Metodologa

Clulas libres

Anlisis de muestras tomadas a lo largo de la edad de cultivo. Recordando que se tomaron tres
muestras por tiempo.
Clulas inmovilizadas
 1 mL de Dricromato
de potasio

Resultados correspondientes a la produccin de enzima alfa amilasa con

enzimas libres de Bacillus subtilis
Los resultados correspondientes a las muestras tomadas a lo largo del tiempo, se muestran en la
Tabla 1. Observando que la longitud de onda a la cual se determin el crecimiento celular
correspondi a 600 nm mientras que para la actividad enzimticas correspondi a 540 nm.

Actividad enzimtica

Se le dio tratamiento a los valores de absorbancia obtenidos de la actividad enzimtica a los

diferentes tiempos, observndose stos en la Tabla 2 al igual que las grficas obtenidas para
finalmente calcular la actividad enzimtica que hubo presente (Grficos 1 a 3). La discusin de los
datos y/o valores obtenidos se presentan en la seccin de anlisis de resultados.
 Tabla 1. Resultados de la cintica de Bacillus subtilis para la produccin de alfa amilasa

Edad Cultivo Densidad Testigo Actividad enzimtica Cantidad de Pureza

ptica (=540 nm) (=540 nm) protena en
(=600 nm) el medio
(=595 nm)
T0 T1 T2
0 0.440 -0.035 -0.001 -0.049 0.088 Bacilos
2.25 - - -0.040 - -0.255 Cocos/Bacilos
4.25 0.524 0.008 0.056 0.058 0.063 0.004 Cocos/Bacilos
6.25 0.118 -0.014 -0.006 -0.017 0.054 Cocos/Bacilos
Tabla 2.
Actividad enzimtica de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis a lo largo del tiempo (edad de cultivo)

ACTIVIDAD ENZIMTICA

EDAD DE Tiempo (min) Absorbancia Concentracin Concentracin Concentracin de Actividad enzimtica (mol Glc+Fruct
CULTIVO (=540 nm) de Glc+Fruct de Glc+Fruct Glc+Fruct (mol/mL) /mL_solucin enzimtica
(H) (mg/mL) (mol/mL) introducido*min)
0 0.15 -0.035 0.0172 5.0516E-05 50.5196 180.326
5 -0.001 0.0889 0.0002 259.9911
10 -0.049 -0.0122 -3.5733E-05 -35.7333
2.25 0.15
5 -0.04 0.0067 1.9715E-05 19.7149
10
4.25 0.15 0.056 0.2090 0.0006 610.4023 89.288
5 0.058 0.2132 0.0006 623.4859
10 0.063 0.2237 0.0006 654.1581
6.25 0.15 -0.014 0.0615 0.0001 179.8991 38.6
5 -0.006 0.0783 0.0002 229.1865
10 -0.017 0.0552 0.0001 161.4163
T (4.25) 0.008 0.1078 0.3183 0.76176

Para el clculo de la concentracin de maltosa se hizo uso del Grfico 4. Curva tipo para la determinacin de Maltosa mediante el reactivo DNS (Ver Anexos). Para los clculos
involucrados en la presente tabla revisar la hoja de clculo.
 660 y = 4.374x + 607.51
300
y = -9.0163x + 137.12 R = 0.9468
250 R = 0.0853

Concentracin de Glc (mol/L)

650
Concentracin de Glc (mol/L)

200
640
150
630
100

50 620

0 610
0 2 4 6 8 10
-50
600
0 2 4 6 8 10
-100
Tiempo (min) Tiempo (min)

Grfico. 1 Actividad enzimtica de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la Grfico. 2 Actividad enzimtica de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la
edad de cultivo correspondiente a las 0 horas edad de cultivo correspondiente a las 4.25 horas

250 y = -1.9366x + 199.95

R = 0.0741
Concentracin de Glc (mol/L)

200

150

100

50

0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (min)

Grfico. 3 Actividad enzimtica de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la
edad de cultivo correspondiente a las 6.25 horas
Determinacin de protena

Para la determinacin de protena que se realiz para las muestras a diferentes tiempos, se hizo uso del mtodo de Bradford, cabe destacar que una vez tratados
los datos (valores de absorbancias) se obtuvieron concentraciones de protena negativas, sin embargo no significa que no haya habido presencia de las mismas.
La justificacin de los valores obtenidos se discuten en la seccin de anlisis.

Tabla 3. Resultados de la determinacin de concentracin de protenas mediante el mtodo Bradford

Tiempo de Absorbancia Protena (g/mL)

vida (h) (=595 nm)
0 0.088 -7.27868
4.25 -0.255 -63.5081
2.25 0.004 -21.0491
6.25 0.054 -12.8524
Enzima producida por Bacillus subtilis a lo largo del tiempo (Edad de cultivo) en un medio sumergido. Para el clculo de la concentracin de protenas se hizo uso
del Grfico 4. Curva tipo para la determinacin de concentracin de protenas mediante el mtodo Bradford (Ver Anexos). Para los clculos involucrados en la
presente tabla revisar la hoja de clculo
 Crecimiento celular

Para la determinacin de crecimiento bacteriano en el biorreactor se hizo uso de la tcnica

sembrado en placa, utilizando placas Petri con Agar Nutritivo, y en su mayora aplicando estra
simple. Las muestras obtenidas se observan en las figuras 1 a 4 correspondientemente a los tiempos
0 (inculo), 2.25, 4.25 y 6.25 horas.

Figura 2. Cultivo en placa de Bacillus subtilis

Figura 1. Cultivo en placa de Bacillus
por la tcnica de siembra estra simple en
subtilis por la tcnica de siembra masiva en
agar Nutritivo para la edad de cultivo
agar Nutritivo para la edad de cultivo
correspondiente a las 2.25 horas
correspondiente a las 0 horas

Figura 3. Cultivo en placa de Bacillus

subtilis por la tcnica de siembra estra Figura 4. Cultivo en placa de Bacillus subtilis
simple en agar Nutritivo para la edad de por la tcnica de siembra estra simple en
cultivo correspondiente a las 4.25 horas agar Nutritivo para la edad de cultivo
correspondiente a las 6.25 horas
Anlisis de resultados
Los resultados arrojados con anterioridad con respecto a la produccin de enzima alfa amilasa libre a partir de Bacillus
subtilis, dan un indicio claro acerca del experimento fallido. Lo que se esperaba era notar un incremento de la enzima
mencionada, a partir de los parmetros establecidos (actividad enzimtica, cantidad de protena principalmente), sin
embargo debido a cuestiones de contaminacin debido a la incorrecta manipulacin de la toma de muestra del biorreactor
y condiciones operativas no es posible asegurar al cien por ciento que se produjera dicha enzima proveniente de la cepa
mencionada.

La eleccin de producir alfa amilasa en clulas libres, radic primordialmente en la facilidad de que sta recibiera al
polisacrido sin ninguna dificultad, como pudo haber ocurrido en caso de haberse aplicado la inmovilizacin de sta en
esferas de alginato de calcio, recordando que los poros pueden llegar a ser tan pequeos que impidieran la entrada del
almidn a la enzima.

Alfa amilasa resulta ser una enzima extracelular (exoenzima), ya que la secrecin de sta se da debido a la imposibilidad
de que acte el sustrato dentro de la clula del microorganismo que la produzca. La principal funcin de las exoenzimas
reside en romper molculas complejas que existen en el medio ambiente. No todos los microorganimos poseen las mimas
exoenzimas, ya que algunas son caractersticas de ciertas especies. Para el caso de Bacillus subtilis, result dicha bacteria
poseer la enzima mencionada, pero a pesar de la cepa elegida como productora de alfa amilasa as como las condiciones
a las cuales fue adaptado el biorreactor, result inevitable la contaminacin del mismo. Cabe destacar que dentro de los
cuidados que se tuvieron a lo largo de la cintica para la produccin de alfa amilasa, no se contemplaron algunos de ellos
como fue el caso de la temperatura, ya que el biorreactor se mantuvo a temperatura ambiente (aproximadamente 21C)
cuando la temperatura ptima para Bacillus subtilis se encuentra en un rango de 25- 90 C. Tambin la agitacin en el
medio sumergido no se vio presente, siendo dicha condicin operativa importante debido a que sta es necesaria para
distribucin de oxgeno en el mismo, recordando que Bacillus subtilis es una bacteria aerbica.

En cuanto al crecimiento de la bacteria se cultiv sta en medio LB (Luria-Bertani) el cual proporcion los nutrientes
necesarios para su desarrollo ptimo pero no para la produccin de la enzima en estudio. Y efectivamente hubo
crecimiento de Bacillus subtilis, muestra de ello se refleja en las figuras 1 a 4 donde se sembr la cepa en placas de agar
LB a los diferentes tiempos que dur la cintica experimental.

Alfa amilasa adems es una enzima inducible, es decir, su concentracin aumenta en respuesta a seales ambientales o
en presencia de una molcula, inductor. En la experimentacin el inductor correspondi al almidn, el cual se agreg en
el tiempo 2.25 horas. Sin embargo, es posible notar que las absorbancias arrojadas no resultaron representativas para la
determinacin de actividad enzimtica. Para el caso del tiempo 0 (Ver Tabla 2.Actividad enzimtica de alfa amilasa
producida por Bacillus subtilis a lo largo del tiempo (edad de cultivo)), se esperaban valores muy bajos, ya que fue en ese
tiempo, cuando se realiz la inoculacin de la cepa al biorreactor y la no induccin de almidn y a pesar de ello, hubo
valores a una longitud de onda de 540 nm, puede especularse que la presencia de alfa amilasa en dicho tiempo no venga
directamente de la bacteria, sino del medio en el que se encontraba, ya que dicho medio (LB) posee entre sus
componentes extracto de levadura, el cual podra contener dentro de su conformacin amilasas. Tambin puede
mencionarse que la curva tipo que permiti el clculo de actividad enzimtica no cubre valores de absorbancia menores
a 0.221 a una longitud de onda de 540 nm, para lo cual sera incorrecto su aplicacin para las absorbancias obtenidas.

Pero no todo puede verse atribuido a las condiciones operativas, tambin se vieron involucrados errores personales o de
manipulacin. La implementacin de un sistema que permitiera tomar muestras del biorreactor planteado consisti en la
adicin de un sistema de venoclisis en conjunto de mangueras que fueron esterilizadas nicamente con etanol durante 5
minutos antes de su implantacin. Dicho sistema, result ser ineficiente al momento de tomar las muestras posteriores,
recurriendo as a cambiarlo por la adicin de mangueras y jeringas (que se esterilizaron de la misma manera que el primer
sistema). De haberse determinado la forma en que se tomaran las muestras desde un inicio al igual que los materiales a
utilizar se hubieran esterilizado correctamente como fue se hizo en el caso del biorreactor, se pudo haber evitado la
contaminacin del cultivo, ya que la contaminacin del mismo fue evidente en los anlisis de pureza de la muestra,
teniendo en un inicio Bacillus subtilis y a lo largo del tiempo aparecieron Cocos (de sepas no identificadas)
Referencias
Ochoa, M.. (Mayo 1994). Produccin de alfa amilasa por una cepa de nativa de Bacillus y su aplicacin al
tratamiento del almidn residual en granos de malta agotados. 25/11/17, de Universidad Autnoma de Nuevo
Len Sitio web: http://eprints.uanl.mx/7120/1/1080074567.PDF
Sarmiento, V. C., Vargas, D. H., Pedroza, A. M., Matiz, A., & Poutou, R. A. (2003). Produccin de a-Amilasa con
celulas libres e inmovilizadas de Thermus sp. Revista MVZ Crdoba, 8(2).
Quintero Moreno, M., MONTOYA CAMPUZANO, O. I., & GUTIRREZ SNCHEZ, P. A. Purificacin y caracterizacin
de una -amilasa producida por la cepa nativa bacillus sp. bbm1. Dyna; Vol. 77, nm. 162 (2010); 31-38 DYNA;
Vol. 77, nm. 162 (2010); 31-38 2346-2183 0012-7353.
 HOJA DE CLCULO
Concentracin de Glc+Fruct como producto de la actividad enzimtica de -amilasa
Para un valor de absorbancia de 0.056 a una longitud de onda de 540 nm (Tiempo 0.15, Edad de cultivo 4.25
horas. Datos obtenidos de Tabla 2).
Concentracin de Glc+Fruct (g/L)
Se toma como referencia el Grfico 4. Curva tipo para la determinacin de Maltosa mediante el reactivo DNS(Ver
Anexos)y se obtiene la ecuacin de la recta, siendo esta:

= 0.4746 + 0.0432

Donde y representa la absorbancia y x la concentracin de maltosa en g/mL. Se despeja entonces x para

conocer la concentracin de maltosa a una cierta absorbancia (0.862)
Despeje
0.0432
=
0.4746

Sustituyendo valores y obteniendo la concentracin de maltosa en unidades (mol/mL) por medio del peso
molecular de la misma:

0.056 0.0432 mg 1
= | |
0.4746 mL 320 g
mol
1mol
= 0.000611 | | = 611.1640
0.000001 mol

Concentracin final de maltosa (mol/mL)
Concentracin final de maltosa = Concentracin final de Glc + Fruct Concentracin del testigo

Concentracin final de maltosa = 611.1640 0.7616


Concentracin final de maltosa = 610.4023

Actividad enzimtica de -amilasa (2 mg/mL)
Pendiente obtenida en el Grfico. 2 Actividad enzimtica de alfa amilasa producida por Bacillus subtilis para la
edad de cultivo correspondiente a las 4.25 horas

mo
= 4.374

Factor de dilucin

=

1
=
0.05
= 20
Actividad enzimtica de -amilasa (2 mg/mL)

=
mol +
= 89.28

Concentracin de protenas mediante el mtodo Bradford sobre la actividad enzimtica de -amilasa

producida por Bacillus subtilis
Para un valor de absorbancia de 0.088 a una longitud de onda de 595 nm (Tabla 3.Resultados de la
determinacin de concentracin de protenas mediante el mtodo Bradford)

Concentracin de protena (mg/mL)

Se toma como referencia Grfico 5. Curva tipo para la determinacin de concentracin de protenas
mediante el mtodo Bradford (Ver Anexos)y se obtiene la ecuacin de la recta, siendo esta:
= 0.0061 + 0.1324

Donde y representa la absorbancia y x la concentracin de maltosa en g/mL. Se despeja entonces x para

conocer la concentracin de maltosa a una cierta absorbancia (0.862)
Despeje
0.1324
=
0.0061

Sustituyendo valores y obteniendo la concentracin de protena:

0.088 0.1324
= = 7.27868
0.0061

ANEXOS
 Curva tipo para la determinacin de Maltosa
mediante el reactivo DNS y = 0.3867x - 0.0243
R = 0.9928
1.200

1.000

0.800
Absorbancia

0.600
=540 nm

0.400

0.200

0.000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

-0.200
Concentracin
Maltosa (mg/mL)

Grfico 4. Curva tipo para la determinacin de Maltosa mediante el reactivo DNS