfonamidică, a fost evaluat utilizând următoarele teste in vitro: capacitatea totală antioxidantă, puterea reducătoare şi capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH. Capacitatea totală antioxidantă a compuşilor testaţi a fost evaluată folosind metoda fosfomolibdenică după tehnica standard (159), cu câteva modificări. Puterea reducătoare a compuşilor sintetizaţi a fost cuantificată prin metoda descrisă în literatură (160) cu câteva modificări.

25

Capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH (1,1-difenil-2- picrilhidrazil) a fost evaluată conform metodei descrise în literatură (161) cu câteva modificări.

8.1.3. Evaluarea capacităţii de biodegradare in vitro Matricile polimerice reticulate (filme, spongi) pe bază de derivați de chitosan cu structură sulfonamidică au fost studiate din punct de vedere al biodegradării, conform tehnicii descrise în literatura de specialitate (162). Metoda se bazează pe utilizarea lizozimului 152975 UI/mg, dizolvat în mediu de tampon fosfat, pH 7,4 în concentrație 10000 UI/mL, la temperatura de 37ºC.

8.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII

8.2.1. Evaluarea acţiunii antimicrobiene in vitro Studiul a fost realizat în colaborare cu Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară, Iaşi precum şi cu Departamentul de Microbiologie din cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie "Gigore T. Popa" Iaşi, Facultatea de Farmacie.

8.2.1.1. Determinarea Concentrației Minime Inhibitorii În seria derivaților de hidrazină cu structură sulfonamidică (3a- f), pentru majoritatea derivaților, valorile CMI în cazul celor nouă tulpini bacteriene testate au fost de 512 µg/mL. Cel mai activ din serie s-a dovedit a fi compusul 3d (derivatul sulfadimetoxinei) care la concentrație de 256 µg/mL a inhibat dezvoltarea pentru majoritatea tulpinilor bacteriene (fig.

8.1).

26

A

A B Fig.8.1. Valorile CMI (µg/mL) ale sulfonamidelor ( 1a-f ) (A) şi ale hidrazinelor sintetizate

B

A B Fig.8.1. Valorile CMI (µg/mL) ale sulfonamidelor ( 1a-f ) (A) şi ale hidrazinelor sintetizate

Fig.8.1. Valorile CMI (µg/mL) ale sulfonamidelor (1a-f) (A) şi ale hidrazinelor sintetizate (3a-f) (B).

K.p- Klebsiella pneumoniae, P.v- Proteus vulgaris, C.f- Citrobacter freundii, E.c. 1 - Enterobacter cloacae, S.a- Staphylococcus aureus, S.e- Staphylococcus epidermidis, E.c. 2 - Escherichia coli, E.f- Enterococcus faecalis, P.a- Pseudomonas aeruginosa.

Comparativ cu activitatea sulfonamidelor părinte, derivatul N 4 - hidrazinoacetilamino-sulfadimetoxina (3d) s-a dovedit mai activ decât sulfadimetoxina pe tulpinile Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae și Pseudomonas aeruginosa, valoarea CMI pentru aceste tulpini fiind de 256 µg/mL, comparativ cu sulfadimetoxina a cărei valoare CMI a fost de 512 µg/mL. În seria hidrazonele cu structură sulfonamidică, plecând de la hidrazina corespunzătoare (3a) la care valoarea CMI a fost de 512 µg/mL pentru toate tulpinile bacteriene testate, prin condensare cu benzaldehida, 4-fluorbenzaldehida și 4-brom-benzaldehida rezultă hidrazone mai active pe Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis și Enterococcus faecalis (fig. 8.2).

27

În seria derivaților de sulfizoxazol (4f1-6), rezultatele obținute au evidențiat valori ale CMI de 512 µg/mL pentru toate tulpinile bacteriene, cu excepia compusul 4f5 (obținut prin condensarea hidrazinei 3a cu 4- hidroxi-benzaldehida), care a fot mai activ pe Pseudomonas aeruginosa (CMI = 256 µg/mL).

A

mai activ pe Pseudomonas aeruginosa (CMI = 256 µg/mL). A B Fig.8.2. Valorile CMI (µg/mL) ale

B

activ pe Pseudomonas aeruginosa (CMI = 256 µg/mL). A B Fig.8.2. Valorile CMI (µg/mL) ale hidrazonelor,

Fig.8.2. Valorile CMI (µg/mL) ale hidrazonelor, derivați de sulfadiazină (4a1- 6)(A) şi sulfizoxazol (4f1-6)(B).

K.p- Klebsiella pneumoniae, P.v- Proteus vulgaris, C.f- Citrobacter freundii, E.c. 1 - Enterobacter cloacae, S.a- Staphylococcus aureus, S.e- Staphylococcus epidermidis, E.c. 2 - Escherichia coli, E.f- Enterococcus faecalis, P.a- Pseudomonas aeruginosa.

În seria azetidinonelor corespunzătoare sulfadiazinei (5a1-6) și sulfizoxazolului (5f1-6), toți compuși testați au valori ale CMI de 512 µg/mL pentru toate cele nouă tulpini bacteriene (fig. 8.3). Se constată astfel că pentru cele două serii, inchiderea ciclului de azetidin-2-onă (β-lactamic), nu a avut o influență favorabilă asupra activității antimicrobiene, contrar așteptărilor.

28

A

A B Fig.8.3. Valorile CMI (µg/mL) ale azetidinonelor, derivați de sulfadiazină ( 5a1- 6 ) (A)

B

A B Fig.8.3. Valorile CMI (µg/mL) ale azetidinonelor, derivați de sulfadiazină ( 5a1- 6 ) (A)

Fig.8.3. Valorile CMI (µg/mL) ale azetidinonelor, derivați de sulfadiazină (5a1- 6)(A) şi sulfizoxazol (5f1-6)(B).

K.p- Klebsiella pneumoniae, P.v- Proteus vulgaris, C.f- Citrobacter freundii, E.c. 1 - Enterobacter cloacae, S.a- Staphylococcus aureus, S.e- Staphylococcus epidermidis, E.c. 2 - Escherichia coli, E.f- Enterococcus faecalis, P.a- Pseudomonas aeruginosa.

Comparativ cu martorii folosiţ, toţi compuşii testaţi sunt mai activi decât sulfanilamida dar mai puţin activi decât ampicilina, ale căror valori CMI sunt prezentate în tabelul 8.1.

Tabel 8.1. Valorile CMI (µg/mL) ale martorilor pozitivi folosiţi

Martor

S.a.

S.e.

E.f.

K.p.

P.v.

C.f.

E.c. 1

E.c. 2

P.a

.

Sulfanilamida

>1000

>1000

>1000

>1000

>1000

>1000

>1000

>1000

800

Ampicilina

35.8

3

3

16

-

-

8

35.8

128

S.a.-Staphylococcus aureus, S.e.-Staphylococcus epidermidis, E.f.-Enterococcus faecalis, K.p.-Klebsiella pneumoniae, P.v.- Proteus vulgaris, C.f.-Citrobacter freundii, E.c. 1 - Enterobacter cloacae, E.c. 2- Escherichia coli, P.a.-Pseudomonas aeruginosa.

8.2.1.2. Determinarea diametrului zonei de inhibiție Rezultatele determinării potențialului antibacterian al probelor pregătite sub formă de spongi pe bază de derivați de chitosan cu structură sulfonamidică, exprimate prin diametrul zonei de inhibiție, sunt prezentate în tabelele 8.2 și 8.3. În cazul derivaților de chitosan cu greutate moleculară medie (8a- f), prelucrați sub formă de spongi, s-a observat că derivații 8b (derivat de

29

sulfamerazină), 8d (derivat de sulfadimetoxină) și 8e (derivat de sulfametoxazol) prezintă activitate antimicrobiană apreciabilă comparativ cu chitosanul, pe toate tulpinile bacteriene cu excepția speciei de Pseudomonas aeruginosa CIP 82118 față de care au fost inactivi. Pe tulpinile bacteriene menționate chitosanul cu greutate moleculară medie (CMMW) s-a dovedit a fi inactiv la concentrația de 2,5 mg/disc.

Tabel 8.2. Diametrul zonei de inhibiție (mm) pentru derivații chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f).

Compus

 

Diamterul zonei de inhibiție (mm)

 

S.a.

S.l.

B.c.

B.s.

E.c.

P.a.

CMMW

0

0

0

0

0

0

8a

0

0

0

0

0

0

8b

11

26

15

12

11

0

8c

0

15

0

0

0

0

8d

10

32

18

19

17

0

8e

12

26

12

9

12

0

8f

0

0

0

0

0

0

S.a. = Staphloccocus auresus ATCC 25923, S.l.= Sarcina lutea ATCC 9341, B.c.= Bacillus cereus ATCC 14579, B.s.= Bacillus subtilis, E.c.= Escherichia coli ATCC 25922, P.a.= Pseudomonas aeruginosa CIP 82118.

În cazul derivaţilor de chitosan cu greutate moleculară mică (9a-f), rezultatele obținute (Tabel 8.3) au evidențiat că majoritatea derivaților sunt mai activi decât chitosanul cu greutate moleculară mică (CLMW), care la concentrația de 2,5 mg/disc s-a dovedit a fi inactiv pe toate tulpinile bacteriene testate. Totodată derivații (9a-f) s-au dovedit mai puțin activi comparativ cu analogii lor cu greutate moleculară medie (8a-f).

Evaluarea activității antifungice a derivaților de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f) și mică (9a-f), prelucrați sub formă de spongi, a evidențiat faptul că niciunul dintre compușii testați nu prezintă activitate inhibitorie, la concentrație de 2,5 mg/disc, pe speciile Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata și Candida sake.

30

Tabel 8.3. Diametrul zonei de inhibiție (mm) pentru derivații chitosan cu greutate moleculară medie (9a-f).

Compus

 

Diamterul zonei de inhibiție (mm)

 

S.a.

S.l.

B.c.

B.s.

E.c.

P.a.

CLMW

0

0

0

0

0

0

9a

0

7

0

0

0

0

9b

0

32

16

20

0

0

9c

0

15

0

0

0

0

9d

0

32

17

19

0

0

9e

0

32

15

0

0

0

9f

0

0

0

0

0

0

S.a. = Staphloccocus auresus ATCC 25923, S.l.= Sarcina lutea ATCC 9341, B.c.= Bacillus cereus ATCC 14579, B.s.= Bacillus subtilis, E.c.= Escherichia coli ATCC 25922, P.a.= Pseudomonas aeruginosa CIP 82118.

8.2.2. Evaluarea potențialului antioxidant in vitro Compușii sintetizați, intermediari și finali, derivați de azetidin-2- onă precum și derivații funcționalizați ai chitosanului, au fost evaluați privind potențialul lor antioxidant, în vederea includerii celor mai activi în matrici polimerice cu potențială acțiune cicatrizantă și regenerant tisulară.

8.2.2.1. Evaluarea potențialului antioxidant al derivaților de hidrazină cu structură sulfonamidică Capacitatea totală antioxidantă (CTA) Metodă se bazează pe reducerea Mo +6 la Mo +5 cu formarea complexului fosfat/ Mo +5 de culoare albastru-verzuie la pH acid, a cărei intensitate depinde de puterea reducătoare a compusului testat. Rezultatele obținute, exprimate în concentrația efectivă 50 (EC50) sunt prezentate în fig. 8.4 pentru sulfonamidele părinte și fig. 8.5 pentru hidrazinele corespunzătoare.

31

Fig. 8.4. CTA pentru compușii 1a -f. Fig. 8.5. CTA pentru compușii 3a - f
Fig. 8.4. CTA pentru compușii 1a -f. Fig. 8.5. CTA pentru compușii 3a - f

Fig. 8.4. CTA pentru compușii 1a-f.

Fig. 8.5. CTA pentru compușii 3a-f și AA.

Din analiza datelor se observă că toți derivații de hidrazină (3a-f) sunt mai activi decât sulfonamidele clasice (1a-f), ceea ce susține că modularea chimică realizată are influență pozitivă asupra potențialului antioxidant. În raport cu acidul ascorbic (AA), la care valoarea EC50 a fost de 0,0067 mg/mL, compușii testați s-au dovedit a fi mai puțin activi.

Puterea reducătoare. Derivații de hidrazină (3a-f) reduc Fe 3+ din complexul fericianură la Fe 2+, cu apariția unei colorații galben-verzuie a cărei intensitate depinde de puterea reducătoare a fiecărui compus. Derivatizarea sulfonamidelor părinte, prin introducerea grupării acetil-hidrazino determină creşterea efectului reducător, toţi compuşii testaţi fiind mai activi decât sulfonamidele de plecare (fig. 8.6, 8.7). Astfel, cei mai activi comparativ cu sulfonamidele părinte, au fost compușii 3b (EC50 = 0,0254 mg/mL) ce s-a dovedit a fi de 47 ori mai activ decât sulfamerazina (1b, EC50 = 1,1991 mg/mL) și compusul 3c (EC50 = 0,0344 mg/mL) ce s-a dovedit a fi de 34 ori mai activ decât sulfametoxidiazina (1c, EC50 = 1,1800 mg/mL). În raport cu acidul ascorbic (AA), cu o valoare EC50 = 0,0075 mg/mL, compușii testați s-au dovedit a fi mai puțin activi.

32

Fig. 8.6 Puterea reducătoare a 1a-f . Fig. 8.7 Puterea reducătoare a 3a-f și AA.

Fig. 8.6 Puterea reducătoare a 1a-f.

Fig. 8.6 Puterea reducătoare a 1a-f . Fig. 8.7 Puterea reducătoare a 3a-f și AA. Capacitatea

Fig. 8.7 Puterea reducătoare a 3a-f și AA.

Capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH. Dacă în cazul sulfonamidelor capacitatea de inhibare este foarte scăzută, variind între 0-36,53%, în cazul derivaților de hidrazină procentele de inhibiție înregistrate au fost mai mari de 50%, variind între 51,25%- 97,45% (fig. 8.8, 8.9)

mari de 50%, variind între 51,25% - 97,45% (fig. 8.8, 8.9) Fig. 8.8. Capacitatea antiDPPH a
mari de 50%, variind între 51,25% - 97,45% (fig. 8.8, 8.9) Fig. 8.8. Capacitatea antiDPPH a

Fig. 8.8. Capacitatea antiDPPH a 1a-f. Fig. 8.9. Capacitatea antiDPPH a 3a-f.

Toți derivații de hidrazină sunt mai activi decât sulfonamidele clasice corespunzătoare și pentru cei mai mulți dintre ei activitatea este comparabilă cu cea a acidului ascorbic (AA) pentru care procentul de

33

inhibiție al radicalilor liberi este 97,59%.

8.2.2.2. Evaluarea potențialului antioxidant al hidrazonelor cu structură sulfonamidică Capacitătea totală antioxidantă (CTA) Valorile EC50, referitoare la capacitatea totală antioxidantă a hidrazonelor studiate sunt prezentate în fig.8.10 (4a1-6) și în fig 8.11 (4f1-

6).

prezentate în fig.8.10 (4a1- 6) și în fig 8.11 (4f1 - 6). Fig. 8.10. CTA pentru
prezentate în fig.8.10 (4a1- 6) și în fig 8.11 (4f1 - 6). Fig. 8.10. CTA pentru

Fig. 8.10. CTA pentru compușii 4a 1-6 .

Fig. 8.11. CTA pentru compușii 4f 1-6 .

Cea mai activă hidrazonă provenită de la sulfadiazină este 4a3 iar cea mai activă provenită de la sulfizoxazol este 4f3. Ambii compuşi sunt rezultatul reacției de condensare dintre hidrazinele corespunzătoare cu 4- Cl-benzaldehida.

Puterea reducătoare În seria derivaților de sulfadiazină (4a1-6), compușii 4a5 (EC50 = 0,051 mg/mL) și 4a6 (EC50 = 0,0503 mg/mL) sunt cei mai activi; ei s-au dovedit a fi de aproximativ 11 ori mai activi decât sulfadiazina (EC50 = 0,5760 mg/mL) (fig. 8.12). În seria derivaților de sulfizoxazol, compusul 4f5 (EC50 = 0,021 mg/mL) este de 16 ori mai activ decât sulfizoxazolul (EC50 = 0,3497 mg/mL) (fig. 8.13). Reacția de condensare a derivaților de hidrazină (3a, 3f) cu diferite aldehide aromatice (benzaldehida, 4-fluorbenzaldehida, 4-clorbenzal- dehida, 4-brombenzaldehida, 4-hidroxibenzaldehida, 4-nitrobenzaldehida) a avut drept rezultat intensificarea acțiunii antioxidante, toţi compuşii

34

testaţi fiind mai activi decât sulfonamidele de plecare (1a și 1f).

mai activi decât sulfonamidele de plecare (1a și 1f). Fig. 8.12. Puterea reducătoare a 4a 1

Fig. 8.12. Puterea reducătoare a 4a 1-6 .

1f). Fig. 8.12. Puterea reducătoare a 4a 1 - 6 . Fig. 8.13. Puterea reducătoare a

Fig. 8.13. Puterea reducătoare a 4f 1-6 .

Capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH. Dependent de capacitatea antiradicalică, compuşii testați decolorează soluţia de DPPH sau îi modifică culoare din violet la galben. În cazul hidrazonelor derivate de la sulfadiazină (4a1-6), cei mai activi s-au dovedit a fi compușii 4a5 (I% = 93,17%) și 4a2 (I% = 91,40%) rezultați în urma condensării derivatului de hidrazină corespunzător (3a) cu 4-hidroxibenzaldehida respectiv cu 4-fluorbenzaldehida (fig. 8.14).

respectiv cu 4-fluorbenzaldehida (fig. 8.14). Fig. 8.14. Capacitatea antiDPPH a 4a 1 - 6 . Fig.

Fig. 8.14. Capacitatea antiDPPH a 4a 1-6 .

(fig. 8.14). Fig. 8.14. Capacitatea antiDPPH a 4a 1 - 6 . Fig. 8.15. Capacitatea antiDPPH

Fig. 8.15. Capacitatea antiDPPH a 4f 1-6 .

35

În seria sulfizoxazolului cei mai activi compuși s-au dovedit hidrazonele rezultate în urma condensării cu benzaldehida (compus 4f1) cu I% = 48,17%, 4-brombenzaldehida (compus 4f4) cu I% = 42,25% și 4- hidroxibenzaldehida (4f5) cu I% = 61,20% (fig. 8.15).

8.2.2.3. Evaluarea potențialului antioxidant al azetidinonelor cu structură sulfonamidică Capacitatea totală antioxidantă Formarea ciclului de azetidin-2-onă (β-lactamic) în urma reacției de ciclizare a hidrazonelor corespunzătoare cu clorura acidului cloracetic, are drept rezultat o intensificare a acțiunii antioxidante, toți compușii fiind mult mai activi decât sulfonamidele părinte, sulfadiazina respectiv sulfizoxazolul. Rezultatele obținute, exprimate în valorile EC50 sunt prezentate în fig. 8.16 (5a1-6) și fig 8.17 (5f1-6).

prezentate în fig. 8.16 (5a1- 6) și fig 8.17 (5f1 -6). Fig.8.16. CTA pentru compușii 5a1

Fig.8.16. CTA pentru compușii 5a1-6.

fig 8.17 (5f1 -6). Fig.8.16. CTA pentru compușii 5a1 -6. Fig.8.17. CTA pentru compușii 5f1 -6.

Fig.8.17. CTA pentru compușii 5f1-6.

Puterea reducătoare În cazul azetidinonelor 5a1-6, valorile EC50 sunt cuprinse între 0,094 mg/mL şi 0,227 mg/mL în timp ce sulfadiazina 1a are o valoare egală cu 0,5760 mg/mL (fig 8.18), ceea ce înseamnă o intensificare a puterii reducătoare de 2,5 până la 6,1 ori. Azetidinonele 5f1-6 prezintă valori EC50 cuprinse între 0,093 mg/ml şi 0,318 mg/ml în timp ce sulfizoxazolul 1f are o valoare egală cu 0,347 mg/mL (fig 8.19), ceea ce înseamnă o intensificare a puterii reducătoare de 1,1 până la 3,7 ori.

36

Fig.8.18. Puterea reducătoare a 5a1-6. Fig.8.19. Puterea reducătoare a 5f1-6. Capacitatea de inhibare a radicalilor

Fig.8.18. Puterea reducătoare a 5a1-6.

Fig.8.18. Puterea reducătoare a 5a1-6. Fig.8.19. Puterea reducătoare a 5f1-6. Capacitatea de inhibare a radicalilor

Fig.8.19. Puterea reducătoare a 5f1-6.

Capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH. În cazul derivaților de sulfadiazină (5a1-6), s-a observat că toți compușii studiați au prezentat o apreciabilă activitate antiradicalică, procentul de inhibiție variind între 61,28%-80,94% (fig. 8.20). În seria sulfizoxazolului, azetidinonele 5f1-6 au prezentat valori ale procentului de inhibiție cuprinse între 33,81% şi 64,28% (fig. 8.21).

de inhibiție cuprinse între 33,81% şi 64,28% (fig. 8.21). Fig. 8.20 . Capacitatea antiDPPH a 5a

Fig. 8.20. Capacitatea antiDPPH a 5a 1-6 .

6 .

(fig. 8.21). Fig. 8.20 . Capacitatea antiDPPH a 5a 1 - 6 . 6 . Fig.

Fig. 8.21. Capacitatea antiDPPH a 5f 1-

37

8.2.2.4. Evaluarea potențialului antioxidant al derivaţilor de chitosan cu structură sulfonamidică Capacitatea totală antioxidantă Derivații de chitosan (8a-f) au prezentat valori ale EC50 cuprinse între 10,28 mg/mL și 1,14 mg/mL, în timp ce pentru chitosan (CMMW) valoarea înregistrată a fost de 80,11 mg/mL, ceea ce însemană are loc o intensificare de 7,8 până la 70 ori a acțiunii antioxidante. În cazul derivaţilor de chitosan cu greutate moleculară mică (9a-f) valorile înregistrate sunt comparabile cu valoarea stabilită pentru chitosanul cu greutate moleculară mică (CLMW). Astfel valorile EC50 pentru derivații 9a-f sunt cuprinse între 3,4-10,61 mg/mL (fig.8.23) în timp ce pentru CLMW valoarea înregistrată a fost de 10,43 mg/mL.

Puterea reducătoare Puterea reducătoare a derivaților de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f) este mai intensă comparativ cu chitosanul, cu exceptia derivatului 8c, obținut în urma derivatizării cu sulfametoxidiazina, a cărei valoare EC50 (10,92 mg/mL) este mai mare decât cea a CMMW (6,65 mg/mL). În seria derivaţilor de chitosan cu greutate moleculară mică (9a-f), cu excepția compusului 9e (derivatul sulfametoxazolului) pentru care valoarea EC50 (3,52 mg/mL) a fost mai mare decât a chitosanului CLMW (1,67 mg/mL), toți ceilalți compuși au fost mai activi decât chitosanul prezentând valori ale EC50 cuprinse între 0,1783 și 1,179 mg/mL.

Capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH În cazul derivaților de chitosan cu greutate moleculară medie (8a- f), s-a observat că toți compușii studiați sunt mai activi decât CMMW în inhibarea radicalilor liberi DPPH, procentul de inhibiție variind între 11,16-67,89%, în timp ce pentru CMMW valoarea înregistrată a fost de

8,14%.

Pentru derivații de chitosan cu greutate moleculară mică (9a-f), procentul de inhibiție variază între 13,61% şi 81,94%, în timp ce CLMW a înregistrat o valoare de 13,21%.

8.2.3. Evaluarea capacităţii de biodegradare in vitro

Derivații

de

chitosan cu greutate

38

moleculară

medie

și

mică,

prelucrați sub formă de matrice polimerice tip spongi și filme, au fost testați și din punct de vedere al biodegradării, utilizînd teste in vitro.

8.2.3.1. Evaluarea capacităţii de biodegradare a spongilor

Comparativ cu chitosanul părinte (CMMW) la care biodegradarea a variat de la 9,92% (în prima zi) la 38,19% (în ziua a 7-a), majoritatea derivaților (8a, 8b, 8d, 8e, 8f) s-au biodegradat într-o proporție mai mare (fig. 8.28). În seria derivaților 9a-f, biodegradarea începe din prima zi de incubare, procentul înregistrat variind între 14,91% (9c, derivat de sulfametoxidiazină) și 54,33% (9d, derivat de sulfadimetoxină) și se intensifică pe parcursul experimentului, ajungând în ziua a 7-a la o valoare ce variază între 26,02% (9c) și 69,36% (9a, derivat de sulfadiazină).

26,02% (9c) și 69,36% (9a, derivat de sulfadiazină). Fig.8.28. Biodegradarea spongilor proveniţi de la

Fig.8.28. Biodegradarea spongilor proveniţi de la derivaţii de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f)

8.2.3.2. Evaluarea capacităţii de biodegradare a filmelor

Rezultatele obţinute la testul de biodegradare in vitro a filmelor provenite de la derivații de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f) sunt prezentate în fig. 8.30.

39

Fig.8.30. Biodegradarea filmelor provenite de la derivaţii de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f) În

Fig.8.30. Biodegradarea filmelor provenite de la derivaţii de chitosan cu greutate moleculară medie (8a-f)

În seria derivaților 8a-f, la sfârșitul zilei a 7-a, cu excepția compusului 8f (derivat de sulfizoxazol) pentru care biodegradarea a fost în procent de 63,04%, pentru restul derivaților aceasta a variat între 9,37% și 40,33%. Pentru filmele de chitosan cu greutate moleculară medie gradul de biodegradare înregistrat, a fost de 10%. În seria derivaților 9a-f, la sfârșitul zilei a 7-a, pentru majoritatea filmelor, gradul de biodegradare a variat între 2,17% și 16,16%, excepție făcând filmul provenit de la derivatul de sulfadiazină (9a), care în ziua a7-a s-a biodegradat în proporție de 25%. În ceea ce privește chitosanul părinte, biodegradarea înregistrată a fost doar de 8,41%.

CAPITOLUL 9. CONCLUZII GENERALE Lucrarea de doctorat prezintă cercetările realizate în scopul sintezei, caracterizării și evaluării biologice a unor noi derivați cu structură sulfonamidică (cloracetil-derivaţi, hidrazinoacetil-derivaţi, arilidenhidrazinoacetil-derivaţi, azetidin-2-one) precum şi a unor noi derivaţi de chitosan cu structură sulfonamidică. 1. Având ca model structural o serie de șase sulfonamide clasice (sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametoxidiazina, sulfadimetoxina, sulfametoxazolul și sulfizoxazolul), prin etape succesive ce au inclus funcționalizare cu clorura acidului cloracetic (cu formare de cloracetil- derivaţi), tratare cu hidrat de hidrazină (rezultând hidrazine cu structură

40

sulfonamidică), condensare cu aldehide aromatice (benzaldehida, 4-

fluorbenzaldehida, 4-clorbenzaldehida, 4-brombenzaldehida, 4- hidroxibenzaldehida, 4-nitrobenzaldehida) cu formarea hidrazonelor corespunzătoare și în final ciclizare cu clorura acidului cloracetic, s-au sintetizat noi derivați de azetidin-2-onă. Prin derivatizarea chitosanului (cu greutate moleculară medie și mică) cu cloracetil-derivații sulfonamidelor clasice au rezultat două noi serii de derivați de chitosan cu structură sulfonamidică.

2. Compușii sintetizați, intermediari și finali, au fost caracterizați din

punct de vedere fizico-chimic, stabilindu-se temperatura de topire, randamentul de reacție, formula moleculară, masa relativă și solubilitatea în diferiți solvenți: apă distilată, alcool etilic, alcool propilic, alcool izopropilic, acetonă, dioxan, metanol, eter etilic, DMSO, DMFA. Derivații de chitosan au fost studiați din punct de vedere al comportamentului termic, folosind metode termogravimetrice: analiza termogravimetrică (TG) și analiza termogravimetrică diferențială (TGA). Au fost stabilite de asemenea, prin analiză spectrală de rezonanță magnetică nucleară, gradul de acetilare pentru chitosan (CMMW, CLMW)

și gradul de substituție pentru derivații de chitosan-sulfonamidă sintetizați.

3. Structura chimică a compușilor intermediari și finali sintetizați a fost

confirmată prin spectroscopie în infraroșu și de rezonanță magnetică nucleară. Spectrele IR înregistrate în domeniul 500-4000 cm-1 au evidenţiat vibraţiile de grup caracteristice elementelor structurale specifice fiecărei serii de compuși: restul cloracetil, gruparea hidrazinică, ciclu aromatic, ciclul beta-lactamic, restul de glucozamină, etc. Spectrele 1H- RMN şi 13C-RMN au fost înregistrate în dimetilsulfoxid deuterat și au pus în evidență semnalelor corespunzătoare protonilor și carbonilor ciclului beta-lactamic: CH-Ar și CH-Cl, ceea ce a validat întreaga schemă de

sinteză. Pentru derivații de chitosan, în spectrele 1H-RMN s-au evidențiat semnalele protonilor caracteristici celor două părţi componente: restul glucozaminic și cel sulfonamidic.

4. Derivații de chitosan-sulfonamidă au fost prelucrați sub formă de

diferite matrici polimerice: filme, spongi, membrane „onion like”, micro/nano-particule, nanofibre, în vederea potențialei lor aplicații în tratamentul rănilor provocate de arsuri. Matricile polimerice obținute au au fost studiate din punct de vedere morfologic prin tehnici microscopice

(microscopia de forță atomică și microscopia electronică de scanare) și din punct de vedere fizico-chimic, stabilindu-se gradul de porozitate,

41

capacitatea de hidratare precum și caracterul hidrofil respectiv hidrofob (folosind metoda unghiului de contact).

5. Compușii sintetizați au fost evaluați din punct de vedere biologic,

urmărind-se prin teste in vitro, stabilirea potențialului antimicrobian și al

celui antioxidant. Studiul antimicrobian, ce a urmărit testarea efectului atât pe tulpini bacterine Gram-pozitive cât și şi Gram-negative, a evidențiat influența favorabilă a reacției de condensare a hidrazinelor cu structură sulfonamidică, cu aldehidele aromatice, asupra efectului antibacterian. O influență similară a fost observată și în cazul derivaților de chitosan- sulfonamidă, pentru care efectul antimicrobian a fost mai intens decât

chitosanul părinte (CMMW, CLMW). Rezultatele evaluării potențialul antioxidant, prin teste in vitro (capacitatea totală antioxidantă, puterea reducătoare şi capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH), au confirmat faptul că prin modularea structurală

a celor șase sulfonamide clasice, potențialul antioxidant crește

semnificativ, în cazul hidrazonelor de câteva sute de ori comprativ cu sulfonamidele părinte; acțiunea acestor compuși fiind comparabilă cu cea a acidului ascorbic. Modificările chimice realizate pe structura chitosanului (CMMW, CLMW)

au influențat pozitiv potenţialul antioxidant, toi derivații de chitosan- sulfonamidă sintetizați fiind mai activi decît chitosanul.

6. Matricile polimerice, de tip filme si spongi au fost studiate din punct de

vedere al biodegradării utilizînd teste enzimatice in vitro. Rezultatele obținute recomandă spongii pentru potențiala utilizare ca pansamente în tratamentul rănilor, datorită gradului de porozitate care asigură o suprafaţă

de contact mare cu mediul biologic.

În concluzie, rezultatele obținute în cadrul studiilor realizare sunt originale și cu potențială aplicație biologică ca agenți antimicrobieni și antioxidanți, o posibilă aplicație fiind cea în tratamentul rănilor provocate de arsuri, unde se impune atât o acțiune antimicrobiană cât și un efect antioxidant, știută fiind implicarea radicalilor liberi în apariția și dezvoltarea diferitelor afecțiuni, inclusiv în cronicizarea rănilor

42

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Zahid HC. Metal-based antibacterial and antifungal sulfonamides:

synthesis, characterization, and biological properties. Transition Met Chem 2009; 34: 153-161.

2. García-Galán MJ, Garrido T, Frail J, et al. Simultaneous occurrence of nitrates and sulfonamide antibiotics in two ground water bodies of Catalonia (Spain). J Hydrol 2010; 383: 93101.

3. Zotta V. Chimie farmaceutică. București: Editura Medicală, 1985, 29-

63.

4. Dănilă G, Rusu G, Ungureanu M, Alexandrescu G. Chimie

farmaceutică. Iași, 1997, 201-247.

5. Bahrami K, Khodaei MM, Soheiliza M. Direct conversion if thiols to sulfonyl chlorides and sulfonamides. J Org Chem 2009; 74, 9287-

9291.

6. Gomes JRB, Gomes P. Gas-phase acidity of sulfonamides:

implications for reactivity and prodrug design. Tetrahedron 2005; 61:

2705-2712.

7. Bosch F, Rosich L. The Contributions of Paul Ehrlich to Pharmacology: A Tribute on the Occasion of the Centenary of His Nobel Prize 2008. Pharmacology 2008; 82(3): 171179.

8. Fatih U, Oral O, Rahmi E, et al. Effects of three different topical antibacterial dressings on Acinetobacter baumannii- contaminated full-thickness burns in rats. Burns 2009; 35: 270-273.

9. Ellena J, Kremer E, Facchin G, et al. X-ray structure and EPR behavior of a new dimeric copper (II) complex with 4-amino-N-(5- methoxy-2-pyrimidinyl) benzensulfonamide. Polyhedron 2007; 26:

3277-3285.

10. Krueger AC, Madigan DL, Jiang WW, et al. Inhibitors of HCV NS5B polymerase: Synthesis and structure-activity releationships of N- alkyl-4-hydroxyquinolon-3-yl-benzothiadiazine sulfamides. Bioorg Med Chem Lett 2006; 16: 3367-3370.

11. Krátký M, Vinsová J, Volková M. et al. Antimicrobial activity of sulfonamides containing 5-chloro-2- hydroxybenzaldehyde and 5- chloro-2-hydroxybenzoic acid scaffold. Eur J Med Chem 2012; 50:

433-440.

43

12.

Alqasoumi SI, Al-Taweel AM, Alafeefy AM. et al. Novel quinolines

and pyrimido[4,5-b]quinolines bearing biologically active sulfonamide moiety as a new class of antitumor agents. Eur J Med Chem 2010; 45: 738744.

13. El-Sayed NS, El-Bendary ER, El-Ashry SM, El-Kerdawy MM. Synthesis and antitumor activity of new sulfonamide derivatives of thiadiazolo [3,2-a]pyrimidines. Eur J Med Chem 2011; 46: 3714-

3720.

14. Mincione F, Benedini F, Biondi S, et al. Synthesis and crystallographic analysis of new sulfonamides incorporating NO- donating moieties with potent antiglaucoma action. Bioorg Med Chem Lett 2011; 21: 32163221.

15. Remko M, Kozíšek J, Semanová J, et al. Synthesis, crystal and molecular structure of two biologically active aromatic sulfonamides and their hydrochloride salts. J Mol Struct 2010; 973: 1826.

16. Bowers S, Probst GD, Truong AP, et al. N-Bridged bicyclic sulfonamides as inhibitors of γ-secretase. Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 69526956.

17. Martone RL, Zhou H, Atchison K, et al. Begacestat (GSI-953): a novel, selective thiophene sulfonamide inhibitor of amyloid precursor protein gamma-secretase for the treatment of Alzheimer's disease. J Pharmacol Exp Ther 2009; 331(2):598-608.

18. Gavernet L, Dominguez Cabrera MJ, Bruno-Blanch LE, Estiύ GL. 3D-QSAR design of novel antiepileptic sulfamides. Bioorgan Med Chem 2007; 15: 15561567.

19. Mustafa G, Khan IU, Ashraf M. et al. Synthesis of new sulfonamides as lipoxygenase inhibitors. Bioorgan Med Chem 2012; 20: 2535

2539.

20. Socala K, Nieoczym D, Wyska E. et al. Sildenafil, a phosphodiesterase type 5 inhibitor, enhances the activity of two atypical antidepressant drugs, mianserin and tianeptine, in the forced swim test in mice. Prog Neuro-Psychoph 2012; 38: 121126.

21. Fuchs SM, Elsner P. Sulfonamides in dermatology. Clin Dermatol 2004; 50(6): 280-290.

22. Del Rosso JQ. The Use of Sodium Sulfacetamide 10%-Sulfur 5% Emollient Foam in the Treatment of Acne Vulgaris. Journal Clin

Aesthet Dermatol 2009; 2(8): 2629.

44

23.

Mendelson JA. Topical mafenide hydrochloride aqueous spray in initial management of massive contaminated wounds with devitalized tissue. Prehosp Disaster Med 2001; 16(3): 172-174.

24. Leja K, Lewandowicz G. Polymer Biodegradation and Biodegradable Polymers a Review. Polish J of Environ Stud 2010; 19(2): 255-266.

25. Batista MKS, Pinto LF, Gomes CAR, Gomes P. Novel highly-soluble peptide-chitosan polymers: Chemical synthesis and spectral characterization. Carbohydr Polym 2006; 64: 299-305.

26. Yang JM, Yang SJ, Lin HT, et al. Chitosan containing PU/Poly(NIPAAm) thermosensitive membrane for wound dressing. Mater Sci Eng 2008; 28: 150156.

27. Tanveer AK, Kok KP, Hung SC. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods. Int J Pharm Pharm Sci 2002; 5(3): 205-212.

28. Kong M, Chen XG, Xing K, Park HJ. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review. Int J Food Microbiol 2010; 144: 51-63.

29. Vinsova J, Vavrikova E. Recent advances in drugs and prodrugs design of chitosan. Curr Pharm Des 2008; 14(13): 1311-1326.

30. Xie Y, Liu X, Chen Q. Synthesis and characterization of water- soluble chitosan derivate and its antibacterial activity. Carbohydr Polym 2007; 69: 142-147.

31. Guiping M, Dongzhi Y, Yingshan Z, et al. Preparation and characterization of water-soluble N- alkylated chitosan. Carbohydr Polym 2008; 74: 121-126.

32. Yang T-C, Chou C-C, Li C-F. Antibacterial activity of N-alkylated disaccharide chitosan derivatives. Int J Food Microbiol 2005; 97(3):

237-245.

33. Öztürk E, Agalar C, Keçeci K, Denkbas EB. Preparation and characterization of ciprofloxacin-loaded alginate/chitosan sponge as wound dressing material. J Appl Polym Sci 2006; 101: 16021609.

34. Xing L, Lie M, Zhengwei M, Changyou G. Chitosan-based biomaterials for tissue repair and regeneration. Adv Polym Sci 2011; 244: 81128.

35. Okamoto Y, Yano R, Miyatake K, et al. Effects of chitin and chitosan on blood coagulation. Carbohydr Polym 2003; 53: 337342.

45

36.

Dev A, Mohan JC, Sreeja V, et al. Novel carboxymethyl chitin

nanoparticles for cancer drug delivery applications. Carbohydr Polym 2010; 79: 10731079.

37. Rinaudo M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog Polym Sci 2006; 31(7): 603-632.

38. Aider M. Chitosan application for active bio-based films production and potential in the food industry: Review. LWT-Food Sci Technol 2010; 43(6): 837-842.

39. Dutta PK, Ravikumar MNV, Dutta J. Chitin and chitosan for versatile applications. JMS Polym Rev 2002; 307.

40. Tao X, Meihua X, Mingchun L, et al. Synthesis, characteristic and antibacterial activity of N,N,N-trimethyl-chitosan and its carboxymethyl derivatives. Carbohydr Polym 2010; 81(4): 931-936.

41. Benediktsdóttir BE, Gaware VS, Rúnarsson OV, et al. Synthesis of N,N,N-trimethyl chitosan homopolymer and highly substituted N- alkyl-N,N-dimethyl chitosan derivatives with the aid of di-tert- butyldimethylsilyl chitosan. Carbohydr Polym 2011; 86(4): 1451-

1460.

42. Geisberger G, Gyenge E, Maake C, Patzke GT. Trimethyl and carboxymethyl chitosan carriers for bio-active polymerinorganic nanocomposites. Carbohydr Polym 2013; 91(1): 58-67.

43. An NT, Dung PL, Thien DT, et al. An improved method for synthesizing N,N′-dicarboxymethylchitosan. Carbohydr Polym 2008; 73( 2): 261-264.

44. Burdick JA, Prestwich GD. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Adv Mater 2011; 23(12): H41-H56.

45. Coulembier O, Degee P, Hedrick JL, Dubois P. From controlled ring- opening polymerization to biodegradable aliphatic polyester:

Especially poly(beta-malic acid) derivatives. Prog Polym Sci 2006; 31: 723-747.

46. Ng KW, Achuth HN, Moochhala S, et al. In vivo evaluation of an ultra-thin polycaprolactone film as a wound dressing. J Biomat Sci- Polym E 2007; 18: 925-938.

47. Nechifor DC, Ciobanu CL, Dorohoi DO, Ciobanu C. Polymeric films properties of poly (vinyl alcohol) and poly (hydroxy urethane) in different concentrations. U.P.B. Sci Bull 2009; 71(1): 97-106.

46

48.

Horvath J, Nagy-Ungvarai Z, Mu Ller SC. Interaction of poly(vinyl alcohol) with the Belousov-Zhabotinsky reaction mixture. Phys Chem Chem Phys 2001; 3: 218-223.

49. O’Boyle NM, Greene LM, Bergin O, et al. Synthesis, Evaluation and structural studies of antiproliferative tubulin-targeting azetidin-2-ones. Bioorg Med Chem 2011; 19: 23062325.

50. Haines PJ, Heal GR, Laye PG, et al. Principles of Thermal Analysis and Calorimetr, The Royal Socoet of Chemistry, UK, 2002.

51. Chavan AA, Pai NN. Synthesis and biological activity of N- Substituted-3-chloro-2-azetidinones. Molecules 2007; 12: 2467-2477.

52. Parasca (Dragostin) OM, Lupașcu F, Vasile C, et al. New hydrazines with sulfonamidic structure: synthesis, characterization and biological activity. Rev Med Chir Soc Med Nat 2013; 117(1): 238-243.

53. Osório TM, Delle Monache F, Chiaradia LD, et al. Antibacterial activity of chalcones, hydrazones and oxadiazoles against methicillin- resistant Staphylococcus aureus. Bioorg Med Chem Lett 2012; 22:

225-230.

54. Asati V, Sahu NK, Rathore A, et al. Synthesis, characterization and antimicrobial evaluation of some 1,3-benzothiazole-2-yl-hydrazone derivatives. Arabian J Chem 2011.

55. Khanmohammadi H, Abnosi MH, Hosseinzadeh A, Erfantalab M. Synthesis, biological and computational study of new Schiff base hydrazones bearing 3-(4-pyridine)-5-mercapto-1,2,4-triazole moiety. Spectrochimica Acta Part A 2008; 71: 1474-1480.

56. Dragostin OM, Lupascu F, Vasile C, et al. Synthesis and Biological Evaluation of New 2-Azetidinones with Sulfonamide Structures. Molecules 2013; 18, 4140-4157.

57. Fujun L, Bing Q, Linghao H, Rui S. Novel starch/chitosan blending membrane: Antibacterial, permeable and mechanical properties. Carbohydr Polym 2009; 78: 146150.

58. Lin Y-C, Tan F, Marra KG, et al. Synthesis and characterization of collagen/hyaluronan/chitosan composite sponges for potential biomedical applications. Acta Biomater 2009; 5: 2591-2600.

59. Cabral JPS. Water Microbiology. Bacterial Pathogens and Water. Int J Environ Res Public Health 2010; 7: 3657-3703.

60. Melo-Silveira RF, Fidelis GP, Santos Pereira Costa MS et al. In vitro antioxidant, anticoagulant and antimicrobial activity and in inhibition

47

of cancer cell proliferation by xylan extracted from Corn Cobs. Int J Mol Sci 2012; 13: 409-426.

.

LISTĂ LUCRĂRILOR ȘTIINȚIFICE PUBLICATE ÎN TIMPUL STAGIULUI DOCTORAL

Articole publicate in extenso din tema tezei de doctorat:

1). Oana Maria Dragostin, Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, Mihai Mares, Valentin Nastasa, Ramona Florina Moraru, Dragos Pieptu, Lenuta Profire. Synthesis and Biological Evaluation of New 2-Azetidinones with Sulfonamide Structures. Molecules 2013; 18, 4140-4157 (ISI, IF.2,67). 2). Oana Maria Parasca (Dragostin), Florentina Gheaţă (Lupaşcu), Andreea Pânzariu, Ioana Geangalău (Vasincu), Lenuţa Profire. Importance of sulfonamide moiety in current and future therapy, Rev Med Chir Soc Med Nat 2013, 117(2) (BDI, B + ). 3). Oana Maria Parasca (Dragostin), Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, M. Mares, V. Nastasa, Lenuta Profire. New hydrazines with sulfonamidic structure: synthesis, characterization and biological activity, Rev Med Chir Soc Med Nat 2013; 117(1): 238-243. (BDI, B + ).

Alte articole publicate in extenso:

1). Florentina Geanina Lupascu, Oana Maria Dragostin, Liliana Foia, Dan Lupascu, and Lenuta Profire, The Synthesis and the Biological Evaluation of New Thiazolidin-4-one Derivatives Containing a Xanthine Moiety, Molecules, 2013, 18(8): 9684-9703 (ISI, IF.2,67). 2). Lenuţa Profire, D. Pieptu, Raluca Petronela Dumitriu, Oana Dragostin, Cornelia Vasile: Sulfadiazine modified CS/HA PEC destined to wound dressing . Rev Med Chir Soc Med Nat 2013; 117(2):525 (BDI, B + ). 3). Ioana Vasincu (Geangalau), Maria Apotrosoaei, Cristina Tuchiluş, Andreea Teodora Pânzariu, Oana Dragostin, D. Lupaşcu, Lenuta Profire:

New derivatives of aryl-propionic acid. synthesis and biological evaluation. Rev Med Chir Soc Med Nat 2013; 117(2):532 (BDI, B + ). 4). Florentina Lupaşcu, Oana Maria Dragostin, Maria Apotrosoaei, Andreea Pânzariu, Dan Lupaşcu, Cornelia Vasile, Lenuţa Profire, Synthesis And Evaluation Of Antioxidant Activity Of Some New Benzylidene-Thiazolidine-Xanthine Derivatives, Rev Med Chir Soc Med Nat 2013, Iași, 2013, 117(1): 244-249 (BDI, B + ).

48

5). Neagu A., Şutu M., Parasca O., Lupaşcu D., Profire L, Sinteza şi caracterizarea fizico-chimică a unor noi derivaţi ai acidului galic, Rev. Med. Chir a Societăţii de Medici şi Naturalişti din Iaşi, ISSN-0048-7848, 2009, vol. 113, nr. 2, Supliment nr. 4, 278-281 (BDI,B + ).