UNIVERSITATEA DE TIINTE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR ION IONESCU DE LA BRAD DIN IAI

FACULTATEA DE AGRICULTUR
SPECIALIZAREA SAPCCPA

METODE DE EVALUARE A NUMRULUI

DE MICRORGANISME

Coordonator tiinific,
Prof. dr. Florin Lipsa

Student,
Alexandra tefania Nstase

1
 Cuprins

Introducere

Capitolul 1 - Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de

microorganisme de alterare din alimente
1.1.Determinarea numrului total de bacterii aerobe mezofile .4
1.2. Determinarea numrului total de drojdii si mucegaiuri...6
1.3. Determinarea bacteriilor sporulate aerobe si anaerobe9
1.4. Determinarea microorganismelor osmofile........11
1.5. Determinarea bacteriilor de putrefacie......13

Capitolul 2 - Metode rapide, clasice si moderne de evaluare a calitii

microbiologice a alimentelor
2.1 Proba reductazei..15
2.2 Metode bazate pe utilizarea petrifilmelor....17

Bibliografie..20

2
 Introducere
Microorganismele (derivat din greaca mikros, = mic + latina organismus = organism)
sunt organisme microscopice vegetale i animale de dimensiuni mici, invizibile cu ochiul liber (dar
care pot vi vzute cu ajutorul microscopului optic i electronic).
n general, acestea sunt unicelulare, cu structur intern relativ simpl. Triesc n sol, n ap, n
aer, n corpul plantelor sau al animalelor i pot fi saprofite sau patogene pentru organismul n care se
dezvolt.
Termenul de "microorganisme" este lipsit de semnificaie taxonomic. Microorganismele includ
un grup vast i heterogen de organisme cu morfologie, activitate biologic i poziie sistematic
diferite:
bacterii,
arhee,
fungi microscopici (mucegaiuri i levuri),
microalge (alge microscopice) i protozoare.
Virusurile i agenii infecioi subvirali (viroizi, virino, virusoizi, prioni).

3
 Capitolul 1 - Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de
microorganisme de alterare din alimente

1.1.Determinarea numrului total de bacterii aerobe mezofile

Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa
lichidelor, a mediilor solide.
Bacteriile mezofile reprezint grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20C,temperaturi
optime n intervalul 30 - 40C i maximum la temperaturi peste 45C.

PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE

Numrul de bacterii aerobe mezofile se apreciaz indirect, pe baza numrului de colonii generate
de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o
diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv, dup termostatare la 37C, timp de 48 de ore.
Numrul de bacterii aerobe mezofile reprezint un indicator valoros pentru aprecierea calitii
generale si a stabilitii la pstrare a produselor alimentare.

MODUL DE LUCRU
Se iau dou placi Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc, n fiecare plac, cte 1 ml prob de
analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 ml diluie iniial, n cazul altor produse. Se realizeaz
apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste operaii cu diluiile
urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal. Se toarn n fiecare
plac Petri cte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 455C.
Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n
repaus pn se produce solidificarea lor. Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul
utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea. Plcile ce conin mediul
solidificat se plaseaz cu capacul n jos, pentru 48 de ore, n termostat cu temperatura de 37C.

PARTICULARIT_I PRIVIND NUMRAREA COLONIILOR

Dup termostatare, se aleg pentru numrare plcile care con_in un numr colonii cuprins ntre 25
si 250, acestea trebuie s fie repartizate pe o suprafa mai mare de 25% din suprafaa total a
mediului de cultur.

4
 Pentru numrare se poate adopta: numrarea manual, cu ajutorul unui numrtor electronic
(care la atingerea fiecrei colonii o contabilizeaz n memoria sa), pentru a evita erorile de
numrare; numrare automatizat, utiliznd instrumente speciale de numrare, cnd se consum
numai 10% din timp, comparativ cu numrarea manual.
Exist totusi si unele limitri ale acestui procedeu si anume: pot s apar erori de numrare n
cazul prezenei n mediu a unor impuriti solide sau bule de gaz; nu se obin rezultate bune cnd
coloniile au diametru mare si sunt rspndite pe o suprafa_ mare etc.
La numrare pot fi ntlnite urmtoarele tipuri de colonii:
o Lanuri de colonii, care aparin unei singure surse (celule asociate, n perechi, lanuri,
pachete etc.). n acest caz se va numra ntregul lan ca o singur colonie;
o Colonii dezvoltate n filmul de ap dintre baza mediului de cultur si suprafaa capacului
inferior;
o colonii dezvoltate n filmul de ap de la suprafa_a mediului cu agar.
Rezultatele se exprim, dup caz, n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml
produs, astfel:
1) Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac:

n care: C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;

n1 = numrul de plci reinute din prima dilue;
n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv;
d = factor de diluie corespunztor primei diluii
Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea
atribuit numrului 10.

2) Plcile inoculate din dou diluii succesive conin mai puin 25 colonii. Se aplic modul de calcul
prezentat mai sus. Plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1,produse lichide) sau
suspensia iniial (d =10-1, produse solide), conin mai puin de 25 colonii:

5
3) n plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau
suspensia iniial (d =10-1, produse solide) nu s-a dezvoltat nici o colonie:
ufc/ml < 1 (produse lichide)
ufc/g < 1 10-1 (produse solide)

4) Cnd plcile conin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numrarea se poate realiza:

pe anumite sectoare delimitate ale suprafeei plcii sectoare delimitate (4,

8 sau 16)
pe o suprafa delimitat (ptrat) de 1 cm2, astfel: cnd numrul de colonii pe un ptrat este
mai mare de 10 se numr la ntmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative, se determin
media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri; cnd
numrul de colonii distribuite pe un ptrat este mai mic dect se numr coloniile de pe 12 ptrele
reprezentative, se determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri.
5) Cnd numrul de colonii pe plac este foarte mare rezoluia este imposibil numrarea,
concentraia de celule mult mai mare dect diluia estimat.
6) Cnd se produce contaminarea accidental sau se obin rezultate neconcludente rezoluia este
analiz efectuat necorespunztor.

1.2. Determinarea numrului total de drojdii si mucegaiuri

Drojdii microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat prin
nmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat (meioz). Majoritatea
drojdiilor sunt saprofite si multe dintre ele au activitate fermentativ.
Mucegaiuri microorganisme eucariote, care prezint organe de reproducere difereniate.
Sunt agenii mucegirii.

PRINCIPIUL METODEI
Prin aceast metod, numrul de drojdii si mucegaiuri se apreciaz indirect, pe baza coloniilor
generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd
proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv gelozat, dup termostatare la 25C
timp de 72 de ore.

6
ECHIPAMENTE
_ Omogenizator;
_ Balan analitic;
_ Termostat reglat la 25C;
_ Baie de ap pentru fluidificarea mediului de cultur reglat la 45C.

MATERIALE SI STICLRIE
_ 25g produs alimentar;
_ 225 ml 0.1% apa peptonat;
_ Plci Petri =10 cm sterile;
_ Pipete de 1 cm3 si 10 cm3 sterile;
_ Eprubete cu ser fiziologic steril, cte 9 cm3 per eprubet;
_ Baloane cu ser fiziologic steril;
_ Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide;
_ Numrtor de colonii.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU

Se cntresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaug 225 ml apa peptonat. Se
omogenizeaz timp de 1 min. Pentru diluarea probei se aplic schema de diluie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluiilor si inocularea probelor

7
 Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 cm2 prob de analizat, dac
produsul este lichid sau cte 1 cm2 diluie iniial, n cazul altor produse.
Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste operaii cu
diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal (Fig.1). Se
toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 cm2 mediu MEA (Malt Extract Agar) cu temperatura de
455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt
lsate n repaus pn se produce solidificarea lor.
Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, pentru 3-5 zile la
temperatura de 25-28C.

REZULTATE
Se rein plcile care conin 25-250 de colonii. Numrul de ufc de drojdii si mucegaiuri per ml sau
gram de produs se calculeaz ca medie ponderat, cu formula urmtoare:

unde
C suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;
n1 numrul de placi reinute dintr-o diluie
n2 numrul de placi reinute din dilu_ia succesiv
d factorul de diluie corespunztor primei diluii din care s-a realizat reinerea plcilor.
Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative.
Se exprima gradul de contaminare printr-un numr cuprins ntre 1,0 si 9,9 multiplicat cu 10x,
unde x este puterea atribuit lui 10.
Dac cele dou placi Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale
(alte produse) conin mai puin de 15 colonii, se face media aritmetic, m, a coloniilor numrate n
cele dou placi.
Rezultatul se exprima sub forma:
- numr de ufc de drojdii si mucegaiuri estimat per ml:
NE=m (produse lichide)
- numr de ufc de drojdii si mucegaiuri estimat per gram
NE=md-1 (alte produse), n care d este factorul de diluie al diluiei iniiale (alte produse).

8
Dac cele dou plci Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale (alte
produse) nu conin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:
- mai puin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);
- mai puin de 1d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)

1.3. Determinarea bacteriilor sporulate aerobe si anaerobe

Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparin genului Bacillus. Sunt bacteria
Gram+, mobile, cu celule de form cilindric, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau
rotunjite, singulare sau asociate n unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanuri. Sporii nu se coloreaz prin
colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal dect al celulei, fiind poziionai
central sau terminal.
Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparin genului Clostridium. Sunt bacterii
Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari dect cele din genul Bacillus,
singure sau n lanuri, care formeaz endospori dispusi central sau terminal, care dau celulelor forma
de suveic sau paleta.

PRINCIPIUL METODEI
Determinarea microorganismelor sporulate aerobe si anaerobe estimeaz numrul
microorganisme n stare sporulata prezente per g sau ml de produs. Proba de analizat sau diluii
succesive se supun pasteurizrii la 80C timp de 10 minute, pentru a distruge toate formele
vegetative , apoi se rceste si se inoculeaz n medii specifice, cultivarea realizndu-se n condiii
particulare n condiii aerobe
sau anaerobe.
MATERIALE SI ECHIPAMENTE SPECIALE
1. Baie de ap reglabil la 45C si la 80C;
2. Stomacher
3. pH-metru;
4. Plci Petri;
5. Termostat reglabil la 37C;
6. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare n anaerobioza;
7. Numrtor de colonii;
8. Reactivi si medii de cultura: mediu de diluare (ap peptonat), medii de cultur.

9
DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Testul se efectueaz n conformitate cu instruciunile de mai jos:
Manipularea esantioanelor
n laborator, nainte de analiz, cu excep_ia produselor alimentare care nu necesit condiii
speciale de depozitare, probele se pstreaz fie la frigider la temperatura de 0-5C, fie congelate, n
funcie de natura produsului.
Prepararea mediilor de cultur
Se pregteste mediul Trypticase Soy Agar n cantiti corespunztoare si se sterilizeaz. Se
tempereaz mediul de cultur ntr-o baie de ap la temperatura de 45C, asigurndu-se c nivelul
apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete. Se cur zona de lucru cu un dezinfectant
adecvat. Se marcheaz n mod clar plcile Petri cu numrul probei, diluia si data termostatrii.
Pregtirea diluiilor
Se prepar un raport de diluie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a de 10g (ml)
produs n 90 ml ap peptonat. Probele se omogenizeaz:
- timpul de amestecare nu trebuie s depseasc 2.5 min, n scopul prevenirii supranclzirii.
- n cazul produsele alimentare care au tendin_a de a spuma, este indicat agitarea moderata.
- diluiile se omogenizeaz prin men_inere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc de 30 cm, n
aproximativ 7 sec).
Pentru fiecare prob de analizat, se pipeteaz 20-25 ml din diluia 10-1 ntr-o eprubet steril. Se
plaseaz eprubetele n baia de ap la 80C si se menin timp de 20 de minute. Dup rcire se prepar
diluii (diluii recomandate sunt de 10-1,10-2, si 10-3).
Inocularea si termostatarea probelor
Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 ml prob de analizat. Se toarn
n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml mediu de cultur cu temperatura de 455C. Mediile se
uniformizeaz rapid, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce
solidificarea. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos.
Pentru bacteriile aerobe sporulate, plcile se termostateaz la 35oC 0.5oC timp de 48 2
ore.
Pentru bacteriile anaerobe sporulate, plcile se termostateaz 35oC 0.5oC timp de 48 2
ore. ntr-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack.

10
Numrarea coloniilor
Coloniile se numr imediat dup perioada de termostatare i dac este posibil, se selecteaz
plcile cu 20-200 colonii.
REZULTATE
Numrul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculeaz cu urmtoarea
formula:

n care: C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;

n1 = numrul de plci reinute din prima diluie;
n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv;
d = factor de diluie corespunztor primei diluii
Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac.
Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea atribuit
numrului 10.

1.4. Determinarea microorganismelor osmofile

PRINCIPIUL METODEI
Drojdiile, mucegaiurile si bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile s creasc ntr-un
mediu cu concentraiii ridicate de zahr sau sare producnd alterri care conducla modificarea
calitii senzoriale si a valorii nutritive a alimentelor.
Prin aceast metod, numrul de microorganisme osmofile se apreciaz prin examen cultural
indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente n proba de analizat, sau o diluie a
acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate, suplimentate cu 10% zahar sau sare, dup
termostatare optim.
MATERIALE SI ECHIPAMENTE
1. Mediu de baza
Pentru bacterii: dextroz, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, ap distilat, 1.000 ml;
Pentru drojdii si mucegaiuri: mediu hiperglucidic.
2. Mediul de diluare: zaharoz sau NaCl 400 g; ap distilat 1000 ml.
11
DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Pentru obinerea diluiilor decimale pot fi folosite dou tehnici pentru orice tip de prob luat n
analiz. Numrul de diluii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in analiza, si anume:
o Din proba de analizat se executa in condiii aseptice dilu_ia 1/5, prin transferul a 20g prob
n 80 ml mediu de diluare. Aceasta reprezint diluia iniial - 1:5 (proba martor). Se
transfer aseptic 20 ml din proba martor n 80 ml mediu de diluare, proba este astfel diluat
cu un factor de diluare de 25.
o Se cntresc in condiii aseptice 10 g prob de analiza si se transfera n 90 ml mediu de
diluare, obinnd diluia nti, din care se obin alte diluii decimale prin diluare succesiva.
Cu o pipet steril se transfer n 2 plci Petri in paralel, cte 1ml prob de analizat. Se
repartizeaz n fiecare plac Petri cte cca. 15ml mediu de cultur fluidificat si temperat la
temperatura de 455C.
Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n
repaus pn se produce solidificarea lor. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu
capacul n jos in urmtoarele condiii:
A. Bacterii osmofile
Plcile Petri se termostateaz la 35-37C timp de 48 3 ore (2 zile). Se rein plcile care conin
25-250 de colonii. Se numr colonii formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n
dublu exemplar si se stabileste numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de produs.
B. Drojdii si mucegaiuri osmofile
Plcile Petri se termostateaz la 25-30C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate sunt de
dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se numr colonii
formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n dublu exemplar si se stabileste
numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de produs.
Se nregistreaz numrul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs.

REZULTATE
Numrul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculeaz ca medie
ponderat, cu formula urmtoare:

12
unde
C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute;
n1 numrul de cutii reinute dintr-o diluie
n2 numrul de cutii reinute din diluia succesiv
d factorul de diluie corespunztor primei diluii din care s-a realizat reinerea plcilor.
Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative.
Se aplica aceeasi formula de calcul ca si la bacterii aerobe mezofile sau drojdii si mucegaiuri.

1.5. Determinarea bacteriilor de putrefacie

PRINCIPIUL METODEI
Bacteriile de putrefacie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine
animal pn la produsi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene, compusi indolici. Primele semne
ale alterrii prin putrefacie sunt formarea de mucus, apari_ia mirosului neplcut si modificarea
gustului.
Bacteriile de putrefacie aparin urmtoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter,
Escherichia, Proteus, Clostridium etc.
Determinarea lor are la baz dou principii:
I. Evidenierea hidrolizei substratului de natur proteic, astfel se determin bacteriile cazeinolitice
(produc hidroliza cazeinei).
II. Evidenierea produsilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste biochimice reunite
in testul HIL (H - eviden_ierea producerii de hidrogen sulfurat; I evidenierea producerii de indol;
L- capacitatea de a lichefia gelatina)

MATERIALE SI ECHIPAMENTE
1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazein sau 10% lapte;
2. Mediul de diluare: ap peptonat;
3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.
DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Se pregteste suspensia ini_ial prin cntrirea a 10 g prob, peste care se adaug 90 ml ap
peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min.

13
a. Determinarea bacteriilor cazeinolitice
Se realizeaz diluii decimale. Prin tehnica cultural Koch se fac inoculri in mediu PCA
suplimentat cu 1% cazein sau 10% lapte. Mediile se uniformizeaz rapid n plci Petri sterile, prin
rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor.
Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, timp de 48h, la temperatura
de 37C.
Bacteriile care prezint capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta n jurul coloniilor o zon
clar incolor comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece, bacteriile
cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzeaz n exteriorul coloniilor si
hidrolizeaz cazeina.
b. Determinarea produsilor finali ai hidrolizei proteinelor - testul HIL
Testul H evideniaz prezena hidrogenului sulfurat, rezultat din proteoliza proteinelor
Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Se plaseaz
deasupra lichidului o hrtie steril mbibat n acetat de plumb. Proba se termostateaz la
temperatura de 37C, timp de 48h. Proba este pozitiv dac hrtia se nnegreste, ca urmare a
formarii de sulfura de plumb, prin reacia dintre acetatul de plumb si H2S care se degaja.
Testul I evideniaz prezena indolului
Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Proba se
termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h, apoi se adug 1 ml reactiv Kovacs sau Erlich.
Proba se consider pozitiv prin apariia unui inel de culoare rosie la interfaa mediu-reactiv, care
indic prezena indolului.
Testul L evideniaz bacteriile care lichefiaz gelatina
Se recolteaz cu ansa celule din suspensia iniial si se neap un tub de gelatin ntr-o eprubet
sterila. Se termostateaz la temperatura de 20C, timp de 7 zile3. Proba este pozitiv dac se
produce lichefierea parial sau total a tubului de gelatin.

REZULTATE
Stabilirea numrului de bacterii cu activitate cazeinolitic se aplica aceeasi formula de calcul
utilizata pentru stabilirea numrului de unitatea formatoare de colonii (metoda indirecta de
numrare).

14
 Capitolul 2 - Metode rapide, clasice si moderne de evaluare a calitii
microbiologice a alimentelor

2.1.PROBA REDUCTAZEI

PRINCIPIUL METODEI
Proba reductazei este o metod indirect de apreciere a numrului de microorganism vii dintr-un
produs, in funcie de corelaia dintre gradul de contaminare si durata n care se produce modificarea
culorii unor indicatori redox (albastru de metilen si resazurina), sub aciunea enzimelor din categoria
reductaze sintetizate de celulele vii prezente n produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare
albastru (in cazul albastrului de metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in
prezenta reductazelor) se transforma in leucoderivai incolori. Analiza se preteaz cel mai bine
pentru evaluarea calitii microbiologice a laptelui materie prima.
In funcie de tipul indicatorului si concentraia acestuia variaz durata analizei siculoarea probei,
parametrii in funcie de care se poate aprecia gradul de contaminare sicalitatea microbiologica a
produsului. Astfel, in cazul utilizrii albastrului de metilen,
Iniial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina si schimb
culoarea de la albastru la violet spre roz si apoi incolor.

MATERIALE SI ECHIPAMENTE
1. Soluie de albastru de metilen 1%
2. Soluie de resazurin 0,05%
DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Pentru analiza laptelui, se transfer 20 ml lapte ntr-o eprubeta steril peste care se adaug 1 ml
soluie de albastru de metilen. Eprubeta se menine n baie de apa termostatat la temperatura de 38-
40C, astfel nct nivelul apei s fie superior probei. Se fac notaii asupra modificrii culorii la
intervale de 20, 60, 120, 180, 330 minute.
Exist si varianta rapida a acestei metode cnd se utilizeaz aceeasi tehnic de lucruutiliznd
urmtoarele cantiti: 10 ml lapte si 1 ml soluie albastru de metilen, diluie 1/10.

15
b. Proba reductazei cu resazurina
n eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaug 1 ml soluie de
resazurina 0,05%, apoi proba se termostateaz la temperatura de 38-40C, urmrindu-se modificarea
culorii in intervalul 20 si 60 minute.
REZULTATE
a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Aprecierea calitii laptelui se face in conformitate cu specificaiile din tabelul 1.
Tabelul 1. Aprecierea calit_ii laptelui n proba reductazic cu albastru de metilen

b. Proba cu resazurina
In proba cu resazurina aprecierea calitii laptelui si a gradului de contaminare se realizeaz in
conformitate cu datele nscrise n tabelul 2.
Se apreciaz c la temperaturi de 38-40C, o capacitatea reductazic superioar o au lactobacilii,
streptococii si bacteriile coliforme. Dac probele se menin la temperatur de 22C la reducere
particip si bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus, Enterococcus.

16
2.2. METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR
Metodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme comerciale,
denumite Petrifilme (n limba englez, Petrifilms), n care mediul de cultur specific (n general, un
mediu selectiv), deshidratat, dar usor rehidratabil este fixat sub forma unui film (cu diametru si
grosime variabil) pe un suport din carton plastifiat si acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea
suspensiei de celule, lichidul hidrateaz mediul si prin termostatare este posibil dezvoltarea
microorganismelor.
Petrifilmele au fost concepute n vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP (analiza
hazardului, punctele critice de control), care prevd aplicarea unor msuri corective, pe tot parcursul
procesului de producie, fr ca acesta s stagneze, ceea ce impune analiza unui numr mare de
probe, cu obinerea unor rezultate prompte si n scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin
aplicarea metodelor clasice de control microbiologic (Bahrim, 2003).
Practica a demonstrat c Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiz microbiologic,
aplicabile mai ales pentru evaluarea calitii materiilor prime si controlul n punctele critice pe
parcursul procesrii acestora, oferind numeroase avantaje, care se regsesc n reducerea timpului de
analiz, reducerea costului analizei per prob, cresterea numrului de probe analizate, asigurarea
inocuitii alimentelor si mbuntirea substanial a productivitii (Jordano si Medina, 1999).
Tehnica de utilizare a Petrifilmelor n analiza microbiologic este extrem de simpl si
presupune parcurgerea urmtoarelor etape:
Se pregteste proba, conform metodologiei clasice, si se dilueaz prin tehnica diluiilor
decimale, pn la o concentraie de celule de aproximativ 104 celule per ml.
Se ridic filmul superior.

Se inoculeaz 1 ml suspensie dintr-o diluie corespunztoare n centrul Petrifilmului asezat

pe un suport special.

17
 Se elibereaz filmul superior, care se las s cad liber.
Cu ajutorul dispozitivului de rspndire se preseaz usor deasupra zonei inoculate pentru
distribuia uniform a celulelor din suspensie pe toat suprafaa circular a mediului de
cultur.

Se ndeprteaz dispozitivul de rspndire si se asteapt un minut pentru solidificarea

mediului.
Se termostateaz (pachete de pn la 20 Petrifilme) n condiii optime, specific pentru
dezvoltarea microorganismelor analizate, n funcie de recomandrile din instruciunile de
utilizare a Petrifilmului.

18
 Se realizeaz numrarea coloniilor (pragul optim de detec_ie 25-250 colonii/petrifilm);
faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care mparte suprafaa mediului
n ptrate cu suprafaa de 1cm2, usureaz mult numrarea.

Se calculeaz ufc/g (ml), similar cu metodele clasice.

Eficiena oferit de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizrii acestora pentru

evaluarea calitii microbiologice a numeroase alimente, inclusiv n industria de panificaie pentru
analiza finii, a pastelor finoase, a cerealelor si a cerealelor pentru micul dejun.

19
Bibliografie
1. G.Zarnea, Tratat de microbiologie generala, Editura Academiei RSR, 1986
2. Adams, M.R.; Moss, M.O.; Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry;
Guildford, UK; 1995
3. https://ro.wikipedia.org/wiki/Microorganism
4. http://referat.clopotel.ro/Microorganisme_folositoare-12779.html
5. http://www.scritub.com/biologie/INTRODUCERE-in-biologia-microo71526.php

20