Triclosan PDF

UNIVERSIDADDESANTIAGODECOMPOSTELA
FacultaddeQumica
DepartamentodeQumicaAnaltica,NutricinyBromatologa
InstitutodeInvestigacinyAnlisisAlimentario

DESARROLLODEMETODOLOGAANALTICAPARALA
DETERMINACINDETRICLOSNYPARABENES.
APLICACINALESTUDIODESUDISTRIBUCINY
TRANSFORMACINENMUESTRASAMBIENTALES

MDELPILARCANOSARODRGUEZ
MemoriaparaoptaralgradodeDoctoraenQumica
SantiagodeCompostela,Octubre2008

D.AlbertoCepedaSez,CatedrticodeUniversidadyDirectordelDepartamentodeQumicaAnaltica,
NutricinyBromatologadelaUniversidaddeSantiagodeCompostela,
Informa:
Que la memoria titulada DESARROLLO DE METODOLOGA ANALTICA PARA LA DETERMINACIN DE

TRICLOSN Y PARABENES. APLICACIN AL ESTUDIO DE SU DISTRIBUCIN Y TRANSFORMACIN EN
MUESTRAS AMBIENTALES, para optar al grado de Doctora en Qumica que presenta Da. Mara del
PilarCanosaRodrguez,hasidorealizadabajoladireccindelosProfesoresTitularesD.IsaacRodrguez
Pereiro y Da. Elisa Mara Rub Cano, en el Departamento de Qumica Analtica, Nutricin y
BromatologadelaFacultaddeQumicadelaUniversidaddeSantiagodeCompostela.
Yparaqueasconste,firmoelpresenteinformeenSantiagodeCompostela,Octubrede2008.
D.AlbertoCepedaSez
D. Isaac Rodrguez Pereiro y Da. Elisa Mara Rub Cano, Profesores Titulares del Departamento de
QumicaAnaltica,NutricinyBromatologadelaUniversidaddeSantiagodeCompostela,
Autorizan:
A la licenciada Da. Mara del Pilar Canosa Rodrguez la presentacin de la memoria titulada
DESARROLLO DE METODOLOGA ANALTICA PARA LA DETERMINACIN DE TRICLOSN Y PARABENES.
APLICACINALESTUDIODESUDISTRIBUCINYTRANSFORMACINENMUESTRASAMBIENTALES,que
harealizadobajosudireccinenelDepartamentodeQumicaAnaltica,NutricinyBromatologadela
Facultad de Qumica de la Universidad de Santiago de Compostela, para optar al grado de Doctora en
Qumica.
Yparaqueasconste,firmamoselpresenteinformeenSantiagodeCompostela,Octubre2008.
D.IsaacRodrguezPereiro Da.ElisaMRubCano

Agradece a la llama su luz, pero no olvides el pie del candil que, constante y paciente, la sostiene en la
sombra. Rabindranath Tagore.

AGRADECIMIENTOS
Quisieramostrarmigratitudenestasbreveslneasaaquellosquehanhechoposibleesta
TesisDoctoral.
AgradeceralDepartamentodeQumicaAnaltica,NutricinyBromatologayalInstitutode
Investigacin y Anlisis Alimentario, as como a D. Rafael Cela Torrijos, director del grupo de
investigacindeCromatografayQuimiometradelDepartamentodeQumicaAnaltica,Nutriciny
Bromatologa de la Universidad de Santiago de Compostela, los medios proporcionados para la
realizacin de este trabajo. Asimismo, al Gobierno de Espaa, la Xunta de Galicia y fondos FEDER
(proyectosDGICTCTQ200603334yPGIDIT06PXIB237039PR),yalMinisteriodeCienciaeInnovacin
porlabecaFPUdisfrutadadurantelarealizacindeestaTesisDoctoral.
Mi ms sincero agradecimiento a D. Isaac Rodrguez Pereiro y Da. Elisa Rub Cano,

directoresdeestetrabajo.GraciasIsaacportupaciencia,tuapoyoylosconocimientoscompartidos.
AElisa,tusnimos,tuayudaincondicionalylaslargascharlasenpocasdedesnimo.
GraciastambinamiscompaerosdelIIAA,alosqueyanoestn,alosquesiguenestando
yalosqueacabandellegar.Agradecerespecialmenteaaquellosquehancontribuidodealgnmodo
enlarealizacindeestetrabajo.
A Da. Mara Teresa Tena Vzquez de la Torre, profesora titular del departamento de
Qumica Analtica de la Universidad de La Rioja, por facilitarme la estancia en su grupo de
investigacin durante el periodo SeptiembreDiciembre de 2006. Gracias Teresa por tus sabios
consejosyporhacermeverquelascosas,tardeotemprano,siempresevenrecompensadas.
Especialmencinaloschicosdellaboratorio5,porsucarioysuamistad,porlasnochesde
laLaurel,yporarrancarmeunasonrisaenlosmomentosdemorria.

Amifamilia,amigos,yenespecialaNachoporsucomprensinyapoyoduranteestelargo
periodo,aellosvadedicadaespecialmenteestaTesis.

Amifamilia

ANacho

NDICE
ndice
NDICE
JUSTIFICACINYOBJETIVOS. 1
CAPTULOI. 5
I.TRICLOSNYCOMPUESTOSRELACIONADOS. 7
1.1.Definicin,estructuraypropiedadesdeltriclosnycompuestosrelacionados.. 7
1.2.Aplicaciones.. 8
1.3.Toxicidad. 9
1.4.Distribucinenelmedioambiente.. 11
1.5.Productosdetransformacindeltriclosn. 17
1.5.1.Closanospolicloradosyclorofenoles.. 17
1.5.2.Dioxinas 18
1.5.3.Metiltriclosn.. 20
II.PARABENES 21
2.1.Definicin,estructuraypropiedadesdelosparabenes. 21
2.2.Aplicaciones.. 22
2.3.Toxicidad. 23
2.4.Distribucinenelmedioambiente.. 24
2.5.Productosdetransformacindelosparabenes. 26
2.5.1.cidophidroxibenzoico. 26
2.5.2.Productosdehalogenacin.. 26
III.METODOLOGAANALTICA 27
3.1.Preparacindemuestraparamatricesacuosas. 27
3.1.1.Extraccinlquidolquido(LLE).. 27
3.1.2.Extraccinenfaseslida(SPE) 28
3.1.3.Microextraccinenfaseslida(SPME). 31
3.2.Preparacindemuestraparamatricesslidas. 36
I
ndice
3.2.1.Extraccinasistidapormicroondas(MAE).. 36
3.2.2.ExtraccinSoxhlet. 38
3.2.3.Dispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)................................................ 39
3.2.4.Extraccincondisolventespresurizados(PLE). 40
3.2.5.Ultrasonidos(US) 42
3.3.Derivatizacin 43
3.3.1.Derivatizacinenmediohomogneo. 43
3.3.2.DerivatizacincombinadaconSPME.. 45
3.3.3.Usodeagentessililantescomoreactivosdederivatizacin 46
3.4.Determinacin.. 48
3.4.1.Cromatografadegases. 48
3.4.2.Cromatografadelquidos 50
CAPTULOII 53
I.MEDIOSEXPERIMENTALESGENERALES.. 55
1.1.Compuestosymaterialesutilizados. 55
1.1.1.Reactivosydisolventes 55
1.1.2.Patrones. 55
1.1.3.AdsorbentesparaSPEyfibrasdeSPME.. 56
1.2.Instrumentacin. 56
1.2.1.Materialgeneraldelaboratorio. 56
1.2.2.Equiposdeextraccinutilizados 57
1.2.3.Programasinformticos.. 57
1.2.4.SistemasGCMS 57
1.3.Preparacindepatrones. 58
II.METODOLOGADESARROLLADA 59
2.1.Protocolosdepreparacindemuestra. 59
II
ndice
2.1.1.Determinacindetriclosnysusderivadosenmuestrasacuosasmediante
extraccinenfaseslida 59
2.1.2.Determinacindetriclosnysusderivadosenmuestrasacuosasmediante
microextraccinenfaseslida. 60
2.1.3.Determinacindederivadosdelcidoparahidroxibenzoicoenmuestras
deaguamedianteextraccinenfaseslida 61
2.1.4.Determinacindemetilparaben,etilparaben,propilparaben,butilparaben
ybencilparabenenmuestrasacuosasmediantemicroextraccinenfaseslida. 62
2.1.5.Determinacindetriclosnyclorofenolesrelacionadosenmuestrasde
sedimentosylodosdedepuradoramedianteextraccinasistidapormicroondas. 63
2.1.6.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenen
muestrasdepolvomedianteextraccincondisolventespresurizados.. 64
2.1.7.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenen
muestrasdepolvomediantedispersindelamatrizenfaseslida.. 65
2.1.8.Determinacindetriclosnymetiltriclosnenmaterialbiolgico
medianteMSPD 66
2.2.Condicionesdedeterminacin 67
2.2.1.GCMS.. 67
2.2.2.GCMS/MS. 68
CAPTULOIII 71
I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y SUS DERIVADOS EN AGUA MEDIANTE
MICROEXTRACCINENFASESLIDA 73
1.1.Introduccin. 73
1.2.Experimentosprevios. 74
1.2.1.Identificacincromatogrfica. 74
1.2.2.EvaluacindelaviabilidaddelmuestreomedianteSPMEcon
derivatizacinonfiber 77
1.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber. 78
III
ndice
1.3.1.Mododemuestreo. 78
1.3.2.Comparativadedistintasfases.. 79
1.3.3.OptimizacindelascondicionesdemuestreoconpoliacrilatoyPDMS
DVB:Influenciadelaagitacin,fuerzainicadelmedioypH 81
1.3.4.Volumendemuestra 83
1.3.5.Tiempodeextraccin.. 84
1.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin.. 86
1.3.7.Evaluacindelosefectosmemoria. 89
1.3.8.Efectosdematriz. 90
1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico. 91
1.4.1.Linealidad.. 91
1.4.2.Lmitesdecuantificacin. 92
1.4.3.Repetibilidaddelproceso.. 93
1.4.4.ExactituddelmtododeSPME.. 93
II. DETERMINACIN DE PARABENES EN AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCIN EN FASE
SLIDA... 95
2.1.Introduccin 95
2.2.Experimentosprevios 95
2.2.1.Eleccindelagentesililanteyestudiospreliminaresderepetibilidad.. 95
2.2.2.Identificacincromatogrfica. 98
2.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber. 100
2.3.1.RecubrimientodelafibradeSPME. 100
2.3.2.Fuerzainicadelmedio.. 101
2.3.3.pHyvolumendemuestra.. 102
2.3.4.Mododemuestreoyagitacin.. 104
2.3.5.Tiempodeextraccin 105
2.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinonfiber. 106
IV
ndice
2.3.7.Evaluacindelosefectosmemoria. 108
2.3.8.Efectosdematriz. 109
2.4.Caracterizacinanalticadelmtodopropuesto 110
2.4.1.Linealidad.. 110
2.4.2.Lmitesdecuantificacindelmtodo 111
2.4.3.Repetibilidaddelmtodo.. 112
2.4.4.ExactituddelprocesodeSPME. 113
III. ESTUDIO DE LA FORMACIN DE DERIVADOS HALOGENADOS DEL TRICLOSN Y
PARABENESENAGUACLORADA. 115
3.1.Introduccin. 115
3.1.1.Antecedentesbibliogrficos. 115
3.1.2.Concentracindelasmuestras.. 118
3.1.3.Preparacindelamuestraparaelestudiodehalogenacin 121
3.1.4.Medidadelclorolibreenaguasdegrifo. 121
3.1.5.Valoracindeladisolucindehipoclorito. 121
3.1.6.Clculodeltiempodevidamedia. 122
3.2.Condicionesinstrumentalesdemedida 123
3.3. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo de triclosn y
compuestosrelacionados. 128
3.3.1.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenmediohomogneoy
estabilidaddeloscompuestossililados.. 128
3.3.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas.. 130
3.3.2.1.Volumendeelucinyvolumendecorte. 130
3.3.2.2.Matricescomplejas:filtracinypurificacindeextractos. 132
3.3.3.Caracterizacindelmtodoanaltico. 134
3.3.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS):linealidad,
repetibilidadylmitesdecuantificacin. 135
V
ndice
3.3.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico 135
3.4. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo para la
determinacindeparabenesenmuestrasdeagua 137
3.4.1.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenmediohomogneoy
estabilidaddeloscompuestossililados 137
3.4.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas.. 139
3.4.2.1.Volumendeelucindeloscartuchosyvolumendecorte. 140
3.4.2.2.Matricescomplejas:Purificacindelosextractos 140
3.4.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS):linealidad,
repetibilidadylmitesdecuantificacininstrumentales 142
3.5.Halogenacindeltriclosn. 145
3.5.1.Pruebaspreliminares. 145
3.5.2.EstudiodedegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibre 146
3.5.3.Cinticasdecloracinenaguaultrapura 147
3.5.4.Identificacindelosproductosdetransformacin. 148
3.5.5.Evolucintemporaldelosproductosmayoritarios. 153
3.5.6.Estudiosdecloracinenaguadegrifo. 156
3.5.7.Presenciadecompuestoshalogenadosenmuestrasreales. 157
3.6.Halogenacindeparabenes.. 159
3.6.1.Pruebaspreliminares. 159
3.6.2.DegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibreenagua
ultrapura... 159
3.6.3.Cinticasdehalogenacinenaguaultrapurayaguadegrifo.. 160
3.6.4.Identificacindelosproductosdetransformacin:Parabenescloradosy
Bromados.... 162
3.6.5.Evolucintemporaldelosderivadoscloradosdelosparabenes 170
VI
ndice
3.6.6.Formacindederivadoshalogenadosdelosparabenesenaguadegrifo
encontactoconproductosdecuidadopersonal. 172
3.6.7.Presenciadeparabeneshalogenadosenmuestrasreales. 174
IV. APLICACIN DE LAS METODOLOGAS DESARROLLADAS A LA DETERMINACIN DE
TRICLOSN, COMPUESTOS RELACIONADOS Y PARABENES EN AGUAS RESIDUALES Y
SUPERFICIALES 177
4.1.Triclosnycompuestosrelacionados. 177
4.2.Parabenes 182
Anexo 187
CAPTULOIV.. 189
I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y CLOROFENOLES EN MUESTRAS DE SEDIMENTO Y
LODOMEDIANTEEXTRACCINASISTIDAPORMICROONDAS. 191
1.1.Introduccin.. 191
1.2.Experimentosprevios. 193
1.2.1.ViabilidaddelaextraccindeTCS,2,4DCFy2,4,6TCFdemuestrasde
lodosmedianteMAE. 193
1.2.2.Identificacincromatogrfica(GCMS/MS) 195
1.3.Estrategiadepurificacindelosextractos.. 197
1.4.Optimizacindelascondicionesdeextraccinasistidapormicroondas.. 200
1.4.1.Temperatura,disolvente,volumendedisolventeyagitacin.. 200
1.4.2.Optimizacindelvolumendeextractante,proporcinmetanol:acetonay
modificadororgnico 202
1.5.Caracterizacindelmtodoanaltico.. 205
1.5.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,
repetibilidadyLOQs.. 205
1.5.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico. 206
1.6.Aplicacinalanlisisdemuestrasreales.. 209
VII
ndice
CAPTULOV 211
I.DETERMINACINCONJUNTADETRICLOSNYPARABENESENMUESTRASDEPOLVO 213
1.2.Condicionesexperimentalesdemedida.. 215
1.3.Extraccincondisolventespresurizados.. 216
1.3.1.Estrategiadepurificacin.. 216
1.3.2.Optimizacindelascondicionesdeextraccin.. 220
1.3.2.1.Disolventedeextraccin 220
1.3.2.2.Temperatura,tiempoymasadecoadsorbente 221
1.3.2.3.Ciclosdeextraccin 225
1.3.3.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin.. 226
1.3.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,
repetibilidadyLOQs. 228
1.4.Extraccinmediantedispersindelamatrizenfaseslida 231
1.4.1.Optimizacindelascondicionesdeextraccin.. 231
1.4.1.1.Eleccindelcoadsorbente.. 231
1.4.1.2.Disolventedeelucin 232
1.4.1.3.Optimizacindelamasadedispersante,disolventedeeluciny
Volumen 234
1.4.1.4.Masadecoadsorbenteyvolmenesdedisolventesdelavadoyelucin.. 236
1.4.2.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenacetonitrilo.. 238
1.4.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,
1.4.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodo. 241
VIII
ndice
1.5.Anlisisdemuestrasreales 243
CAPTULOVI. 245
I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y METILTRICLOSN EN MUESTRAS DE MATERIAL
BIOLGICO.. 247
1.1.1.Antecedentesbibliogrficos. 247
1.1.2.Determinacindecontenidograsodelasmuestras.MtodoBligh&Dyer.. 250
1.1.3.Condicionesinstrumentalesdemedida 251
1.2.MSPDconretencindelpidos 253
1.3.MSPDconeliminacindelpidos 257
1.3.1.Porcentajedecidosulfricoenelcoadsorbente.. 258
1.3.2.Tipoyvolumendeextractante.. 259
1.3.3.EstabilidaddeTCSyMTCSenlasmuestrasconadicin.. 260
1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico. 261
1.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,
1.4.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico. 262
1.5.Aplicacindelametodologadesarrollada. 264
CONCLUSIONES.. 267
BIBLIOGRAFA.. 273
ACRNIMOS. 287
IX
JUSTIFICACINYOBJETIVOS

Justificacinyobjetivos
JUSTIFICACINYOBJETIVOS
Hastamediadosdelosaos90,unnmerocrecientedecompuestosorgnicosconelevada
toxicidad, muy estables qumicamente y con carcter bioacumulativo, como los PCBs, dioxinas,
diversospesticidas,etc,fueronincluidosenlaslistasdecontaminantesorgnicospersistentes(POPs)
y sometidos a intensos programas de monitorizacin, a la vez que se desarrollaron las distintas
legislacionesenreferenciaalosnivelesmximosemitidosypermitidosenelmedioacutico.
Apartirdeestemomento,enlosestudiosmedioambientales,sehaempezadoaconsiderar
otro tipo de sustancias, denominados contaminantes emergentes, como son los productos
farmacuticos y de cuidado personal (PPCPs) [Loos R; 2003][Petrovi M; 2003]. Un contaminante
emergente corresponde, en muchos casos, a un compuesto no regulado, el cual es un futuro
candidatoparaunaposteriorregulacin,dependiendodesusefectospotencialessobrelasaludyel
medioambiente[BarcelD;2003].Losproductosdecuidadopersonalincluyenunamplionmero
de compuestos, como, por ejemplo, frmacos, esteroides y hormonas, fragancias, estabilizantes,
antispticos,Lacaractersticaprincipaldeestoscompuestosesquenoprecisanserpersistentesen
el medio ambiente para ejercer efectos negativos, ya que su continua descarga, compensa la
eliminacin y transformacin de los mismos. La introduccin de PPCPs en el medio ambiente
provienededistintasvas:
Descargasdeaguasresiduales(tratadasynotratadas)enrosymares.
Frmacosexcretadossinmetabolizar.
Jabones, desinfectantes, etc, que se vierten directamente a los ros y mares [Kanda R;
2003][AgeraA;2003][ArnoldWA;2003].
Empleo de aerosoles y otros preparados en actividades cotidianas de aseo y limpieza del
hogar.

Enlamayoradeloscasos,latoxicidaddeestoscompuestosesbaja,sinembargopueden
serprecursoresdeotrasespecies,consideradoscontaminantesprioritarios,comoporejemplolas
dibenzopdioxinas policloradas o sustancias cloradas aromticas [Arnold WA; 2003][Hell K;
2000][TixierC;2002].Adems,lapresenciaconstantedeantibiticos,frmacos,bactericidas,etc,en
el medio ambiente ha provocado el desarrollo de cepas bacterianas resistentes a dichos agentes,
malformaciones de los rganos sexuales en animales, cambio de sexo en los peces y descenso de
fertilidad en humanos [http:www.ayaba.es/diario]. Incluso algunos autores han puesto de
manifiesto la posible relacin entre ciertos tipos de cncer y el uso de estos compuestos en
productosdecuidadopersonal[DarbrePD;2004].

3
Justificacinyobjetivos
Lacontinuaintroduccindeestassustancias,aparentementeinocuas,ascomolosescasos
controles medioambientales de los mismas, hace necesario el desarrollo de una serie de
metodologasanalticasquepermitanobtenerdatosrespectoasudistribucinmedioambiental,as
comoelriesgopotencial,alargoplazo,derivadodesuusocotidianoennuestroshogares.Deeste
modo,esposibleestablecerlanecesidaddesarrollar,ono,unalegislacinencaminadaalcontrolde
estassustancias,aparentementeinofensivasporcontactodrmicooporingestin,ascomodelos
subproductosgeneradosapartirdelosmismasmediantereaccionesfotoqumicasuoxidativas.

En este trabajo se han desarrollado distintos mtodos analticos, aplicados a matrices
medioambientales, para la determinacin de un bactericida de amplio uso, el Triclosn, as como
clorofenoles relacionados (2,4diclorofenol, 2,3,4triclorofenol, 2,4,6triclorofenol) [Kanetoshi A;
1987][Canosa P; 2005 A], un producto de biometilacin del mismo, el metiltriclosn [Balmer ME;
2005], y por ltimo, una familia de compuestos utilizados como conservantes, los parabenes
(metilparaben,etilparaben,propilparaben,butilparabenybencilparaben)[BenijtsT;2004].
Agua, lodo, polvo de atmsferas interiores y msculo de pescado han sido seleccionados
como matrices, para evaluar su distribucin en el medio ambiente. En general, se ha optado por
optimizarmetodologasdepreparacindemuestrasencillasydebajocoste,comosonlaextraccin
enfaseslida,lamicroextraccinenfaseslidayladispersindematrizenfaseslida.Adems,se
han utilizado la extraccin asistida por microondas y la extraccin acelerada con disolventes en
variasaplicaciones.
Adicionalmente al desarrollo de metodologas de determinacin de estos compuestos, se
hanllevadoacabodiversosestudiosenloreferenteasutransformacinqumicaenaguascloradasy
laposibilidaddemigracindelTriclosndesdesuperficiestratadasconestebactericidaaalimentos
encontactoconlasmismas.

4
CAPTULOI
Triclosnycompuestosrelacionados
I.TRICLOSNYCOMPUESTOSRELACIONADOS
1.1.Definicin,estructuraypropiedadesdeltriclosnycompuestosrelacionados
El triclosn [5cloro2(2,4diclorofenoxi)fenol], TCS, es un fenoxifenol triclorado

comercializado con el nombre de Irgacare MP o Irgasan DP 300 que presenta propiedades
antibacterianas. Es un polvo blanquecino escasamente soluble en agua, hidrolticamente estable y
poco voltil, con una elevada hidrofobicidad. Debido a su reactividad, se estudiar conjuntamente
con varios de sus productos de transformacin: el metiltriclosn, el 2,4diclorofenol, el 2,3,4
triclorofenolyel2,4,6triclorofenol,loscualessemuestranenlafiguraI.1.
Figura I.1. Estructuras del triclosn (TCS), metiltriclosn (MTCS), 2,4diclorofenol (2,4DCF), 2,3,4
triclorofenol(2,3,4TCF)yel2,4,6triclorofenol(2,4,6TCF).
Cl OH Cl OMe
O O
Cl Cl Cl Cl
TCS MTCS
Cl Cl
Cl
Cl OH OH
OH
Cl Cl Cl Cl
2,4DCF 2,3,4TCF 2,4,6TCF
El metiltriclosn [5cloro2(2,4diclorofenoxi)anisol], MTCS, es un anisol generado en

procesosdebiometilacindeltriclosn,cuyaspropiedadesfsicoqumicasleproporcionancarcter
bioacumulativo[BalmerME;2005].Losclorofenolesanterioresseconsideranposiblesproductosde
hidrlisisdeltriclosnenmedioacuoso.El2,4diclorofenol(2,4DCF)yel2,3,4triclorofenol(2,3,4
TCF)fueronpropuestosinicialmentecomosubproductosdehidrlisis[OnoderaS;1987],aunque
estudios posteriores, pusieron de manifiesto que son el 2,4,6triclorofenol (2,4,6TCF) junto con el
2,4diclorofenollosproductosfinalesgeneradosenreaccionesdeoxidacinehidrlisisdeltriclosn
[RuleKL;2005][CanosaP;2005A].
7
Introduccin

EnlatablaI.1,semuestranalgunasdelaspropiedadesdescritasparaestoscompuestos.
TablaI.1.Propiedadesdeltriclosnycompuestosrelacionados.
Propiedades TCS MTCS 2,4DCF 2,3,4TCF 2,4,6TCF
Pm(g/mol) 289.5 303.6 163 197.4 197.4
pKa 7.80 8.05 7.10 6.59
LogKow 4.8 5.4 2.99 3.66 3.57
Puntoebullicin(C) 345 359 210 260 246
Puntofusin(C) 162 128 113 111 96
Pvapor(Torr) 3.26105 5.18105 0.136 0.008 0.0177
Solubilidad,pH3(g/L) 0.004 0.001 3.6 0.79 0.87
Solubilidad,pH7(g/L) 0.005 0.001 3.9 1.4 3.2
Solubilidad,pH9(g/L) 0.069 0.001 36 61 190
1.2.Aplicaciones
El triclosn exhibe un amplio espectro bactericida contra las bacterias Gram + y Gram ,
ademsdehongosylevaduras.Suefectoantibacterianoesdebidoalainhibicinqueejercesobrela
protena transportadora enoilacil reductasa (ENR), encargada de la biosntesis de cidos grasos
necesariosparalaformacindelasparedescelularesylareproduccindelasbacterias[SingerH;
2002][McAvoyD;2002][GlaserA;2004].
El triclosn est presente en mltiples productos relacionados con la desinfeccin en un
rango que va desde 0.1 a 0.3 % (10003000 g/g), como jabones, desodorantes, limpiadores,
champs y cosmticos [http://www.listadeespera.net/guia/pdf/RD1599_1997_17oct.pdf].
Adems, es adecuado para su introduccin en polmeros y fibras, en almohadillas de colchn,
tablerosdecorte,zapatosyropadeportiva[OrvosDR;2000][BirkelM;1993][GlaserA;2004].Para
lospolmerosytejidos,contenidosdetriclosn(Microban)de300g/gofrecenproteccincontra
las bacterias Gram +, 7501000 g/g frente a bacterias Gram + y , 3005000 g/g proteccin
adicional al desarrollo de hongos; con 4000 g/g es posible mantener las propiedades
antibacterianasenaquellosproductosquesonlavadosconfrecuencia[GacnJ;2001].Suusoms
conocido es como aditivo en dentfricos, ya que se considera un agente activo contra la gingivitis,
ejerciendoestaaccinaconcentracionessuperioresa0.050.06mM(1417g/g)[ZuckerbraumHL;
1998].

8
1.3.Toxicidad
El triclosn es un compuesto de baja toxicidad aguda. Diversos estudios sobre su uso en

productosdecuidadopersonalrevelanque,alasconcentracionesutilizadas(0.3%,segnRD1599
del17octubre1997),noestxico,carcinognico,teratognico,niirritantedeojosypiel.Eltriclosn
penetra en el cuerpo humano por contacto con la piel, las mucosas y el tracto intestinal,
reducindosesuconcentracinalamitadtras21horas,retornandofinalmentealosnivelesiniciales
alcabode8das[McAvoyD;2002][AllmyrM;2006A].
El mayor problema derivado de la introduccin de triclosn en las formulaciones de
productos de cuidado personal es su continua descarga en el medio ambiente, ya que puede
producirefectosadversossobrelaflorayfaunaacutica.Lasalgas,organismosunicelularesypeces
hansidolosprincipalesorganismosenlosquesehaestudiadosutoxicidad.
Dado que las algas comprenden el primer escaln en la pirmide alimentaria, un efecto
adverso en ellas puede desembocar en un efecto en cadena para organismos de mayor tamao
[ShipperO;2003].Lasalgasunicelulares,particularmentelasalgasverdesylascianobacterias,son
delordende30a80vecesmssensiblesalaexposicinatriclosnqueotrosorganismosacuticos
[TatarazakoN;2004][OrvosDR;2002].Elcrecimientodeestasalgasesinhibidoaconcentraciones
de TCS comprendidas entre 1.3 y 13 ng/mL en un tiempo de exposicin de 4 das, con una
concentracinmediainhibitoria,conocidacomoIC50,de4.7ng/mL.UnestudiorealizadoporOrvosy
colaboradores [Orvos DR; 2002] mostr que al disminuir la concentracin de triclosn, el
crecimientodelasalgassereanudaba,sugiriendoquelosorganismosseencuentranenunestado
latente. As mismo, descubrieron que el mayor efecto txico se produjo sobre la especie
Scenedesmus Subspicatus, dado que este organismo es capaz de transformar qumicamente el
triclosnen2,4diclorofenol,demayortoxicidadqueelcompuestodepartida.
Bioensayos realizados por Wilson y colaboradores [Wilson BA; 2003] sugirieron que la
estructura y funcin de las comunidades de algas pueden experimentar modificaciones cuando
sufrencontinuasdescargasdeefluentesdeplantasdetratamientodeaguasresidualesconteniendo
triclosn.Anivelesinferioresa0.015ng/mLseobservunaligeradisminucindelapoblacinde
dosespeciesdealgas,siendomssignificativacuandosealcanzaronconcentracionescomprendidas
entre0.15y1.5ng/mL.Deigualmodo,estudiosinvivosobrelareproduccinsexualyasexualdel
algaC.Ehrenbergii,realizadosporCinigliaycolaboradores[CinigliaC;2005],pusierondemanifiesto
que niveles inferiores a 0.1255 mg/L no afectaron al tamao de los cloroplastos y su morfologa,
aunqueseinhibielcrecimientovegetativocuandolosnivelesalcanzaronlos0.5mg/L,mermando
inclusosureproduccinsexualanivelesde0.937mg/L.
9
Introduccin
Dentro de los vertebrados, la toxicidad del TCS ha sido estudiada en peces y anfibios,
principales pobladores de ros y lagos. En un estudio inicial, el grupo de Orvos [Orvos DL; 2002]
descubri que las cras de la trucha arcoiris presentaban una disminucin de su supervivencia
cuandoeranexpuestasduranteunperiodode35a61dasanivelesdetriclosndelordende71.3
ng/mL, sin que hubiese diferencia de longitud y peso con respecto a las muestras control. Sin
embargo, se manifestaron malformaciones en la mandbula, curvatura de la espina dorsal,
inactividad y natacin errtica, factores que afectan negativamente a la supervivencia. Estimaron
tambin la concentracin media letal (EC50) del triclosn para la carpa cabezona (Pimeaples
promelas) y para la perca (Leponis macrochirus), siendo del orden de 260440 ng/mL. Por ltimo,
observaron que el factor de bioconcentracin del TCS aument prcticamente el doble cuando su
concentracinenaguadisminuyde30a3ng/mL.
Ishibashi y colaboradores [Ishibashi H; 2004] investigaron como afecta la presencia del
triclosnaldesarrolloreproductivodelmedaka(OryzasLatipes).Estimaronen601ng/mLelEC50(24
h) para las larvas, adems de observar una reduccin y retraso de la eclosin de 14 das. En esta
mismalnea,Tatarazakoycolaboradoresdeterminaronqueelpezcebra(DanioRerio)yelmedaka
(Oryziaslatipes)presentaronunadisminucindel50%desuspoblaciones(IC50)aconcentraciones
de triclosn del orden de 220 ng/mL y 400 ng/mL respectivamente, similares a los resultados
obtenidosporOrvos[TatarazakoN;2004].

Conrespectoalosanfibios,losgruposdeFrakeryVeldhoenhanevaluadolatoxicidaddel
TCS para dos especies de rana diferentes. Para la rana leopardo (Rana pipiens), niveles de
concentracin de 230 ng/mL provocaron alteraciones del sistema nervioso, mientras que a
concentraciones1000vecesinferiores,seobservunadisminucindepesoimportante,ascomoun
aumento de mortandad en las cras [Fraker SL; 2004]. Para la rana toro (Rana catesbeiana),
Veldhoenycolaboradoresobservaroncambiosenlametamorfosismediadaporlahormonatiroidea
en presencia de niveles de triclosn inferiores a 150 ng/mL durante 4das, traducindose en una
disminucindepesoyunaumentodeltamaodelacolaenlosrenacuajos[VeldhoenN;2006].
Laactividadtiroideatambinhasidoestudiadaenratas[CroftonKM;2007]disminuyendo
losnivelesdehormonastiroideasalaumentarlacantidaddetriclosninoculado,aligualquesuceda
en la rana toro. En este caso, los niveles necesarios para observar efectos adversos fueron de 30
mg/kgporda.

Entre las aplicaciones del triclosn, la utilizacin como agente antimicrobiano en
desodorantesocremas,haceposiblequeseproduzcalapenetracincutneadelmismo.Estudiosin
vivo en ratas y humanos, pusieron de manifiesto que entre un 21 y un 28 % del triclosn era
adsorbidodrmicamenteporlasratas,mientrasqueparaloshumanossloel15%delacantidad
10
aplicadapenetrabaenlapiel.Dentrodelorganismo,eltriclosnestransformadoporelhgadoensu
conjugadoglucurnido [Moss T;2000], elcual tiene un tiempo depermanencia medio de 4horas
cuandoesadministradooralmenteahumanos[SioufiA;1997].
El mayor problema derivado del uso del triclosn, se debe a su reactividad, ya que se
considera precursor de contaminantes prioritarios como los clorofenoles, dioxinas y compuestos
policloradosgeneradosendistintasreaccionesdetransformacinqueseenumerarnmsadelante
[HellK;2000][GraovacCM;1995][OnoderaS;1987][TixierC;2002].
1.4.Distribucinenelmedioambiente
Enlabibliografaexistente,sehapuestodemanifiestolapresenciadetriclosnendistintas
matricesmedioambientales,talescomoaguasresidualesysuperficiales,sedimentos,lodos,eincluso
muestrasdematerialbiolgico(msculoygrasadepescado,lechematerna,etc).
Sabaliunasycolaboradores[SabaliunasD;2003]afirmaronqueesimportanteconocerlos
procesos que determinan la estabilidad del TCS, y por tanto, su cantidad disponible en el medio
acutico,paralaestimacindelosposiblesriesgosderivadosdesupresenciaenelmedioambiente
y,encasonecesario,establecerlacorrespondientelegislacinencaminadaacontrolarelusodeeste
bactericida. En general, se observa que la distribucin del TCS en el medio ambiente depende de
variosfactoresentrelosquecabedestacar:
ElpHylaconcentracindeslidosensuspensin.Eltriclosnesunasustanciaionizable,yla
variacinenestosparmetrosmodificasudistribucinenelmedioacutico,demodoquesi
elpHaumenta,larelacintriclosnionizado/triclosnsinionizartambinseincrementa.Una
cantidadimportantedemateriaparticuladaprovocaunaumentodeltriclosnadsorbidoensu
superficie, siempre que el pH del agua sea inferior al pKa del compuesto [Sabaliunas D;
2003][TixierC;2002].
Fotlisis. El triclosn es susceptible de sufrir una transformacin fotoltica en las aguas
superficiales,bajolaaccindelaluzsolar.LaextensindeestareaccinesfuncindelpHdel
medio(seproduceunincrementodeunfactorde30delrendimientodelareaccincuandoel
pHseincrementade5.9a11.0)ydelacantidaddeluzsolarquerecibe.Encualquiercaso,la
fotodegradacin del triclosn slo es significativa en la superficiede las masas de agua. Por
estarazn,losprocesosdefotlisissonimportantesenaguassuperficialesperonoenaguas
subterrneasoresiduales[FerrerI;2004][AranamiK;2007][SnchezPradoL;2006AyB].
Biodegradacin. El triclosn puede ser biodegradado por los organismos presentes en el
agua.Esteprocesodependedelatemperaturadelmedioydelaprofundidad.Porejemplo,la
bacteriaAchromobacterXylosoxidasasdegradaeltriclosnenlasuperficiedelaspartculasen
11
Introduccin
suspensingenerandocomoproductoprincipaldedegradacinel2,4diclorofenol,delmismo
modoqueelalgaScenedesmusSubspicatus[TixierC;2002][OrvosDR;2000].
Cloracin. En presencia de cloro libre, el triclosn puede sufrir la halogenacin de su anillo
fenlico, dando lugar a los tetra y al penta closano, y a dos productos de ruptura de su
molcula,el2,4diclorofenolyel2,4,6triclorofenol[RuleKL;2005][CanosaP;2005A].

Actualmente,existenmltiplesestudiosenlosqueseevalalaconcentracindetriclosn
en distintos tipos de matrices medioambientales. En el caso de muestras acuosas, las
concentracionesvaranenormementeentreaguasresidualesyaguassuperficiales,perotambinen
distintas zonas del planeta. Con estos datos, se pueden valorar los porcentajes de eliminacin de
triclosn por parte de las estaciones depuradoras de agua residual. Se estima que durante los
tratamientos primarios se elimina entre un 7 y un 48 % del compuesto [Sabaliunas D; 2003][van
SteeLLP;1999],mientrasqueeneltratamientosecundario,laeliminacinesdelordendel8195.5
%[LeeHB;2003][BesterK;2003],tablaI.2.Encualquiercaso,estosvaloresdebenconsiderarsecon
suma precaucin, puesto que hacen referencia nica y exclusivamente a las concentraciones del
compuestoendisolucin,sintenerencuentalafraccinadsorbidaenellodo.

TablaI.2.Nivelesdetriclosnenaguaresidualtratadaysintratar.
Aguaresidualsintratar Aguaresidualtratada
Localizacin Referencia
(ng/mL) (ng/mL)
1.337.8 0.422.1 AgeraA;2003
Espaa(Almera) 2.3562 0.1269 MezcuaM;2004
0.394.2 0.080.40 GmezMJ;2007
Espaa(Barcelona) na 0.045 KusterM;2008
Espaa(Corua) 0.1950.228 nd QuintanaJB;2007
a
0.61.3 0.110.65 EnvProy861;2003
Suiza
0.5841.3 0.0700.65 LindstromA;2002
a
0.11.5 <0.2 EnvProy861;2003
0.38 0.16 BendzD;2005
Suecia
0.090.7 na PaxusN;2004
na nd0.50 PaxusN;1996
nd nd QuintanaJB;2004
Alemania 1.11.3 0.0430.059 BesterK;2003
0.010.6 na BesterK;2005
12
Aguaresidualsintratar Aguaresidualtratada
(ng/mL) (ng/mL)
a
Dinamarca 1.63.0 <11.8 EnvProy861;2003
5.921.9 0.3413.35 SabaliunasD;2003
ReinoUnido
<3.1 nd KandaR;2003
Noruega 0.0432.8 0.160.48 WeigelS;2004
1.66.1 0.0200.035 HaldenRU;2005
3.816.6 3.48.0 McAvoyD;2002
314 0.160.46 ShelverWL;2007
EstadosUnidos 1.3 <0.002 VanderfordSA;2006
1 na StackelbergPE;2004
na 0.072 ThomasPM;2004
na 0.010.02 BoydGH;2003
Mxico 0.662.04 na GibsonR;2007
0.373.24 0.030.74 LeeHB;2003
0.871.83 na LeeHB;2005
Canad
na nd BoydGH;2003
na 0.063 HuaW;2005
Japn 0.30.8 0.1 NakadaN;2006
China 0.0220.213 na WuJL;2007
Australia na 0.0230.434 YingGG;2007
nd:pordebajodeloslmitesdedeteccin
na:noanalizado
a
http://www.mst.dk/udgiv/Publications/2003/8779729843/HTML/kap04_eng.htm

Salvoalgunaexcepcin,elnivelmediodetriclosnenelaguaresidualsintratamientoesdel
ordende2ng/mL,mientrasqueenelaguaresidualtratada,losnivelessoninferioresa0.1ng/mL.
En general, el porcentaje de eliminacin del triclosn por parte de las estaciones depuradoras de
aguaresidualoscilaentreun40yun100%.Todoellodependerdeltipodetratamientoquereciba
elaguaresidual,siendoelmsefectivoeltratamientoconlodosactivos[HeidlerJ;2007][Thompson
A;2005].
LosnivelesdeTCSpresentesenotrasmatricesacuosasseresumenacontinuacin,tablaI.3.
13
Introduccin
TablasI.3.Nivelesdetriclosnenotrasmuestrasdeagua.
Concentracin
Tipodemuestra Localizacin Referencia
(ng/mL)
0.032 Noruega BonesJ;2006
Aguadegrifo <0.734 LoraineGA;2007
EstadosUnidos
<0.001 VanderfordSA;2006
Aguagrifo(previo
1.43 EstadosUnidos LoraineGA;2006
tratamiento)
Aguaspluviales 0.00160.029 EstadosUnidos BoydGH;2004
Aguamanantial 0.0010.0012 Mxico GibsonR;2007
nd Espaa(ACorua) QuintanaJB;2007
nd QuintanaJB;2004
Alemania
0.0030.010 BesterK;2005
0.0030.014 LindstromA;2002
Suiza
0.0810.130 BarberLB;2006
0.14 Dinamarca ErikssonE;2003
0.087 Noruega BonesJ;2006
Ro nd BoydGH;2003
00.14 KolpinDW;2004
EstadosUnidos
0.0090.035 ZhangS;2007
0.010.12 CooganMA;2007
0.0040.008 Canad HuaW;2005
0.0260.038 WuJL;2007
China
0.0351.023 PengX;2008
<0.075 Australia YingGG;2007
0.02 Suiza SingerH;2002
Lago <0.010 EstadosUnidos VanderfordSA;2006
nd Canad BoydGH;2003
nd Noruega WeigelS;2004
Mar 0.0160.099 China WuJL;2007
0.0550.134 Japn NishiI;2008
Aunque los valores de triclosn encontrados en aguas de ro y lago son inferiores a los
presentes en las aguas residuales, debido a su alta lipofilia, este compuesto es susceptible de
14
bioacumularse en animales y plantas presentes en ecosistemas que sufren continuasdescargas de

aguaresidual.Dentrodelosorganismosvivos,sehaestudiadolapresenciadeltriclosnenpecesde
ro.AlaeeyValters[AlaeeM;2003][ValtersK;2005]cuantificaronnivelesdetriclosnenplasmadel
orden de 0.6110.4 ng/g, mientras que AdolfssonErici [AdolfssonErici M; 2002] y Houtman
[Houtman CJ; 2004] analizaron bilis de pescado para determinar las concentraciones de triclosn
presentesenesteorganismo.Losvalorescuantificadososcilaronentre10710ng/g(referidoapeso
total) y 1480 g/mL (referido a bilis), respectivamente. En algas, las concentraciones fluctuaron
entre10y146ng/g[CooganMA;2007].
Ladistribucindeltriclosntambinhasidoestudiadaenmatricesslidas,principalmente
enlodosprocedentesdeestacionesdepuradorasdeaguaresidualysedimentosderosquereciben
descargasdeaguaresidualtratada.Debidoasualtocarcterlipoflico,cabeesperarquelosniveles
seanmuchomselevadosenestasmuestrasqueenaguasresidualesosuperficiales,tablaI.4.
TablaI.4.Nivelesdetriclosnencontradosenmuestrasdelodoysedimento.
Concentracin
Tipodemuestra Localizacin Referencia
(g/g)
Sedimentoro nd0.036 Espaa(ACorua) MoralesS;2005
0.13070.00027 Espaa(Almera) AgeraA;2003
0.012 Espaa(Crdoba) MoralesMuozS;2005
Sedimentomarino
0.050 EstadosUnidos BurkhardtMK;2005
0.250.45 Alemania KronimusA;2004
Sedimentolago 0.053 Suiza SingerH;2002
0.45.4 Espaa(ACorua) MoralesS;2005
137 Grecia GatidouG;2007
a
0.0286.4 Dinamarca EnvProy861;2003
Lododepuradora 1.21.3 Alemania BesterK;2003
0.6211.55 Canad ChuS;2007
0.0916.79 Australia YingGG;2007
7.514.7 EstadosUnidos McAvoyD;2002
Suelo 0.00060.009 EstadosUnidos XuJ;2008
ahttp://www.mst.dk/udgiv/Publications/2003/8779729843/HTML/kap04_eng.htm
Talcomosemuestraenlatablaanterior,losnivelesdetriclosnenloslodosdedepuradora
son hasta 1000 veces superiores a los detectados en las aguas residuales sin tratar. En ocasiones,
15
Introduccin
estos lodos son utilizados como abonos. Por ello, es necesario controlar de algn modo la
distribucindeltriclosnenestamatrizslida[HeidlerJL;2007].
Porltimo,cabedestacarestudiosenlosqueseevalulapresenciadetriclosnenleche
materna, en plasma humano y orina procedente de individuos que usaban productos de cuidado
personalquecontienenensuformulacinestebactericida.Losnivelesdetectadosenlechematerna
estuvieron comprendidos entre 0.022 y 9 ng/g [Allmyr M; 2006 A y B][AdolfssonErici M;
2002][DayanAD;2007].Enplasma,losnivelesoscilaronentre0.4y38ng/g[AllmyrM;2006B]yen
orinafuerondelordende127ng/mL[YeX;2005].

Losposiblesproductosdetransformacindeltriclosntambinhansidoanalizadosenlas
matrices anteriormente indicadas. Quiz el ms importante de todos ellos, y directamente
relacionadoconl,eselmetiltriclosn,generadoprincipalmenteenlasplantasdepuradorascomo
producto de biometilacin. En los lodos, sus concentraciones estn comprendidas entre 0.050.45
g/g[McAvoyD;2002],mientrasqueeninfluentesyefluenteslosvaloresoscilanentre0.0010.04y
0.0020.011ng/mL[Irgasan;1998].Sonlasmatricesbiolgicasaquellasenlasquesehaanalizado
exhaustivamente la presencia del metiltriclosn, principalmente en peces de ro. Balmer y
colaboradores cuantificaron niveles de metiltriclosn del orden de 1300 ng/g, referido a tejido
graso,entruchasprocedentesdeunlagosuecoendondelosnivelesdemetiltriclosnenaguaeran
de 0.021.2 ng/L [Balmer ME; 2004]. Niveles similares de metiltriclosn fueron encontrados uno y
dosaosdespusdelprimermuestreoenesemismolago(nd233ng/gy1302100ng/genlpidos,
respectivamente) [Valters K; 2005][Buser HR; 2006]. En el plasma de pescado los niveles de
metiltriclosncuantificadosson1000vecesinferioresalosencontradosengrasadebidoalaelevada
lipofilidaddeestecompuesto(logKow5.1)[AlaeeM;2003].

Los clorofenoles relacionados con el triclosn: el 2,4diclorofenol, 2,3,4triclorofenol
[Onodera S; 1998] y el 2,4,6triclorofenol [Canosa P; 2005 A y B][Rule KL; 2005] tambin fueron
cuantificadosenalgunosestudios.Parael2,4diclorofenol,sehandetectadoconcentracionesenel
influente de una depuradora del orden de 0.030.20 ng/mL, mientras que para el efluente
correspondiente, los niveles oscilaron entre 0.01 y 0.21 ng/mL, con lo que se concluy que
prcticamente no hay eliminacin de este compuesto [Lee HB; 2003]. Para el caso de los dos
triclorofenoles supuestamente relacionados, es el 2,4,6triclorofenol el que presenta mayores
niveles de concentracin en el influente (0.020.1 ng/mL) frente al 2,3,4triclorofenol [Eriksson E;
2003]. Concentraciones similares de 2,4,6triclorofenol fueron detectadas por Quintana y
colaboradores[QuintanaJB;2007]enaguaresidualnotratada.
16
Los clorofenoles relacionados con el triclosn no slo fueron analizados en muestras de

aguaresidual,sinoquetambinfuerondetectadosenorina.ElgrupodeYe[YeX;2005]encontr
2,4diclorofenoly2,4,6triclorofenolanivelesde1.9y0.5ng/mL,respectivamente,enestamatriz.

Otros compuestos relacionados con el triclosn son los closanos clorados. Estos son
derivadoshalogenadosdeltriclosnloscualesseformanenpresenciadecloroenelmedioacuoso.
Mc Avoy y colaboradores detectaron estos compuestos en agua residual sin tratar y agua residual
tratada a niveles inferiores a 0.6 ng/mL, mientras que en el lodo la concentracin media de estos
fenoxifenolestetraypentacloradosfuede0.42g/g[McAvoyD;2002].
Porltimo,lasdioxinasrelacionadasconeltriclosnsehandetectadoenaguasresiduales
sin tratar y tratadas a niveles de 0.028.9 ng/mL y 0.0040.4 ng/mL, respectivamente [Mezcua M;
2004].

1.5.Productosdetransformacindeltriclosn

El triclosn, como producto de cuidado personal, presenta una baja toxicidad aguda y un
porcentaje apreciable de eliminacin o degradacin medioambiental. Como resultado de procesos
naturales o industriales (por ejemplo, el tratamiento de aguas residuales) parte del triclosn sufre
procesosdemineralizacincompleta[FederleTW;2002][HeidlerJ;2007].Sinembargo,unafraccin
apreciable del mismo es introducido en el medio ambiente donde puede transformarse en otros
compuestosclorados,comoporejemplo,elmetiltriclosn,lasdioxinas,clorofenolesyotrosclosanos
clorados,loscualesposeenunaelevadatoxicidady/ounimportantecarcterbioacumulativo.
1.5.1.Closanospolicloradosyclorofenoles
En relacin a la formacin de derivados clorados del triclosn, la primera referencia

existenteseremontaa1987.Onoderaycolaboradores[OnoderaS;1987]observaronlaformacin
de 2,4diclorofenol, 2,3,4triclorofenol, 4,5dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol [tetraclosano II], 5,6
dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol [tetraclosano I] y 4,5,6tricloro2(2,4diclorofenoxi)fenol
[pentaclosano] cuando trataban agua residual conteniendo triclosn con hipoclorito sdico.
Kanetoshi y colaboradores [Kanetoshi A; 1987] tambin identificaron los tres closanos anteriores
como resultado de la inmersin de tejidos tratados con triclosn en una disolucin de hipoclorito
sdico.
Aos ms tarde, el grupo de Rule [Rule KL; 2005] estudi la cintica de reaccin del
triclosnenaguaclorada.AligualqueOnoderayKanetoshi,observaronlaaparicindelosclosanos
anteriores y el 2,4diclorofenol, aunque el triclorofenol que identificaron fue el 2,4,6triclorofenol.
17
Introduccin
Estos resultados fueron obtenidos paralelamente al trabajo llevado a cabo en esta Tesis Doctoral
[Canosa P; 2005 A]. Trabajos posteriores del grupo de Rule demostraron la evolucin de los
compuestosanterioresacloroformo[FissEM;2007].
La formacin de 2,4diclorofenol no solamente es debida a reacciones de halogenacin y
posterior ruptura del enlace ter, sino que cierto tipo de algas y bacterias, son capaces de
transformar el triclosn en 2,4diclorofenol [Orvos DR; 2000]. Adems, se forma en procesos de
cloracindefenoles,procedentesdecidoshmicosyflvicos,enaguadesinfectadaconclorolibre.
El2,4,6triclorofenolsegeneraporsucesivassustitucionesdeldiclorofenol[PatnaikP;2000].
Conrespectoalatoxicidaddeestassustancias,el2,4diclorofenolesconocidoporserun
potencial disruptor endocrino [Graovac M; 1995][Mol HGJ; 2002]. Los fenoles, y en general, los
fenoles clorados, son txicos a concentraciones de partes por billn (ng/mL). La Agencia de
ProteccinMedioambiental(EPA)recomiendaqueelaguapotablenocontengamsde0.03g/mL
de fenoles clorados para exposiciones de 1 a 10 das en el caso de un adulto sano
[http://www.atdsr.cdc.gov/e/toxfaqs/estfacts107.html]. Adems, el 2,4diclorofenol est incluido
enlalistadecandidatosdecontaminantesprioritariosdelaEPA[http://www.epa.gov/iris].
El 2,3,4triclorofenol y el 2,4,6triclorofenol son considerados predioxinas, ya que
experimentosdedescomposicintrmicasobrecenizasmuestranlaformacindedioxinasapartir
de estos compuestos [Hell K; 2000][Capdeville J; 2002]. Asimismo, el 2,4,6triclorofenol est
clasificadocomoposiblecarcinognico[http://www.epa.gov/iris][FissEM;2007],siendolosniveles
mximospermitidosde0.012g/mL.Porltimo,conrespectoalosclosanospoliclorados,Kanetoshi
evaluunadosisletalmedia,LD50,pararatonesdeentre430y710mg/kg[KanetoshiA;1992].

1.5.2.Dioxinas
Eltriclosnesconocidocomounapredioxina.Lasdioxinassonsustanciasaltamentetxicas
y consideradas por la EPA como contaminantes prioritarios, de modo que sus niveles en el medio
ambienteestnestrictamentecontrolados.Laformacindedioxinasapartirdeltriclosn,sepuede
producirmediantedosvas:
Vafotoqumica.Laformacindedioxinasrelacionadasconeltriclosn,principalmentela2,8
diclorodibenzodioxina,puedellevarseacabomediantefotlisisdirectaoindirecta.
Fotlisis directa. La formacin de dioxinas mediante fotlisis directa es ms rpida a pH

superior al pKa del triclosn [SnchezPrado L; 2006 A]. El grupo de Arnold [Arnold WA; 2003]
estudilafotodegradacindelTCSadistintospHsylongitudesdeonda.Lalongituddeondamxima
de absorcin en el espectro del triclosn corresponde a 279 nm, mientras que para la especie
desprotonada es de 292 nm, coincidiendo en la zona del ultravioleta cercano. De este modo,
18
evaluaronlavidamediadeltriclosnenaguaenfuncindelapocadelao(cantidaddeluz)ydela
formaqumicaexistente,tablaI.5.
TablaI.5.Tiempodevidamediadeltriclosnenfuncindelaformaexistenteydelapocadelao.
Tiempodevidamedia Formaprotonada Formadesprotonada

Verano 2.55horas 6.15minutos
Invierno 5.5das 5.35horas
Tambin es importante la presencia de materia orgnica disuelta en el medio acuoso, ya

queelrendimientodelareaccindisminuyeenun20%,debidoalaadsorcindeltriclosnsobrela
superficiedelaspartculasensuspensin[TixierC;2002].
Fotlisis indirecta. La formacin de dioxinas tambin est descrita mediante la fotlisis

indirecta, debido a la reaccin del triclosn con los radicales hidroxilo o con el oxgeno singlete
generadosporlaaccindelaradiacinsolar.Tixierycolaboradores[TixierC;2002]estudiaroneste
fenmeno y concluyeron que era muy favorable, debido a las altas constantes de velocidad de
reaccinyalaconcentracinrelativamenteelevadaderadicalesenagua.

Mezcua [Mezcua M; 2004] y Ferrer [Ferrer I; 2004] estudiaron detalladamente los

productos que se generan en la fotlisis del triclosn. Mezcua y colaboradores observaron la
formacin, como producto mayoritario, de la 2,7/2,8dibenzodicloropdioxina y evaluaron su
presenciaenaguasresiduales.Concluyeronquelaconcentracinmximadedioxinasealcanzabaa
los1000minutosdeexposicinsolar.Ferrerycolaboradoresinvestigaronlapresenciadeproductos
intermedios generados en la degradacin fotoqumica del triclosn, utilizando como tcnica de
deteccinlacromatografadelquidosacopladaaunespectrmetrodemasasdetiempodevuelo.
Estos productos intermedios presentaron prdidas de cloro, ruptura del enlace ter formando un
monoclorodihidroxilado,ysustitucindeuntomodecloroporungrupohidroxilo.
Lavelocidaddelareaccindefotodegradacindependedesistaseproduceenaguadulce
o en agua salada. Aranami y colaboradores [Aranami K; 2007] observaron que el tiempo de vida
mediadeltriclosnenaguadulceesde4das,frentealos8dasparaelaguasalada.
Combustin de lodos conteniendo triclosn. El hecho de que se formen dioxinas mediante la

combustindelodosesdegranrelevancia,yaqueseconocequeun1520%deltriclosneliminado
en las plantas de tratamiento de agua residual, se adhiere a los lodos. En algunas estaciones
depuradoras,estoslodossoneliminadosmedianteincineracin.
19
Introduccin
Kanetoshi y colaboradores [Kanetoshi A; 1987] estudiaron la pirolizacin del triclosn y

closanos clorados relacionados. Observaron la formacin de diversas dioxinas tricloradas,
tetracloradas,pentacloradaseinclusohexacloradas.Enlasiguientetabla,semuestraelporcentaje
dedioxinageneradarespectoalacantidadtotaldeclosanos,tablaI.6.
TablaI.6.Porcentajededioxinasformadoapartirdelacombustindelodosconteniendotriclosny
closanosrelacionados.
%Dioxinaformadaenlacombustindeloslodos
DiCDD TriCDD TetraCDD PentaCDD HexaCDD
TCS 42
TetraI 44 25 1
TetraII 22 46
Penta 16
1.5.3.Metiltriclosn
El triclosn puede ser biotransformado por diversos organismos en su anisol, el

metiltriclosn. Este compuesto es mucho ms estable frente a la degradacin fotoqumica,
bioacumulndoseenlostejidos(principalmenteenloslipdicos)deaquellosseresvivosexpuestosa
descargascontinuasdeaguasconteniendotriclosn.Porlotanto,puedeserconsideradocomoun
marcador de los niveles de triclosn en aquellos medios que sufrendescargas de aguas residuales
[Balmer ME; 2004][Lindstrom A; 2002]. Adems, los niveles de metiltriclosn detectados son
superioresenlosefluentesdelasplantasdepuradorasfrentealosinfluentes,loqueindicaquese
generaprincipalmenteenlasdepuradorasdeaguaresidual[CooganMA;2007].
20
Parabenes
II.PARABENES
2.1.Definicin,estructuraypropiedadesdelosparabenes
Los parabenes son esteres del cido 4hidroxibenzoico ampliamente utilizados como
estabilizantes y preservativos en cosmticos, jabones, alimentos, etc. Los ms empleados son el
metilparabenoparahidroxibenzoatodemetilo(E218),eletilparabenoparahidroxibenzoatodeetilo
(E214), el propilparaben o parahidroxibenzoato de propilo (E216), butilparaben o
parahidroxibenzoato de butilo y el bencilparaben o parahidroxibenzoato de bencilo en niveles
inferiores al 0.8 % (p/p), expresados como cido parahidroxibenzoico. Las estructuras de los
parabenesjuntoconladelcidodelqueprocedensemuestranenlafiguraII.1.
Figura II.1. Estructura del metilparaben (MeP), etilparaben (EtP), propilparaben (PrP), butilparaben
(BuP),bencilparaben(BzP)ydelcidophidroxibenzoico(ApOH).
O O O
C OCH3 C OC2H5 C OC3H7
HO HO HO
MeP EtP PrP
O O O
C OC4H9 C OCH2Ph C OH
HO HO HO
BuP BzP ApOH

Losparabenessonslidosrelativamentesolublesenaguaehidrolticamenteestablesque
presentan mayor carcter hidrofbico al aumentar el tamao de su cadena hidrocarbonada. En la
tablaII.1,semuestranlaspropiedadesfsicoqumicasmsrelevantesdelosmismos.
21
Introduccin
TablaII.1.Propiedadesfsicoqumicasdelosparabenesyelcidophidroxibenzoico.
Propiedades MeP EtP PrP BuP BzP ApOH
Pm(g/mol) 152.15 166.17 180.20 194.23 228.24 138.12
pKa 8.30 8.30 8.20 8.22 8.20 4.57
LogKow 1.86 2.40 2.90 3.46 3.60 1.40
Puntoebullicin(C) 265 297 294 309 390 336
Puntofusin(C) 116 120 125 129 168 171
Pvapor(Torr) 5.55103 7.59104 9.30104 3.56104 1.24106 4.48105
Solubilidad,pH3(g/L) 64 25 12 5 1.2 8.3
Solubilidad,pH7(g/L) 67 25 12 5 1.2 1000
Solubilidad,pH9(g/L) 377 140 81 35 8.9 1000
2.2.Aplicaciones
Los steres del cido phidroxibenzoico (parabenes) son ampliamente utilizados como
preservativos en productos de cuidado personal y en alimentos. Son activos frente hongos y
levaduras y contra algunos microorganismos Gram + y Gram , provocando disrupcin en los
procesosdetransportedemembrana,inhibicindelasntesisdeADNyARNounindoseaenzimas
(ATPasasyfosfotransferasas)claveparaeldesarrollodelasbacterias[ValkovaN;2001].
Los parabenes no estn incluidos en el Anexo I de la lista de sustancias peligrosas de la
Directiva67/548/CE;sinembargo,ladirectiva76/768/CEdelaUninEuropearestringesusniveles
encosmticosaunaconcentracinmximade0.4%paracadauno,0.8%(expresadocomocido)
para mezclas de los mismos [Borremans M; 2004]. Debido a su sinergia de actuacin y a que su
toxicidadrelativaaumentaconeltamaodelacadena,esimportantetenerlosencuentaalahora
de preparar mezclas de los mismos para minimizar los riesgos al consumidor [Charnock C;
2007][DoronS;2001].
Comoaditivosencosmticos,elmetilparabenyelpropilparabensonlosmsutilizadosen
unrangodeconcentracionesnormalmenteinferiora0.3%y0.1%respectivamente,aunquepueden
llegaraencontrarsenivelesprximosal1%.DebidoasugranestabilidadtrmicaadiferentespHs,y
asuescasaadsorcinsobrelasuperficiedelosenvoltorios,sonampliamenteutilizadosencosmtica
e incluso son usados como antimicrobianos en alimentos. De hecho, se aaden en bebidas
alcohlicas, productos congelados, gelatinas, pulpa de tomate, zumo de frutas, siropes, etc, en
dondesusnivelesoscilanentre4502000g/g,loquesuponeunaingestade46mg/Kg/daparaun
adulto [Darbre PD; 2004]. Tambin se incorporan en frmacos, supositorios, anestsicos, colirios,
22
Parabenes
pldoras, jarabes e inyectables en concentraciones inferiores al 1 % [Soni MG; 2002][Peck AM;

2006].
Enlanaturalezatambinpuedenencontrarseenalgunasfrutas,vinoblanco,einclusoseha
descubiertoqueelmetilparabenactacomounaferomonaenlosperros[SoniMG;2002].
2.3.Toxicidad
El comit cientfico de alimentacin de la Unin Europea estableci una ingesta diaria

aceptable (Aceptable Daily Intake) para los parabenes del orden de 10 mg/kg, expresado como la
sumadeMeP,EtPyPrPydesussalessdicas[HarveyPW;2004AyB].
No existe una legislacin respecto a las dosis considerada como txica, pero la Directiva
EuropeadeCosmticos76/768/CEE,ensuAnexoVI,indicaquelosnivelesmximosencosmticos
no deben superar el 0.4 % como compuestos individuales y el 0.8 % para mezclas de los mismos.
Muchos estudios indican que no son mutagnicos, pero que pueden causar aberraciones
cromosmicas, particularmente en presencia de bifenilos policlorados. A nivel celular pueden
provocardisrupcindelafuncincelularatravsdelainhibicindeloslisosomas[DarbrePD;2004].
Losparabenesseencuentranenunagranvariedaddeproductosenbajasconcentraciones.
Suimportanciavienedadaporlaexposicincontinuaalaqueestsometidalapoblacin[ByfordJR;
2002].Sonadsorbidosinmediatamenteporeltractogastrointestinalyporlasangre,hidrolizadosal
cido phidroxibenzoico o su conjugado, y excretados por la orina. Tambin son adsorbidos por la
piel y gracias a las carboxilesterasas, se convierten en el cido phidroxibenzoico [Pugazhendhi D;
2005].
Encontactoconlapiel,sonacumuladosenloscomponentesgrasosdelostejidoshumanos
debidoasusmoderadoscoeficientesdeparticinoctanol/agua(logKow1.8a3.6).Adems,algunos
estudiosrecientesmostraronlapresenciadeparabenesenloscnceresdemama(nivelesinferiores
de20ng/g),demodoqueseespeculaconquepuedaninfluirenelcrecimientoydesarrollodelos
tumores [Darbre PD; 2004 y 2006][Harvey PW; 2004 A y B][Zhang Q; 2005]. Estudios in vitro,
utilizando las clulas cancerosas MCF7, muestran que tienen la capacidad de desplazar al 17
estradiol del receptor estrognico citoslico, responsable de la proliferacin y crecimiento de
tumoresmamarios[GoldenR;2005].Enestudiosinvivoconroedores,seobservunincrementoen
la pared vaginal y en el peso del tero en hembras, y disminucin de la calidad del esperma en
machos, cuando se les aplic tpicamente un preparado conteniendo en su formulacin los
parabenes. Su subproducto ms importante, el cido phidroxibenzoico, aplicado tpicamente
provocestosefectosanivelesde5g/g,500vecessuperioraladosisde17estradiolnecesaria
paraprovocarlamismarespuesta[GoldenR;2005].
23
Introduccin
Dentrodelosparabenes,elmspotentecomodisruptorendocrinoeselbutilparaben,an
as,sucarcterestrognicoes10000vecesinferiorqueel17estradiol,porloquelosnivelesalos
que estamos expuestos no deberan afectar al ser humano [Byford JR; 2002][Harvey PW; 2004 y
2006].
Losefectosdelbutilparabensobrehormonastiroideasyreproductorasenelhombrefueron
estudiados por Janjua y colaboradores [Janjua NRQ; 2007]. La administracin cutnea del
butilparaben, en preparados conteniendo un 2 % de este compuesto, durante dos semanas
consecutivas a niveles de 23 mg/cm2, di lugar a una concentracin de 135 ng/mL en suero. La
cantidadencontradaparecenomodificarlosnivelesdehormonastiroideasysexuales.
El mayor problema que pueden desencadenar estos compuestos son los productos de
reaccin que se puedan generar en los distintos medios. As, en aguas potables, en presencia de
cloro a niveles bajos (g/mL), los parabenes son susceptibles de transformarse en compuestos
monoydihalogenados,cuyasposiblesrepercusionesenelmedioambienteyenelserhumanoson
desconocidas[AlumA;2004][CanosaP;2006A].
2.4.Distribucinenelmedioambiente
Los parabenes, al igual que el triclosn, son introducidos en el medio acutico por la
continuadescargadeaguaresidual,ascomoelvertidodirectodedetergentes,jabonesoproductos
quepuedancontenerensuformulacinestoscompuestos.
Los parabenes, en general, son estables en medio acuoso a diferentes pHs y a elevadas
temperaturas. Por otra parte, su moderado coeficiente de particin octanolagua indica la
posibilidad de ser adsorbidos en matrices slidas, principalmente en medios cidos, ya que a pH
bsicosusolubilidadseveincrementadaunas50veces.
Son fotoqumicamente estables, de modo que en presencia de luz no se descomponen,
pero, en cambio, son biodegradables por organismos dando lugar al cido parahidroxibenzoico,
considerado un potencial disruptor endocrino. Estudios de cloracin en agua realizadas en la
presente Tesis Doctoral, mostraron la posibilidad de transformarse en compuestos clorados en
tiemposrelativamentecortosaligualqueeltriclosn[CanosaP;2006A].
Algunostrabajoshanevaluadosupresenciaenelmedioacutico.Enaguasdero,sehan
detectadonivelesinferioresalos80ng/Lparaelpropil,etilymetilparaben[BenijtsT;2004][Canosa
P; 2006 B]. En aguas residuales, tambin se ha analizado la presencia de los parabenes, siendo el
propilparabenlaespeciemayoritaria[LeeHB;2005].Engeneral,lasconcentracionesdetectadasde
estoscompuestossoninferioresa2.5ng/mLparaaguaresidualsintratar,mientrasqueelefluente
delaplantadepuradorapresentanivelesinferioresa100ng/L.EnlatablaII.2seresumenlosniveles
descritosenlabibliografaenmatricesacuosas.
24
Parabenes
TablaII.2.Concentracindeparabenesenaguasresidualesysuperficiales.
Tipode MeP EtP PrP BuP BzP
muestra (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL)
Influente 0.101.47 0.020.27 0.202.43 0.020.26 nd Canad BenijtsT;2004
Influente 2.6 0.6 na na na Dinamarca ErikssonE;2003
Efluente 0.020.03 <0.01 <0.010.04 <0.01 nd Canad BenijtsT;2004
Efluente nd0.30 <0.10.2 <0.10.3 na nd Suecia PaxusN;1996
Efluente 0.002 nd 0.003 na na Blgica BenijtsT;2004
Efl.industrial 0.004 nd 0.006 na na Blgica BenijtsT;2004
Ro 0.025 nd 0.078 na na Blgica BenijtsT;2004
na:noanalizado
Supresenciaenlodos,procedentesdelasplantasdepuradorasdeaguaresidualtodavano
ha sido estudiada, en cambio, su distribucin en atmsferas interiores fue evaluada por Rudel y
colaboradores[RudelRA;2003].EstosautoresinvestigaronlosnivelesdeMeP,EtPyBuPenairey
polvode120hogaresestadounidenses,encontrandolosnivelesdeconcentracinquesemuestran
enlatablaII.3.
TablaII.3.Distribucindeparabenesenatmsferasinteriores[RudelRA;2003].
MeP EtP BuP
Aire(ng/m3) nd21 nd4 3.2
Polvo(g/g) nd8.24 nd2.18 nd0.223
En relacin a las matrices biolgicas, la deteccin de parabenes en tumores mamarios ha

destapado la alarma sobre la posible relacin existente entre el uso de cosmticos conteniendo
parabenes en su formulacin y el posible desarrollo de cncer de mama. El grupo de Darbre,
dedicadoalestudiotoxicolgicodelosparabenes,analiztumoresde20individuosconcncerde
mama. Todas las muestras fueron positivas, siendo los niveles mximos detectados de 12.8 ng/g
paraMeP,2ng/gparaEtP,2.6ng/gparaPrPy2.3ng/gparaBuP[DarbrePD;2004].Losparabenes
tambin han sido detectados en fluidos biolgicos como leche materna [Ye X; 2008A] y en suero
humano[YeX;2008B]anivelesdelordendelosbajosng/mL.
25
Introduccin
2.5.Productosdetransformacindelosparabenes
2.5.1.cidophidroxibenzoico
El cido phidroxibenzoico es un producto de degradacin de los parabenes. Estudios con

animalesmuestranquelosparabenessonadsorbidosinmediatamenteporeltractointestinalypor
lasangre,hidrolizadosalcidocorrespondientedandolugarasuconjugadoglucurnido,siendoste
excretado por la orina. Los parabenes tambin pueden ser adsorbidos rpidamente por la piel en
dondelascarboxilesterasassoncapacesdehidrolizarlosalcido,quepenetrarporvadrmicaen
elorganismo.Elcidophidroxibenzoicosecaracterizaportenerpropiedadesestrognicassimilares
alestradiol,tantoenensayosinvivocomoinvitro[PugazhendhiD;2005][DarbrePD;2006][Golden
R;2005].
2.5.2.Productosdehalogenacin
Cuandolosproductosdecuidadopersonalentranencontactoconaguadegrifoclorada,el
cloropresenteenelaguapuedereaccionarconlosparabenespresentesensuformulacin.
Ensuestructura,losparabenespresentanunsteryenposicinparaalmismo,ungrupo
hidroxilo.Elgrupohidroxiloesungrupodador,demodoquelospareselectrnicosnocompartidos
sedeslocalizanenelanilloaumentandosudensidadelectrnica,sobretodoenlasposicionesortoy
paraalmismo.Porotraparte,elgruposteresloquesedenominaungrupodesactivanteenortoy
para,dirigiendolasustitucinelectrfilaaromticahacialaposicinmeta.Estasdoscontribuciones
favorecen la introduccin de electrfilos en las dos posiciones en orto al grupo hidroxilo. Los
productosderivadosdeestareaccinenaguascloradassonel3cloro4hidroxibenzoatodealquiloy
3,5dicloro4hidroxibenzoato de alquilo. Del mismo modo, la presencia de bromuro en las aguas
naturales,principalmentedeciudadescosteras,ennivelesdelordende2660ng/mL,haceposible
que reaccione con el anillo aromtico mediante una sustitucin electrfila aromtica cuando es
oxidadoabromoenpresenciadecloro[RicharsonSD;2003][vonGuntenU;2003].Porlotanto,es
posible tambin la formacin de hidroxibenzoatos de alquilo bromados. En general, estos
compuestossonmslipoflicosquelosparabenes(logKow2.486.78),demodoquetendranmayor
tendencia a bioacumularse en los tejidos, y por lo tanto a ser potencialmente ms txicos,
principalmente los bromados [Hansch C; 1972], aunque, a da de hoy, no hay ningn estudio que
demuestreestosdatos.Porotraparte,susolubilidadesmayorapHsentornoa7,debidoaquesus
pKas oscilan entre 3.1 y 6.78, con lo que cabe esperar que se encuentren mayoritariamente en
disolucinacuosa.
26
Metodologaanaltica
III.METODOLOGAANALTICA
El fin de cualquier metodologa de preparacin de muestra es disponer del analito en el

estadomspuroposibleyenundisolventecompatibleconlatcnicadedeterminacinutilizada.
Paraello,enlamayoradelosproblemasanalticosesnecesariorealizarunaprimeraetapaenlacual
aislaremoslosanalitosdelamatrizqueloscontieneconsiguiendosupurificacinyconcentracin.En
muchos casos, es inevitable una etapa de transformacin de los analitos, variando una serie de
propiedadesdelosmismosparafacilitarsudeterminacin.
Enestetrabajosehanconsideradodistintostiposdemuestras,slidasylquidas,utilizando
diversastcnicasdepreparacindemuestraquedescribiremosacontinuacinenfuncindeltipo
dematrizalacualseaplican.
3.1.Preparacindemuestraparamatricesacuosas
Las matrices acuosas suelen contener los compuestos a concentraciones muy inferiores a
los lmites de deteccin de los equipos utilizados en la etapa de determinacin. Adems, es muy
probablequelamatriznoseacompatibleconlatcnicademedida,porlocualsuelesernecesaria
unaetapadepreparacindemuestraque,sobretodoenmatricesmedioambientales,nospermita
concentrar los analitos y a su vez separarlos de otros compuestos que puedan interferir en su
determinacin.
Entre los mtodos preparacin de muestra empleados en esta Tesis Doctoral figuran la
extraccinlquidolquido(LLE),laextraccinenfaseslida(SPE)ylamicroextraccinenfaseslida
(SPME).
3.1.1.Extraccinlquidolquido(LLE)
Laextraccinlquidolquidoesunatcnicadepreparacindemuestraenlacualseproduce
una transferencia de los analitos desde una fase, generalmente acuosa, a otra orgnica,
transferenciaregidaporunaconstantedereparto.Elmayorproblemaderivadodeestatcnicaesel
granconsumodedisolventes,conelcorrespondientegastoyproblemamedioambiental.
La LLE ha sido utilizada para extraer triclosn [Graovac M; 1995][Bester K; 2003 y 2005]
[Sabaliunas D; 2003], metiltriclosn [Shelver WL; 2007], clorofenoles [Hanada Y; 2002][Mol HGJ;
2002]einclusoloscompuestospolicloradosprocedentesdelahalogenacindeltriclosn[Okumura
T;1996]enmuestrasdeaguaresidualyaguasuperficial.Enestostrabajos,elpHdelamuestraseha
ajustadoa2,ylaextraccinhasidollevadaacaboconhexano,toluenoodiclorometano.Elextracto
obtenidoesconcentradoaunvolumenconocidoyderivatizadocondiazometano[KandaR;2003],
27
Introduccin
anhdrido actico [AdolfssonErici M; 2002], o agentes sililantes [Sabaliunas D; 2003][Shelver WL;

2007]parasuposterioranlisisporcromatografadegases.Ademsdeparamatricesacuosas,laLLE
sehautilizadocomotcnicadeextraccindeltriclosndealimentos,potencialmentecontaminados
porunaposiblemigracindelbactericidadesdeelfilmprotector,enzumos,fiambres,etc[Sanches
Silva A; 2005], y para determinar la cantidad de triclosn en los plsticos que lo contienen como
aditivo[JunkerLM;2004].
La extraccin con disolventes orgnicos tambin se ha empleado en la determinacin de
triclosnymetiltriclosnenmatricesbiolgicas,talescomoorina[SioufiA;1997],plasmahumano
[Birkel M; 1993][Sioufi A; 1997] y de pescado [Allmyr M; 2006 A y B][Alaee M; 2003], bilis
[HoutmanCJ;2004],lechematerna[AdolfssonEriciM;2002][AllmyrM;2006AyB]yplacadental
[RasmussenHI;1996].Tambinseutilizparaextraerlosparabenesentejidotumoraldepacientes
con cncer de mama [Darbre PD; 2004]. En todas las aplicaciones descritas es necesaria una
purificacinposteriordelextractodebidoalagrancomplejidaddelmismo.

3.1.2.Extraccinenfaseslida(SPE)
LaSPEsedesarrollamediadosdelosaos70comoalternativaalaLLE.Hoyendaesuna
de las tcnicas de preparacin de muestra ms ampliamente utilizadas en el caso de matrices
lquidas o incluso gaseosas. Mediante la SPE, conseguimos concentrar y/o purificar los analitos
mediantesuretencinenunafaseslida,ounafaselquidainmovilizadasobreunsoporteslido,
para a continuacin proceder a su elucin con un disolvente adecuado [Rodrguez I;
2000][ThurmannEM;1998].Entrelasmltiplesventajasquepresentadestacanlassiguientes:

bajamanipulacindelamuestra
altopoderdeconcentracin
obtencindeextractospurificadosconaltasrecuperaciones
menorconsumodedisolventesencomparacinconLLE
ausenciadeemulsiones
posibilidaddeautomatizacin
versatilidadeneltipodeadsorbentesutilizados[CmaraC;2002][CelaR;2002].
El adsorbente de extraccin en SPE est contenido en tres posibles formatos: discos,

cartuchos y jeringas. El primero se utiliza principalmente para concentrar grandes volmenes de
muestra,entre2y4L[LoraineGA;2006][BoydGH;2003y2004],permitiendoflujosdepasode

28
Metodologaanaltica

lquido muy elevados debido a la escasa Figura III.1. Distintos formatos de SPE: Jeringa,
resistencia al paso de muestra que poseen, CartuchoyDiscos.
mientras que los cartuchos y jeringas pueden
ser fcilmente integrados en sistemas online
con el equipo de medida, generalmente un
cromatgrafo de lquidos. De este modo, la
manipulacindelamuestraesmnima,aunque
losvolmenesconcentradossoninferioresalos

empleados en las aplicaciones offline [Bones J;
2006][YeX;2005y2006].

ElprocesodeconcentracindelamuestraenSPEconstadelassiguientesetapasbsicas,
descritasenlafiguraIII.2.

FiguraIII.2.EsquemadepreparacindemuestramedianteSPE.
1. Acondicionamiento de la fase
Pasodela Limpiezade Elucindelos
Acondicionamiento muestra columna compuestos estacionaria. Se hace pasar a travs del
cartucho un disolvente o mezcla de
disolventesadecuados,eliminandoaslas
impurezas, hidratando la fase
estacionariayfacilitandolatransferencia
demateriaconlamuestra.
2. Paso de la muestra a travs del
material adsorbente. El objetivo de esta
etapa es retener cuantitativamente el
Elucinde analito, consiguiendo adems un cierto
interferencias Analitos
gradodeselectividad.
3.Lavado.Seutilizandisolventescongranafinidadporlasinterferencias.
4.Elucin.Conundisolventeapropiadoserecuperaelanalitodelafaseadsorbente.Porlogeneral
se utiliza un pequeo volumen de disolvente orgnico, aunque tambin se puede realizar una
desorcintrmica[CelaR;2002].
Las fases adsorbentes en SPE son similares a las empleadas en cromatografa de lquidos.
Las ms comunes son las de slices enlazadas, polmeros de tipo estirenodivinilbenceno, carbn
grafitizado,silicatodemagnesio,slicagelyxidosdealuminio(tablaIII.1).
29
Introduccin
TablaIII.1.AdsorbentesmscomunesenSPE.
Adsorbente Tipodefase Estructura
Octadecilsilano(C18) Invertida Si(CH2)17CH3
Octilsilano(C8) Invertida Si(CH2)7CH3
Fenilsilano Invertida SiPh
Slice Normal SiOH
Cianopropil Normal Si(CH2)3CN
Diolsilano Normal Si(CH2)4CHOHCH2OH
SCX Cambiadorinico Si(CH2)3SO3
SAX Cambiadorinico Si(CH2)3N+(CH3)3
CBA Cambiadorinico Si(CH2)3COO
AmberlitaXAD2 Polimrica Poliestirenodivinilbenceno
BondElutENV Polimrica Poliestirenodivinilbenceno
IsoluteENV+ Polimrica Poliestirenodivinilbenceno
LiChrolutEN Polimrica Poliestirenodivinilbenceno
OasisHLB Polimrica Divinilbencenovinilpirrolidona
Dentro de las aplicaciones encontradas para los analitos estudiados, la SPE es una de las
tcnicasdeconcentracindemuestrasacuosasmsutilizada.Paraaguasresidualesysuperficiales,
los polmeros ms empleados son slices funcionalizadas y materiales polimricos de fase reversa
como el C18 [Agera A; 2003][Mc Avoy D; 2002][Benijts T; 2003] y el Oasis HLB [Singer H;
2002][HaldenRU;2005][HuaW;2005][BenijtsT;2004].Ademshayalgunaaplicacinenlaquese
ha empleado adsorbentes mixtos conteniendo grupos funcionales apolares e intercambiadores
aninicos (por ejemplo, Oasis MAX), para la extraccin conjunta de cidos orgnicos, fenoles,
triclosnyparabenes[LeeHB;2005].Loseluyentescomnmenteusadossonacetatodeetilo[WuJL;
2007][Gmez MJ; 2007][Thomas PM; 2004], acetona [Gibson R; 2007][Paxus N; 2004], metanol
[Lee HB; 2003][Quintana JB; 2004][Nakada N; 2006][Vanderford BJ; 2006][Bendz D; 2005] y
acetonitrilo[HebererT;1997].

Tambin se ha seleccionado la SPE, combinada online, con cromatografa de lquidos (LC)
paraextraereltriclosnydiversosclorofenolesenmuestrasdeorina[YeX;2005]ylechematerna
[Ye X; 2006]. En el caso de los parabenes, existen mltiples estudios en donde la SPE ha sido
seleccionada para la extraccin de estos aditivos en suspensiones de medicamentos [Rebbeck C;
2006],cosmticos[ShenHY;2007],colutorios[KokoletsiMX;2005]einclusoaire[RudelRA;2003].
30
Metodologaanaltica
3.1.3.Microextraccinenfaseslida(SPME)
Lamicroextraccinenfaseslidaesunatcnicadepreparacindemuestradesarrolladapor
Belardi y Pawliszyn en 1989 [Cmara C; 2002][Pawliszyn J; 1997]. Se basa en la utilizacin de una
fibra de slicefundida recubierta deuna fase adsorbente de naturaleza polimrica (figura III.3). Los
analitospresentesenlamuestra,porlogeneral,noseextraencuantitativamenteenlafibra,sinoque
seestableceunequilibrioentrelasfasesexistentesenelvialenelquesellevaacaboelprocesode
extraccin[CelaR;2002].AdiferenciadelaSPE,SPMEnoprecisadedisolventesorgnicosyrequiere
unamanipulacinmnimadelamuestra.
FiguraIII.3.DispositivoparaSPME.
Cuerpodela Guadel
jeringa mbolo
Muelle
Ferrula y
septum
Cuerpo
ajustable Piezade
acerode Agujadeacero
fijacinde
lafibra
Fibrade
slicefundida
Elprocesodemicroextraccinenfaseslidasedesarrollaendosetapasbsicas:
1. Etapa de extraccin: Se expone la fibra a la muestra contenida en un vial sellado para que se
produzcalamigracindelosanalitosdesdestahastalafibraduranteuntiempodado.
2.EtapadedesorcindelafibradeSPME:Seintroducelafibraenelinyectordeunsistemaanaltico
(cromatgrafo de gases o de lquidos) donde los analitos sern desorbidos trmicamente o por
disolucinenlafasemvil[CelaR;2002].
Elmuestreopuedellevarseacabodetresmodosdiferentes,segnlascaractersticasdelos
analitosydelamuestra,esquematizadosenlafiguraIII.4:
Extraccin directa o por inmersin (A): Se introduce la fibra directamente en la muestra lquida,
producindoselamigracindirectadelosanalitosdesdelamatrizhastalafibra.Sesueleseleccionar
cuandolasmuestrassonrelativamentesencillasylosanalitospocovoltiles.
31
Introduccin
Extraccinenespaciodecabeza(HSSPME)(B):Lafibraesexpuestaalespaciodecabezaexistente
sobre la muestra, de modo que los analitos pasan de la muestra al espacio de cabeza, y de ah, al
recubrimiento polimrico. Es adecuado para compuestos voltiles en matrices que sufren
tratamientos drsticos (modificaciones de pH, digestiones cidas o bsicas, etc), siendo adems
selectivoconrespectoaaquellosanalitosdeelevadopesomolecular.
Microextraccinenfaseslidaindirectaoatravsdeunamembrana(C):Entrelafibraylamuestra,
sesitaunamembranaqueevitaeldeterioroquesepuedeproduciralanalizarmuestrascomplejas
enlamodalidaddeinmersin[PawliszynJ;1997].Sumayorlimitacinradicaenlaexistenciadeuna
barrera fsica entre la muestra y la fibra, que ralentiza enormemente la cintica del proceso de
extraccin.
FiguraIII.4.ModosdemuestreoenSPME:A)Muestreodirecto,B)MuestreoenespaciodecabezayC)
SPMEindirectaoconmembrana.
A B C

La microextraccin en fase slida es una tcnica de equilibrio en la que se produce la

distribucin del analito en las distintas fases existentes en el sistema. Los equilibrios se producen
entre el polmero que recubre la fibra y la muestra, el espacio de cabeza y la muestra, y el
recubrimientodelafibrayelespaciodecabeza.Encondicionesdeequilibrio,elbalancedemateria
anteriorseresumeenlasiguienteecuacin:
C0Vs = ChVh + CsVs + Cf Vf

donde C 0 eslaconcentracininicialdeanalitoenlamuestra, C h , C s y C f son,respectivamente,la
concentracinenelespaciodecabeza,enlamuestrayenlafibratrasalcanzarseelequilibrio.Por
otraparte,Vseselvolumendemuestra,VhyVfsonlosvolmenesdelespaciodecabezaydelafibra.
32
Metodologaanaltica
Los coeficientes de reparto entre las tres fases presentes en el vial de extraccin vienen
dadospor:

K fh = Cf Khs = Ch K fs = Cf
C h C s C s

As, la cantidad de analito en el recubrimiento de la fibra ( n = C f Vf ) se puede expresar
como:
K fhKhs Vf C o Vs
n=
K fhKhs Vf + Khs Vh + Vs

Cuandosealcanzaelequilibrio:
Kfs=KfhKhs

Ysustituyendoenlaecuacinanterior:

K fs Vf C 0 Vs
n=
K fs Vf + K hs Vh + Vs

Cuando no existe espacio de cabeza, es decir, la muestra llena por completo el vial de
extraccin,eltrminoKhsVhdesaparecedelaexpresinanterior:

K fs Vf C 0 Vs
n=
K fs Vf + Vs

Considerandoqueelvolumendelamuestraacuosa(Vs)esmuchomayorqueelvolumendel
recubrimientodelafibra(Vf),puedecumplirsequeKfsVf<<Vs,enestecaso:

n=KfsVfCo

Estoes,unavezalcanzadoelequilibrio,lacantidaddeanalitoextradoserindependiente
del volumen de muestra y directamente proporcional a su concentracin inicial en la muestra, el
volumendefasecontenidaenlafibradeSPMEylaconstantederepartoentrelafibraymuestra.
33
Introduccin
Comoseobservaenladeduccinanterior,laconstantededistribucinKfs,nosindicaquela
eficaciadelaextraccinesdependientedelpolmeroquerecubrelafibradeSPMEascomodesu
espesor,tablaIII.2.Unaelevadaafinidaddelafibraporlosanalitosesesencial,yaquelamatrizyla
fibraestncompitiendoporlasespecies[CelaR;2002].
Desdeelpuntodevistacintico,laSPMEsebasaenlasegundaleydedifusindeFick,ya
que se produce una difusin de los analitos desde el seno de la disolucin acuosa a la fase
estacionariaquerecubrelafibra[PawliszynJ;1997][LordH;2000].

Cabedestacarquelasfrmulasdesarrolladasslosonaptascuandoelpolmeroquerecubre
lafibradeSPMEesunlquido.Parapolmerosslidos,eltratamientoesanlogocuandosetrabaja
con concentraciones bajas de analito, ya que el rea superficial disponible para la adsorcin ser
proporcionalalvolumendelrecubrimiento,asumiendoquelaporosidadeshomognea.

Tabla III.2. Recubrimientos comerciales utilizados, ms habitualmente, como fases extractantes en
SPME.
Faseestacionaria Espesordefase(m) Polaridad Tmximadesorcin(C)
100 280
PDMSa 30 Apolar 280
7 340
PAa 85 Polar 320
CWDVB 65 Polar 260
PDMSDVB 65 Semipolar 270
CARPDMS 75 Semipolar 340
DVBCARPDMS 50/80 Semipolar 270
a
Fasespolimricaslquidas

EntrelosparmetrosqueafectanalaeficaciadelaSPME,losmsimportantesson:
Temperatura. Afecta a la cintica de extraccin y a la cantidad de analito sobre la fibra en el

equilibrio. Al aumentar la temperatura se acelera la transferencia de materia desde la matriz a la
fibra, haciendo que la cintica sea ms rpida, mientras que en condiciones de equilibrio, al ser la
SPMEunprocesoexotrmico,disminuyelamasadeanalitoincorporadaenlafibra.
Tiempodeextraccin.LaSPMEesunatcnicadeequilibrioentrelasfasesexistentes,peromuchas
vecesesimposibletrabajarenestascondiciones.Porello,desdeelpuntodevistaprctico,seutilizan
tiempos menores que el necesario para alcanzar el equilibrio, trabajando entonces en condiciones
cinticas.Eshabitualajustareltiempodemuestreoaladuracindelaetapaposteriordeseparacin
cromatogrfica.
34
Metodologaanaltica
Efecto salino.Laadicindesales(NaCl,KCl,etc)provocaunaumentodelafuerzainica,variando
entonceslasconstantesdedistribucindelosanalitosentrelamuestrayfibrayconello,laeficacia
del proceso extactivo [Canosa P; 2006 B]. En general, la masa de analito extrada aumenta con la
fuerza inica, aunque cuando la concentracin de sal es muy elevada puede provocar el efecto
contrarioparaciertoscompuestos[LordH;2000][CanosaP;2005B].
pHdelamuestra.Cuandotenemoscompuestoscongruposcidosobsicos,elpHafectaalgradode
disociacin de los mismos, y por lo tanto a su solubilidad. Para obtener la mxima eficacia de
extraccin,sehadetrabajaraunpHdosunidadespordebajodelpKaencasodecompuestoscidos,
ydosunidadesporencimaencasodelosbsicos.
Volumendelamuestra.Engeneral,paraespeciesnoinicas,elvolumendelamuestraesmayorque
eldelafibra,demodoquelacantidaddeespecieaextraerpuedesersimplementeproporcionalala
concentracinen la muestra, el volumen de la fibra y el coeficiente de reparto Kfs. En ocasiones la
cantidad de analito en la fibra aumenta con el volumen de muestra (Vs) hasta que se cumple que
Vs>>KfsVf. A partir de ese momento, la eficacia de extraccin no aumenta con el volumen de la
muestra, denominndose volumen infinito. En todo caso en SPME es muy poco habitual usar
volmenesdemuestraporencimade100mL.
Volumen de espacio de cabeza. Cuando se lleva a cabo el muestreo en la modalidad espacio de
cabeza, el volumen del mismo ser muy importante, ya que si es muy grande, los compuestos
voltilessediluyeneneste,disminuyendosuconcentracinenlafibra.Adems,amenortamaodel
espaciodecabeza,msrpidaeslacinticadelprocesodeextraccin.
Agitacin de la muestra. La agitacin favorece la difusin de los analitos que se encuentran en la
matriz acuosa hasta la fibra, acelerando la cintica de extraccin. La influencia de la agitacin es
especialmente significativa cuanto mayor sea el peso molecular de los compuestos y, sobre todo,
cuandoseoperaenlamodalidaddemuestreoporinmersin.
Adicindedisolvente.Laadicindedisolventesorgnicosamuestrasacuosasnormalmentereduce
lacantidaddeanalitoextrada.Sinembargo,paramuestrasslidasaumentalaeficaciadeextraccin,
yaquefavoreceladifusindelosanalitosdesdelamatrizalafibra[PawliszynJ;1997].

Dentro de las aplicaciones de la SPME a muestras acuosas, el anlisis de clorofenoles
relacionadosconeltriclosneselcampoquepresentaunmayornmerodeaplicaciones,dentrode
los analitos considerados en este estudio. Generalmente, se selecciona el muestreo en espacio de
cabeza, para lo cual es necesario incrementar previamente la volatilidad de los compuestos
derivatizndolos con anhdrido actico [Bartk P; 1997][Llompart M; 2002] o con un agente
alquilantecomoelalquilcloroformiato,compatiblesconlasmuestrasacuosas [HenricksenT;2001].
LasfibrasqueproporcionanmayorrespuestaparaestoscompuestosderivatizadossonPA [BartkP;
1997][Ribeiro A; 2002], PDMS [Henricksen T; 2001][Llompart M; 2002] y CARPDMS [Llompart M;
35
Introduccin
2002],siendorecomendableempleartemperaturaselevadasyadicindesalparamejorarlaeficacia
delaextraccin.
Enelcasodelosparabenes,laSPMEsehaempleadoparaelanlisisdecosmticosmediante
espectrometra de movilidad inica, en donde la fibra triple DVBCARPDMS present mejores
resultadosfrenteaPDMS,PAyPDMSDVB[LokhnauthJK;2006].
3.2.Preparacindemuestraparamatricesslidas

Laextraccinyrecuperacindelosanalitosenmatricesslidaspuederesumirseencuatro
etapas:desorcindeloscompuestosdelossitiosactivosdelamatriz,difusindelosmismosatravs
de la matriz, solubilizacin de los analitos en el extractante y la recoleccin de los extractos. La
interaccinentrelosanalitosylasmuestrasslidassuelesermuchomsintensaqueenelcasodelas
matrices lquidas, de modo que es necesario emplear tcnicas de extraccin ms enrgicas. En
consecuencia, son tcnicas poco selectivas, de modo que muchas veces ser necesario considerar
etapasposterioresdelimpieza.

Dentro de las tcnicas utilizadas para la extraccin de parabenes y triclosn en muestras
slidas, se encuentra la extraccin asistida por microondas (MAE), Soxhlet, la extraccin por
ultrasonidos (US), la dispersin de la matriz en fase slida (MSPD) y la extraccin con disolventes
presurizados(PLE)[CamelV;2001].
3.2.1.Extraccinasistidapormicroondas(MAE)
La extraccin asistida por microondas se basa en el uso de la energa de microondas para

conseguir que los compuestos de inters pasen de la muestra a un disolvente adecuado. Es una
tcnicarpida,queutilizavolmenespequeosdeextractanteyquepermiteelcontroldeunaserie
deparmetrosqueafectanalaeficaciadeextraccin[CamelV;2000].
Elcalentamientoinducidoporlaenergademicroondassefundamentaenlaorientacinde
dipolossometidosaunaradiacinelectromagnticadefrecuenciacomprendidaentrelos100mHzy
los3GHz.Enpresenciadelcampoelectromagntico,losdipolosseorientanpreferentementeenuna
determinadadireccin,volviendoaunestadodesordenadocuandoelcampocesa.Lafriccinentre
molculas causada por estos movimientos provoca la emisin de energa calorfica. A 2.5 GHz
(frecuencia a la que operan los extractores de microondas), el alineamiento de molculas polares
seguidodelcorrespondienteretornoalestadodesordenado,ocurreaproximadamente5X109veces
porsegundo,locualprovocauncalentamientosumamenterpido.
36
Metodologaanaltica
Laaplicacindelaenergademicroondaspuedellevarseacaboenrecipientessellados(bajo
control de presin y temperatura) o en vasos abiertos (presin atmosfrica). En el primer caso, el
disolvente puede calentarse por encima de su punto de ebullicin a presin atmosfrica, mientras
queusandorecipientesabiertos,latemperaturamximaalcanzadacorresponderaladelpuntode
ebullicindeldisolventeapresinatmosfrica[BlangerJMR;2006].
Losparmetrosqueafectanalaeficaciadelaextraccinsonlanaturalezadeldisolvente,la
temperatura,lapotencia,eltiempodeextraccinylanaturalezadelamatriz.Latemperaturaayuda
a aumentar la difusividad de los analitos desde la matriz al disolvente. El efecto de la energa de
microondas es fuertemente dependiente de la naturaleza del disolvente y de la matriz. Aquellos
disolventes que tienen una elevada constante dielctrica experimentan una elevada temperatura,
aumentandoladifusividaddelosanalitosdesdelamatrizaldisolvente,mientrasquelosdisolventes
con una baja constante dielctrica prcticamente no son calentados, actuando simplemente como
solubilizadoresdelosanalitos.Enestecaso,slosecalientalamatrizgraciasalapresenciadeagua
ensuestructura[LettelierM;1999].
Lacantidaddeenergaaplicadaesunparmetroacontrolar,debidoaquepuedeproducir
un calentamiento excesivo de la muestra. El tiempo de extraccin tambin es estudiado, debido a
que valores excesivamente largos podran causar la degradacin de compuestos termolbiles. La
mayoradeestosparmetrospuedenoptimizarsemediantediseosdeexperimentos,loquepermite
establecerlascondicionesptimasconunmenornmerodeensayos,reduciendotiempo,trabajoy
considerandolasposiblesinteraccionesquepuedentenervariosfactoresentres[EgizabalE;1998].
Por otra parte, las caractersticas de la matriz tambin pueden provocar variaciones en la
recuperacin de los compuestos, sobre todo en matrices con alto contenido en materia orgnica,
debidoainteraccionesanalitomatriz [CamelV;2000y2001].As,MahugoSantanaycolaboradores
[MahugoSantana C; 2005] observaron que la naturaleza del suelo afect significativamente a la
extraccindeclorofenolesmedianteextraccinmicelarasistidapormicroondas.Amayorcontenido
de materia orgnica, se observ un descenso de la recuperacin de los mononitrofenoles y un
aumentodelasealdelosalquilfenoles.Adems,laeficaciadeextraccindelosclorofenolesresult
mseficazenaquellossuelosdenaturalezacida.
En la mayora de las aplicaciones, es necesario llevar a cabo la purificacin del extracto
obtenido debido a la escasa selectividad de esta tcnica. Rice y colaboradores [Rice SL; 2007]
desarrollaronunametodologaparalaextraccindediversoscompuestosutilizadosenproductosde
cuidadopersonal,entreloscualesseencontrabaeltriclosn,enmuestrasdesueloysedimentos.La
extraccin,realizadaconunamezcladediclorometano:metanol(2:1),a115C,durante15minutos,
proporcionextractosquetuvieronqueserpurificadosconslicapreviamenteasuanlisismediante
GCMS.
37
Introduccin
3.2.2.ExtraccinSoxhlet
Soxhlet es la tcnica ms antigua para la extraccin de compuestos orgnicos en matrices

slidas. Desarrollada en 1879, sigue siendo hoy en da una tcnica aceptada por la Agencia de
Proteccin Medioambiental (EPA), como el mtodo 3540C, y usada como procedimiento de
referenciaconrespectoalquesevalidanotrastcnicasmsactuales[FidalgoUsedN;2007].
FiguraIII.5.EquipodeextraccinSoxhlet.

Salidadeagua La extraccin exhaustiva de componentes
Condensador orgnicos en un sistema Soxhlet se lleva a cabo
Entradadeagua usando un disolvente orgnico, el cual refluye a
travsdelamuestracontenidaenundedalporoso
AparatoSoxhlet
de celulosa o vidrio, figura III.5. Las ventajas ms
Slidoendedal
decelulosa importantes de la extraccin Soxhlet son el
Disolvente contactocontinuodelamuestraconunaporcin
fresca de disolvente, simplicidad, bajo coste de
adquisicin y la posibilidad de procesar grandes
cantidadesdemuestra.
Dentro de sus limitaciones, nos encontramos el tiempo necesario para la extraccin y los
volmenesdedisolvente,engeneralmuyelevadosfrenteotrastcnicas,loqueimplicalanecesidad
deconcentrarlosextractosorgnicosobtenidos[LuquedeCastroMD;1998].
Enloreferentealafamiliadecompuestosestudiados,sehanencontradoaplicacionesdela
extraccinSoxhletparatriclosnymetiltriclosnenlodosdedepuradora,sedimentosyalgas.Parael
caso de lodos, se ha utilizado acetato de etilo durante 6 horas. Los extractos fueron purificados
mediantecromatografadepermeacinengel(GPC)paraeliminarlasmacromolculascoextradas
[BesterK;2003].Paralasalgaselprotocolofueelmismoperosehautilizadodiclorometanoenvez
deacetatodeetilocomodisolventedeextraccin[CooganMA;2007].
La combinacin del procedimiento Soxhlet con el uso de energa de microondas permite
realizarextraccionesmuchomsrpidasconlamismaeficaciaqueunSoxhletconvencional.Morales
Muoz y colaboradores [MoralesMuoz S; 2005] utilizaron esta combinacin para extraer
contaminantescomoelbisfenolA,elestradiolyeltriclosndesedimentosmarinos.Enslo5ciclos
deextraccinde120segundos,usando35mLdediclorometanoa100Wdepotencia,extrajeronlos
compuestoscuantitativamente.ConlametodologaSoxhletconvencionalfueronnecesarios100mL
dediclorometanoy24horasparaobtenerresultadosequivalentes.
38
Metodologaanaltica
3.2.3.Dispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)
Ladispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)esunatcnicadepreparacindemuestra
con una gran aceptacin para la extraccin de compuestos orgnicos en matrices slidas o
semislidas.Desarrolladaen1989porBarker [BarkerSA;1989],MSPDsebasaenladisrupcindela
estructuradelamatrizconayudadeunmorteroylahomogenizacindelamismasobreunsoporte
slido.Eldispersadoestransferidoauncartucho,normalmentedepolipropileno,ylosanalitosson
eluidosconundisolventeapropiado(figuraIII.6).
FiguraIII.6.EsquemadelprocesodeMSPD.
Elucin
Dispersin dela
muestra
Preparacindel
Coadsorbente
cartucho
Laparticin(faseestacionarialquida)oelequilibriodeadsorcin(faseestacionariaslida),
similaralexistenteenunacolumnacromatogrfica,esresponsabledeladistribucindelosanalitos
entrelamuestradispersadayeldisolventedeelucin.LaeficaciayselectividadenMSPDdependede
varios factores entre los cuales destacan la seleccin del material dispersante, utilizacin de co
adsorbentes,eltipodedisolventeylasecuenciadeelucin.
Naturalezadelsoporteslidoydelafaseenlazada.Losmaterialesderivadosdelaslicason
los ms empleados en la disrupcin de la matriz en MSPD, ya que presentan la ventaja de poseer
grupos silanoles no enlazados, tanto en la superficie de las partculas como en los poros, que
interaccionanconelaguadelamuestra,actuandoasuvezcomoagentedesecante.
Dentrodelosadsorbentesdenominadosdefasereversa,elmsempleadoeseloctadecil
silano (C18), frente a otros como el C8 y el C30. El C18 est formado por partculas de slice con
cadenashidrocarbonadasde18carbonos,unidasqumicamentealosgrupossilanoles.Laspartculas
deslicaactancomodispersantes,mientrasqueelC18solubilizaloscomponentesdelamatrizsobre
susuperficie.Conestetipodefasesesposibleobtenerextractosrelativamentelibresdegrasaspara
muestrasdemsculo[KubalaDrinicH;2003][LeBoulaireS;1997],hgado[CrescenziC;2001][Horne
39
Introduccin
C;1998],rin[RuizMJ;2005]ypescadosconaltocontenidolipdico[TollsJ;1999][GarcaReyesJR;
2007][CanosaP;2008],usandoacetonitrilocomodisolvente.
En la actualidad, las fases reversas basadas en las cadenas hidrocarbonadas se estn
sustituyendo por aminopropilslica o por aminas primariassecundarias (PSA) [GarcaReyes JF;
2007][Ferrer C; 2005][Cunha SC; 2007] para reducir el contenido de lpidos en los extractos
procedentesdemuestrasbiolgicasdeorigenanimal.
ElFlorisil(MgSiO3),laalmina(Al2O3)ylaslica(SiO2)sonadsorbentesdenominadosdefase
normalutilizadosparalaextraccindepesticidas,herbicidasycontaminantesprioritariosenmatrices
biolgicas [GmezAriza JL; 2002][Martnez A; 2005], vegetales y frutas [Hu YY; 2006] mediante
MSPD. Adems, se han usado como dispersantes de muestras medioambientales (lodos de
depuradora, sedimentos, polvo de aspiradora,) para la extraccin de contaminantes tanto
prioritarios como emergentes [Pena MT; 2007][Blanco E; 2006][Shen X; 2006]. Estos adsorbentes
puedenserutilizadostalcomoseencuentrancomercialmenteomodificadosmediantelaadicinde
agua,cidosobasesenfuncindelascaractersticasyelcomportamientoquequeramosconferirles
[CarroMA;2005].
Coadsorbente.Enmuchoscasosesposibleobtenerextractoslibresdeimpurezasmediante
la purificacin onlinedel extractoprimario obtenido enMSPD.Estopuede lograrsecolocandouna
capadecoadsorbente,generalmentededistintanaturalezaqueelslidoutilizadoparadispersarla
muestra,alfondodelcartuchodeMSPD.Enmuchoscasos,estecoadsorbenteactareteniendolas
interferencias [Pensado L; 2005], pero tambin puede destruirlas cuando presenta algn tipo de
modificacinqumica[CarroMA;2005][CanosaP;2008].
Naturalezadelamatrizdelamuestra.Loscomponentesdelamatrizdispersadasemueven
a travs de la fase cromatogrfica, contenida en el cartucho de MSPD, lo que hace posible un
fraccionamientoenfuncindelanaturalezadeestoscompuestospresentesenlamatriz,ascomode
lassustanciasinterferentesquepuedenhacermscomplicadosudeterminacinanaltica.
Disolventeysecuenciadeelucin.AligualqueencromatografaoenSPE,lapolaridaddel
disolventeesdegranimportanciaalahoradedeterminarqueanalitoseluyendelcartuchodeMSPD
yenqueordenlohacen.Lacorrectaeleccindeldisolventeyeldiseodelperfildeelucinpermite
obtener extractos libres de impurezas en base a la retencin de las mismas en la fase estacionaria
[PensadoL;2005],omedianteunaprimeraelucinparaeliminarlasdelcartuchodeMSPD [Canosa
P;2007B][GarcaM;2007].
3.2.4.Extraccincondisolventespresurizados(PLE)
La extraccin con disolventes presurizados, tambin denominada extraccin acelerada con

disolventes(ASE),fuecomercializadaporlacompaaDionexen1995[FidalgoUsedN;2007].PLEes
40
Metodologaanaltica
una tcnica de extraccin slidolquido que combina la utilizacin de temperaturas (50200C) y

presiones elevadas (5003000 psi), con disolventes en estado lquido para proporcionar una
extraccinrpidayeficazdelosanalitosdesdedistintostiposdematrices,contenidasenunacelda
deacerosellada [GarridoLpezA;2005].Sehademostradoqueestatcnicaesequivalenteaotras
metodologas como Soxhlet, siendo incluso utilizada como mtodo de referencia por la Agencia de
ProteccinMedioambiental(USEPAMethod3545).Lapresinelevadaesnecesariaparamantenerel
disolventeenestadolquidoalastemperaturasdetrabajo,normalmentesuperioresasupuntode
ebullicin a presin atmosfrica. A estas temperaturas, ligeramente inferiores al punto crtico, las
propiedades del disolvente se modifican, de modo que su viscosidad disminuye, penetrando con
facilidadenlosporosdelamatriz,favoreciendoladifusindelosanalitos.Deestemodo,laeficacia
deextraccinseincrementa,minimizandoelvolumendedisolventeempleada[RichterBE;1996].

Eltipodedisolventeylatemperaturadetrabajosonlosparmetrosquemsafectanala
eficacia de PLE. El disolvente debe ser capaz de solubilizar los analitos sin arrastrar el resto de los
componentesdelamatriz.Porsuparte,latemperaturatienequesersuficientementeelevadacomo
paraaumentarlasrecuperacionesyfavorecerlacinticadeextraccin,sindegradaraloscompuestos
objeto de estudio [ConchaGraa E; 2004][Rodil R; 2006]. Otros factores a estudiar a la hora de
desarrollarunmtododePLEsonelnmerodeciclos,eltiempodeextraccinysecado,yenmenor
medidalapresinenlasceldasdeextraccin,aunque,engeneral,esteltimonoesunparmetro
queafecteengranmedidaalaeficaciadeextraccin,demodoquepuedeserfijadodeantemano
[CamelV;2001].

Enlaextraccinenmodoesttico,eldisolventeesintroducidoenlacelda,mantenindolaa
presinconstanteduranteuntiempopredeterminado.Trasestaetapa,laceldasevacarecogiendo
todoelextractoenunvialcolector.Acontinuacin,sehacepasarunvolumendedisolvente,elcual
viene expresado como tanto por ciento del volumen de celda (porcentaje de flush) para arrastrar
posiblestrazasdelosanalitosquepudiesenquedarenlacelda.Esevolumen,enelcasodequese
produzcan dos o ms ciclos de extraccin, es dividido entre el nmero de los mismos [Richter BE;
1996].AlgunosequiposdePLEposeenunavlvularestrictoraquepermiterealizarlaextraccinen
mododinmico,demodoqueestpasandocontinuamenteunflujoconstantededisolventeatravs
delaceldapresurizada.Enestecaso,laextraccinesmsefectiva,peropresentaelinconvenientede
obtenerextractosconunvolumenelevado[CamelV;2001].
Elesquemadeunequipodeextraccincondisolventespresurizadossemuestraenlafigura
III.7.
41
Introduccin
FiguraIII.7.Equipodeextraccincondisolventespresurizados.
Vlvulade
mezcla
Bomba
Los equipos de PLE constan de una bomba
Horno paraimpulsareldisolvente,unhornodonde
se introducen las celdas de acero
Vlvula
depurga
presurizadas, para mantenerlas a la
Celda temperatura seleccionada, un vial colector
Vlvulade en donde se recoge el extracto lquido, y
esttica
Disolventes nitrgeno para purgar la celda una vez
Vial
colector terminadoelprocesodeextraccin.
Nitrgeno
La aplicacinde esta metodologa a laextraccin de triclosn y metiltriclosn en muestras

slidassehacentradoensedimentosylodosdedepuradora.Lamuestraesmezcladaconunslido,
generalmenteunsoporteinerte(arenaohidromatrix),pararellenartodoelvolumendelacelda.La
utilizacin de diclorometano, como disolvente para la extraccin, a 100C durante 5 minutos,
proporciona recuperaciones del orden del 100 % para el triclosn [Agera A; 2003][Singer H;
2002][ChuS;2007]yelmetriltriclosn [SingerH;2002].Burkhardtycolaboradores [BurkhardtMK;
2005] seleccionaron mezclas polares de agua:isopropanol a 120C y 200C para la extraccin de
contaminantes antropognicos, entre los cuales se encontraba el triclosn, en sedimentos. PLE ha
sidoaplicadatambinaladeterminacindetriclosnymetiltriclosnenpescado,seleccionandouna
mezcladeciclohexano:diclorometano(1:1)paralaextraccindelosanalitos,conjuntamenteconla
fraccinlipdica,yposteriorpurificacinporcromatografadepermeacinengel(GPC) [BalmerME;
2004y2005].
3.2.5.Ultrasonidos(US)
Es una tcnica sencillade extraccin slidolquido(USEPA 3550), endonde la muestra se

poneencontactoconundisolventeadecuado,ysesometealosultrasonidosgeneradosenunbao
deaguaoporunasondadeultrasonidos.Deestemodo,seproducelaagitacincontinuadelamatriz
coneldisolventeorgnico.Elefectomecnicodelosultrasonidosprovocaunamayorpenetracindel
disolvente en los materiales slidos, facilitando la transferencia de los analitos de la matriz al
disolvente.Unavezfinalizadalaetapadesonicacin,secentrifugalamuestrayelsobrenadantese
trata de modo adecuadopara realizar el anlisis. La eleccin deldisolvente es esencial para que el
42
Metodologaanaltica
mtodo permita obtener elevadas recuperaciones de los analitos de inters [FildalgoUsed N;

2007][CelaR;2002].
Debidoasusencillez,estatcnicaesutilizadaampliamenteenlaextraccindeparabenesen
cosmticos[LabatL;2000][ZhangQ;2005],siendoseleccionadaenlaDirectiva96/45/ECdelaUnin
Europeacomomtododereferenciaparaverificarlacomposicinenproductosdecuidadopersonal
[ShenHY;2007][http://eurlex.europa.eu].Tambinsehandesarrolladometodologasdeextraccin
detriclosnyparabenesenmatricesmedioambientalesbasadasenelusodeenergadeultrasonidos.
As,Rudelycolaboradores [RudelRA;2003]determinaronlapresenciadediferentesparabenesen
muestras de polvo, previamente sometidas a una etapa de lixiviacin en medio cido, mediante
sonicacinenpresenciadediclorometano.Gatidou [GatidouG;2007]extrajolodosdedepuradora
con una mezcla de metanol y agua para la determinacin de triclosn y otros contaminantes
emergentes.ElextractoobtenidotraslasonicacinfuepurificadomedianteSPE.
3.3.Derivatizacin
Laderivatizacinesunaoperacinorientadahacialatransformacindelosanalitosenotras
especiesmscompatiblesconlatcnicadedeterminacin,oquepresentenmejorescaractersticas
para su deteccin [Mol HGJ; 2002][Rodrguez I; 2000][Blau K; 1993]. En el caso de usar tcnicas
cromatogrficas en la etapa de determinacin, los objetivos concretos de los procesos de
derivatizacinson:
1. Mejorarlaestabilidadtrmicadelosanalitos
2. Mejorarlaresolucincromatogrficaentrepicos
3. Modificarindirectamentelasensibilidaddeldetector,introduciendoenlasmolculasgrupos
orgnicosadecuadosqueincrementansurespuesta[CelaR;2002].
3.3.1.Derivatizacinenmediohomogneo
La derivatizacin en medio homogneo es aquella en la cual el agente derivatizante se

adicionadirectamentealmedioodisolventequecontieneelanalito.Segnlaformaexperimentalde
llevaracaboelproceso,podemoshablarde:
Derivatizacindiscontinuauoffline.Laderivatizacinserealizapreviamentealaintroduccindelos
analitosenelsistemacromatogrfico.
Derivatizacinencontinuouonline.Laderivatizacinserealizaenelpropiosistemacromatogrfico
[CelaR;2002].
43
Introduccin
En el caso concreto de la cromatografa de gases, la modalidad ms utilizada es la

derivatizacin offline, con distintos tipos de reacciones entre las que destacan las siguientes para
compuestosfenlicos:
Acetilacin. Se lleva a cabo utilizando anhdrido actico y una base, en medio acuoso u orgnico
[HenriksenT;2001].AdolfssonErici,SioufiyBirkelhanseleccionadoestareaccinparaderivatizarel
triclosn en extractos de leche humana, orina y plasma [AdolfssonErici M; 2002][Sioufi A;
1997][BirkelM;1993].Delmismomodo,losextractosobtenidosdemuestrasdecorchoybarricade
robleparaelanlisisdeanisolesy2,4,6triclorofenol,fueronderivatizadosconestereactivoparaser
determinadosposteriormenteenunsistemaGCECD[PizarroC;2006AyB].
Metilacin.Unadelasopcionesmsutilizadasalahoradederivatizareltriclosneslametilacin
con diazometano. Este agente derivatizante presenta varios inconvenientes como la necesidad de
generarse insitu,escarcinognicoydalugaraunareaccinmuyexotrmica [HellK;2000][BlauK;
1993].Porlogeneral,eldiazometanonoescompatibleconeldisolventequecontienelasespeciesa
derivatizar, siendo necesaria la evaporacin a sequedad del extracto antes de aadir este
derivatizante, as como eliminar el exceso del mismo al finalizar la reaccin [Ternes TA; 2002],
adems de no permitir la distincin entre el triclosn y su anisol (metiltriclosn) presente en la
muestra [Singer H; 2002]. An as, varios autores han utilizado la metilacin como reaccin de
derivatizacindeltriclosn.Lamayoradeellosutilizarondiazometano[LindstromA;2002][KandaR;
2003][Alaee M; 2003][Nakada N; 2006][Graovac M; 1995][Agera A; 2003][Okumura T;
1996][Kronimus A; 2004], aunque algunos han recurrido a otros reactivos como el metil
clorometanoato[WeigelS;2004][BendzD;2005][PaxusN;2004].
Sililacin.Sindudaeslareaccinmsverstilalahoradedeterminarsustanciascongruposcidos
utilizandocromatografadegases.Mediantelaformacindelenlacesiliciooxgeno,sebloqueanlas
interacciones dipolodipolo reduciendo la polaridad de aquellas especies con grupos hidroxilos o
carboxilos.Laderivatizacindeberealizarseenmedioorgnico,empleandodisolventesnoprticos
[BlauK;1993].Algunosautoreshanseleccionadoestareaccin,utilizandodiversosagentessililantes
entre los que destacan el N,Ndietiltrimetilsililamina [Mc Avoy D; 2002], el N,Obis
(trimetilsilil)trifluoroacetamida [Boyd GR; 2003 y 2004][Lee HB; 2005], el NmetilN
(trimetilsilil)trifluoroacetamida [Ternes TA; 2002] y el N(tertbutildimetilsilil)N
metiltrifluoroacetamida[QuintanaJB;2007][HebererT;1997][CanosaP;2005By2006A].
Formacin de pentafluorobencil y pentafluropropionil derivados. Esta reaccin se lleva a cabo con
los correspondientes bromuros alquilfluorados, dando lugar a compuestos altamente estables
[Allmyr M; 2006 B][Lee HB; 2005][Rule KL; 2005] y fcilmente detectables mediante ECD
espectrometrademasasempleandoionizacinqumicaenmodonegativo.
44
Metodologaanaltica
3.3.2.DerivatizacincombinadaconSPME
Enlosprocesosdemicroextraccinenfaseslida(SPME),laderivatizacinpuedellevarsea
cabodedistintasmaneras.
Derivatizacin directa sobre la muestra. La derivatizacin se produce en el vial que contiene la

muestra, de modo que las formas derivatizadas son las extraidas por la fibra de SPME. En varias
referencias se utiliza este modo de derivatizacin. Por ejemplo, la determinacin de ms de 30
fenolesenaguamedianteHSSPMEhasidollevadoacaboutilizandoanhdridoacticoparaacetilar
los compuestos en disolucin acuosa [Llompart M; 2002]. Esta estrategia de anlisis haba sido
utilizadatambinporBartk[BartkP;1997].
DerivatizacinsobrelafibradeSPMEoderivatizacinonfiber.Laderivatizacin onfibersepuede
realizarincorporando,previamentealmuestreo,elderivatizanteenlafasepolimricadelafibrade
SPME, de modo que el proceso de extraccin y derivatizacin tienen lugar de manera simultnea.
Estamodalidaddetrabajonecesitaqueelderivatizanteseaestablecuandoseponeencontactocon
lamuestra.Acontinuacin,enumeramosalgunostrabajosqueaplicanestametodologa.
Tsai y colabradores [Tsai SW; 2003] expusieron la fibra a O2,3,4,5,6
(pentafluorobencil)hidroxilamina, para determinar aldehidos en una muestra acuosa mediante HS
SPME.Kosterycolaboradores [KosterEHM;2002]emplearonladerivatizacin onfiber,exponiendo
la fibra previamente al agente derivatizante (cloruro de pentafluorobenzoilo) para la posterior
extraccindeanfetaminasenmuestrasdeorinamedianteSPMEporinmersin.

Cuandoladerivatizacinserealizadespusdelaetapadeextraccin,lafibraconteniendo
losanalitosseexponealespaciodecabezadeunvialdondesesitaelderivatizante.Engeneral,este
mtodo se utiliza para especies poco voltiles presentes en muestras acuosas, usando agentes
derivatizantesquesedegradanencontactoconagua[RodrguezI;2004].
Shaoycolaboradores [ShaoY;2003]aplicaronladerivatizacin onfiberalanlisisdetrans
resveratrol, un compuesto fenlico, en vino, frutas y soja. Tras el muestreo mediante inmersin,
derivatizaronelanalitoconbis(trimetilsilil)trifluoroacetamida.
La determinacin de monosteres de cidos ftlicos mediante SPME por inmersin y
posterior derivatizacin onfiber con diazometano fue llevada a cabo por Alzaga y colaboradores
[AlzagaR;2003].Ensutrabajo,observaronquelaexposicindelasfibrasdeCWDVBalosvapores
de diazometano daaba gravemente dicho recubrimiento. Engelmann y colaboradores [Engelmann
MD; 2003] tambin escogieron esta metodologa para determinar clenbuterol en agua. Tras el
45
Introduccin
muestreo por inmersin con la fibra de PA, sta fue expuesta a un vial conteniendo
hexametildisilazano. Musshoff y colaboradores [Musshoff F; 2002] propusieron un mtodo similar
para la determinacin de cannabinoides en pelo. Tras una digestin bsica, extrajeron los analitos
medianteHSSPMEyposteriormenteexpusieronlafibraaNmetilN(trimetilsilil)trifluoroacetamida
[MusshoffF;2002].Brownycolaboradores [BrownH;2003]derivatizaronanfetaminaspresentesen
fluidosbiolgicoscondiferentesalquilcloroformiatos,utilizadosespecficamenteparaespeciescon
grupos amino, transformndolos en los correspondientes carbamatos. Rodrguez y colaboradores
[Rodrguez I; 2004] analizaron frmacos cidos mediante SPME por inmersin y posterior
derivatizacinonfiberconN(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida.
Derivatizacin en el puerto de inyeccin. En esta modalidad, la derivatizacin tiene lugar en el

inyector del cromatgrafo de gases cuando los analitos y el reactivo derivatizante, presentes en la
fibra,sesometenaaltastemperaturasdurantelaetapadedesorcin[CelaR;2002].
3.3.3.Usodeagentessililantescomoreactivosdederivatizacin
LautilizacindeagentessililantescomoderivatizantesdecompuestoscongruposOH,NH2
ySHesmuyhabitual,yaqueelsiliciotieneunagranafinidadporestosheterotomos [HebererT;
1997].Lareaccinpuedellevarseacaboenmedioorgnico,atemperaturamoderada,siempreque
el disolvente empleado no contenga los grupos anteriormente descritos que consumiran el
derivatizante[BesterK;2003][MusshoffF;2002].
Entre los agentes sililantes ms utilizados se encuentran el bis
(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), el NmetilN(trimetilsilil)trifuoroacetamida (MSTFA) y el N
(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida(MTBSTFA)(figuraIII.8).
Figura III.8. Estructura de los principales agentes sililantes utilizados para la derivatizacin de los
compuestosestudiados.
HC CH
O 3 3
HC CH
HC O 3 3 Si
O 3 CH
3 Si N
CH CF CH CH
Si N 3 3 3
CF 3
CF N 3 CH Si
3 CH CH CH 3
CH 3 3 3 HC
3 3 CH
3
MSTFA MTBSTFA BSTFA

46
Metodologaanaltica
Diversos autores han seleccionado estos reactivos para la determinacin de triclosn,

clorofenoles o parabenes mediante cromatografa de gases, tabla III.3. Para el desarrollo de las
distintas metodologas descritas en esta memoria, se ha utilizado el MTBSTFA como derivatizante.
Estereactivopresentaunagranventajafrenteaotrosagentessililantes:elgrupotertbutil,conun
gran impedimento estrico, evita la hidrlisis de los enlaces oxgenosilicio, lo que hace que los
derivadosobtenidosseanrelativamenteestablesfrentealahumedad [HebererT;1997][Spaulding
RS;2002].Adems,encomparacinconotrosagentessililantes,presentabajotiempodereacciny
normalmentestapuedeserllevadaacaboatemperaturaambiente[BlauK;1993].
Otraventajaadestacardeesteagentederivatizante,eslamayorestabilidadquepresentan
las fibras de SPME a los vapores del MTBSTFA, en comparacin con otros agentes sililantes ms
voltiles[RodrguezI;2004].
Tabla III.3. Resumen de aplicaciones empleando agentes sililantes como derivatizantes de los
compuestosestudiados.
BSTFA
Analito Matriz Condicionesderivatizacin Autor
50Lderivatizante+50Lpiridinaal
VariosPPCPS,TCS Lodosdepuradora GatidouG;2007
residuoseco,65C,20minutos
Aguassuperficialesy 1mLderivatizantealextractoevaporado, BoydGR;2003y
VariosPPCPs,TCS
residuales 80C,20minutos 2004
Contaminantesorgnicos,
PolvoyAire RudelRA;2003
MeP,EtP,BuP
Piridina:derivatizante(2:1)alresiduoseco,
PPCPs,TCS Sedimentosysuelos RiceSL;2007
70C,20minutos
MSTFA
50Ldeextracto+50Lderivatizante,
Clorofenoles Agua HebererT;1997
25C,60minutos
MTBSTFA
Frmacos,estrgenos, 50Lderivatizante+10Lpiridinaal
Aguaresidual GibsonR;2007
fenoles,TCS residuoseco,60C,30minutos
75Lderivatizante+75Lextractoen
Frmacoscidos,TCS Aguaresidualynatural LeeHB;2005
acetonitrilo,75C,30minutos
47
Introduccin
MTBSTFA
TCS Aguaconsumo ShelverWL;2007
nonano,25C,60minutos
TCS;2,4DCF;2,4,6TCF Aguaresidual QuintanaJB;2007
acetatodeetilo,25C,5minutos
50Ldeextracto+50Lderivatizante,
Clorofenoles Agua HebererT;1997
25C,1h
3.4.Determinacin
Entrelasdistintastcnicasempleadasparalaseparacinydeterminacindeloscompuestos
estudiados,lasmshabitualessonlacromatografadegasesacopladaaespectrometrademasasy,
en menor medida, con sistemas de deteccin de captura electrnica y emisin atmica; y la
cromatografa lquida de alta resolucin con deteccin ultravioletavisible o en combinacin con
espectrometrademasas.
3.4.1.Cromatografadegases
La cromatografa de gases (GC) se basa en la distribucin de los analitos entre una fase
estacionaria,depositadaenlacolumnacromatogrfica,yunafasemvilogasportador.Lamayora
delasaplicacionesaladeterminacindelosanalitosdeintersutilizancolumnasconfase5%difenil
95%dimetilsiloxanode30mdelongitud,comercialmenteconocidascomoHP5oDB5, [AgeraA;
2003][ZhaoRS;2007],condimetrosinternoscomprendidosentre0.25mmy0.32mm,yespesores
defasede0.25m [BalmerME;2004][AdolfssonEriciM;2002].Normalmente,seutilizainyeccin
enmodosplitless[SingerH;2002],aunquealgunosautoreshanconsideradoelempleodeinyectores
de temperatura programada [Bester K; 2003 y 2005] para mejorar los lmites de cuantificacin
obtenidos. Dentro de los distintos detectores utilizados para la determinacin de los compuestos
estudiados,losmsselectivossoneldetectordecapturaelectrnica(ECD)yeldetectordeemisin
atmica(AED).
El ECD proporciona una respuesta selectiva hacia las molculas que poseen tomos
electronegativos como el triclosn, metiltriclosn y clorofenoles [Birkel M; 1993][Graovac M;
1995][Sioufi A; 1997]. Evidentemente, carece de inters para parabenes. El detector de emisin
atmica(AED)permiteladeteccindelaradiacinemitidaporlosdiferenteselementospresentesen
losanalitosseparadosporlacolumnacromatogrfica.Elplasmaalimentadoporhelio,einducidopor
microondas,consigueexcitaralostomos,dandolugaraunespectrodeemisinqueserdetectado
48
Metodologaanaltica
porunareddediodos.Muypocosautoreshanseleccionadoestatcnicaparadeterminartriclosnen
muestras de agua residual [Van Stee LLP; 1999] debido a sus elevados lmites de deteccin para
especiescloradas.Sinembargo,hasidoutilizadacomotcnicadedeteccinenladeterminacinde
triclosnenplacadental[RasmussenHI;1996].
Sinduda,latcnicamsutilizadahoyendaparaladeterminacindecompuestosorgnicos
a niveles traza es la cromatografa de gases combinada con la espectrometra de masas (GCMS).
Mediante esta tcnica es posible obtener registros tridimensionales, es decir, para cada tiempo de
retencin, obtenemos un espectro de masas de las especies que emergen de la columna
cromatogrfica.
ElanalizadordemasasutilizadoduranteeldesarrollodeestaTesisDoctoralesunatrampa
de iones. El efluente cromatogrfico llega a la fuente de ionizacin, en este caso de impacto
electrnico,consistenteenunfilamentodewolframioqueemiteelectronesaceleradosgraciasaun
potencial aplicado entre el filamento y el nodo, figura III.9. Este chorro de iones impacta
perpendicularmente con las molculas neutras procedentes de la columna cromatogrfica
provocando su ionizacin. Las especies ionizadas pasan al analizador de masas que se encuentra a
alto vaco (105 psi), para evitar la colisin y reconstruccin de los fragmentos cargados,
sometindolosaunacorrientederadiofrecuenciasporpartedelelectrodoanular,queestabilizala
trayectoriadeunfragmentoconunadeterminadamasa/carga(m/z)enunarbitacircular,mientras
quelosrestantesfragmentoscolisionanconloselectrodoscolectoresconectadosatierra.Cuandoel
potencialvara,esosfragmentossedesestabilizandesurbitaypasanaldetector,unmultiplicador
deelectrones,dondeseintensificalasealdebidoalacascadadeelectronesquesegeneraencada
colisin. En cada barrido, se registra un espectro de masas completo del efluente cromatogrfico
[CelaR;2002][SkoogDA;1994].
FiguraIII.9.Trampadeionesutilizadacomoanalizadorenelespectrmetrodemasas.
49
Introduccin
Otra posibilidad que tenemos dentro de la espectrometra de masas es realizar una

refragmentacindelosionesprimarios.Laespectrometrademasasentndem(MS/MS)contrampa
deiones,acopladaaGC,sehaconvertidoenlaherramientaanalticamspopularparaelanlisisde
matricescomplejasdebidoasualtaespecificidadymoderadocoste.Laidentificacindelosanalitos
sebasaenlostiemposderetencinylafragmentacinespecficadecadainprecursoraisladoenla
trampa.Laespectrometrademasasentndemproporciona:
- Mayor informacin estructural de los analitos, debido a la obtencin del espectro de los iones
producto.
- Incrementodelarelacinsealruido,eliminandoposiblesinterferenciasquepudiesenexistiren
elespectrodemasas.
Existen varios tipos de barridos para la obtencin de espectros de MS/MS, aunque el ms

utilizadoparaelanlisisdemuestrasmedioambientaleseslaformacindeionesproducto.stosse
generanpordisociacininducidaporcolisin(CID)delinprecursorcuandosesometeacolisiones
sucesivasconhelioenlatrampa.Normalmente,esascolisionessonpocoenergticas,perolaenerga
transicional del in precursor aumenta, convirtiendo la energa cintica en energa vibracional.
Cuando el in precursor adquiere una gran cantidad de energa vibracional, los enlaces pueden
romperse,formandoespeciesdemenorrelacinm/z.
DentrodelasaplicacionesdeGCaladeterminacindetriclosn,parabenesycompuestos
relacionados, lo ms habitual es utilizar espectrometrade masas conionizacin mediante impacto
electrnico,registrandoloscromatogramasdecorrienteinicatotalTIC(totalioncurrent) [Sanches
SilvaA;2005][LoresM;2005][AllmyrM;2006AyB],enmodoSIM(singleionmonitoring)[BesterK;
2005][CooganMA;2007][LeeHB;2005]oempleandoMS/MS[SingerH;2002][WuJL;2007].
3.4.2.Cromatografadelquidos
La cromatografa de lquidos (LC) se basa en la distribucin de los analitos entre una fase
estacionariayunafasemvillquida.Esunatcnicaampliamenteutilizadaparaladeterminacinde
triclosnyparabenes.Engeneralsesuelenemplearfasesestacionariasdenaturalezaapolar,deltipo
C18 [YeX;2005][GanzeraM;2006], C8 [ZhangQ;2000][AgeraA;2003] ofenilhexil [QuintanaJB;
2004]ymezclasmetanol:aguaoacetonitrilo:agua,conalgnmodificadortipocidoactico [Halden
RU;2005][LabatL;2000],acetatoamnico[KokoletsiMS;2005]otributilamina[QuintanaJB;2004],
como fases mviles. Los sistemas de deteccin habitualmente empleados son ultravioletavisible y
espectrometra de masas o masasmasas. La deteccin mediante espectroscopa ultravioletavisible
se ha utilizado principalmente para el determinacin de parabenes en cosmticos [Borremans M;
50
Metodologaanaltica
2004][LabatL;2000],seleccionandolalongituddeondade254nmpararegistrarloscromatogramas.
Enelcasodemuestrasmedioambientales,laespectrometrademasasylaespectrometrademasas
en tndem son las opciones ms utilizadas para la determinacin tanto de triclosn como de
parabenes [Ganzera M; 2006][Chu S; 2007]. Normalmente, la ionizacin se realiza mediante
electrospray en modo negativo (ESI). Benijts [Benijts T; 2003] compar varias de las fuentes ms
usadas en LCMS: la ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI), el electrospray (ESI) y la
ionizacinconsprayinico(SSI)paraladeterminacinde20disruptoresendocrinos,entreloscuales
seencontrabanlosparabenes.Losresultadosqueobtuvieronmostraronunpatrndefragmentacin
y una sensibilidad similar para todas ellas, aunque APCI produjo espectros con peor relacin
seal/ruido.
Por ltimo, cabe destacar el uso de tcnicas como la electrocromatografa capilar [Huang
HY;2004],unhbridoentrelacromatografalquidadealtaresolucinylaelectroforesiscapilar,yla
electroforesis micelar electrocintica o electrocromatografa micelar [Mahuzier PE; 2001][Han F;
2008],paraelanlisisdeparabenesencosmticosyalimentos.
51

CAPTULOII
Mediosexperimentalesgenerales

I.MEDIOSEXPERIMENTALESGENERALES
1.1.Compuestosymaterialesutilizados

1.1.1.Reactivosydisolventes
- Aguaultrapura(MilliQ).
- Disolventes:nhexano,diclorometanoyacetonaparaanlisisdetrazas,Merck;acetatodeetilo,
acetonitriloymetanolgradoHPLC,Merck.
- cidosybases:cidoclorhdrico(36%),Prolabo;cidosulfricoconcentrado(96%),AnalytiCals;
cidoacticoglacialparaanlisis(99%),Merck;cidofrmico(96%),Aldrich;hidrxidosdico
(98%),Merck.
- Sales:sulfatosdicoanhidro(99%),Merck;carbonatopotsico(99%),Aldrich;clorurosdico
(99.9%), Vorqumica S.L.; tiosulfato sdico (99 %), Panreac; yoduro potsico (99 %), Aldrich;
yodatopotsico(99%),Aldrich;bromuropotsico(99%),Aldrich.
- Reactivos clorantes: Hipoclorito sdico con una concentracin de cloro libre de 4 % (p/v),
Aldrich.
- Derivatizantes:N(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida,MTBSTFA(97%)Aldrich;bis
(trimetilsilil)trifluoroacetamida,BSTFA(97%),Aldrich.
1.1.2.Patrones
- Triclosn(5cloro2(2,4diclorofenoxi)fenol)97%,Aldrich.
- 2,4diclorofenol, 2,3diclorofenol, 2,5diclorofenol, 2,6diclorofenol, 3,4diclorofenol, 3,5
diclorofenol,todosellosconpureza>98%,Merck.
- 2,3,4triclorofenol,2,4,6triclorofenol,2,3,5triclorofenol,2,4,5triclorofenol,2,3,6triclorofenol,
todosellosconpurezadel99%,Merck.
- Metiltriclosn(5cloro2(2,4diclorofenoxi)anisol)>98%,TorontoResearchChemicals.
- Metilparaben,Etilparaben,Propilparaben,ButilparabenyBencilparaben,todosellosde99%de
pureza,Fluka.
- 3clorometilparaben98%deAPINChemicalsLTDy3cloroetilparaben97%depureza,Aldrich.
- 2,4,6triclorobifenilo(PCB30)98.5%,DrEhrenstorfer.
55
Experimental
1.1.3.AdsorbentesparaSPEyfibrasdeSPME

- AdsorbentesdeSPE:CartuchosOasisHLB(60mg),Waters;cartuchosdeslicaSepPak,(500
mg)Waters; Florisil (60100 mesh), Aldrich; almina neutra (150 mesh), Aldrich; slica neutra
(230400mesh),Aldrich;slicacida(5,10y20%cidosulfrico,preparadaenellaboratorioa
partirdeslicaneutra);C18(70230mesh),Aldrich;arenalavadaconcidosulfrico,VWR.
- Fibras de SPME: Polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 m, PolidimetilsiloxanoDivinilbenceno
(PDMSDVB) de 65 m, Poliacrilato (PA) de 85 m, CarbowaxDivinilbenceno (CWDVB) de 70
myCarboxenPolidimetilsiloxano(CARPDMS)de75m,Supelco.
1.2.Instrumentacin
1.2.1.Materialgeneraldelaboratorio
- Materialdevidriodeusohabitualenellaboratorio
- Balanzaelectrnicadeprecisin(SartoriusBP3150)
- Granatario(SartoriusBP310S)
- Placaagitadoracalefactora(Selecta)
- Barrasagitadorasmagnticasrecubiertasdetefln
- SoportemanualdefibrasparaSPME(Supelco)
- VialesdevidriodedistintosvolmenesparaSPME(10,20y100mL)conseptasdeelastmero
recubiertasdetefln
- Vialesdevidrioparacromatografadegasesde1.5mLparamuestreadorautomtico
- Pipetasautomticasde20200Ly1001000L(Kartell,Eppendorf,Transferpette)
- ElectrododemembranadevidrioparamedidadepH(Methrom654)
- Filtrosdefibradevidriode47mmdedimetroy1mdetamaodeporo(Millipore)
- Filtrosdemembranade47mmdedimetroy0.45mdesterdecelulosa(Millipore)
- Filtrosdejeringade13mmdedimetroy0.22mdetamaodeporo(MillexGV)
- Jeringasde2mL
- Bombadevaco,modeloAspiratorA35(Eyela)
- Fritasdevidrio
- Tubosyconectoresdeteflon
- Baodeultrasonidos(Selecta)
- Estufa(Reyoe)
- Centrfuga(Unicen)
- TubosdecentrifugadePyrex
56
Mediosexperimentalesgenerales
- EmbudosdeExtraccinLquidoLquidode250mL
- CartuchosdeSPEdepolipropilenode15mL(IST)
- Fritasdepolietilenode20mm(IST)
- Botellasdevidriombarde300mL
- Morterodevidriode100mLdecapacidad
- FiltrosdecelulosaparaPLEde20mm(Ahlstrom)
- MedidordecloroHI93710(HannaInstruments)
- Equipo de concentracin de muestras lquidas, por corriente de nitrgeno, Turbo Vap II
Workstation(ZymarkCorporation)
- Tamizadorconplacasdedistintaluzdemalla(Retsch)
- LiofilizadorCryodoscon8bocas(Telstar)
1.2.2.Equiposdeextraccinutilizados
- Sistemadeextraccinpormicroondas:extractorEthos(Millestone)equipadocon12vasosde
tefln.
- Sistema de extraccin condisolventes presurizados: ASE 200(Dionex) equipado con celdas de
acerode11mLyvialescolectoresde60mL.
- ExtractorSoxhletconcapacidadpara125mLycartuchosdecelulosaparaextraccin(Supelco).
1.2.3.Programasinformticos
- PaqueteestadsticoStatgraphicsPlus5.1yStatgraphicsCenturionXV.I
- SaturnGCMSworkstationsoftware(versin5.4y6.42).
1.2.4.SistemasGCMS
- CromatgrafodegasesVarianCP3900conpuertodeinyeccintiposplitsplitlessacopladoaun
espectrmetrodemasasdetrampadeionesSaturn2100T,provistodeunautosamplerVarian
CP8400.Columna:HP5MS(30mx0.25mmd.i.x0.25mdf).
- CromatgrafodegasesVarianCP3800conpuertodeinyeccintiposplitsplitlessacopladoaun
espectrmetrodemasasdetrampadeionesSaturn2200,provistodeautosamplerCombiPal.
Columna:CPSil8(30mx0.25mmd.i.x0.25mdf).
- CromatgrafodegasesVarianGCStarCxconpuertodeinyeccintiposplitsplitlessacopladoa
un espectrmetro de masas de trampade iones Saturn3. Columna: CPSil8 CB LowBleed/MS
(30mx0.25mmd.i.x0.25mdf).
57
Experimental
1.3.Preparacindepatrones
Se prepararon por pesada, en una balanza analtica de precisin, disoluciones stock

individuales de 2 mg/g en metanol para cada uno de los compuestos objeto de estudio.
Posteriormente,apartirdelasdisolucionesstock,seprepararon(tambinporpesada)disoluciones
mezcladetrabajoenmetanol(parahacerlasadicionesamuestrasdeagua,lodos,polvoymaterial
biolgico) y patrones de calibracin en acetato de etilo y en acetonitrilo de distintas
concentraciones.
Los patrones se almacenaron en congelador y los stock se prepararon aproximadamente
cada12mesesparaprevenirposiblesproblemasderivadosdesudegradacin.
58
Metodologadesarrollada
II.METODOLOGADESARROLLADA
2.1.Protocolosdepreparacindemuestra
2.1.1. Determinacin de triclosn y sus derivados en muestras acuosas mediante

extraccinenfaseslida

El protocolo desarrollado para concentrar muestras acuosas mediante SPE consta de los
siguientespasos:
1. AcidificacindelamuestraapH23concidoclorhdrico2M.
2. Filtracinconfiltrosdefibradevidrio.
3. AcondicionamientodelcartuchoOasisHLB(60mg/3mL)con3mLdeacetatodeetilo,3
mLdemetanoly3mLdeaguaapH2.
4. Pasodelamuestraatravsdelcartuchoconunflujoaproximadode10mL/min.
5. Secadodelcartuchoconcorrientedenitrgenoa14psidurante30minutos.
6. Elucindelcartuchoconacetatodeetilo,recogiendo2mLdeeluyente.
7. En el caso de anlisis de muestras de agua residual, se procede a la purificacin de los
extractos primarios con cartuchos de slica SepPak de 500 mg (Waters). Se deposita el
eluato procedente del cartuchoOasis HLB en este adsorbente, eluyendo posteriormente
unafraccinde5mLdeacetatodeetilo,queesconcentradaaunvolumenfinalde2mL.
8. Una alcuota de 0.5 mL del extracto se derivatiza con 20 L MTBSTFA a temperatura
ambientedurante5minutos
9. Lospatronesdecalibradoseprepararonapartirdelasmezclascorrespondientesenacetato
deetilo,siendoderivatizadosdelmismomodoquelosextractosdelasmuestrasdeagua.

Figura II.1. Esquema del proceso de extraccin en fase slida para la determinacin triclosn,
clorofenolesymetiltriclosn.
Eluir 2mLdeacetatode
AjustarapH2 etilo
Filtrarconfibradevidrio
Oasis HLB
Sloaguasresiduales:
Acondicionarcartucho(3mL PurificarconSepPak0.5g
AcOEt,MeOH,H2OpH2) slica,elucin5mL y
Pasarlamuestraa10mL/min concentracina2mL
Secarcartuchoencorrientede 1L
N2 14psi,30min 0.5mLextracto+20L
GCMS
MTBSTFA5min aT
Ambiente HP5MS

59
Experimental
2.1.2. Determinacin de triclosn y sus derivados en muestras acuosas mediante

microextraccinenfaseslida
Paraladeterminacindetriclosn,metiltriclosnyclorofenolesrelacionadosenaguaseha
desarrolladootrametodologaanalticabasadaenlamicroextraccinenfaseslidacombinadacon
una etapa posterior de derivatizacin onfiber. El protocolo se describe detalladamente a
continuacin:
1. Acidificacindel agua a analizar a pH 4.5 con cidoclorhdrico 0.05 M. En el casode que

contenga materia particulada, se proceder a la filtracin previa con filtros de fibra de
vidrio.
2. Tomarunvolumendemuestrade20mLydepositarlaenunvialde22mL.
3. Adicin del patrn correspondiente en metanol para obtener la concentracin deseada,
manteniendoelporcentajedemetanolenelvialdeSPMEpordebajode1%(v/v).Sellar
concpsuladealuminioyconseptadetefln.Agitara500rpmdurante2minutos.
4. IntroduccindelafibradePAoPDMSDVBatravsdeunorificiopracticadoenelsptum,
exponindoladirectamentealamuestraduranteeltiemposeleccionado(30minutos).
5. Traselmuestreo,retraerlafibraysacardelvial.
6. Exponer al espacio de cabeza de un vial de 1.5 mL, conteniendo 20 L de derivatizante
(MTBSTFA)atemperaturaambiente,durante10minutos.
FiguraII.2.Procesodemicroextraccinenfaseslidaparaladeterminacindetriclosn,clorofenoles
ymetiltriclosn.
FibradePAoPDMSDVB
20mLmuestrapH4.5 Derivatizacinonfiber
Muestreoporinmersin. 20LMTBSTFA
Agitacina500rpm Enespacio decabeza
30min atemperatura 10min 3min desorcin
ambiente GCMS
CPSil8LowBleed

60
2.1.3. Determinacin de derivados del cido parahidroxibenzoico en muestras de agua

medianteextraccinenfaseslida
El protocolo para la determinacin de metilparaben, etilparaben, propilparaben,

butilparabenybencilparabenenaguasedetallaacontinuacin:

1. AcidificacindelamuestraacuosaapH23concidoclorhdrico2M.
2. Filtracindelamismaconfiltrosdefibradevidrio.
3. AcondicionamientodelcartuchoOasisHLB(60mg/3mL)con3mLdeacetatodeetilo,3
mLdemetanoly3mLdeaguaapH2.
4. Pasodelamuestraatravsdelcartuchoconunflujoaproximadode10mL/min.
5. Secadodelcartuchoconcorrientedenitrgenoa14psidurante30minutos.
6. Elucindelcartuchoconacetatodeetilo,recogiendo2mLdeeluyente.
7. Enelcasodeanlisisdemuestrasdeaguaresidual,seprocedealalimpiezadelosextractos
con cartuchos de slice SepPak de 500 mg, Waters. Para ello, se deposita el eluato
obtenido anteriormente en este segundo cartucho, y se eluye una fraccin de 5 mL con
acetatodeetilo,queposteriormenteseconcentraraunvolumenfinalde2mL.
8. Setoman0.5mLdeeseextractoyseleaade40Ldelagentederivatizante(MTBSTFA).Se
agitaysedejareaccionara70Cdurante1hora.
9. Lospatronesdecalibradoseprepararonapartirdelasmezclascorrespondientesenacetato
deetilo,siendoderivatizadosdelmismomodoquelasmuestras.
FiguraII.3.Esquemadelprocesodeextraccinenfaseslidaparaladeterminacindeparabenesen
muestrasacuosas.
Eluir 2mLdeacetatode
AjustarapH2 etilo
Filtrarconfibradevidrio
Oasis HLB
Sloaguasresiduales:
Acondicionarcartucho(3mL PurificarconSepPak0.5g,
AcOEt,MeOH,H2OpH2) elucin5mL y
Pasarlamuestraa10mL/min. concentracina2mL
Secarcartuchoencorrientede 1L
N2 14psi,30min 0.5mLextracto+40L
GCMS
MTBSTFA60min a70C
HP5MS
61
Experimental
2.1.4. Determinacin de metilparaben, etilparaben, propilparaben, butilparaben y

bencilparabenenmuestrasacuosasmediantemicroextraccinenfaseslida
Para la determinacin de parabenes en muestras acuosas, se ha desarrollado tambin una

metodologa basada en la microextraccin en fase slida con derivatizacin en la fibra de los
compuestosestudiados:
1. VerificarqueelpHdelamuestraseencuentraentornoa67unidades.Enelcasodeque
contengamateriaparticulada,seprocederalafiltracinconfiltrosdefibradevidrio.
2. Tomarunvolumendemuestrade10mLyadicionar150mg/mLdeNaCl,depositndolosen
unvialselladode11mL.
3. Adicin del patrn correspondiente en metanol para obtener la concentracin deseada,
manteniendo el porcentaje de metanol por debajo del 1 % (v/v) en el vial de extraccin.
Sellarconcpsuladealuminioyconseptadetefln.Agitara500rpmdurante2minutos.
4. IntroduccindelafibradePAatravsdeunorificiopracticadoenelsptum,exponindola
directamentealamuestraduranteeltiemposeleccionado(40minutos).
5. Traselmuestreo,retraerlafibrayretirarelvial.
6. Exponerlafibraalespaciodecabezadeunvialdevidriode1.5mL,conteniendo20Lde
derivatizante(MTSBTFA),atemperaturaambientedurante10minutos.
FiguraII.4.Procesodemicroextraccinenfaseslidaparaladeterminacindeparabenes.
FibradePA
1020mLmuestra
150mg/mL NaCl Derivatizacinonfiber
Muestreoporinmersin. 20LMTBSTFA
Agitacina500rpm Enespacio decabeza
10min 3min desorcin
40min atemperatura
ambiente GCMS/MS
HP5MS
62
2.1.5.Determinacindetriclosnyclorofenolesrelacionadosenmuestrasdesedimentos
ylodosdedepuradoramedianteextraccinasistidapormicroondas
La metodologa desarrollada para el anlisis de muestras de lodo de depuradora y

sedimentossebasaenlaextraccinasistidapormicroondas.Elprocesocomienzaconlaliofilizacin
de las muestras, seguido de la homogeneizacin de las mismas con un triturador. El protocolo se
describeacontinuacin:

1. Se deposita 1 g de sedimento, 0.5 g de lodo liofilizados, en un vaso de microondas de
teflncon30mLdeacetona:metanol(1:1)y300Ldecidofrmico.
2. Procederalaextraccinenelmicroondasa130Cdurante20minutosconunapotenciade
500Watios.
3. Centrifugar el extracto a 3500 rpm, recoger el sobrenadante y mezclarlo con 100 mL de
NaOH0.2M(pH12.7).
4. Extraccinlquidolquidocon2x15mLdenhexano.
5. RecuperarlafaseacuosayajustarapH2.5conHCl2M.
6. RealizarlaSPEdeesafaseacuosatalcomosehadescritoenlaseccin2.1.1.,realizandoun
lavado, previo al secado de los cartucho Oasis HLB 60 mg, con 25 mL de una disolucin
acuosaal20%demetanol.LosextractossepurificarontambinconcartuchosdeslicaSep
Pakde500mg.
7. Derivatizacin de 0.5 mL de extracto con 20 L de MTBSTFA durante 5 minutos a
temperaturaambiente.
8. Inyeccin de 1 L de extracto en el cromatgrafo de gases, con determinacin mediante
MS/MS.
Figura II.5. Esquema de preparacin de las muestras de sedimentos y lodos de depuradora para el
aislamientodetriclosnyclorofenolesrelacionados.
Mezclarcon100
mL NaOH 0.2M
AcidificarFAapH2.5.SPE
LLEcon2X15mL conelprotocolo2.1.1.
Hexano
MAE:0.51g, 30mL Derivatizacinde0.5mL
con20L MTBSTFA5min a 1L
acetona:metanol 1:1
TAmb GCMS/MS
300L cidofrmico
130C,20min,500W HP5MS
63
Experimental
2.1.6.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenenmuestrasde
polvousandoextraccincondisolventespresurizados
Dentro del anlisis de muestras de polvo de ambientes interiores, se ha desarrollado una

metodologa de extraccin con disolventes presurizados para los compuestos anteriores. Las
muestras, recogidas de aspiradores domsticos, fueron tamizadas considerando la fraccin con
tamaodepartculapordebajode60mparasuanlisis,almacenndolasatemperaturaambiente
enrecipientesestriles.Lapreparacindelamuestrasellevaacabodelsiguientemodo:

1. Sepreparalaceldade11mLdeacero,introduciendodeabajoaarriba:2filtrosdecelulosa
de20mmdedimetro,1gdesulfatosdicoanhidro,1gdeFlorisilactivado(130C/48h),
lamuestradispersadacon3gdeFlorisilactivadoy1gdesulfatosdicoanhidro.Rellenarla
celdaconsulfatosdicoanhidroycolocarunfiltrodecelulosa.
2. Seprocedeaunalimpiezapreviadelamuestraconnhexanoa40Cenuncicloestticode
4minutosa3.4MPa.Elflushseprogramaa50%ylapurgadelaceldasefijaen1minuto.
3. Laextraccindelamuestraserealizaconacetatodeetiloa103C,en3ciclosde1minutoa
13.8 MPa en esttico. El volumen de flush se fija en 100 % y el tiempo de purga en 60
segundos.
4. Concentrarelextractodeacetatodeetiloa2mLyfiltrarconfiltrosde0.22m.
5. Derivatizar 0.5 mL con 20 L de MTBSTFA, a 65C, durante 5 minutos e inyectar en el
cromatgrafo1L.
Figura II.6. Protocolo de preparacin de muestras de polvo mediante extraccin acelerada con
disolventes.
1filtrodecelulosa Cleanup:nhexano
40C/4min/1
Na2SO4 ciclo/3.4MPa/esttico/
50%flush/60seg purga
0.5gpolvo+1gNa2SO4+
3gFlorisil activado Extraccin:acetatodeetilo103C/1min/3
ciclos/13.8MPa/esttico/100%flush/60seg 1L
1gFlorisil activado purga
1gNa2SO4 GCMS/MS
Concentracina2mL yderivatizacin0.5mL
11mL 2filtrosdecelulosa CPSil8
con20L MTBSTFAa65C/5min

64
2.1.7.Extraccinconjuntadetriclosn,metil,etil,propilybutilparabenenmuestrasde
polvomediantedispersindelamatrizenfaseslida

Eltipodemuestrasempleadoenesteestudioylafraccinanalizadafueronlasmismasque
enelcasoanterior.Elprotocolooptimizadodepreparacindemuestrasedetallaacontinuacin:

1. Pesar 0.5 g de polvo y 0.5 g de sulfato sdico anhidro y depositarlos en un mortero de
vidrio.
2. Pesar 1.25 g de C18, aadirlos al mortero y realizar la dispersin de la muestra hasta la
obtencindeunpolvomuyfino.
3. Enelcartuchode15mLdepolipropileno,conteniendounafritadepolietileno,sedepositan
2gdeFlorisilactivadoa130durante48horas.
4. Seaadeeldispersadodelmorteroyparacompactarelcontenido,seintroduceotrafrita.
5. Sehaceunlavadodelcartuchocon10mLdediclorometano,descartndolo.
6. Sesecaelcartuchoavaco.
7. Elucincon10mLdeacetonitriloyconcentracindelextractoa1mL.Filtrarconfiltrosde
0.22m.
8. Derivatizacinde0.5mLcon0.1mLdeMTBSTFAa45Cdurante5minutos.
9. Inyeccinde1LenGCMS/MS.
FiguraII.7.EsquemadelprocedimientoparalaextraccindeparabenesytriclosnmedianteMSPD.
MSPD:0.5gpolvo+0.5gNa2SO4+1.25gC18,co
adsorbente2gFlorisil activadoa130C/48h
Concentrara1mL
Fraccionamiento: fraccinAcN
Fr 1:10mL DCM(descartar) Derivatizar 0.5mL 1L
Secado +0.1mL MTBSTFA
a45C,5min GCMS/MS
Fr 2:10mL AcN
HP5MS
65
Experimental
2.1.8.DeterminacindetriclosnymetiltriclosnenmaterialbiolgicomedianteMSPD
Se ha optimizado tambin un mtodo para la extraccin de triclosn y metiltriclosn en

muestras de pescado y alimentos. En el caso del pescado, se eliminan espinas, piel y agallas. El
msculoseliofilizahastaobtenerunamuestracompletamentesecayhomognea.Lasmuestrasde
alimento, se utilizaron tal como se adquieren en el supermercado.El protocolo depreparacin de
muestrasedescribeacontinuacin:

1. Se dispersan 0.5 g de muestra con 1 g de sulfato sdico anhidro y 1.5 g de slica neutra
activada.
2. Enelcartuchodepolipropilenode15mLsedepositan,despusdelafritadepolietileno,3g
deslicaimpregnadaconun10%(p/p)decidosulfrico.
3. Serecogen10mLdediclorometanoyseconcentranasequedad
4. Reconstituirelresiduocon1mLdeacetatodeetiloyfiltrarconfiltrosdejeringade0.22
m.
5. Sederivatizan0.5mLdeextractocon50LdeMTBSTFAdurante5minutosatemperatura
ambiente.
6. SeinyectaunmicrolitroenelsistemaGCMS/MS.
FiguraII.8.Protocoloparalaextraccindetriclosnymetiltriclosnenmuestrasbiolgicas.
MSPD:0.5gmuestra+1g
Na2SO4+1.5gslica neutra, Reconstituircon1
coadsorbente3gslica con mL deAcOEt
10%(p/p)H2SO4
Derivatizar 0.5mL 1L
Elucin10mL DCM +50L MTBSTFA
20C,5min GCMS/MS
Concentrarasequedad
HP5MS
66
2.2.Condicionesdedeterminacin
Los mtodos de determinacin propuestos utilizan la cromatografa de gases acoplada a

espectrometra de masas, tanto simple (GCMS) como en tndem (GCMS/MS), como tcnicas de
determinacin.Enelprimercaso,esposibleidentificarlasespeciespresentesenelcromatograma
por sus espectros de masas, considerando la fragmentacin existente y comparando con la
biblioteca de espectros. En el segundo caso, tal como ya ha sido mencionado anteriormente, es
posibleincrementarlarelacinsealruido,ascomoobtenermayorselectividad.Porestarazn,la
espectrometra de masas se ha seleccionado como tcnica de deteccin en muestras de agua,
especialmenteenlosestudiosdedegradacindelosanalitosenaguaclorada,paralaidentificacin
de los subproductos generados. Encambio, en elcasode las muestras slidas, se ha seleccionado
MS/MSparaaumentarlaselectividadyreducirloslmitesdecuantificacinalcanzados.

2.2.1.GCMS

Enlassiguientestablassemuestranlosparmetroscromatogrficos,ascomolosrelativos
alespectrmetrodemasas,paraladeterminacindelosanalitosdeinters.
Tabla II.1. Parmetros de determinacin de triclosn, metiltriclosn, clorofenoles y parabenes

medianteGCMS.
Parmetroscromatogrficos
SPME(TCS) Iny.Directa(TCSyParabenes)
Columnacromatogrfica CPSil8LowBleed HP5MS
Inyector Split/splitless Split/splitless
ModoInyeccin Splitless Splitless
PA:270C
Tinyector 280C(1L)
PDMSDVB:260C
Tiemposplitless 3min 2min
Flujosplit 20mL/min 20mL/min
Tinicial 70C(3min) 50C(2min)
Rampa 10C/min 10C/min
Tfinal 270C(10min) 270C(10min)
Flujogasportador(He) 1mL/min 1mL/min
67
Experimental
ParmetrosMS
Mododeionizacin EI(70eV)
Corrientedeemisindelfilamento 20A
Voltajedelmultiplicador 2000V
Rangomasas 100550m/z
Tmanifold 50C
Tlneadetransferencia 280C
Ttrampadeiones 220C
Tiempodedelay 10min
2.2.2.GCMS/MS
LassiguientestablassemuestranlascondicionesdedeterminacinenGCMS/MS.Parael
desarrollodelmtododeMS/MSunavezseleccionadoelinprecursor,laventanadeaislamientoy
el offset del multiplicador, se ha de optimizar el nivel de almacenamiento (Storage Level) y la
amplitud de excitacin. La eleccin del in precursor o padre se hace en base a los espectros de
masas de impactoelectrnico obtenidos realizandoun barrido completo (full scan). La ventanade
aislamiento(IsolationWindow)permiteaislarenlatrampaunrangoprximoalinprecursor.Los
valoresrecomendadososcilanentre1y14unidadesdem/z,aunquelomshabitualeslautilizacin
de3unidadesdem/z,loqueimplicaquetomaunsegmentode1.5unidadesinferiorysuperiorala
relacin m/z del in padre. El offset del multiplicador permite mejorar los lmites de deteccin
incrementandoelvoltajedeldetector.Engeneral,seobservaunagananciade105cuandotenemos
unoffsetde300V.
Una vez fijados los parmetros anteriores, con ayuda de la herramienta de desarrollo
automatizado de mtodos (AMD) que posee el software empleado, se han optimizado el nivel de
almacenamientoylaamplituddeexcitacin.
Elniveldealmacenamientodependedelamasadelinprecursor.Parasuclculo,seutiliza
laherramientaqqueposeeelsoftware.Esteparmetrodependedelarelacinm/zdelinpadre
o precursor y nos indica la masa ms baja que va a ser almacenada en la trampa una vez
fragmentado ste, teniendoen cuentaque debe fijarse al menos dos unidades por debajo del in
productoconmenorrelacinm/z.
Para la optimizacin de la amplitud de excitacin se hace un barrido variando, hasta un
mximo de 10 valores, el voltaje aplicado al in precursor. Este depender del tipo de onda que
68
seleccionemos, siendo noresonante en el caso de iones de naturaleza lbil, frente al modo

resonanteparaaquellosmsdifcilesdefragmentar,yaqueamayorvoltaje,menoreslaenergade
laondaderadiofrecuenciasnecesariapararefragmentarelinprecursor.
TablaII.2.ParmetrosdeGCMS/MSparaladeterminacindetriclosn,metiltriclosn,clorofenolesy
parabenes.
Parmetroscromatogrficos
SPME(Parabenes) Iny.Directa(ParabenesyTCS)
Columnacromatogrfica HP5MS HP5MS/CPSil8
Inyector Split/splitless Split/splitless
ModoInyeccin Splitless Splitless
Tinyector PA:270C 280C(1L)
Tiemposplitless 3min 2min
Flujosplit 20mL/min 20mL/min
Tinicial 70C(3min) 50C(2min)
Rampa 10C/min 10C/min
Tfinal 270C(10min) 270C(10min)
Flujogasportador(He) 1mL/min 1mL/min
ParmetrosMS/MS
Mododeionizacin EI(70eV)
Corrientedeemisindelfilamento 70A
Voltajedelmultiplicador 2000V(offset+100V)
Tmanifold 50C
Tlneadetransferencia 280C
Ttrampaiones 220C
Tiempodedelay 10min
Mododepreparacin CID,resonante
Ventanaaislamiento 3m/z
69
Experimental
AdquisicinMS/MS
In Nivelde Rangode Ionesde
Amplitudde
Compuesto precursor almacenamiento adquisicin cuantificacin
excitacin(V)
(m/z) (m/z) (m/z) (m/z)
2,4DCF 219 96 0.53 90230 183
2,4,6TCF 255 110 1.10 100270 217
2,3,4TCF 255 110 1.10 100270 217
MTCS 304 130 1.50 120330 232+252+254
TCS 347 140 1.50 130360 200+310
MeP 209 92 0.5 85220 177
EtP 223 98 0.5 90240 151+177+195
PrP 237 104 0.5 90250 151+195
BuP 251 110 0.5 100260 151+195
BzP 285 90 0.4 80300 163+241
70
CAPTULOIII
SPMEaplicadaalaextraccindeTriclosnycompuestosrelacionados
I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y SUS DERIVADOS EN AGUA MEDIANTE

MICROEXTRACCINENFASESLIDA
1.1.Introduccin
La extraccin lquidolquido y en fase slida son las modalidades ms comunes para la

determinacin de contaminantes emergentes en muestras lquidas. En general, son tcnicas que
precisangrandesvolmenesdemuestra,disolventesmuchasvecestxicosyetapasposterioresde
concentracinylimpieza[SabaliunasD;2003][SingerH;2002][BoydGR;2003][LindstromA;2002].
Lamicroextraccinenfaseslida(SPME)hasidoseleccionadaparalaextraccinconjunta
de triclosn, metiltriclosn, 2,4diclorofenol y 2,3,4triclorofenol en muestras acuosas como
alternativa a otras tcnicas de concentracin. De este modo, se reduce el volumen de muestra, la
manipulacin de la misma y el uso de disolventes orgnicos. Combinada con la cromatografa de
gases, permite obtener lmites de cuantificacin muy bajos, ya que los analitos son desorbidos
directamente en el inyector del cromatgrafo a alta temperatura. El problema lo encontramos
cuandotenemosgrupospolaresenlasmolculasdelasespeciesadeterminar,comoeselcasodel
triclosn y los clorofenoles, puesto que ser necesario la derivatizacin de los mismos para
incrementar la eficacia de las separaciones cromatogrficas as como reducir los lmites de
cuantificacindelmtodoanaltico.LaderivatizacinenSPME,talcomoseindicenlaintroduccin,
puedellevarseacaboenlapropiamatrizosobrelafibra.Enelprimercaso,lomshabitualesaadir
alamuestraelagentederivatizante,porejemploelanhdridoactico[LlompartM;2002],mientras
que en el segundo, el derivatizante se deposita, previa o posteriormente a la extraccin de los
analitos,sobrelafasepolimricadelafibradeSPME[RodrguezI;2004].

Dentro de las aplicaciones desarrolladas para la determinacin de triclosn en muestras
acuosas, solamente hay una referencia relativa a la utilizacin de la SPME. Lores y colaboradores
[LoresM;2005][SnchezPradoL;2006AyB]utilizaronlafibradepolidimetilsiloxano(PDMS)para
estudiarladegradacinfotoqumicadeltriclosneidentificarlosproductosgenerados.Laeleccin
delrecubrimientodePDMSsehaceenbasealaestructuradelpolmero,sinconsiderarsueficacia
en la extraccin de los compuestos, puesto que este no presenta dobles enlaces que puedan
absorberlaradiacinutilizadaparairradiarloscompuestosadsorbidos.
Conrespectoalmetiltriclosn,nosehaencontradoningunaaplicacinenlaqueseutilicela
microextraccinenfaseslidacomotcnicadeextraccin.
Enelcasodelosclorofenoles,laSPMEhasidoampliamenteutilizadaparasudeterminacin
enmatricesacuosas.EnlatablaI.1,seresumenlasaplicacionesmsrelevantes.

73
Determinacinyreactividadenagua
TablaI.1.AplicacionesdeSPMEparaladeterminacindeclorofenolesenmuestrasacuosas.
LOD RSD
Analitosymatriz Procedimiento Detec. Ref.
(ng/L) (%)
Derivatizacin:anhdridoactico4L/mLy0.02gKHCO3
30fenolesenagua(2,4 SPME1:HSSPMEconCARPDMS,12mLmuestracon0.6
0.3
DCF,2,4,6TCF,2,3,4 g/mLNaCl,30mina100C GCMS 313 (1)
7.7
TCF) SPME2:HSSPMEconPDMS,12mLmuestracon0.6g/mL
NaCl,30mina60C.
13clorofenoles(2,4
DCF,2,3,4TCF,2,4,6, SPMEdirectaconPA,2mLmuestraapH2,saturadacon 4.5
GCMS 525 (2)
TCF)enlixiviadosde NaCl,60mina40Cconagitacina500rpm. 5.2
suelos
Derivatizacin:1.2mLmuestra+50Ldepiridina(204
mg/L),fenantrenod10(0.1mg/L)y2,4Dd3(0.5mg/L)+
Pesticidascidos,entre 4.6
300mgNaCl,mezclar30min.Aadir5L GCMS 160 (3)
ellos2,4DCF,enagua 8.3
butilcloroformiato.Dejar24hreaccionando.
SPME:PDMS20minHSSPME.
10fenoles(2,4DCF, SPMEdirectaconPA,20mLmuestra,10%NaCl,pH4, 6.3
GCMS 5360 (4)
2,4,6TCF)enagua agitacin1000rpm,40mina35C. 11
Variosclorofenoles(2,4 HSSPMEconPA,7.5mLmuestra,50mMHCl,0.2MKCl, 3.6
GCFID 4060 (5)
DCF,2,4,6TCF)enagua 30mina80C. 4.7
Variosfenoles(2,4DCF) SPMEdirectaconPA,5mLmuestra,15%NaCl,40mina
GCFID 350 1.2 (6)
enagua 70C.
Derivatizacin:ExposicindelafibraPDMSDVBalHSdel
vialcon1.5mLclorurodepentafluorobencilo0.1%(v/v)
Variosclorofenoles(2,4 6.4
entolueno,20mina40C GCECD 105 (7)
DCF,2,4,6TCF)enagua 10.3
Extraccin:SPMEdirectacon3mLmuestra,2%(p/v)
K2CO3,agitacin,10mina40C.
SPME:SPMEdirectaconCarbowax/TPR100,4mL
muestra,30%NaCl,pH2.7,agitacin550rpm,40mina
8clorofenoles(2,4DCF, HPLC 1100 7.5
40C. (8)
2,4,6TCF)enagua DAD 2200 11.5
Desorcin:introducirfibraen60Lde5%polioxietileno
10laurilter10min.
(1)LlompartM,2002;(2)RibeiroA,2002;(3)HenriksenT,2001;(4)GuerraSimesN,2007;(5)PortilloM,2006;(6)Lanas
FM,2007;(7)BianchiF,2002;(8)MahugoSantanaC,2007.
1.2.Experimentosprevios
1.2.1.Identificacincromatogrfica
Laidentificacindelosanalitos,enelmtododeSPME,sellevacaboutilizandoeltiempo
deretencindelospicosregistrados,ascomolosespectrosdemasasobtenidosenfullscanparalos
74
compuestos derivatizados. Los clorofenoles y el triclosn presentan en su estructura un grupo

hidroxiloelcualessusceptibledesufrirunareaccinconelagentesililantedandolugaraunterde
siliciocon114unidadesdemasasobreelpesomoleculardelanalitodepartida,figuraI.1.

FiguraI.1.ReaccinentreeltriclosnyelMTBSTFA.
CH3
H 3C C H3
Cl OH O Si
Cl O CH3
Si CH 3
O
N O
+ CF3
CH 3
C H3 CH3
Cl Cl Cl Cl
Triclosn MTBSTFA Triclosnsililado

Elcompuestotertbutildimetilsililado,alentrarencontactoconlafuentedeionizacin,da
lugar a un fragmento caracterstico de m/z [M57]+, correspondiente a la prdida del grupo tert
butilo.Debidoalapresenciadetomosdecloroenlasmolculasdelosanalitos,seobtuvoelpatrn
de fragmentacin derivado de la abundancia isotpica de este elemento. Para el cloro elemental
existendosistoposenlanaturaleza:el 35Clyel 37Cl,conabundanciasrelativasde75.77%y24.23
%,respectivamente.Dadoqueestamosconsiderandocompuestosdiclorados(2,4DCF)ytriclorados
(2,3,4TCF,TCSyMTCS),losionesdefragmentacin[M57]+y[M+257]+presentarnabundancias
relativas 3:2 para el caso de compuestos diclorados y 1:1 para los triclorados. En la figura I.2 se
puedenobservarlosespectrosdemasasdelosanalitosconsiderados.
FiguraI.2.Espectrosdemasasparael2,4DCF,2,3,4TCFyTCSderivatizados,yelMTCS.
219 Cl Si+
100% O
253 255 Cl
Cl 100% O
Si+
Cl
75% 221 Cl
Si+
O 75%
50% Cl Cl Si
183 O 50% Cl
Si+ Si
Cl O 257 Cl O
Cl
25% Cl Cl
185 25%
[M.]+276+278 217
183 219 [M.]+310+312
0%
0%
175 200 225 250 m/z 200 225 250 275 300 m/z

75
[M.]+302+304
302 304
100% 347
O 100% 345
O +
Cl OMe
Si+
Cl Cl O Cl O
75% 252
Cl Cl
75% O
Cl Cl
50% OMe 254 200
50% Si+
O O
306 Si+ 349 Si
+ O Cl O Cl O
Cl
O O
25% 232 Cl
25% 202
267 Cl Cl Cl
234 310
312 [M.]+402+404
0% 0%
230 250 270 290 310 m/z 200 250 300 350 m/z

En base a estos primeros experimentos, se establecieron los parmetros de identificacin
delosanalitos,utilizandocomotcnicadedeteccinGCMS,tablaI.2.

TablaI.2.ParmetrosdeidentificacinenGCMSparatriclosnycompuestosrelacionados.
Ionesidentificacin Intensidades
Tr(min)1 Ionescuantificacin(m/z)
(m/z) relativas(%)
219 100
2,4DCF 17.01 219+221 221 73
183 24
253 90
255 100
2,3,4TCF 19.51 253+255
257 37
217 10
302 93
304 100
MTCS 22.64 302+304
252 41
232 11
345 95
347 100
TCS 24.73 345+347 349 36
310 7
200 28
1
ColumnatipoCPSil8LowBleed
76

1.2.2.EvaluacindelaviabilidaddelmuestreomedianteSPMEconderivatizacinonfiber
Inicialmente,seevalulaposibilidadderealizarlaextraccinmedianteSPMEylaposterior
derivatizacinonfiberconMTBSTFA.Paraello,enunvialde22mL,sedepositaron20mLdeagua
ultrapura con adicin de un patrn en metanol que contiene triclosn, metiltriclosn, 2,4
diclorofenol y2,3,4triclorofenol, de modo que la concentracin aproximada fue de 5 ng/mL en la
muestra.Serealizelmuestreoporinmersinconagitacina500rpm,conunagitadormagntico
recubierto de tefln, durante 15 minutos. Para las pruebas preliminares, se seleccion la fibra de
poliacrilato (PA) debido a que su naturaleza polar hace que sea adecuada para la extraccin de
fenolesporinmersin[RibeiroA;2002].Traselmuestreo,lafibraseexpusoalespaciodecabezade
un vial de 1.5 mL conteniendo 50 L de MTBSTFA durante 20 minutos a 40 C, utilizando las
condiciones de derivatizacin descritas previamente por Rodrguez y colaboradores para anti
inflamatorioscongruposcarboxlicos[RodrguezI;2004].Trasesetiempo,lafibrasedesorbienel
puerto de inyeccin del sistema GCMS. Los experimentos, llevados a cabo por cuadruplicado,
mostraronunavariabilidadenlasealparaloscompuestosderivatizadosinferioral7%,tablaI.3.
Porotraparte,seevalusiduranteesteprocesoelmetiltriclosnsufraalgntipodedegradacin.
Laconclusinfuequesurespuestanosemodificabaporlapresenciadelderivatizante.

TablaI.3.Repetibilidaddeextraccin(N=4)yderivatizacinonfiberpara2,4DCF,2,3,4TCF,MTCSy
TCS.
Compuesto RSD(%)
2,4DCF 1.8
2,3,4TCF 5.0
MTCS 4.2
TCS 6.2
En los cromatogramas de GCMS se han encontrado seales intensas que correspondena

especiestertbutildimetilsililadas,figuraI.3.Porotraparte,nohubopresenciadeloscompuestossin
sililar,loqueimplicaqueelprocesodederivatizacinenlafibraescuantitativo.

77
Figura I.3. Cromatograma de GCMS para una muestra de agua (5 ng/mL) extrada con SPME y
derivatizacinonfiber.
219 1 255
MCts
100% 100% 2
75% 75% 4
6 50%
183 50%
25% 25% 217
0% 0%
183 3 TCS
175 200 225 250 m/z 200 225 250 275 300
5 m/z
MTCS
302 347
100% 3 100% 4
4 75% 252 75%
50% 50% 200
25% 232 25%
267 310 387
3 0% 0%
230 250 270 290 310m/z 200 250 300 350 m/z
2
2
2,3,4TCF
1
1 2,4DCF
0
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
minutos

1.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber
Unavezdemostradalaviabilidaddelprocesodederivatizacinonfiberdeloscompuestos
objeto de estudio, se ha llevado a cabo la optimizacin sistemtica de las distintas variables que
pueden afectar a la eficacia del proceso de preparacin de muestra con objeto de maximizar su
rendimiento.
Enprimerlugar,seestudiaronlosfactoresquepuedenafectaralaeficaciadeextraccin,
manteniendolascondicionesdederivatizacinusadasenlaspruebaspreliminares(exposicindela
fibraalespaciodecabezadeunvialconteniendo50LdeMTBSTFAdurante20minutosa40C).
Para estos experimentos, el nivel de adicin de 2,4DCF, 2,3,4TCF, TCS y MTCS a las muestras de
agua se fij en 10 ng/mL, y el tiempo de muestreo, salvo que se indique lo contrario, fue de 30
minutos.
1.3.1.Mododemuestreo

Laposicindelafibraesunodelosparmetrosmsimportantesalahoradeoptimizarun
mtododeSPME.Losmodosdemuestreoevaluadoshansido:
78
o Muestreoporinmersin(directo)atemperaturaambiente
o Muestreoenespaciodecabeza(HS)atemperaturaambiente
o MuestreoenHSa100C.
Para identificar el modo de muestreo que permite obtener las mayores eficacias de
extraccin,sellevaronacabounaseriedeexperimentosexponiendolafibradepoliacrilatodurante
30 minutos a 15 mL de agua ultrapura ajustada a pH 2 con HCl 0.1 M, en viales de 22 mL. Los
resultadosobtenidossemuestranenlasiguientefigura,figuraI.4.
FiguraI.4.Sealrelativaparalosdiferentesmodosdemuestreoconsideradosfrentealmuestreopor
inmersin.
6
Sealrelativaalmuestreopor
5
2,4DCF
4
inmersin
2,3,4TCF
3
TCS
2
MTCS
1
0
Inmers i n HSa TAmb HSa 100C
En el grfico anterior se puede observar que, con la excepcin del metiltriclosn que
presentaunarespuestaelevadaparaelmuestreoenespaciodecabezaa100C,lamejoropcines
efectuarelmuestreoporinmersin,atemperaturaambiente.Puestoqueelobjetivodeltrabajoes
ladeterminacinconjuntadeloscuatrocompuestos,seseleccionelmuestreoporinmersinpara
proseguirelestudio.
1.3.2.Comparativadedistintasfases
Laseleccindelafaseextractanteesunparmetroimportantealahoradedesarrollarun
mtododeSPME,yaquelaeficaciadeextraccinseveclaramenteafectadaporlanaturalezadel
recubrimientodelafibra.
La eleccin previa de la fibra de poliacrilato (PA) se ha hecho en base a las propiedades
polares que presenta este polmero, que lo hacen adecuado para la extraccin de clorofenoles,
aunquelascaractersticasdeltriclosny,especialmente,delmetriltriclosn,menospolaresquelos
79
clorofenoles, sugieren la posibilidad de utilizar otras fases. Las fibras estudiadas, as como las
temperaturasyeltiempodedesorcinempleadossemuestranenlasiguientetabla,tablaI.4.
TablaI.4.Fibrasutilizadas.
Faseest. Espesor(m) Toperacin Tdesorcin Tiempodesorcin
PDMS 100 200270C 260C 3min
PDMSDVB 65 200270C 260C 3min
PA 85 200310C 270C 3min
CARPDMS 75 240300C 270C 3min
CWDVB 65 220250C 220C 3min
Los experimentos se llevaron a cabo exponiendo las fibras directamente a 20 mL deagua

ultrapura,conadicindeloscompuestos(10ng/mL),durante30minutos.Losresultadosobtenidos,
figura I.5, muestran que las fibras de PA, CWDVB y PDMSDVB, con caractersticas polares y
semipolares, son las que presentaron mejores resultados para la extraccin conjunta de los
compuestos.

FiguraI.5.RespuestasnormalizadasconrespectoalafibradePAparalasdistintasfasesevaluadas
(N=3).
PA PDMS CWDVB PDMSDVB CARPDMS

RespuestanormalizadarespectoaPA
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS Res pues ta
promedi o
Compues to
Porotraparte,lafibradePDMStambinproporcionbuenosresultadosparaeltriclosny,
sobre todo, para el metiltriclosn, pero, en cambio, el rendimiento de la extraccin fue muy bajo
paralosclorofenoles,observandouncomportamientoinversoenelcasodelafibradeCARPDMS.El
80
triclosn y el metiltriclosn presentan constantes de particin octanolagua elevadas (4.8 y 5.4)

frentealosclorofenoles(2.99y3.66),demodoquelautilizacindefasesdecaractersticasapolares,
como es el caso de PDMS, favorece la extraccin de aquellos compuestos ms lipoflicos. Por otra
parte, la fibra de CARPDMS posee una naturaleza bipolar debido a la combinacin de ambos
polmeros. Esta fibra presenta mayor afinidad por los compuestos de menor tamao (2,4DCF y
2,3,4TCF), ya que la relacin entre el tamao molecular de los analitos y el tamao de poro del
carboxeninfluyeenormementeenlacapacidaddeadsorcindeestepolmero.Lasfasespolimricas
denaturalezapolar,PAyCWDVB,ylafibradePDMSDVB(semipolar),resultaronadecuadasparala
extraccinconjuntadeloscuatroanalitos.Finalmente,seseleccionaronlasfibrasdePDMSDVByPA
paracontinuarelestudio,descartandolafibradeCWDVB,debidoaquevariosautoreshandescrito
problemas de estabilidad para este recubrimiento, adems de que no aporta ventajas adicionales
respectoapoliacrilatoyPDMSDVB[AlzagaR;2003][RodrguezI;2003].
1.3.3. Optimizacin de las condiciones de muestreo con poliacrilato y PDMSDVB:

Influenciadelaagitacin,fuerzainicadelmedioypH
Utilizando el programa estadstico Statgraphics 5.1, se evalu la influencia de estas tres

variables en la eficacia de la SPME mediante un diseo factorial 23, con 2 puntos centrales. Los
valoresdeestasvariablesenlosdistintosexperimentosfueronlosindicadosenlatablaI.5.Comose
puedecomprobar,entodosloscasos,elpHsemantienepordebajodelpKadeloscompuestos.Los
experimentosdescritosenlatablaI.5sellevaronacaboconambasfibras,empleandomuestrasde
agua ultrapura (15 mL) con adicin de los compuestos a 10 ng/mL. Los resultados obtenidos para
cadaunodelosanalitossegnlafaseutilizada,semuestranenlatablaI.5.
TablaI.5.Experimentosrealizadosparaevaluarlascondicionesptimasdeextraccinparalasfibras
dePAyPDMSDVB.Respuestasobtenidasenreasdepico.
Agitacin PA(readepicox104) PDMSDVB(readepicox104)
Exp. NaCl(g) pH
(500rpm) DCF TCF MTCS TCS DCF TCF MTCS TCS
1 2.0 Sin 4.5 18 26 60 29 50 46 233 77
2 0.0 Sin 6.0 102 160 182 119 89 109 237 88
3 0.0 Sin 3.0 64 98 273 67 128 158 252 118
4 4.0 Sin 3.0 90 130 99 84 68 92 184 124
5 0.0 Con 6.0 334 960 1900 492 691 992 2234 913
6 2.0 Con 4.5 88 139 904 529 255 126 1075 730
81
Agitacin PA(readepicox104) PDMSDVB(readepicox104)

Exp. NaCl(g) pH
(500rpm) DCF TCF MTCS TCS DCF TCF MTCS TCS
7 4.0 Con 6.0 83 126 467 95 307 184 464 610
8 0.0 Con 3.0 299 763 1248 586 749 1065 2630 1026
9 4.0 Sin 6.0 120 189 51 170 105 106 226 148
10 4.0 Sin 3.0 522 865 226 529 856 1141 580 628
Traseltratamientodelosdatos,conelpaqueteestadsticoStatgraphics5.1,seobtuvieron
loscoeficientesestandarizadosparalosefectosprincipalesasociadosconlosfactoresconsiderados,
tablaI.6.Estoscoeficientesestimanelefectodeunfactordadoenelrendimientodelaextraccin
paracadacompuesto.Suvalorabsolutoesproporcionalalainfluenciadelcorrespondientefactoren
elprocesodeSPME.Unsignopositivo,indicaunincrementoenlaeficaciadeextraccincuandoel
factorcambiadelnivelbajoalaltoeneldominiodeldiseo,mientrasqueelsignonegativoindicaun
comportamientoopuesto.
Latendenciafuesimilarparaambasfibras:laagitacinresultserelfactormsimportante
conunefectopositivoenlaeficaciadelaextraccin,sobretodoparaloscompuestosmslipoflicos
(TCS y MTCS), probablemente debido a sus bajos coeficientes de difusin en agua. La adicin de
clorurosdicoprovocunadisminucindelasealparatodosloscompuestos,siendosignificativa
(95%confianza)paraelMTCSconambasfasespolimricas,yparaelTCSconPDMSDVB.Porltimo,
el pH parece ejercer un efecto negativo aunque no significativo en la extraccin. En base a estos
resultados, el pH se fij en 4.5 unidades, un valor intermedio en el dominio del diseo, para
asegurarsedequeloscompuestosestnenformaprotonada(2unidadespordebajodesupKa).La
agitacin, dado que mejora significativamente la eficacia de extraccin se mantuvo en 500 rpm
duranteelmuestreo.
TablaI.6.Coeficientesestandarizadosdelosefectosprincipalesparalosfactoresconsideradosenla
optimizacindelprocesodeSPMEutilizandoPAyPDMSDVB.
PA PDMSDVB

DCF TCF MTCS TCS DCF TCF MTCS TCS
Agitacin 2.1 2.3 12.0a 9.5a 3.2a 2.3 8.7a 26.0a
NaCl 0.02 0.07 9.1a 1.8 0.5 0.7 6.5a 5.5a
pH 0.8 0.4 2.5 0.9 0.9 0.9 0.6 1.2
a
Factoresestadsticamentesignificativosparaunniveldeconfianzadel95%
82
Dentro del rango estudiado en el diseo, la adicin de sal provoc una reduccin en las
respuestasdelosanalitos.EnconcretoparaelcasodelMTCS,conambasfibras,yparaelTCS,conla
fibradePDMSDVB,elefectofueestadsticamentesignificativo.Desdeelpuntodevistacinticola
sal ralentiza la difusin de los analitos desde la muestra a la fibra, sobre todo para las especies
lipoflicas.Porotrolado,atendiendoalatermodinmicadelaSPME,deberaresultarpositivapara
especiespolaresynoinicas(porejemplo,el2,4DCFyel2,3,4TCF).Portanto,antesdefijarelvalor
ptimodeestefactor,sereevalusuefectoadiferentesniveles.LafiguraI.6muestraque,incluso
paralosfenoles,laeficaciadeextraccin(usandolafibradePA)disminuyeconlaadicindecloruro
sdico.Portanto,seprescindidelaadicindesalparaexperimentosposteriores.
FiguraI.6.Efectodelasalenlaextraccindeloscompuestosmspolares(fibradePA).
2,4DCF 2,3,4TCF TCS
2000
1500
reas(x10 )
4
1000
500
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
NaCl(g/mL)
1.3.4.Volumendemuestra
El volumen de muestra est relacionado con la sensibilidad del mtodo, de modo que se
consiguelacantidadmximadeanalitoenlafibracuandosellegaaldenominadovolumeninfinito.A
partir de este punto, la cantidad de analito extrada es independiente del volumen de la muestra
empleadoyvienedadopor
n=KfsVfC0

Paraevaluarlainfluenciadeestavariableenlaeficaciadeextraccinserealizaronunaserie
deexperimentosutilizandovolmenesdemuestrade10,20y110mL,envialesde11,22y120mL,
conteniendo la misma concentracin de los analitos (10 ng/mL) y considerando un tiempo de
extraccinde30minutosparaambasfibras(PAyPDMSDVB),figuraI.7.Talcomosepuedeobservar
enlagrfica,nohaydiferenciassignificativasentrelosvolmenesde10y20mLparaambasfibras.
83
Para100mLdeagua,seapreciunapequeadisminucinenlaseal,principalmenteparaelTCSy
MTCS con la fibra de PA. Este comportamiento puede deberse a problemas de agitacin y, por lo
tanto,unadifusinmenoseficazdelosanalitoshacialafibra.
Elvolumendemuestrautilizadoenexperimentosposterioresfuede20mL,noobstanteen
elcasodedisponerdepocamuestra,sepuedereducira10mL.
FiguraI.7.InfluenciadelvolumendemuestraenlaeficaciadelaSPME(N=3).
10mL 20mL 100mL
7000
Seal(reasx10 )
6000
3
5000
4000
3000
2000
1000
0
24DCF 234TCF MTCS TCS 24DCF 234TCF MTCS TCS
PA PDMSDVB

1.3.5.Tiempodeextraccin
Uno de los aspectos a considerar en los mtodos de SPME es la influencia del tiempo de
extraccin en la cantidad de analito concentrado sobre la fibra. Hasta alcanzar condiciones de
equilibrio,elrendimientodelaextraccinaumentaconeltiempodeexposicinalamuestra.
Se realiz el estudio de la cintica de extraccin para ambas fibras, utilizando 20 mL de
agua, ajustada a pH 4.5, con un nivel de adicin de los compuestos de 5 ng/mL. Los tiempos de
extraccinestudiadosfueron5,10,30,45,60,90y120minutos.Posteriormente,seprocediala
derivatizacindelosanalitosretenidosenlafibra,exponindolaalespaciodecabezadeunvialcon
50LdeMTBSTFAdurante20minutosa40C,traslocualsedesorbienelinyectordelsistemaGC
MS.
En la figura I.8 se puede observar que tras dos horas de muestreo todava no se ha
alcanzadoelequilibrio.Porotraparte,cabedestacarlasimilitudenlosperfilesdeextraccindelos
compuestosconambasfibras.Laexcepcinfueel2,4diclorofenol,quepresentunamayoreficacia
deextraccinconlafibradePDMSDVBfrentePA,dentrodelintervalodetiempoestudiado.
84
Debidoaquenosealcanzaelequilibriotrasdoshorasdemuestreo,stehaderealizarse
bajocondicionescinticasparaqueelprocedimientodesarrolladoseaaceptabledesdeelpuntode
vista del tiempo dedicado a la preparacin de la muestra. Para ajustar la duracin de la etapa de
preparacindemuestra(extraccinyderivatizacin)aladeseparacincromatogrfica,selimitel
tiempodemuestreoa30minutos.
FiguraI.8.Cinticasdemicroextraccinparalosanalitosobjetodeestudio.
2,3,4TCF,PA 2,3,4TCF,PDMSDVB MTCS,PA MTCS,PDMSDVB
2500
2000
4
reasx10
1500
1000
500
0
5 10 30 45 60 90 120
Tiempo(min)

2,4DCF,PA 2,4DCF,PDMSDVB TCS,PA TCS,PDMSDVB
1600
1400
1200
4
reasx10
1000
800
600
400
200
0
5 10 30 45 60 90 120
Tiempo(min)
85
1.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin
El efecto del tiempo (1040 minutos), temperatura (4070C) y volumen de derivatizante

(20100L)enlasealanaltica(reasdepico)sehaestudiadoutilizandoundiseoexperimentala
2 niveles con 3 puntos centrales. La matriz de experimentos utilizada se muestra a continuacin,
tablaI.7.
Lasextraccionessellevaronacaboconmuestrasdeaguaultrapura,apH4.5,conadicinde
loscompuestosanivelde5ng/mL.Trasunmuestreode30minutos,seexpusolafibraalespaciode
cabeza de un vial conteniendo MTBSTFA, en las condiciones indicadas en la tabla I.7 para cada
experimento.Losresultadosobtenidos,enreadepico,semuestranenlasiguientetabla.
TablaI.7.Matrizdeexperienciasyresultadosobtenidosenlaoptimizacindeladerivatizacinon
fiber.
Tiempo PA(readepicox104) PDMSDVB(readepicox104)
Exp. T(C) Vol.(L)
(min) DCF TCF MTCS TCS DCF TCF MTCS TCS
1 55 25 60 136 576 1602 780 316 549 1290 590
2 70 10 20 155 520 1255 632 263 473 1125 488
3 40 40 100 165 691 1762 904 341 526 1344 559
4 70 40 100 56 393 1107 532 149 417 1212 504
5 40 40 20 211 619 1276 670 372 554 1299 550
6 40 10 20 181 521 1276 547 498 701 1759 771
7 70 10 100 117 471 1088 602 319 562 1401 606
8 55 25 60 129 556 1158 742 383 651 1750 712
9 70 40 20 91 527 1438 716 219 566 1724 711
10 40 10 100 193 596 1401 685 436 618 1355 609
11 55 25 60 144 514 1198 617 399 651 1613 681
Tras el tratamiento estadstico de los datos, se obtuvieron los valores de los coeficientes
estandarizadosparalosefectosprincipalesylasinteraccionesdeordendosentrefactores,figuraI.9.
Slo se encontraron factores estadsticamente significativos (95 % confianza) para el 2,4DCF y el
86
2,3,4TCF.Enelcasodeltriclosn,ningnfactorafectalaeficaciadeladerivatizacin,mientrasque
paraelmetiltriclosn,talcomoeslgico,nohubovariacindelasealdelmismo,figuraI.9.
Para el 2,3,4TCF y sobre todo para el 2,4DCF, el tiempo y la temperatura afectaron
significativa y negativamente a las respuestas obtenidas para ambas especies, lo cual puede ser
explicadoporunadesorcinparcialdeestoscompuestosdurantelaexposicindelafibradeSPME
alagentederivatizanteatemperaturaselevadas.

Figura I.9. Carta Pareto correspondiente a la optimizacin de las condiciones de derivatizacin on
fiber,usandoMTBSTFA,paralasfibrasdePAyPDMSDVB.
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS
BC
AC
PDMSDVB
AB
C:T
B:MTBSTFA
A:Tiempo
BC
AC
AB
PA
C:T
B:MTBSTFA
A:Tiempo
10 8 6 4 2 0 2 4
Efectosestandarizados
Porotraparte,lainteraccintiempotemperatura(AC)yvolumendeMTBSTFAtemperatura
(BC)influyerontambindemodonegativoenlassealesobtenidasparaalgunoscompuestosconla
87
fibra de PA. Este comportamiento sugiere de nuevo la posibilidad de prdidas en la etapa de

derivatizacinatiemposytemperaturaselevadas,ademsdedesplazamientodelosanalitosporel
agentederivatizante,figuraI.10.
FiguraI.10.Grficosdeinteraccionesparael2,4DCFyel2,3,4TCFconlafibradePA.
Interacciones2,4DCF Interacciones2,3,4TCF
220 670
2,3,4TCF(reax104)
2,4DCF(reax104)
190 630

590
160
+
550 +
+ + +
130 +
510 +
+
100 470
+ +
70 + 430 +
10.0 40.0 10.0 40.0 20.0 100.0 10.0 40.0 10.0 40.0 20.0 100.0
AB AC BC AB AC BC
En vista de los resultados anteriores, el tiempo y el volumen de derivatizante se

mantuvieronensusvaloresbajos(10minutosy20LdeMTBSTFA,respectivamente)conobjetode
minimizarladuracindelmtodopropuestoademsdelconsumodederivatizante.Alobservarque
unamenortemperaturaredundabaenmayoresrespuestas,serealizaronpruebasadicionalespara
evaluarlaviabilidaddellevaracaboladerivatizacinonfiberatemperaturaambiente,figuraI.11.
FiguraI.11.Derivatizacinonfiberatemperaturaambienteversus40C(N=3).
40C TAmbiente
1800
1600
1400
4
reasx10
1200
1000
800
600
400
200
0
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS
PA PDMSDVB
Tanto los valores medios de las respuestas obtenidas como sus coeficientes de variacin,
fueron similares en ambas condiciones para las dos fibras. Por conveniencia, en experimentos
posteriores,laderivatizacinsellevacaboatemperaturaambiente,evitandoaslanecesidadde
88
utilizarsistemasdecontroldetemperatura.Porlotanto,lascondicionesfinalesdederivatizacinon
fiber fueron 20 L de agente derivatizante (MTBSTFA), temperatura ambiente (20 2C) y 10
minutos,paraambasfibras.
1.3.7.Evaluacindelosefectosdememoria
Despus de la desorcin de la fibra, en el puerto de inyeccin del cromatgrafo, pueden

quedarrestosdelosanalitosenlafasepolimricaquedaranlugaraproblemasdecontaminacin
en el anlisis de la siguiente muestra. Por esa razn, es necesario evaluar si la temperatura y el
tiempodedesorcinutilizadossonsuficientesparaeliminarcompletamentelosanalitosdelafibra.
Traslarealizacindeunmuestreosobreaguaconunniveldeadicindelosanalitosdelordende3
ng/mL, con posterior derivatizacin e inyeccin en un GCMS, se desorbi de nuevo la fibra para
determinarlosposiblesrestosdelosanalitossobrelamisma.Adems,paraponerdemanifiestola
presencia de especies sin derivatizar en el recubrimiento, se repiti el experimento anterior pero
exponiendolasfibrasdenuevoaunafraccinfrescadelagentederivatizante,antesdelasegunda
desorcin.Losporcentajesdeseal,respectoalaprimeradesorcindelafibra,semuestranenla
tablaI.8paraambasfibras.
TablaI.8.SealrelativaenlasegundadesorcindelasfibrasdeSPME.
%Seal PA PDMSDVB
relativa 24DCF 234TCF MTCS TCS 24DCF 234TCF MTCS TCS
2desorcin 0.0 0.0 0.4 0.9 0.0 0.0 0.7 0.9
Derivatizacin
0.0 0.0 0.5 1.2 0.0 0.0 1.3 1.7
+2desorcin
Enprimerlugar,cabedestacarlasimilitudentrelosresultadosobtenidosparalasdosfibras.
Se puede observar que, tras tres minutos de desorcin, se eliminaron completamente los analitos
msvoltiles(2,4diclorofenoly2,3,4triclorofenol)mientrasqueparaelmetiltriclosnyeltriclosn
los efectos de memoria representaron entre el 0.4 y el 1.7 % de sus reas de pico en la primera
desorcin. Las seales relativas en la segunda desorcin fueron similares tanto considerando la
etapaadicionaldeexposicinalagentederivatizantecomosinconsiderarla,loqueindicaqueestas
seales proceden de restos de los analitos derivatizados remanentes en la fibra despus de su
desorcindurante3minutosa270C(PA)y260C(PDMSDVB).
89
Paraminimizarlosefectosmemoria,traslaprimeradesorcin,lasfibrassesituaronenel
inyector de otro sistema cromatogrfico a la misma temperatura de desorcin (270C para PA y
260CparaPDMSDVB)duranteotrostresminutos.Trasestasegundadesorcin,nosedetectaron
problemasdecontaminacincruzada.
1.3.8.Efectosdematriz

Cuandounmtodoanalticoesaplicadoamuestrasreales,lasealobtenidapuedevariar
en funcin de la matriz analizada. Concretamente en la tcnica de SPME, puede producirse una
disminucindelacantidadextradaalaumentarlacomplejidaddelamuestra.
Paraevaluarlaposibleexistenciadeefectosdematriz,serealizunaadicindelamezcla
delosanalitosencuatromatricesdistintas(aguaultrapura,aguadero,aguaresidualtratadaysin
tratar)anivelde3ng/mL.Elanlisisdelasmuestras,portriplicado,serealiztalcomosedetallen
la parte experimental. Los resultados para cada uno de los analitos segn la fibra seleccionada se
muestranacontinuacin,figuraI.12.Enelcasodelasaguasresidualessesustrajo,alasealdelas
muestrasconadicin,elcorrespondienteblanco(muestrasinadicin).
FiguraI.12.Comparacinderespuestas(%sealrelativaaaguaMilliQ)utilizandodistintasmatrices
acuosas(N=3).
MilliQ Ro Efluente Influente MilliQ Ro Efluente Influente
140% 140%
Porcentajerelativo(PDMSDVB)
120% 120%
Porcentajerelativo(PA)
100% 100%
80% 80%
60% 60%
40% 40%
20% 20%
0% 0%
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS
Compuesto Compuesto

90

Engeneral,estasfigurasnosmuestranquelaeficaciadelaextraccinnoseveafectadapor
la naturaleza de la matriz, con lo cual no es necesario realizar adiciones a cada muestra, para
cuantificarlosnivelesdeestoscompuestosenlosdistintostiposdeagua.
1.4.Caracterizacindelmtodoanaltico

El mtodo analtico desarrollado, figura I.13, ha sido caracterizado en lo referente a
linealidad, lmites de cuantificacin y exactitud, considerando como tcnica de deteccin la
cromatografadegasesacopladaaespectrometrademasas(GCMS).

FiguraI.13.EsquemadelprocesodeSPMEparaladeterminacindeTCS,MTCS,2,4DCFy2,3,4TCF
enagua.
FibradePA PDMSDVB
20mL muestrapH4.5 Derivatizacinonfiber
MuestreoporinmersinaT.A. 20LMTBSTFA,
Agitacina500rpm HS,10min
30min
1.4.1.Linealidad
Se procedi al estudio de la linealidad en las respuestas de los compuestos objeto de

estudioparamuestrasconadicin,anivelesdeconcentracincomprendidosentre0.03ng/mLy10
ng/mL.Serealizaronsietenivelesdeadicinenelrangoanteriordeconcentracionessobreaguaa
pH4.5.EnlatablaI.9,semuestranlasecuacionesdelasrectasdeadicinobtenidasparacadauno
de los analitos con ambas fibras, y sus coeficientes de determinacin (R2). Como se puede
comprobarlarespuestasemantuvolinealenelrangoevaluado.
91
Tabla I.9. Rectas de calibrado y coeficientes de determinacin obtenidos con las dos fibras
estudiadas,utilizandocomotcnicadedeterminacinGCMS.
PA PDMSDVB
Ecuacin Y=180602X+5902 Y=409714X+37951

2,4DCF
2
R 0.999 0.999
Ecuacin Y=412432X+23768 Y=470739X+22327
2,3,4TCF 2
R 0.996 0.999
Ecuacin Y=791457X51462 Y=829610X1374
MCTS 2
R 0.998 0.999
Ecuacin Y=836108X10920 Y=837032X+21116
TCS
R2 0.999 0.999
1.4.2.Lmitesdecuantificacin

Los lmites de cuantificacin (LOQs) se definen como la cantidad mnima de analito que
puede ser cuantificada con fiabilidad, correspondiente a una relacin S/N de 10. Los lmites de
cuantificacin obtenidos para el mtodo desarrollado con deteccin por GCMS son los que se
muestranenlatablaI.10.
Tabla I.10. Lmites de cuantificacin para el mtodo desarrollado utilizando como tcnica de
determinacinGCMS.
Fibra 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS
LOQ PA 7 2 2 1
(ng/L) PDMSDVB 4 2 2 1
ComparandolosLOQsdelametodologadesarrolladaenestaTesisDoctoral,frenteaotras
basadas en la SPME para la determinacin de clorofenoles en agua, se observa que utilizando la
mismafibraymododemuestreosonequivalentesoinclusoinferioresquelosobtenidosporotros
autorestalcomoseapreciaenlatablaI.1delpresentecaptulo[GuerraSimesN;2007][RibeiroA;
2002].

92
1.4.3.Repetibilidaddelproceso
Serealizunestudioderepetibilidaddelprocesodemuestreoyderivatizacinparalasdos
fibras evaluadas, utilizando como tcnica de determinacin GCMS. Para ello, se analizaron, por
quintuplicado,muestrasde20mLdeaguaultrapuraapH4.5,conadicindelosanalitosanivelde
0.5ng/mL.Losresultadosobtenidossemuestranacontinuacin,tablaI.11.
TablaI.11.EstudioderepetibilidadutilizandocomotcnicadedeterminacinGCMS(N=5).
PA(CV%) PDMSDVB(CV%)
Adicinenagua
Ndeciclosdeextraccinprevios
(ng/L)
15 70 0 40 60
2,4DCF 490 7.2 9.5 8.0 18.2 17.2
2,3,4TCF 488 7.6 10.3 7.8 15.8 17.4
MCTS 519 9.2 6.8 6.4 23.3 21.1
TCS 497 8.7 8.0 5.9 21.3 17.5

La variabilidad obtenida con la fibra de PA es inferior, en todos los casos a 10 %, sin
embargo se observa que hay una prdida de repetibilidad al aumentar el nmero de ciclos de
extraccinderivatizacin para la fibra de PDMSDVB. Este comportamiento podra ser debido a la
obturacin de los poros del polmero de DVB debido a especies poco voltiles coextradas,
incrementandoaslavariabilidaddelosresultados.
1.4.4.ExactituddelmtododeSPME
LaexactituddelmtododeSPMEseevaluconunamuestradeaguaresidualsobrelacual
sepracticunaadicindelosanalitosanivelde1ng/mL.Paralaextraccindelamuestraseemple
la fibra de PA en las condiciones seleccionadas, tanto para la muestra sin adicin como para la
muestraconadicin.Unavezrestadalasealparalamuestrasinadicin,secalcullarecuperacin
como la relacin (en tanto por cien) entre la concentracin encontrada y la concentracin terica
aadida.Losresultadosobtenidossemuestranenlasiguientetabla.
93
TablaI.12.ExactituddelmtododeSPME.Muestraconadicinde1ng/mL.
Aadido(ng/L) 941 986 940 989

Encontrado(ng/L) 98170 96448 98253 100562
Recuperacin% 104.3 97.8 104.5 101.6
94
SPMEaplicadaalaextraccindeParabenes
II. DETERMINACIN DE PARABENES EN AGUA MEDIANTE MICROEXTRACCIN EN FASE

SLIDA
2.1.Introduccin
En esta seccin de la memoria, se describe la aplicacin de SPME a la extraccin de los

steres alqulicos y benclicos del cido parahidroxibenzoico en muestras de agua. Previamente al
desarrollo de esta metodologa [Canosa P; 2006 B], slo exista una aplicacin de SPME para la
determinacindeparabenesenformulacionescosmticas.LokhnauthySnow[LokhnauthJK;2005]
llevaron a cabo la optimizacin de los parmetros que afectan a la microextraccin de estos
compuestos,utilizandolaespectrometrademovilidadinicacomotcnicadedeterminacin.Estos
autores,compararonvariasfibras(PDMSde100m,PDMSde7m,PAde85m,PDMSDVBde65
m y DVBCARPDMS de 50/30 m), considerando un tiempo de extraccin de 15 minutos. Los
mejoresresultados,enloreferenteaeficacia,fueronlosobtenidosconPA,PDMSDVByDVBCAR
PDMS, seleccionando finalmente la fibra triple ya que alcanz el equilibrio en 15 minutos para
muestras de cosmticos (50 mg) diluidas con 100 mL de agua. El pH del medio se mantuvo por
debajodel pKa de los compuestos y el porcentaje decloruro sdico se fij en un 20%. Aunque la
precisin obtenida con esta metodologa ha sido aceptable (RSDs inferiores a 7 %), sus lmites de
cuantificacin, del orden de 30 ng/mL, fueron muy superiores a los niveles presentes en aguas
residualesysuperficiales.Estohacequeseanecesarioeldesarrollodeunametodologamssensible
para muestras de agua. Con este fin, adems de derivatizar los analitos retenidos en la fibra, se
decidi utilizar la espectrometra de masas en tndem, acoplada a cromatografa de gases, como
tcnicadedeterminacin.

2.2.1.Eleccindelagentesililanteyestudiospreliminaresderepetibilidad
Losparabenessonderivadosfenlicossusceptiblesdesufrir,aligualqueeltriclosnylos
clorofenoles, una reaccin de derivatizacin cuando se ponen en contacto con un agente sililante.
Para poner de manifiesto el incremento de sensibilidad, as como la mejora en la forma de pico,
proporcionado por la derivatizacin se tom una alcuota de 500 L de un patrn de 2 g/mL en
acetato de etilo (de MeP, EtP, PrP y BuP), y se mezcl con 20 L de N(tertbutildimetilsilil)N
metiltrifluoroacetamida(MTBSTFA).Trascincominutosdereaccin,seinyect1Ldelamezclaen
elsistemaGCMS.Asmismo,sehainyectadoelpatrnsinprocederalaetapapreviadesililacin.
LoscromatogramasobtenidossemuestranenlafiguraII.1.
95

Figura II.1. Cromatograma reconstruido con los iones caractersticos del MeP, EtP, PrP y BuP sin
derivatizar(B;m/z121)ycomoderivadossililados(A,m/z209,223,237,251).ColumnaHP5MScon
12mesesdeuso.
251
100% BuPSilil
237 75%
100% PrPSilil
50%
75%
25% 151 195 235 309
50% 135
151 0%
kCts 100%
EtPSilil 223 25%
91 135 169
195 294
100 150 200 250 300
0% m/z
75% 100 150 200 250 300
50% m/z
151 177 195 235
25%
750
0%
100 150 200 250
280
300
m/z
A
MePSilil
500 100% 209
75%
50% 177
135 235
25% 91 266
195
0%
250 100 125 150 175 200 225 250 275
m/z
0
kCts EtP
100% 121
MeP 121
PrP
20
100%
75% 152
75%
50%
25%
93 138
100%
75%
121
138
149
B
50% 93 166
152 50%
25% 0% 93 177
100 120 140 160 180 m/z 25%
0%
15 100 120 140 160 0%
100 125 150 175 200
m/z m/z
100% 121 BuP

10 75%
138
50%
25% 93
149 177
5 0%
100 120 140 160 180
m/z
0
14 15 16 17 18 19 20 minutos

La eleccin del agente derivatizante se hizo en base a los espectros de masas
correspondientes a impacto electrnico, al utilizar bis(trimetilsilil)trifluoracetamida (BSTFA) o N
(tertbutildimetil)Nmetiltrifluroacetamida(MTBSTFA)comoagentessililante,figuraII.2.

96
FiguraII.2.EspectrosdemasasparalosparabenesderivatizadosconBSTFAyMTBSTFA.
BSTFA MTBSTFA
209 209
100% 177 100%
75% 224 75%
193 177
50% 50%
135
149 MeP 235
25% 195 25% 91 135 149 195
121 166 166 251 266
0% 0%
100 125 150 175 200 225 250 275
125 150 175 200 225 m/z m/z
193 223
100% 100%
75% 223 238
75%
195
50% 50%
151 EtP
210 235
135
25% 163 177 25% 135 151 195
105 163177 280
0% 0%
100 125 150 175 200 225 250 100 150 200 250 300
m/z m/z
195 237
100% 100%
210
75% 75%
50% 50%
151 PrP 151
25% 237 252 25% 195
169 91 135 169 294
135
0%
0%
100 150 200 250 300
125 150 175 200 225 250 m/z
m/z
195
100% 251
100%
210
75% 75%
193
50% 50%
151 BuP
25% 251 25% 151 235
169 135 195 309
135 169
0% 0%
100 125 150 175 200 225 250 100 150 200 250 300
m/z m/z
193 285
100% 100%
75% 75% 91
50% 50%
BzP 235
25% 91 25% 179
285 163 342
0%
0%
100 150 200 250 300 350
100 150 200 250 m/z m/z

Como se puede observar en la anterior figura, la utilizacin de BSTFA como derivatizante
proporciona espectros de masas con mayor fragmentacin (a excepcin del BzP) frente a la
utilizacindeMTBSTFA,dondeelpicobasecorrespondeconelindem/z[M57]+.Dadoqueesun
97
fragmento intenso, es posible seleccionarlo como in precursor a la hora de llevar a cabo la

optimizacin de los parmetros de masasmasas para la determinacin de los compuestos
estudiados.

Una vez seleccionado el agente derivatizante, se evalu la posibilidad de realizar la
extraccindeloscompuestosconlafibradepoliacrilato,previamenteutilizadaparalaextraccinde
triclosnyclorofenoles,ysuposteriorderivatizacinexponindolaalespaciodecabezadeunvial
conteniendoMTBSTFA.Laextraccinsellevacaboenunamuestradeaguaultrapura,apH4.5,con
adicindelosanalitos(20ng/mL),durante30minutosyconagitacina500rpm.Traslaextraccin,
seprocedialaderivatizacinonfiberdeloscompuestosexponiendolafibraalespaciodecabeza
de un vial conteniendo 20 L de MTBSTFA, durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los
resultadosobtenidosmostraronunavariabilidadinferior al11%paratodosloscompuestos,tabla
II.1.
TablaII.1.Repetibilidad(%RSD)delprocesoSPMEconderivatizacinonfiber(N=5rplicas).Pruebas
preliminares.
MeP EtP PrP BuP BzP
11.0% 8.4% 4.8% 4.4% 5.2%
2.2.2.Identificacincromatogrfica
Laidentificacindelospicoscromatogrficoscorrespondientesalosanalitosestudiadosse
realiz considerando sus tiempos de retencin, as como los espectros de MS y MS/MS para sus
derivadostertbutildimetilsililados.ParalaoptimizacindelascondicionesdeMS/MSseinyectun
patrnenacetatodeetilo,conunaconcentracinde0.5g/mLparacadacomponente,derivatizado
con 50 L de MTBSTFA. Con ayuda de la herramienta de desarrollo automatizado de mtodos
(Automated Methods Development, AMD) se optimizaron los parmetros que afectan a la
fragmentacin, como son el nivel de almacenamiento de excitacin o excitation storage level y la
amplituddeexcitacin.EnelcasodelMeP,EtP,PrPyBuPlosespectrosdeMS/MSpresentaronun
patrn de fragmentacin similar, correspondiente a la sustitucin de la cadena alqulica por un
protn(sealesam/z195)seguidodeprdidasdeCO2(sealesam/z151),y/oagua(sealesam/z
177),figuraII.3.Paraelbencilparaben,sufragmentacinresultmscompleja,presentandounin
productoa241correspondientealaprdidadeCO2apartirdelinprecursor(m/z285).Unsegundo
in producto de m/z 163 procede de la prdida del anillo aromtico (78 unidades) y CO2 (44
unidades),figuraII.3.

98

Figura II.3. Espectros de masasmasas obtenidos para los parabenes, tertbutildimetilsililados, en
modoresonante.

MeP 177 EtP 177
100%
100%
75% 151 195
75%
50% 163
50%
25%
25% 135 169 223 235
135 149 166 195 205
121 181 209 0%
0%
125 150 175 200 225 m/z
125 150 175 200 m/z

PrP BuP
151 151
100% 100%
195
195
75% 75%
50% 235 50%
25% 237 251
133 163 177 25% 123133 169
123 213 177
0% 0%
100 150 200 250 100 150 200 250
m/z m/z
BzP 163
100% 241
75%
50%
285
25% 225
0%
150 200 250 300
m/z

LostiemposderetencinylascondicionesdedeteccinenMSyMS/MSsemuestranenla
siguientetabla.
TablaII.2.TiemposderetencinyparmetrosdeMS/MSparaladeterminacindeparabenes.
In Nivelde Iones
Amplitudde Ionesproducto
Tr(min)1 precursor almacenamiento cuantificacin
excitacin(V) (m/z)
(m/z) (m/z) (m/z)
MeP 15.80 209 92 0.5 195,177,149 177
EtP 16.58 223 98 0.5 195,177,163,151 195+177+151
PrP 17.60 237 104 0.5 195,163,151 195+151
BuP 18.62 251 110 0.5 195,151 195+151
BzP 22.37 285 90 0.4 241,225,163 241+163
1
ColumnaHP5MS
99
2.3.OptimizacindelprocesodeSPMEconderivatizacinonfiber

Los distintos parmetros que afectan al proceso de SPME se han optimizado de modo
sistemticoparaobtenereficaciasdeextraccinadecuadasparaladeterminacindeparabenesen
muestras acuosas a niveles de las partes por trilln (ng/L). En todos los ensayos realizados, se
emple agua ultrapura con adicin de los compuestos a nivel de 2 ng/mL, manteniendo las
condicionesdederivatizacinutilizadasenlaspruebaspreliminares.
2.3.1.RecubrimientodelafibradeSPME
Seestudilaeficaciadeextraccindecincofibras(PDMS,PDMSDVB,PA,CARPDMSyCW
DVB)paralaconcentracindeparabenesenmuestrasdeaguaajustadasapH2.5.Laextraccinse
llev a cabo en la modalidad de inmersin, durante20minutos, a temperatura ambiente. Al igual
queenelcasodeltriclosn,setuvoencuentaelrangodetrabajodelasfibrasparaseleccionarla
temperatura del puerto de inyeccin, considerando para todas ellas un tiempo de desorcin de 3
minutos(tablaI.4deestecaptulo).LosresultadosobtenidossemuestranenlafiguraII.4.
Figura II.4. Eficacias de extraccin para las fibras de PDMS, PDMSDVB, PA, CARPDMS y CWDVB.
SealrelativaalafibradePA.
PA PDMSDVB PDMS CARPDMS CWDVB
SealnormalizadarespectoaPA
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
MeP EtP PrP BuP BzP

Como se puede comprobar, las respuestas ms elevadas corresponden a PA, seguida de
CARPDMS (excepto para BzP) y PDMSDVB. Estos resultados fueron comparables a los obtenidos
porLokhnauthycolaboradores,paraelanlisisdeparabenesenproductoscosmticos[Lokhnauth
JL;2005].Laafinidaddeloscompuestosporlasfasespolimricaspuedeserexplicadaenbaseasus
polaridades, siendo ms afines a recubrimientos de naturaleza polar (PA) y semipolar (CARPDMS,
100
PDMSDVB) frente a los de naturaleza apolar (PDMS). Sorprendentemente, la fibra de CWDVB,

tambinconcarcterpolar,proporcioneficaciasdeextraccinmuybajas.
2.3.2.Fuerzainicadelmedio
Lafuerzainicapuedeafectarconsiderablementealaeficaciadelaextraccin.Laadicin
de cloruro sdico se utiliz para poner de manifiesto como vara la seal de los compuestos
estudiadosenfuncindelafuerzainicadelmedio.Enesteestudio,seprepararonalcuotasde18
mLdeaguaultrapura,apH2.5,conconcentracionescrecientesdeclorurosdicodesde0hasta300
mg/mL.ElmuestreofuellevadoacabousandolafibradePA,porinmersin,duranteuntiempode
40 minutos. Tal como se aprecia en la siguiente figura (figura II.5), inicialmente se observ un
incremento en las respuestas de los analitos hasta 100150 mg/mL de cloruro sdico,
mantenindoseconstante,oinclusodisminuyendo,paraloscompuestosmslipoflicos(BuPyBzP),
aconcentracionesdesalsuperiores.
Tericamente,laadicindesalprovocaunincrementodelafuerzainicadelmedioconel
consecuente aumento de la cantidad de analito extrado por la fibra. Desde el punto de vista
termodinmico, este comportamiento puede explicarse, para compuestos polares y no inicos,
comounainteraccindelasmolculasdeaguaconlosionessalinosenlugardeconlosanalitos.Por
otra parte, la presencia de grandes cantidades de sal, provoca un aumento de la viscosidad de la
muestraquehacequeladifusindelosanalitoshacialafibraseamslenta,fenmenoqueyahaba
sidoobservadoparaeltriclosn.
FiguraII.5.InfluenciadelaadicindesalenlaeficaciadelaSPMEdeparabenes.FibradePA,n=3
rplicas.
MeP EtP PrP BuP BzP

1000000
900000
800000
700000
600000
reas
500000
400000
300000
200000
100000
0
0 50 100 150 200 250 300 350
mg/mLNaCl

101

Enbaseaestosresultados,seseleccion150mg/mLcomolaconcentracinptimadesal,
ya que hasta este valor se observ un incremento en la respuesta de todos los compuestos. Bajo
estas condiciones, se revisaron las eficacias relativas de extraccin para los recubrimientos que
proporcionaronlasmayoresrespuestasenausenciadesal:PA,PDMSDVByCARPDMS,figuraII.6.
DenuevolafibradePAproporcionrespuestasclaramentesuperioresalasdosrestantes,adems
se observ que las respuestas relativas obtenidas para PDMSDVB aumentaron al aadir sal a las
muestras,mientrasqueparaCARPDMSseobtuvoelcomportamientocontrario,sobretodoparalos
compuestosmslipoflicos.

FiguraII.6.ComparativaderespuestasobtenidasconPA,PDMSDVByCARPDMS.Muestrasconsal
(150mg/mL)ysinsal,40minutosdemuestreo.
PA PDMSDVB CARPDMS
1.2
1
SealrelativaaPA
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0mg/mL 150 0mg/mL 150 0mg/mL 150 0mg/mL 150 0mg/mL 150
mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL
MeP EtP PrP BuP BzP

CantidaddeNaCl

2.3.3.pHyvolumendemuestra

El efecto del pH en la eficacia de extraccin fue evaluado considerando los parmetros
anteriormente ajustados (150 mg/mL NaCl y PA). Su influencia se investig a tres niveles distintos
(2.5,4.5y6.5),todosellos,almenos,2unidadespordebajodelpKadeloscompuestos(8.28.3).As
mismo, se realizaron tambin extracciones a pH 8.1, figura II.7. En conjunto, se observa que la
eficacia de extraccin es independiente del valor de pH considerado. Por tanto, en experimentos
posterioresnoseajustelpHdelasmuestras.

102
FiguraII.7.InfluenciadelpHenlaeficaciadeextraccindelosparabenesmedianteSPME(N=3).
300000
250000
pH2.5
200000 pH4.5
reas
150000 pH6.6
pH8.1
100000
50000
0
MeP EtP PrP BuP BzP
El volumen de muestra es otro factor a optimizar ya que de acuerdo con la teora de la

SPME para un sistema en dos fases, en condiciones de equilibrio termodinmico, la cantidad de
analitoextradovienedadopor
K fs Vf C 0 Vs
n=
K fs Vf + Vs
De modo que a mayor volumen de muestra, mayor ser la cantidad de analito extrada,
hasta que el trmino KfsVf sea ms pequeo que Vs. A partir de este momento, la masa de analito
extradaesindependientedelvolumendemuestraysuvalorvienedadoporlasiguienteexpresin:
n=KfsVfC0
En base a estos argumentos, se realizaron extracciones considerando varios volmenes
diferentesdemuestra(10,20y110mL)conteniendolosanalitosaidnticoniveldeconcentracin.
Los resultados obtenidos muestran que las eficacias son similares para todos los compuestos, con
excepcin del BzP que parece presentar un ligero incremento de seal al utilizar volmenes de
muestramayores,endetrimentodesurepetibilidad,figuraII.8.
FiguraII.8.Influenciadelvolumendemuestraenlaeficaciadelaextraccin(N=3).
10mL 20mL 110mL
600000
1.5E+05
500000
1.0E+05
400000
5.0E+04
reas
300000 0.0E+00
MeP EtP PrP
200000
100000
0
MeP EtP PrP BuP BzP
103
Teniendoencuentaestosresultados,elvolumendeaguaempleadoselimita1020mL
(dispuestaenvialesde1122mL)enfuncindelacantidaddemuestradisponible.
2.3.4.Mododemuestreoyagitacin
LaeficaciadelaextraccinenSPMEhasidoevaluadaconsiderandotresmodosdiferentes
demuestreo(inmersinatemperaturaambiente,espaciodecabezaHSatemperaturaambientey
HSa100C)paramuestrasdeaguaultrapura,conteniendo150mg/mLdeNaCl,duranteunperiodo
de40minutos.Trasladerivatizacin,lafibrafuedesorbidaenelpuertodeinyeccindelsistemaGC
MS/MS,obteniendoloscorrespondientesregistroscromatogrficos.Losresultadosrevelaronqueel
muestreoenmododirectoproporcionmayoreseficaciasdeextraccinfrentealespaciodecabeza,
tantoatemperaturaambiente(TA)comoa100C.SalvoenelcasodelMeP,larespuestaobtenida
conelmuestreoenespaciodecabezarepresentamenosdel5%delacorrespondientealmuestreo
porinmersin,figuraII.9.

FiguraII.9.MododemuestreoparalafibradePA.Sealrelativaamuestreoporinmersin(N=3).
SealrelativaainmersinaTA
1.4
1.2
1
0.8 Inmers in
0.6
HSa TA
0.4
HSa 100C
0.2
0
MeP EtP PrP BuP BzP

Una vez demostrado que la extraccin por inmersin es la que proporcion resultados
ptimos,elefectodelaagitacinsehaevaluadounivariantemente.Sellevaronacabounaseriede
experimentossinagitacinyconagitacina500rpm,generandounvrtexhomogneoenelvialde
la muestra. Los resultados obtenidos mostraron que la agitacin favorece en gran medida la
extraccindeloscompuestosdemayorlogKow,yaquemejorasudifusinenelmedioacuosodesde
elsenodelamuestraalasuperficiedelafibra,mientrasqueenelcasodelMePsuefectonoresult
significativo,figuraII.10.
104
FiguraII.10.Efectodelaagitacinenlasealdelosparabenes.DatosparaSPMEporinmersincon
fibradePA(N=3).
Sealrelativaamuestreoa500
1.4
1.2
1
0.8 conagitacin
rpm 0.6 500rpm
0.4
sinagitacin
0.2
0
MeP EtP PrP BuP BzP

2.3.5.Tiempodeextraccin
Una vez fijados el volumen de muestra (10 mL), la cantidad de NaCl (150 mg/mL), la
agitacin (500 rpm), el modo de muestreo (inmersin) y el tipo de fibra (PA), se evalu el tiempo
necesario para llegar a una situacin de equilibrio en la extraccin. Para la realizacin del estudio
cintico,seprepararonunaseriedemuestrasdeaguaultrapuraconadicindelosparabenesanivel
de2ng/mL.Lostiemposdemuestreofueronde5,10,20,30,45,60,90y170minutos,obteniendo
losperfilesdeextraccinquesemuestranenlafiguraII.11.

FiguraII.11.Cinticasdeextraccinparalosparabenes.
MeP EtP
3.00E+05
2.50E+05
2.00E+05
reas
1.50E+05
1.00E+05
5.00E+04
0.00E+00
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo(min)
105
PrP(sealx2) BuP BzP
2.50E+06
2.00E+06
1.50E+06
reas
1.00E+06
5.00E+05
0.00E+00
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo(min)
Los grficos anteriores revelan que 60 minutos de exposicin fueron suficientes para
alcanzarelequilibrioenelcasodelMeP.ParaEtP,PrP,BuPyBzPnosealcanzelequilibriodentro
del intervalo de tiempo evaluado. Finalmente, se decidi limitar el tiempo de extraccin a 40
minutosparaincrementarlaproductividaddelmtodo,referidaanmerodemuestrasprocesadas
porunidaddetiempo.
2.3.6.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinonfiber
Latemperatura,eltiempodederivatizacinyelvolumendederivatizantesonfactoresque
afectan directamente a la derivatizacin sobre la fibra. Sus efectos potenciales en la seal de los
parabenes derivatizados fueron evaluados simultneamente, empleando un diseo factorial de
modomixto3x22, condospuntoscentrales,conayudadelprogramaestadsticoStatgraphicsPlus
5.1.Enestetipodediseos,unodelosfactoresesestudiadoatresnivelesdentrodelespaciodelas
variables,demodoqueesposibleobtenereltrminocuadrticoasociadoalmismo.Dentrodelos
factores evaluados, la temperatura se seleccion como la variable a estudiar a tres niveles: 20C
(temperatura ambiente), 45C y 70C. Volumen de derivatizante (2080 L) y el tiempo de
derivatizacin(1040minutos)seestudiaronadosniveles.Paratenersuficientesgradosdelibertad
yestimaraselerrorexperimental,seincluyerondospuntoscentraleseneldiseo.

Parallevaracabolosexperimentosseutilizaron10mLdeaguaultrapura(conadicindelos
compuestos a nivel de 2 ng/mL), conteniendo 150 mg/mL de NaCl. El muestreo, con la fibra de
poliacrilato,sellevacabodurante40minutos,conagitacina500rpm.Unavezfinalizadalaetapa
deextraccin,ysecadalaagujadelajeringadeSPME,seprocedialaderivatizacinonfiberenlas
condicionesindicadasenlatablaII.3.Losresultadosobtenidos(readepico)tambinsemuestran
enlasiguientetabla.
106
TablaII.3.Matrizdeexperienciasparalaoptimizacindelascondicionesdederivatizacinonfiber
delosparabenes,yrespuestas(reasdepico)obtenidasmedianteGCMS/MS.
Temperatura Volumen Tiempo
MeP EtP PrP BuP BzP
(C) (L) (min)
45 20 10 117125 172911 415511 884877 80787
20 80 10 157808 207277 536774 1090911 986334
70 80 40 69773 111101 267276 626188 587871
70 20 40 65599 112078 282820 629675 604691
20 80 40 90668 170129 360302 767988 629756
70 20 10 72742 140032 295392 691161 603352
20 20 40 75172 144829 338346 785112 723726
45 80 40 77366 143203 314748 685058 603486
20 20 10 89135 178071 389166 888333 773942
45 50 25 152782 141325 316257 905918 680502
45 80 10 78167 139644 312642 697832 653764
45 20 40 77435 154507 342570 810312 686343
70 80 10 66075 144235 353531 889005 807883
45 50 25 103420 154710 352565 843442 766278
El anlisis de los datos anteriores mostr que ni el trmino cuadrtico asociado con la
temperatura,nilasinteraccionesdeordendosentrefactoresfueronestadsticamentesignificativos
(95%deconfianza),conlocuallainterpretacindelosresultadosresultsencilladebidoaquelos
factoressonindependientesentres.Losefectosprincipalesestandarizadossepuedenobservaren
latablaII.4.Estosseobtienenrelacionandoelvalordelefectoestimadoconelerror,demodoque
su valor absoluto es proporcional al cambio de respuesta del compuesto derivatizado cuando una
determinada variable pasa del nivel inferior al superior, dentro del dominio del diseo. El signo
indica si la eficacia en la derivatizacin incrementa (signo positivo) o si tiende a disminuir (signo
negativo).
TablaII.4.Valoresestandarizadosdelosefectosprincipalesasociadosconlosfactoresconsiderados
enlaoptimizacindeladerivatizacinonfiberdelosparabenes.
MeP EtP PrP BuP BzP
Temp.(C) 2.46a 4.36a 2.79a 2.24 1.90
Tiempo(min) 1.81 2.70a 2.12 2.20 2.43a
Vol.MTBSTFA(L) 0.62 0.24 0.44 0.18 0.21
a
Factoresestadsticamentesignificativosaunniveldeconfianzade95%

Los resultados obtenidos mostraron que la temperatura y el tiempo son factores que
afectan negativamente al rendimiento de la reaccin de derivatizacin, siendo estadsticamente
107
significativos para MeP, EtPy PrP la temperatura, ypara el EtP y BzPel tiempo. Por otra parte, el
volumen de derivatizante result ser un factor no significativo. En base a estos resultados se
seleccion como tiempo, temperatura de derivatizacin y volumen de derivatizante ptimo 10
minutos,20C(temperaturaambiente)y20LdeMTBSTFA.Estascondicionesresultaronidnticasa
las optimizadas para triclosn, 2,4diclorofenol y 2,3,4triclorofenol en la primera parte de este
captulo.

2.3.7.Evaluacindelosefectosmemoria
Aligualqueparaeltriclosn,seevalulapresenciadetrazasdeparabenesenlafibrade
SPMEunavezrealizadaladesorcindelosanalitosenelpuertodeinyeccindelcromatgrafo.Tras
realizarlaextraccindeunamuestradeaguaconteniendo2ng/mLdecadaunodelosparabenes,y
procederaladesorcindelafibradePA(270Cdurante3minutos),sevolviadesorberdurante
otros 3 minutos. La seal obtenida para esta segunda desorcin fue normalizada respecto a la
registradaenlaprimera.Igualmente,serealizlamismaoperacin,peroantesdellevaracabola
segunda desorcin de la fibra, se expuso al espacio de cabeza de un vial conteniendo 20 L de
MTBSTFA,atemperaturaambiente,durante10minutos.

Losresultadosobtenidossemuestranenlasiguientetabla,enlacualsepuedecomprobar
queenlasegundadesorcinseobtienensealesinferioresal0.1%paraelMePyelPrP.Cuandola
fibrafueexpuestadenuevoalderivatizanteestassealesaumentaronligeramente,llegandoal0.2
%.Ladistribucindelosparabenessobrelafibra,alahoradeevaluarlosefectosmemoria,result
ser similar al existente en los cosmticos (mayor cantidad de MeP y PrP), lo que sugiere que su
presencia sobre el polmero puede ser debida a la contaminacin existente en las atmsferas
interiores,ointroducidaporeloperadorduranteelprocesodeSPME,msqueaefectosdememoria
propiamentedichos[RudelRA;2003].

TablaII.5.SealrelativaenlasegundadesorcindelafibradeSPME.
Porcentajedesealrelativa
MeP EtP PrP BuP BzP
(%)
2desorcin 0.15 0.00 0.03 0.00 0.00
Derivatizacin+2
0.23 0.00 0.12 0.00 0.00
desorcin
108
2.3.8.Efectosdematriz
Lapresenciadeotrassustancias(cidoshmicos,macromolculas,etc)enlamatrizacuosa
puede afectar en gran medida a la eficacia de extraccin en SPME. Para investigar como afecta el
tipo de agua al rendimiento del mtodo propuesto, se utilizaron cuatro matrices diferentes: agua
ultrapura,aguadero,aguaresidualtratada(efluente)yaguaresidualsintratar(influente).Todas
estasmuestrasfueronfortificadasconlosanalitosanivelde2ng/mL,yanalizadasenlascondiciones
descritasanteriormente.Cabedestacarqueaquellasquepresentaronmateriaensuspensinfueron
pasadas a travs de filtros de fibra de vidrio con un tamao de poro de 1 m. Las muestras sin
adicin tambin fueron analizadas para tenerlas en cuenta a la hora de cuantificar los niveles
encontrados.

En la figura II.12 se comparan las respuestas obtenidas para cada matriz. Los resultados,
correspondientes a extracciones en triplicado, se representaron como seal relativa a la obtenida
paramuestrasdeaguaultrapura.Enbaseaellos,sepuedeafirmarquelasealdeloscompuestoses
independientedeltipodemuestra,demodoqueseraposiblellevaracabosucuantificacinusando
una calibracin externa sobre agua ultrapura, en lugar de recurrir a realizar adiciones sobre cada
muestraaprocesar.
FiguraII.12.Comparacinderespuestas(%desealrelativaaaguaMilliQ)paralosparabenesen
distintasmatricesacuosas.
1.2
SealrelativaaaguaMilliQ
1
MilliQ
0.8
Ro
0.6
Efluente
0.4 Influente
0.2
0
MeP EtP PrP BuP BzP
109

2.4.Caracterizacinanalticadelmtodopropuesto
UnavezoptimizadaslascondicionesdeSPMEyderivatizacinonfiberconMTBSTFA,figura
II.13, se procedi a la caracterizacin del mtodo propuesto en base a su linealidad, repetibilidad,
exactitud y lmites de cuantificacin, utilizando la cromatografa de gases acoplada a la
espectrometrademasasentndemcomotcnicadedeteccin.
Figura II.13. Esquema del mtodo desarrollado basado en la microextraccin en fase slida y
derivatizacinonfiberparaladeterminacindeparabenesenmuestrasdeagua.
FibradePA
1020mLmuestra Derivatizacinonfiber
150mg/mL NaCl 20LMTBSTFA,
MuestreoporinmersinaT.A. HS,10min
Agitacina500rpm
40min

2.4.1.Linealidad
Lalinealidaddelmtodofueevaluadautilizandomuestrasdeaguaultrapuraconadicinde
los compuestos a concentraciones crecientes desde 0.02 hasta 5 ng/mL. Los coeficientes de
determinacinoscilaronentre0.996y0.999dependiendodelcompuesto,tablaII.6.Comosepuede
comprobar en la figura II.14, la respuesta se mantiene lineal para el rango de concentraciones
estudiado.
Tabla II.6. Rectas de calibrado y coeficientes de determinacin para los parabenes utilizando GC
MS/MScomotcnicadedeteccin.
MeP EtP PrP BuP BzP
Ecuacin Y=76793X+35272 Y=77914X+7808 Y=265044X+29999 Y=360160X+17191 Y=38185X+1721
R2 0.999 0.997 0.998 0.996 0.999
110
FiguraII.14.CurvasdecalibradoparaMePyBzPenunrangodeconcentracionescomprendidasentre
20ng/Ly5ng/mL.
450000 MeP
400000
y=76793x+35272
2
350000 R =0.999
300000
250000 y=38185x+1721
reas
2
R =0.999 BzP
200000
150000
100000
50000
0
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000
ng/mL
2.4.2.Lmitesdecuantificacindelmtodo
Paraevaluarloslmitesdecuantificacindelmtodopropuesto,setuvieronencuentalos
blancos del procedimiento analtico. Una vez realizado el muestreo en las condiciones ptimas, se
observlapresenciadeunapequeasealdeMePequivalenteaunaconcentracindelordende5
10ng/Lenmuestraenlosblancosdeaguaultrapura,mientrasqueparalosdemscompuestos,la
seal result despreciable. En base a esta observacin, los lmites de cuantificacin estimados
(correspondientesaunarelacinS/N=10)semuestranenlatablaII.7.
Tabla II.7. Lmites de cuantificacin para los parabenes aplicando la metodologa SPME
derivatizacinonfiberydeteccinmedianteGCMS/MS.
LOQ MeP EtP PrP BuP BzP
ng/L 25 5 2 1 5
ElorigendelasealdeMePenlosblancosfueinvestigadoconsiderandodiversosfactores
por separado. Ni los septas de tefln, ni el agua ultrapura, ni el NaCl, ni el agitador magntico
parecenserlascausasdelapresenciadeMePenlafibra,yaquecuandosetomunafibranueva
acondicionada, y sta fue expuesta a un vial conteniendo 20 L de MTBSTFA, la seal obtenida
permaneciprcticamenteconstante,tablaII.8.

111

TablaII.8.ContribucindediferentesfactoresalasealdeMePenlosblancos.
MeP(rea
Factor Procedimiento
depico)
MuestreodeMilliQsinagitacin,conNaCl(150mg/mL),fibradePAy
Agitadoresmagnticos 2966
exposicinalderivatizante
MuestreodeMilliQconagitacin,NaCl(150mg/mL),fibradePAy
Septastflon 3900
exposicinalderivatizante.Noseencapsulaelvial
NaCl MuestreodeMilliQ,agitacin,fibradePAyexposicinalderivatizante 2789
AguaMilliQ DerivatizacinsobrelafibradePAsinmuestreoprevio 2662

Utilizarunnuevolotedederivatizanteparaexponerlafibrasin
Derivatizante 3685
muestreoprevio
Sinexponeralderivatizante 39
Fibra Fibranueva
Expuestaalderivatizante 3671

LapresenciadeMePenlafibradeSPMEpreviamentealusodelamisma,indicaqueste
compuestopuedeprocederdelaatmsferadellaboratorio[RudelRA;2003]y/odelasresinasque
seutilizanparaadherirlafibradeslicealcuerpodeacerodelaagujadeSPME[BraunP;2003].Por
lotanto,paraevitarfalsospositivosenladeterminacindeMePenaguamedianteSPME,espreciso
verificardeformasistemticalasealdelosblancos.

2.4.3.Repetibilidaddelmtodo
Larepetibilidaddelmtodopropuestofueevaluadautilizandomuestrasdeaguaultrapura
fortificadasconlosparabenesadiferentesnivelesdeconcentracin.Lasextraccionessellevarona
cabo por cuadruplicado en las condiciones descritas en la figura II.13. Los resultados obtenidos
muestranunabuenaprecisininclusoanivelesprximosalosLOQs,tablaII.9.
TablaII.9.Repetibilidad(%RSD)delprocesodemicroextraccinyderivatizacinonfiber(N=4).
ng/L MeP EtP PrP BuP BzP
20a 11.9 7.3 7.3 10.4 7.6
200 10.7 8.5 1.1 5.5 13.3
500 8.3 6.3 2.4 4.7 9.0
a
50ng/LparaMeP
112
2.4.4.ExactituddelprocesodeSPME
Se evalu la exactitud del mtodo desarrollado usando agua de ro con adicin de los
compuestosadosconcentracionesdiferentes:200y1000ng/L.Fuenecesarioanalizarlapresencia
previadelosmismosenelagua,ytenerlaencuentaparaelclculodelaexactitud.Losresultados
obtenidos, tabla II.10, mostraron que el mtodo de SPME permite evaluar de manera fiable las
concentracionesdelosparabenesenmuestrasdeagua,conunaexactitudyprecisinalrededordel
10%.
TablaII.10.ExactituddelmtododeSPMEparamuestrasdeaguaderoconadicin(N=3).
Con.aadida Con.medida Con.aadida Con.medida

Exactitud Exactitud
(ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL)
MeP 0.21 0.220.02 105% 1.01 1.130.03 112%

EtP 0.21 0.230.01 109% 1.01 1.060.08 105%
PrP 0.23 0.220.03 96% 1.12 1.260.06 112%
BuP 0.21 0.200.02 95% 1.02 1.090.04 107%
BzP 0.21 0.200.03 95% 1.02 1.080.09 106%
113

Consideracionesgenerales
III. ESTUDIO DE LA FORMACIN DE DERIVADOS HALOGENADOS DEL TRICLOSN Y

PARABENESENAGUACLORADA
3.1.Introduccin
EnestecaptulodelaTesisseinvestigalareactividaddeltriclosnylosparabenesenaguas
cloradas, evaluando el riesgo de formacin de subproductos halogenados cuando estas especies,
biendeunaformadirectaoatravsdeproductosdecuidadopersonal,entranencontactoconagua
degrifoclorada.Paraello,ademsdeconsiderarlasposiblesreaccionesquepuedendarlugarestos
compuestos, se desarroll una metodologa analtica sencilla para la extraccin de los analitos de
partidaysusposiblesderivadosenmuestrasacuosas.
3.1.1.Antecedentesbibliogrficos
Una de las lneas de investigacin de mayor actualidad, en relacin con la presencia de

contaminantes emergentes en el medio acutico, es el estudio de las posibles reacciones de
transformacindeestasespecies,laidentificacindelosproductosquegeneranylaestimacinde
laestabilidaddelosmismos,supersistenciaytoxicidadenelmedioambiente[RichardsonSD;2005
y 2006]. En el medio acutico, las reacciones de transformacin ms importantes son de tipo
fotoqumicoyredox.Dentrodelareactividadporvafotoqumica,eltriclosnesuncompuestoque
sufreimportantestransformacionesenelmedioambiente,dandolugaracompuestostxicoscomo
la 2,8dibenzopdioxina [SnchezPrado L; 2006 A]. En el caso de las reacciones redox, estas se
producen con reactivos que se introducen de un modo intencionado en el medio acutico para
eliminar compuestos de naturaleza orgnica. Dentro de los agentes oxidantes, el cloro libre
(combinacindelcidohipoclorosoehipocloritodesodio)eselmsutilizadojuntoconelozono,el
dixidodecloroylacloramina.Elclorolibresiguesiendoempleadohoyendaparadesinfectarlas
aguas de consumo y asegurar su calidad bacteriolgica. Incluso a aquellas aguas tratadas
previamenteconozonooradiacinultravioleta,selesaadeposteriormenteunacantidaddecloro
residual para que mantengan su asepsia a lo largo de las redes de distribucin en las grandes
ciudades.Enalgunospases,elclorolibreesusadotambinenlostratamientosterciariosaplicados
enlasestacionesdepuradorasdeaguasresidualesurbanas.Loscompuestosorgnicos,enpresencia
deestosagentesoxidantespuedenreaccionardandolugaraespeciesconcaractersticasdistintasa
los productos de partida. En algunos casos, estos subproductos son especies voltiles fcilmente
eliminables, aunque txicos, como los trihalometanos; aunque, tambin puede dar lugar a otros
productos txicos y ms persistentes que los analitos de partida [Gallard H; 2002][Huber MM;
2005][RichardsonSD;2003].
115

Loscompuestosquecontienengruposfenlicosensuestructurapresentanunascinticas
decloracinmuyfavorables[GallardH;2002][AlumA;2004][PatnaikP;2000].Estasreacciones,de
sustitucinelectrfilaaromtica,estnfavorecidasporlapresenciadelgrupohidroxiloqueaumenta
la densidad electrnica del anillo bencnico, debido a los pares de electrones no compartidos del
oxgenoquesedeslocalizanporlosenlacestipo,principalmenteenlasposicionesenortoyparaal
mismo.Estohacequeelfenol,porejemplo,sea1000vecesmsreactivofrentealbencenoyquese
formen principalmente productos de halogenacin en orto y para al grupo hidroxilo frente a las
sustituciones en meta, las cuales no estn favorecidas ni desde el punto de vista cintico ni
termodinmico.
Estudios de cloracin de frmacos (estradiol, etinilestradiol, ibuprofeno, ketoprofeno,) y
otrosproductosdecuidadopersonal(filtrossolares)mostraronlaposibilidaddesufrirreaccionesde
transformacin en presencia de cloro [Pinkston KE; 2004][Negreira N; 2007], dixido de cloro
[HuberMM;2005]yozono[vonGuntenU;2003],siendolasozonizacionesaquellasquepresentan
cinticas ms rpidas, seguidas de las cloraciones con dixido de cloro, y por ltimo, cloro libre
[HuberMM;2005].ElpHesunfactormuyimportanteenalgunasdeestasreacciones,yaqueenel
casodelosfenoles,laformafenolatoeslamsreactivayenelcasodelasaminas,laformabsicaes
la que presenta mayor reactividad. En lo referente al cloro libre, considerado como la suma de
concentracionesdecidohipoclorosoyelhipoclorito,laformacidaeslareactiva,demodoquelos
pHsptimosdereaccinparaespeciesfenlicassernloscomprendidosentreelpKadelcompuesto
yelpKadelcidohipocloroso[PinkstonKE;2004].
En el caso del triclosn, experimentos realizados en 1987 pusieron ya de manifiesto la
formacin de derivados halogenados en medio acuoso conteniendo cloro libre. El grupo de
Kanetoshi [Kanetoshi A; 1987] estudi la formacin de derivados clorados del triclosn cuando
materialestextiles,productosdecuidadopersonalyplsticos,quecontenanestebactericida,eran
puestosencontactoconconcentracioneselevadasdeclorolibre.Losproductosquesedetectaron
fueron dos tetras y un pentacloro fenoxifenol (closanos). Onodera y su grupo [Onodera S; 1987]
confirmaron la formacin de estos compuestos cuando trataban aguas residuales, conteniendo
triclosn, con hipoclorito sdico durante una hora. A diferencia de los primeros autores,
identificaron otros dos productos de degradacin, el 2,4diclorofenol y el 2,3,4triclorofenol. Aos
mstarde,en2005,paralelamentealasinvestigacionesllevadasacaboenestaTesisDoctoral,Rule
y colaboradores [Rule KL; 2005] obtuvieron resultados anlogos a los observados con condiciones
diferentesalasnuestras.Ensutrabajo,eltriclosnseencontrabaenexceso(0.728g/mL)frenteal
hipoclorito sdico (0.1921.77 g/mL) en disoluciones tamponadas con bicarbonato sdico. La
determinacin por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GCMS) de los
compuestosderivatizadosconbromurodepentafluorobencilo,revellapresenciadelosdostetrasy
116
el pentacloro fenoxifenol, as como de 2,4diclorofenol en el medio de reaccin. Los productos

finalesdecloracindeltriclosnfueroncidoscarboxlicoscloradosytrihalometanos.
Los mismos productos de halogenacin del triclosn, descritos en esta Tesis Doctoral
[Canosa P; 2005 A], han sido hallados en estudios posteriores por Greyshock y colaboradores
[GreyshockAE;2006]cuandoevaluaronlareactividaddelbactericidaconexcesodemonocloramina.
La cintica de degradacin del triclosn fue entre 2 y 4 veces ms lenta que con cloro libre, y
adems, no se detectaron los productos de ruptura del mismo cuando existe exceso de triclosn
frente a la monocloramina. Por otra parte, el grupo de investigacin de Fiss [Fiss EM; 2007],
basndose en los estudios de Canosa y colaboradores [Canosa P; 2005 A y 2006 A], estudi que
sucedacuandounproductoconteniendotriclosnensuformulacin(1.23mg/g)seaadisobre
agua con 2 g/mL de cloro libre. En menos de un minuto se haba consumido todo el triclosn,
dandolugaravariossubproductosdecloracinyderupturadelenlaceterexistenteentrelosdos
anillosaromticosdelcompuesto,ascomocloroformocomoproductofinal.
El caso de los parabenes, el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral es el nico, hasta el
momento, en el cual se ha estudiado su reactividad en agua clorada. Algunas referencias sobre
subproductos del cido parahidroxibenzoico y del metahidroxibenzoico, mostraron que el primero
precisunamayorconcentracindecloroparareaccionarfrentealsegundo,ademsdepresentar
unacinticamuylenta,yaqueelgrupocarboxlicoactacomodesactivantecuandoestionizado,
puestoquedisminuyeladensidadelectrnicaenelanilloaromtico[ChangE;2006].Shaydullinay
colaboradores[ShaydullinaGM;2005]estudiaronlaformacindesubproductosdeoxidacinpara
el cido ortometoxibenzoico en presencia de ozono y cloro libre. En el primer caso, observaron la
rupturadelanillobencnicoylaformacindediversosproductosdeoxidacin,mientrasqueenel
segundo, la halogenacin se produjo en las posiciones orto y para al grupo OMe, as como
sustitucionesdelCOOHporCl.Lasimpurezasquepresentabaelreactivodecloracindieronlugara
laaparicindelosproductosbromados.Lapresenciadehaluros(bromurosoyoduros)enunmedio
conteniendo un agente oxidante, como es el hipoclorito, provoca la formacin de compuestos
halogenadosdebidoalaoxidacininicialquesufrenabromooyodo,yposteriorataqueelectrfiloal
anilloaromtico.Lapresenciadeestassalespuedeocurrirdemodonatural,sobretodoenacuferos
situadosenzonascosteras,anivelescomprendidosentre140g/Lenaguadelluvia,20150g/Len
aguaderoy65mg/Lenaguademar[vonGuntenU;2003][InabaK;2006].Cabedestacarquela
formacin de compuestos bromados es 10 veces ms rpida que los clorados. Por otra parte,
estudios de toxicidad, con cidos haloacticos, pusieron de manifiesto que los compuestos
bromadospresentanunamayortoxicidadquelosclorados[RichardsonSD;2003].
117
3.1.2.Concentracindelasmuestras

La tcnica ms habitual para la preparacin de muestras acuosas es la extraccin en fase
slida(SPE),permitiendoconcentrardeformaparalelagrandesvolmenesdemuestraalavezque
proporcionarecuperacionescuantitativasparaungrannmerodecompuestosorgnicos.LaSPEse
haseleccionadoenmuchoscasoscomomtododeconcentracinparaladeterminacindetriclosn
oparabenesenaguasresidualesysuperficiales.
Para la realizacin de los estudios de halogenacin citados anteriormente, nos hemos
decantado por esta tcnica, no slo por su versatilidad y sencillez, sino porque permite realizar
variasextraccionessimultneasy,adiferenciadelaSPME,esposiblereanalizarelextractousando
diferentescondicionescromatogrficas.Portanto,previamentealosestudiosdehalogenacindel
triclosn y los parabenes, se llev a cabo la optimizacin de las condiciones de extraccin en fase
slida.EnlatablaIII.1seresumenvariasdelasmetodologasdesarrolladasenlabibliografaparala
determinacindeltriclosnylosparabenes.
Tabla III.1. Preparacin de muestras acuosas mediante SPE para la determinacin de triclosn y
parabenesenaguas.
Analitosy LOD Rec
Procedimiento Deteccin RSD(%) Ref.
matriz (ng/L) (%)
TCSyotros Filtrarconfibradevidrio,acidificarapH2,
PPCPsen concentrarcondiscosSDBXC.EluirconDCMy GCMS 0.2 23 60 (1)(2)
aguaresidual MeOH.Concentrara0.5mLyderivatizarcon
ysuperficial BSTFA.
TCS,PBsy Filtrar1Ldemuestra,ajustarapH3.Concentrar
otrosPPCPs conOasisMAX150mgyeluirconMeOHyMeOH GCMS 10 5 87 (3)
enagua con2%cidofrmico.DetivatizarconPFPAycon
residual MTBSTFA.
TCSyMTCS AjustarapH2,200mLdeaguaresidual1Lde
enagua aguasuperficial.Concentrarconpoliestireno GCMS (4)
residualy divinilbenceno.EluirconMeOH:DCM.Etilarcon
superficial diazoetanoypurificarconslica.
TCS,frmacos Extraccinde50100mLdeaguaapH2conOasis
cidosen HLB60mg.Elucincon6mLdeMeOH.Adicinde LCESI()
1124 5 48 (5)
aguaresidual cidomeclofenmico,ac.2,4diclorobenzoicoy MS/MS
ysuperficial fenopropcomopatronesinternos.
TCS,AINEs, AjustarapH7.ConcentrarconOasisHLB60mg.
cafenaen LavarcontampnfosfatopH7,hexanoyeluir3mL GCMS 6 4 84 (6)
aguaresidual AcOEt.DerivatizarconBSTFA.
118
Consideraciones generales
Analitos y LOD Rec

Procedimiento Deteccin RSD (%) Ref.
matriz (ng/L) (%)
TCS, AINEs,
Filtrar agua a pH 7, concentrar con Oasis HLB 500
cafena,
mg. Eluir 5 mL hexano, 5 mL AcOEt y 14 mL MeOH. GC-MS 0.07 15 85 (7)
insecticidas
Concentrar a 0.5 mL y aadir metilcloroformiato
agua residual
para derivatizar.
y mar
Concentrar de 1 L de agua a pH 2, conteniendo
TCS en agua 13
C12-TCS, con Florisil activo. Lavar con 5 mL 5% GC-MS/MS 0.25 14 96 (8)
residual y
MeOH en agua y elucin con 6 mL AcOEt.
superficial
Concentrar a 0.2 mL
Ajuste de 1 L de agua a pH 6.8 y concentrar con 900
TCS, AINEs en GC-MS -- -- -- (9)
mg C18. Elucin con DCM. Derivatizar con
agua residual
anhdrido actico y piridina.
TCS, PPCPs,
Ajuste a pH 2 de 250 mL de agua residual filtrada
AINEs,
3 L agua superficial. Concentrar con Oasis HLB 200 GC-MS 10 12 93 (10)
frmacos
mg. Lavado con varios disolventes, elucin con
agua residual
acetona. Derivatizacin con BSTFA.
y superficial
TCS, PPCPs y LC-ESI(-)-
Extraccin de 0.5 L muestra con Oasis HLB 60 mg. 0.34 13 99 (11)
otros DE en
Elucin con 5 mL MeOH y 5 mL MeOH:MTBE. MS/MS
agua residual
TCS, MTCS, Extraccin de 2-4 L de agua a pH 3 con discos
PPCPs en Empore SDB-RPS de PE-DVB, utilizando con 110-
GC-MS -- -- (12)
agua de surrogado el cido 2,4-diclofenoxiactico y patrn 128
consumo interno 4,4-dibromooctafluorobifenol.
Extraccin de 0.5-1 L de agua con cartuchos C18 de
TCS, AINEs en GC-MS 50 10 79 (13)
1 g. Elucin con 10 mL de acetona. Derivatizacin
agua residual
con metilcloroformiato.
Aadir 20 mL de MeOH a 50-100 mL de agua a pH
TCS, closanos 2. Concentrar sobre 1 g de C18. Elucin con acetato
y MTCS en de etilo, tolueno y hexano. Concentracin a 0.5 mL, GC-MS 10 21 79 (14)
agua residual adicin de PCB-52 y derivatizacin con N,N-
dietiltrimetilsililamina.
TCS y otros
Extraccin de 50 mL de muestra filtrada con PE- 200-
compuestos GC-AED -- -- (15)
DVB. Lavado con agua ultrapura, secado y elucin
clorados en 500
con 100 L AcOEt.
agua residual
900
Utilizan para cidos discos de intercambio aninico,
sustancias,
neutros Oasis HLB y C18, y bsicos intercambio GC-MS -- -- -- (16)
TCS, MeP y
catinico. Elucin secuencial con varios disolventes.
EtP en agua
Derivatizacin de grupos cidos con MeI.
residual
AcOEt: acetato de etilo; AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos; BSTFA: bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamida; DE: disruptores
endocrinos; DCM: diclorometano; MeOH: metanol; MTBE: metil-tert-butilter PE-DVB: poliestireno-divinilbenceno; PFPA:
anhdrido pentafluoropropinico; PPCPs: productos de cuidado personal.
119
Analitosy LOD Rec

Procedimiento Deteccin RSD(%) Ref.
matriz (ng/L) (%)
TCS,frmacos Concentracindelamuestradeaguaconcartuchos
enagua OasisHLB60mg.ElucinconMeOHycambiode GCMS 1020 6 84 (17)
residual disolventeaMTBE.
DE,MeP,EtP, Concentracinde0.5LdeaguaconOasisHLB200
PrP,BzPen mg.Elucincon6mLPropanol:MTBE(1:9). LCMS/MS 0.54 5 95 (18)
aguaresidual Concentrarasequedadyredisolverenfasemvil.
TCSy Extraccinde2LdeaguaconcartuchosOasisHLB
triclorocarban 60mg.Elucincon4mLdeacetona:MeOH(1:1), LCMS (19)
enagua 10mMdecidoactico.Concentrarasequedady
superficial reconstituircon1mLdeMeOH:acetona.
Pasar0.5Ldeaguaporfiltrosdecelulosa.Ajustara
pH3yaadirelsurrogado5bromo2(2,4
TCSenaguas LCMS 1 12 82 (20)
dibromofenoxi)fenol.ExtraerconOasisHLB500mg
superficiales
yeluirconAcOEt:acetona(1:1).Concentrara
sequedadydiluirconagua:MeOH(1:1).
TCSy
Concentracinde500mLdeaguaapH4con
frmacosen LCUV 90 11 102 (21)
columnasdeC18.Lavadocon20mLdeACNen
agua
aguayelucinconlafasemvil.
superficial
DE,MeP,EtP, Concentracinde50mLdeaguacon200mgde
PrPyBzPen C18,lavadoconaguayelucincon6mLde LCMS 311 8 98 (22)
aguaresidual DCM:Isopropanol(8:2).
(1)BoydGR,2003;(2)BoydGR,2004;(3)LeeHB,2005;(4)LindstromA,2002;(5)QuintanaJB,2004;(6)ThomasPM,2004;
WeigelS,2004;(8)WuJL,2007;(9)NakadaN,2006;(10)GibsonR,2007;(11)VanderfordBJ,2006;(12)LoraineGA,2006;(13)
PaxeusN,2004;(14)McAvoyD,2002;(15)vanSteeLLP,1999;(16)ErikssonE,2003;(17)LeeHB,2003;(18)BenijtsT,2004;
(19)HaldenRU,2005;(20)HuaW,2005;(21)BonesJ,2006;(22)BenijtsT,2003
AcOEt:acetatodeetilo;AINEs:Antiinflamatoriosnoesteroideos; BSTFA:bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida; DE:disruptores

endocrinos; DCM: diclorometano; MeOH: metanol; MTBE: metiltertbutilter PEDVB: poliestirenodivinilbenceno; PFPA:
anhdridopentafluoropropinico;PPCPs:productosdecuidadopersonal.
De acuerdo con la bibliografa revisada, la eleccin de los cartuchos Oasis HLB es la ms

habitual, ya que este tipo de polmero posee un balance hidroflico (Nvinilpirrolidona) y lipoflico
(divinilbenceno)queproporcionaunaretencinycapacidadsuperioresfrenteaotrosadsorbentes
[http://www.cienytech.com/ES/pysdisextoasis.htm]. La versatilidad de este polmero permite
extraercompuestostantopolarescomoapolares,locualresultaimprescindibleeneltipodeestudio
que vamos a realizar, donde se prev la formacin de compuestos halogenados con diferentes
propiedadesfsicoqumicasyestructurasaprioridesconocidas.
120
3.1.3.Preparacindelamuestraparaelestudiodehalogenacin
En los estudios de formacin de productos de halogenacin se han utilizado muestras de

agua ultrapura (100250 mL). Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente
(temperatura del agua 15 2 C) utilizando botellas de vidrio mbar de 300 mL. El pH de las
muestrasfueajustadoconayudadetamponesfosfato,acetatoobicarbonato(0.1M)enfuncindel
pHrequerido(entre5y9unidades),aadiendo5mLdeladisolucintampnporcada100mLde
muestra.TraselajustedelpH,seadicionunacantidadconocidadeclorolibre(sumadeHClOyClO
) as como del compuesto de partida en metanol (el porcentaje de metanol en la muestra fue
siempreinferioral0.1%).Lasmuestrasseagitaronmanualmentedurantedosminutos,ysedejaron
reaccionar un tiempo determinado. Pasado ese tiempo, se aadieron 10 mg de tiosulfato sdico
(reductor) para eliminar el exceso de cloro presente en el medio. Una vez que la reaccin fue
detenida,elpHdelamuestraseajusta2conHCl1M,yserealizlaSPEtalcomosehadescritoen
elcaptuloII,secciones2.1.1y2.1.3.
Enelcasodelasmuestrasdeaguadegrifo,sedeterminpreviamentelacantidaddecloro
presente en la misma con ayuda de un fotmetro, tal como se indica en el siguiente apartado. A
continuacin,seprocedidelmismomodoqueconlasmuestrasdeaguaultrapura.
3.1.4.Medidadelclorolibreenaguasdegrifo
Enlosestudiosrealizadosconaguadegrifofuenecesariodeterminarlaconcentracinde
cloro libre (HClO y ClO) presente en la muestra, para lo cual, se utiliz un fotmetro de filtro. La
determinacin se basa en la reaccin que tiene lugar entre el cloro libre y la N,Ndietil1,4
fenildiamina (DPD) dando lugar a un complejo de color rosado que absorbe a 555 nm. Antes de
realizarlamedida,seprocespreviamenteunblancodeaguaenausenciadelDPD;lamedidadela
muestrasehaceaadiendoelagentecomplejantealagua.Laconcentracindeclorolibreesleda
directamente,expresadaenmg/L(ppm)[ClesceriLS;1998].
3.1.5.Valoracindeladisolucindehipoclorito

Dado que las disoluciones de hipoclorito tienen una estabilidad limitada, es necesario
controlarlaconcentracinexactadeclorolibrepresenteenlamismasemanalmente.Paraello,se
realizunavaloracinredoxcontiosulfatosdico.Estecompuestonoespatrnprimario,conlocual
es necesario estandarizarlo previamente con KIO3 (patrn primario). En un matraz erlenmeyer se
aaden 25 mL de disolucin de KIO3 (0.0200 M), 2 mL de H2SO4 3M y 2 g de KI, de modo que se
generaI2(colorpardorojizo)segnlareaccin:
121
KIO3+5KI+3H2SO43I2+3K2SO4+3H2O (1)
Enlaburetatenemosladisolucindetiosulfatosdico,Na2S2O3,aproximadamente0.1M,y
vamos aadiendo esta disolucin hasta que aparece un color amarillo plido. En ese momento se
aadenunasgotasdeengrudodealmidn(indicador)demodoquelacoloracindeladisolucinse
torna azul, debido al complejo que se forma entre el yodo y el engrudo. Se aade ms tiosulfato
hasta que la disolucin vira a transparente lo que significa que se ha consumido todo el I2. La
reaccinredoxseproduceentreelyodoyeltiosulfatosdico:
I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI (2)
Conociendo el volumen gastado, es posible conocer la concentracin real del tiosulfato
sdico,segnlafrmula:
MNa2S2O3=6x(MKIO3xVKIO3)/VNa2S2O3 (3)
Unavezconocidalaconcentracinexactadeltiosulfato,serealizalavaloracinpropiadela
disolucindehipoclorito.Paraello,sediluye10vecesladisolucincomercial(40g/Ldecloroactivo)
conaguaultrapura,yseaade10mLdelamismaa10mLdecidoactico3My2gKIcontenidos
enunmatrazerlenmeyer.DeestamaneraseformaI2debidoalapresenciadelhipocloritosegnla
reaccin:
ClO+2I+2H+Cl+H2O+I2 (4)
Unavezgeneradoelyodoenelmedio,seprocedealavaloracintalcomosehaballevado
a cabo para la estandarizacin del tiosulfato. Considerando la ecuacin (2), los moles de yodo
generadosvienendadosporlaexpresin:
molesI2=1/2x(MNa2S2O3xVNa2S2O3) (5)

De acuerdo con la ecuacin 4, los moles de hipoclorito (ClO) coinciden con los moles de
yodo.Laconcentracindeestaespeciesepuedeexpresarcomocloroactivoatravsdelareaccin:
ClO+Cl+2H+Cl2+H2O (6)
3.1.6.Clculodeltiempodevidamedia
Los experimentos de degradacin del triclosn, metil, etil, propil y butilparaben fueron
llevados a cabo usando concentraciones de los mismos en el rango de los ng/mL, mientras que la
concentracin de cloro se mantuvo a los niveles presentes en las aguas de consumo domstico
(mg/L). La velocidad de reaccin del compuesto considerado para dar lugar a los productos de
cloracinsedefinesegnlasiguienteecuacin:
Analito+ClorolibreProductosdecloracin

122
[Analito] x y
V= = k [Analito] t [Cloro]0
t
La concentracin de cloro libre se mantiene en exceso, de modo que la expresin puede
ajustarsedelsiguientemodo:
x
V = k[Analito] t
y
siendo k = k [Cloro] 0 laconstanteaparentedelavelocidaddereaccin.
Los datos experimentales mostraron que x=1, esto es el orden parcial de la reaccin
respectoalTCSylosparabenesfuelaunidad.Portanto:
[Analito]
V= = k[Analito] t
t
Reorganizandoestaexpresin,obtenemoslasiguienteintegral:
t [Analito] t
= kt
0 [Analito] 0
t
Integrando,llegamosalasiguienteexpresin:
[Analito]
Ln t = kt
[Analito]
0
Eltiempodevidamedia(t1/2)eseltiempoquetardaenreducirselaconcentracininiciala
lamitad,porlotanto,vienedadopor:
Ln(0.5)
t =
1/2 k
DondekeslapendientedelarectaobtenidaalrepresentarLn[Analito]frentealtiempodereaccin.
3.2.Condicionesinstrumentalesdemedida
ParaelseguimientodelasreaccionesdehalogenacindeTCSyparabenesfuenecesariola
utilizacindeunatcnicaquenospermitaponerdemanifiestolapresenciadelasdistintasespecies
generadas,ascomoseguirladisminucinenlaconcentracindelanalitodepartida.Conayudade
lacromatografadegasesacopladaalaespectrometrademasasen fullscan,esposiblerealizarla
separacindelasdistintasespeciesascomolaidentificacindelosproductosdehalogenacinen
baseadoscriterios:comparacindetiemposderetencinyespectrosdemasasconpatronespuros,
einterpretacindelosespectrosdemasasdelospicoscromatogrficoscorrespondientesaespecies
desconocidas, teniendo en cuenta que sufren la misma reaccin de sililacin que el analito de
partida y que en su mayora se trata de especies policloradas, polibromadas y combinaciones de
123
ambas.Lasintensidadesrelativasdelosclustersdeionesdeestasespeciesvienencontroladaporlas
abundanciasnaturalesdelosistoposdelbromo(79Bry 81Br,50.5%y49.5%)ydecloro(35Cly 37Cl,
75.77%y24.23%).LatablaIII.2recogelasintensidadesrelativastericasparalos clustersdeiones
enlosespectrosdemasasdeimpactoelectrnicoparaespeciespolihalogenadas.
TablaIII.2.Relacindeintensidadesenlosespectrosdemasas(EI)paracompuestoshalogenados.
ClBr X X+2 X+4 X+6 X+8 X+10
Cl 100 32.5
Cl2 100 65.0 10.6
Cl3 100 97.5 31.7 3.4
Cl4 76.9 100 48.7 10.5 0.9
Cl5 61.5 100 65.0 21.1 3.4 0.2
ClBr 76.6 100 24.4
Cl2Br 61.4 100 45.6 6.6
Cl3Br 51.2 100 65.0 17.6 1.7
ClBr2 43.5 100 69.9 13.7
Cl2Br2 38.3 100 89.7 31.9 3.9
Cl3Br2 31.3 92.0 100 49.9 11.6 1.0
ClBr3 26.1 85.1 100 48.9 8.0
Cl2Br3 20.4 73.3 100 63.8 18.7 2.0
Br 100 98.0
Br2 51.0 100 49.0
Br3 34.0 100 98.0 32.0
Br4 17.4 68.0 100 65.3 16.0
En las siguientes tablas se muestran los tiempos de retencin, as como los iones de
identificacindeloscompuestosdepartidaydelosproductosdecloracinybromacindetectados
paraTCSyparabenes.

TablaIII.3.Parmetrosdeidentificacin(GCMS)paraeltriclosnysusproductosdehalogenacin,
ascomodelmetiltriclosn.
Ionescuantificacin Ionesidentificacin Intensidadesrelativas
Compuesto Tr(min)1
(m/z) (m/z) (%)
219 100
2,4DCF 15.80 219+221 221 73
183 24
124
Tr Ionescuantificacin Ionesidentificacin Intensidadesrelativas

Compuesto
(min)1 (m/z) (m/z) (%)
253 94
255 100
2,4,6TCF 17.43 253+255
257 37
217 18
253 90
2,3,4TCF 18.21 253+255 255 100
257 37
315 100
Clhidroxifenol 20.05 315+317
317 35
302 88
304 100
MTCS 21.19 302+304
252 53
254 36
349 100
351 76
diClhidroxifenol 21.38 349+351
314 30
316 18
383 100
385 83
triClhidroxifenol 22.95 383+385
387 32
291 33
345 95
347 100
TCS 23.28 345+347
349 36
200 28
379 73
TetraI 24.67 379+381+383 381 100
383 54
379 72
TetraII 25.12 379+381+383 381 100
383 57
413 52
415 100
Penta 26.76 413+415+417
417 75
419 27
1
columnaHP5MS
125
Tabla III.4. Parmetros de identificacin (GCMS) para MeP, EtP, PrP, BuP y sus productos de
halogenacin,ascomodelbencilparaben.
Tr Ionescuantificacin Ionesidentificacin Intensidadesrelativas
Compuesto
(min)1 (m/z) (m/z) (%)
209 100
MeP 15.59 209 177 56
195 33
223 100
151 35
EtP 16.35 223
195 30
177 21
243 100
3ClMeP 17.19 243+245
245 38
237 100
151 50
PrP 17.38 237
195 44
169 44
257 100
3ClEtP 17.88 257+259 259 37
149 36
287 93
3BrMeP 18.06 287+289
289 100
251 100
151 151
BuP 18.39 251
169 169
195 195
277 100
3,5DClMeP 18.54 277+279
279 71
301 94
3BrEtP 18.70 301+303
303 100
271 100
3ClPrP 18.82 271+273
273 37
291 100
3,5DClEtP 19.17 291+293 293 68
183 30
321 68
ClBrMeP 19.38 321+323 323 100
325 27
1
columnaHP5MS
126
Tr
Compuesto Ionescuantificacin(m/z) Ionesidentificacin(m/z) Intensidadesrelativas(%)
(min)1
315 100
3BrPrP 19.60 315+317 317 99
319 18
285 100
3ClBuP 19.76 285+287
287 37
335 67
ClBrEtP 20.01 335+337 337 100
339 29
305 100
3,5DClPrP 20.06 305+307 307 67
309 15
365 43
3,5DBrMeP 20.21 365+367+369 367 100
369 53
329 90
3BrBuP 20.55 329+331
331 100
319 100
3,5DClBuP 20.99 319+321
321 74
379 52
3,5DBrEtP 20.79 379+381+383 381 100
383 53
349 71
ClBrPrP 20.83 349+351 351 100
353 25
393 61
3,5DBrPrP 21.60 393+395+397 395 100
397 60
363 70
ClBrBuP 21.69 363+365 365 100
367 30
91 100
BzP 22.05 285 285 76
235 24
407 50
3,5DBrBuP 22.43 407+409+411 409 100
411 54
1
columnaHP5MS
127

3.3. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo de triclosn y
compuestosrelacionados
Previamente a los estudios de halogenacin del triclosn, se desarroll un mtodo de

extraccinmedianteSPEconderivatizacinenmediohomogneoparaloscompuestosestudiados
(triclosn,2,4diclorofenol,2,3,4triclorofenolymetiltriclosn).Lacromatografadegasesacopladaa
laespectrometrademasas(GCMS)fueseleccionadacomotcnicadedeterminacin.
3.3.1. Optimizacin de las condiciones de derivatizacin en medio homogneo y

estabilidaddeloscompuestossililados
Conelobjetivodeoptimizarlascondicionesdederivatizacindetriclosn,2,4diclorofenoly
2,3,4triclorofenol se llev a cabo un diseo factorial completo tipo 23, con dos puntos centrales,
para evaluar cuales son los factores que afectan, de modo estadsticamente significativo, a la
derivatizacin. En concreto se estudi la influencia de la temperatura, el tiempo y el volumen de
derivatizante(MTBSTFA).

Pararealizaresteestudiosepreparpreviamenteunpooldeextractosdeaguaresidual,sin
tratar,conunaadicinde2ng/mLdetriclosn,2,3,4,triclorofenoly2,4diclorofenol.Paraello,se
concentraron4muestrasde500mL,ajustadasapH2,utilizandocartuchosOasisHLBde60mg.Los
compuestosfueronextradoscon2mLdeacetatodeetilo,ystossecombinaron.Paralarealizacin
de los diez experimentos del diseo factorial, se utilizaron alcuotas de 0.5 mL de este pool y el
volumencorrespondientedederivatizante.Entodosellos,elvolumen finalseajusta700Lcon
acetato de etilo. Se inyect 1 L del extracto en el sistema GCMS y los resultados obtenidos se
trataron en el programa estadstico Statgraphics 5.1, obteniendo el valor de los efectos
estandarizados, los cuales se muestran junto con las condiciones experimentales en la siguiente
tabla(tablaIII.5).Comosepuedeobservar,ningnfactorfueestadsticamentesignificativoparalos
trescompuestos.Cabedestacarquelasdesviacionesestndarrelativasdelasreasdepicoparalos
10 experimentos del diseo fueron inferiores al 5 %. En base a estos resultados se seleccion el
volumeninferiordederivatizante(20L),untiempodereaccinmnimo(5minutos)ytemperatura
ambiente,simplificandoaselprocesodederivatizacin.
128
SPEaplicadaalaextraccindeTCSycompuestosrelacionados
TablaIII.5.Dominioexperimentalyefectosprincipaleseinteraccionesestandarizadosobtenidospara
laoptimizacindelascondicionesdederivatizacindeltriclosnycompuestosrelacionados.
Dominioexperimental Efectosprincipaleseinteracciones
Factor Rangodevalores 2,4DCF 2,3,4TCF TCS
A:V.MTBSTFA(L) 20 200 1.35 0.72 0.72
B:Tiempo(min) 5 60 1.33 1.88 1.28
C:Temperatura(C) 20 70 0.07 0.53 0.77
AB 0.05 0.49 0.59
AC 0.84 1.09 0.85
BC 0.48 0.18 9104
t=3.20paran=3yun95%
Se estudio tambin la estabilidad de los compuestos sililados en el tiempo, puesto que

podransersusceptiblesdesufrirlahidrlisisdelenlaceSiO.Paraello,seprepararondospatrones
en acetato de etilo de concentracin aproximada 200 ng/mL para cada compuesto, as como dos
extractosde500Ldeunamuestradeaguaresidual,deconcentracinentornoa800ng/mL.Se
derivatizaroncon20y50LdeMTBSTFAenamboscasos,y1Ldecadaunofueinyectadoenel
sistemaGCMS,endassucesivostrassupreparacin.Paraevitarlaconcentracindelosextractos,
estos fueron almacenados a 4C entre inyecciones. Los resultados obtenidos para el triclosn se
muestranenelgrficoadjunto,endondepodemosversusealrelativafrentealPCB30,utilizado
comopatrninternoparaminimizarlasvariacionesenlarespuestadelsistemadeGCMSduranteel
estudio.
FiguraIII.1.Estabilidadtemporaldeltriclosnsililadoparaunpatrn(200ng/mL)yunextractode
agua(800ng/mL)usandodistintosvolmenesdederivatizante.
1DIA 2DIA 3DIA 6DIA 9DIA
16
SealTCSrelativaaPCB30
14
12
10
8
6
4
2
0
Extracto,MTBSTFA50L Extracto,MTBSTFA20L Patrn,MTBSTFA50L Patrn,MTBSTFA20L
129

ComosepuedeobservarenlafiguraIII.1,elcompuestoderivatizadoresultserestableal
menos durante 9 das tras el proceso de sililacin, lo que implica la posibilidad de almacenar
extractosypatronesdecalibracintrassupreparacinparasureinyeccinencasonecesario.El2,4
diclorofenol y el 2,3,4triclorofenol mostraron un perfil similar al del triclosn en lo referente a la
estabilidadtemporaldesusderivadossililados.
3.3.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas

Una vez fijadas las condiciones de derivatizacin, se procedi a la optimizacin de un
mtododeSPEparaladeterminacindeloscompuestosanteriores,ademsdelmetiltriclosn,en
muestras acuosas. En primer lugar, se estudi el volumen de elucin y el volumen mximo de
muestra a concentrar con los cartuchos de Nvinilpirrolidona y divinilbenceno. A continuacin, se
considerlaposibilidaddepurificarlosextractoscorrespondientesaaguaresidualparalaposterior
aplicacin del mtodo al anlisis de muestras reales, as como a los estudios de halogenacin del
triclosn.
3.3.2.1.Volumendeelucinyvolumendecorte
LaextraccindeloscompuestosestudiadossellevacaboempleandoloscartuchosOasis
HLBde60mg.Laeleccindeacetatodeetilocomodisolventedeelucinenlugardemetanol,tal
como indica el protocolo genrico de preparacin de muestra, se hizo en base a estudios previos
realizadosconestrgenosporRodrguezycolaboradores[RodrguezI;2003].Larecuperacindelos
analitosconacetatodeetilopermitiladerivatizacindirectadelextractoobtenidosinnecesidadde
un cambio de disolvente, ya que el metanol reaccionara con el agente sililante. Para evaluar el
volumendedisolventenecesariopararecuperarloscompuestos,sehizopasar1Laguaultrapura,
con adicin de los analitos a nivel de 4 ng/mL a travs de un cartucho Oasis HLB de 60 mg,
procediendoalsecadodelmismoylaelucinde4fraccionesdeacetatodeetilode2mLcadauna.
Tras la etapa de derivatizacin, se inyect 1 L del extracto en el sistema GCMS. Los resultados
obtenidos mostraron que los compuestos son eluidos cuantitativamente con 2 mL de acetato de
etilo,figuraIII.2.
130
Figura III.2. Elucin de un cartucho Oasis HLB de 60 mg con fracciones consecutivas de 2 mL de

acetatodeetilo.
100.00%
80.00%
Sealrelativa
60.00%
40.00%
20.00%
0.00%
1 2 3 4
Fra cci n
El volumen de ruptura del cartucho de 60 mg, se estudi haciendo pasar 2 L de agua

ultrapura, con adicin de los compuestos del orden de 4 ng/mL, a travs de dos cartuchos
conectadosenserie,paraqueelsegundocartuchoretengalasposiblesprdidasquepuedasufrirel
primero.Losresultadosobtenidosmostraronqueelvolumendecortedelcartuchoessuperiora2L,
puestoqueloscompuestosnofuerondetectadosenelextractoprocedentedelsegundocartucho,
figuraIII.3.
Figura III.3. Seales (reas de pico) correspondientes a la evaluacin del volumen de corte de los
cartuchosOasisHLBde60mgempleando2Ldemuestra.
2E
+0
6
1E
reasdepico
+
06
6E
+0
5
0E
1
+0
0
2 tu cho
2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS r
Ca
131
3.3.2.2.Matricescomplejas:filtracinypurificacindeextractos
Las matrices reales (agua de ro, agua residual) contienen materia particulada,
macromolculas y compuestos orgnicos que pueden obturar el cartucho de extraccin, as como
interferirenladeterminacindeloscompuestosdeinters.Paraevitarambosproblemas,seestudi
laviabilidadderealizarlafiltracin,previaalaSPE,delamuestradeaguaparaeliminarlamateria
particulada,evitandolaobturacindeloscartuchos,ascomolaposteriorpurificacindelextracto
enacetatodeetiloconcartuchoscomercialesdeslica.
Con respecto a la filtracin, se ha tenido en cuenta que muchos compuestos sufren

retencin en la superficie de los filtros. Singer y colaboradores [Singer H; 2002] indicaron que el
triclosneraretenidoporlosfiltrosdepoliamida,adiferenciadelosfiltrosdecelulosaregenerada.
Losfiltrosconsideradosfuerondemembranadeacetatonitratodecelulosade0.45mydefibrade
vidriode1mdetamaodeporo.Enamboscasos,sefiltraronmuestrasdeaguaultrapura(pH2)
conteniendoloscuatroanalitosanivelde25ng/mL.PosteriormenteseconcentraronmedianteSPE.
Tambinseprocesunareferenciasinfiltrarparaponerdemanifiestoelnivelderetencindelos
compuestossobrelosfiltros.LosresultadosobtenidossemuestranenlafiguraIII.4.
FiguraIII.4.Evaluacindelaretencindelosanalitosendistintosfiltros.Sealrelativaalareferencia
nofiltrada(N=3).
Referenci a Cel ul os a (0.45m) Fi bra devi dri o
1.2
Concentracinrelativa
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Compues to
El triclosn y especialmente el metiltriclosn, mostraron una adsorcin importante en los

filtrosdeacetatonitratodecelulosa,siendomsacusadacuantomayoressuconstantedeparticin
132
octanolagua (4.8 y 5.4, respectivamente). En base a estos resultados, se decidi utilizar filtros de
fibradevidrio.
Conrespectoalosextractosprocedentesdeaguasresiduales,seconsiderlaposibilidadde
llevar a cabo su purificacin con cartuchos comerciales de slica neutra de 500 mg (SepPak 500
mg/3mL).Estetipodeadsorbenteretienemolculasdenaturalezapolar,lascualespuedenacortar
lavidatildelacolumna,ademsdeconsumirparcialmenteelderivatizanteaadidoalosextractos.

Elprimerpasofueevaluarlacantidaddedisolventenecesarioparaeluircuantitativamente
loscompuestosdeladsorbenteenfasenormal.Paraello,secargaron2mLdeunpatrnenacetato
deetilo(2g/mL)sobreuncartuchodeslica,recogiendofraccionesdeacetatodeetilo,laprimera
de ellas de 5 mL y las sucesivas de 2 mL. La primera fraccin fue concentrada a 2 mL, y
posteriormente derivatizada junto con las otras tres. Los resultados obtenidos se muestran en la
figuraIII.5.

FiguraIII.5.Perfildeelucindelosanalitosenloscartuchosdeslicade500mg(N=3).
120%
100% 4.00%
3.00%
Sealrelativa
80%
2.00%
60% 1.00%
0.00%
40% 2
20%
0%
1 2
Fraccin
Comosepuedecomprobar,5mLdeacetatodeetilofueronsuficientesparalaelucinde
loscompuestosdelcartuchodeslica.

En la figura III.6 se muestran los cromatogramas de GCMS (corriente inica total)
correspondientes al extracto de una muestra de 1 L de agua residual, con y sin etapa de limpieza
sobreslica.Lareduccindelacomplejidaddelcromatogramaesevidente,figuraIII.6,noslodesde
elpuntodevistadelasealcromatogrfica,sinoquelareduccindelacoloracindelextractofue
tambinimportante.
133
Figura III.6. Superposicin de cromatogramas (GCMS) para un agua residual con limpieza (lnea
continua)ysinlimpieza(lneadiscontinua).
MCts
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
10 15 20 25 30 minutos
3.3.3.Caracterizacindelmtodoanaltico
Unavezoptimizadaslascondicionesdeconcentracindelosanalitos,medianteextraccin
en fase slida, con derivatizacin en medio homogneo y anlisis mediante GCMS, figura III.7, se
caracteriztantoelmtododedeterminacincomoelprocesoanalticoensuconjunto.
FiguraIII.7.EsquemadelprocesodepreparacindemuestramedianteSPEparaladeterminacinde
triclosnycompuestosrelacionadosenagua.
AcondicionamientoOasisHLB60mg:
3mL AcOEt,MeOH,H2OpH2
Pasodelamuestra:
1L,pH2,filtrada
confibradevidrio
SecadoconN214psi/30min
Elucin PurificacinSepPak0.5g
2mLacetatodeetilo (sloaguasresiduales)
Derivatizar 0.5mL con20L Eluir 5mLAcOEt y

MTBSTFAaT Amb.5min concentrara2mL

134
3.3.3.1. Caracterizacin del mtodo de determinacin (GCMS): linealidad, repetibilidad y

lmitesdecuantificacin

La linealidad de la respuesta analtica se evalu mediante un calibrado a 10 niveles de
concentracincomprendidosentre25ng/mLy3g/mL.Lasregresionesobtenidasalrepresentarel
valor de rea de pico frente a la concentracin de los analitos, mostraron coeficientes de
determinacinde0.999.
Larepetibilidaddeinyeccinfueestudiadainyectando1Ldeunpatrnde400ng/mLpor
quintuplicado.Loscoeficientesdevariacinobtenidosparacadaunodeloscompuestosseindican
enlatablaIII.6,siendoinferioresentodosloscasosa2.5%.
Loslmitesdecuantificacin(LOQs)sedefinencomolacantidadmnimadecompuestoque
produce una seal cromatogrfica con una relacin S/N de 10, cuando se registran los
cromatogramasalasrelacionesdem/zdelpicobasedelespectrodemasasdelcompuesto.LosLOQ
del equipo (GCMS) para los cuatro analitos estudiados se evaluaron inyectando niveles de
concentracin inferiores a 5 ng/mL. Con ayuda del software GCMS Saturn Workstation 5.4 se
calcularonloslmitesdecuantificacinparaloscompuestos.Estesoftwareintegralasealderea
(ruido)delos5scansobtenidospreviayposteriormentealpicocromatogrficoparadarlugaralos
lmitesdecuantificacin,tablaIII.6.
TablaIII.6.Ecuacionesdelasrectasdecalibrado,coeficientesdedeterminacin,LOQsyrepetibilidad
paralosanalitosestudiados.
Recta R2 LOQ(ng/mL) Repetibilidad(%RSD,n=5)
2,4DCF Y=1091X+16070 0.999 4 1.2

2,3,4TCF Y=857X+11349 0.999 3 1.4
MTCS Y=784X+1315 0.999 2 2.4
TCS Y=1164X+25057 0.999 3 1.0

3.3.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico

Los lmites de cuantificacin (LOQs) se definen como la cantidad mnima de analito que
puede ser cuantificado con fiabilidad, correspondiente a una relacin S/N de 10. En base a esta
definicin y teniendo en cuenta el factor de concentracin obtenido, as como los blancos de
proceso, se establecieron los siguientes LOQs para un volumen de muestra de 1 L, tabla III.7. Los
135
LOQsobtenidosconlametodologadeSPEdesarrolladason2vecessuperioresalosobtenidospor
SPME,tablaI.10.

TablaIII.7.LmitesdecuantificacindelmtododeSPE(Vol.1L).
Compuesto LOQ(ng/L)
2,4DCF 8
2,3,4TCF 6
MTCS 4
TCS 6

La exactitud y precisin del mtodo desarrollado se evaluaron para cada uno de los
compuestosendistintasmatricesacuosas.Pararealizaresteestudio,sehautilizado1Ldeaguacon
adicindelosanalitosanivelde0.5ng/mL,realizando4rplicasdelprocesoanalticoparacadatipo
demuestra.Enelcasodelefluente(aguaresidualtratada),secompararonlasrecuperacionesylos
coeficientes de variacin obtenidos con y sin etapa de purificacin. Las recuperaciones se
determinaron mediante un calibrado externo, con patrones en acetato de etilo de distintas
concentraciones, teniendo en cuenta las seales obtenidas para las muestras sin adicin. Las
recuperaciones obtenidas oscilaron entre 77 y 116 %, con RSDs inferiores al 10 %, prcticamente
paralamayoradelasmuestras,tablaIII.8.
TablaIII.8.Recuperaciones(%)delmtodopara1Ldemuestraconadicindeloscompuestosanivel
de0.5ng/mL(N=4).
Matriz 2,4DCF 2,3,4TCF MTCS TCS
AguaMilliQ 945 954 953 983

Aguaro 1083 1054 10311 887
Res.tratadasinlimpieza 1124 1064 1164 1143
Res.tratadaconlimpieza 924 775 1104 1026
Res.sintratarconlimpieza 903 893 1082 985
136
SPEaplicadaalaextraccindeParabenes
3.4. Extraccin en fase slida con derivatizacin en medio homogneo para la

determinacindeparabenesenmuestrasdeagua
Paraladeterminacindeparabenesenmuestrasdeaguaseoptimiztambinunmtodo
deextraccinenfaseslida.Estametodologafueaplicadaalanlisisdemuestrasdeaguaderoy
aguaresidual,ascomoparaseguirlosestudiosdehalogenacinalos cualesnosreferiremosms
adelante.
3.4.1. Optimizacin de las condiciones de derivatizacin en medio homogneo y

estabilidaddeloscompuestossililados
Lascondicionesdederivatizacinenmediohomogneodelosparabenesenloreferentea
volumen de derivatizante (20100 L), tiempo (560 minutos) y temperatura (2070C), fueron
estudiadosmedianteundiseoexperimentalfactorialfraccionalenmodomixto3x22conunpunto
central. Este tipo de diseo permite estudiar uno de los factores a 3 niveles (en nuestro caso la
temperatura),estimandoaseltrminocuadrticoasociadoalmismo.
Parallevaracabolosdistintosexperimentossepreparunpooldeextractos,enacetatode
etilo, correspondientes a agua residual tratada a la que se adicion los parabenes a nivel de 700
ng/mL. Una vez obtenido este pool, se aadi a 500 L de extracto el volumen de derivatizante
indicadoenlatablaIII.9,diluyendoconacetatodeetilohastaunvolumenfinalde600Lencaso
necesario.LosextractosfueroninyectadosenelsistemaGCMSobteniendolasreasdepicoquese
muestranenlatablaIII.9.
Tabla III.9. Experimentos realizados y reas de pico obtenidas durante la optimizacin de la

derivatizacinenmediohomogneo.
Temperatura V.MTBSTFA Tiempo
MeP EtP PrP BuP BzP
(C) (L) (min)
45 100 5 178940 156294 152202 225023 135059
70 100 5 162922 145024 147815 200001 140083
70 20 60 173866 164183 158159 222404 155725
20 20 5 39231 39959 38311 51694 39612
45 100 60 184084 170689 151894 238164 175905
45 20 5 56168 55400 57169 72217 33142
70 20 5 137631 119913 120735 174833 143094
20 20 60 50095 50644 39134 75725 70025
45 60 32.5 166651 166589 158907 224407 150386
137
Temperatura V.MTBSTFA Tiempo

MeP EtP PrP BuP BzP
(C) (L) (min)
70 100 60 168919 147106 156030 209399 147308
45 20 60 194579 173437 165120 240398 162801
20 100 60 172321 152592 157493 213701 153918
20 100 5 171392 155645 157094 215901 151517
Traseltratamientodelosresultadosobtenidos(reasdepico)conelprogramaestadstico
Statgraphics 5.1, se obtuvieron las cartas Pareto para los 5 compuestos estudiados, y las
correspondientes superficies de respuesta. MeP, EtP, PrP y BuP presentaron cartas Pareto y
superficiesderespuestasimilares.ElBzPdifiereligeramente,aunquelasconclusionesalasquese
llegaronfueronlasmismas,figuraIII.8.
FiguraIII.8.CartasParetoysuperficiesderespuestaparaeletilparabenyelbencilparaben.
CartaParetoEtP SuperficiederespuestaEtP
Tiempo=60,0
Tiempo=60min
B:Volumen +
AB - (X10000)
20
A:Temperatura
17
C:Tiempo 14
reas
BC 11
AA 8 100
80
5 60
AC 40
20 30 20
40 50 60 0
70 Volumen (L)
0 1 2 3 4 Temperatura (C)

CartaParetoBzP
SuperficiederespuestaBzP
Tiempo=60,0
Tiempo=60min
B:Volumen +
(X10000)
AB -
21
C:Tiempo 18
reas
A:Temperatura 15
BC 12
AA 9 100
80
6 60
AC 40 Volumen (L)
20 30 20
40 50 60 0
70
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Temperatura (C)

EnlascartasParetosepuedeobservarquevaloresaltosdetemperatura,tiempoyvolumen
deMTBSTFAafectarondemodopositivoalaeficaciadederivatizacin.InclusoparaMeP,EtP,PrPy
BuP el volumen de derivatizante fue estadsticamente significativo (95% confianza), as como la
interaccin temperaturavolumen (AB). Las superficies de respuestas obtenidas para 60 minutos,
mostraron que a temperaturas elevadas, la seal result ser mucho mayor frente a temperatura
ambiente.Conrespectoalderivatizante,paraobtenermejoresresultadosserequierenvolmenes
138
mayoresdeMTBSTFA,aunqueatemperaturaselevadas,seobservquelarespuestaprcticamente
no variaba con el volumen de derivatizante, con lo cual, se seleccion un valor medio (40 L de
MTBSTFA)dentrodeldominioexploradoeneldiseo.
Una vez fijadas las condiciones de derivatizacin (40 L de MTBSTFA a 70C durante 60
minutos)seevalulaestabilidaddeloscompuestosderivatizadoseneltiempo.Paraello,seprepar
unpatrnenacetatodeetilode1.2g/mLyunextractodeunefluenteconadicindelosanalitosa
nivelde500ng/mL.Quinientosmicrolitrosdelasdisolucionesanterioresfueronderivatizadoscon40
L de MTBSTFA a 70C durante una hora, inyectando posteriormente 1 L en el sistema GCMS
durante varios das. Al igual que en el caso del triclosn, se utiliz como patrn interno el PCB30
para compensar los posibles cambios de respuesta que puede haber en el equipo. Los resultados
obtenidos, mostraron que los parabenes derivatizados son estables durante un periodo de 7 das
cuandosonalmacenadosa4C,figuraIII.9.
FiguraIII.9.Estabilidaddeloscompuestossililadoseneltiempo.SealrelativaalPCB30.
Da1 Da2 Da3 Da6 Da7 Da8
12
10
SealrelativaaPCB30
0
MeP EtP PrP BuP BzP MeP EtP PrP BuP BzP
Patrn Muestra

3.4.2.OptimizacindelprocesodeSPEparamuestrasacuosas

Unavezfijadaslascondicionesptimasdederivatizacin,losparmetrosdeextraccinde
los parabenes en muestras de agua fueron optimizados usando el mismo adsorbente que para el
triclosn.Lascondicionesdepartidafueronlasmismas:aguaapH2.5,cartuchosOasisHLBde60
mgyacetatodeetilocomoeluyente.
139
3.4.2.1.Volumendeelucindeloscartuchosyvolumendecorte

La cantidad de acetato de etilo necesaria para recuperar los compuestos del cartucho de
SPE, as como el volumen mximo de muestra a concentrar con la fase polimrica seleccionada
fueronevaluadossimultneamente.Paraelloseconcentrunamuestradeaguaultrapurade2La
pH2.5conunniveldeadicinde2ng/mL.Estamuestrasehizopasarpordoscartuchosconectados
en serie, de modo que en el caso de que el volumen de corte sea menor, el eluato del segundo
cartucho presentar seal para los compuestos estudiados. Por otra parte, el primer cartucho fue
eluidocon3fraccionesdeacetatodeetilo(2mLcadauna)paraestablecerelvolumenmnimode
disolventenecesariopararecuperarcuantitativamenteloscompuestos.Losresultadosobtenidosse
muestranenlafiguraIII.10.
FiguraIII.10.VolumenderupturaydeelucindelosparabenesusandocartuchosOasisHLBde60
mg.
1200000
1000000
reasdepico
800000
600000
400000
BzP
200000 BuP
PrP
0 EtP
Fr1 MeP
Fr2
Fr3
Cartucho1 Fr1
Cartucho2

ComosepuedeobservarenlafiguraIII.10,2mLdeacetatodeetilofueronsuficientespara
eluirconjuntamenteloscincocompuestos.Porotraparte,elvolumendecortedelcartuchoresult
sersuperiora2Ldemuestra,puestoquenohaypresenciadelosparabenesenelsegundocartucho.

3.4.2.2.Matricescomplejas:Purificacindelosextractos
Losextractosprocedentesdeaguasresidualespresentaronunagrancomplejidaddebidoa
la presencia de sustancias coextradas. Del mismo modo que se ha hecho para el triclosn, se
140
planteunaestrategiadepurificacindelosextractosprocedentesdeloscartuchosdefasereversa,
utilizandocartuchosdeslicaneutracomerciales,SepPakde500mg.

Fue necesario conocer el volumen de acetato de etilo necesario para recuperar los
compuestosdeloscartuchosdefasenormal.Paraello,sedepositsobreestecartuchounaalcuota
deunpatrndelosanalitosconunaconcentracinde2g/mL.Serecogieronfraccionessucesivas
de2mLdeacetatodeetilo,que,unavezderivatizadas,fueroninyectadosenelsistemaGCMS.Las
reasdepicoobtenidasserepresentaronenlasiguientefigura,figuraIII.11.

FiguraIII.11.PerfildeelucinparalosparabenesdeloscartuchosdeslicaSepPakde500mgcon
acetatodeetilo.
MeP EtP PrP BuP BzP
100%
80%
Sealrelativa
60%
40%
20%
0%
1 2 3 4
Fraccin(2mL)

En la figura anterior se puede apreciar que son necesarios, al menos, 4 mL de acetato de
etilo para recuperar cuantitativamente los parabenes de los cartuchos de slica. Por lo tanto, la
purificacindelosextractosdeaguasresidualesserealizarpasandoatravsdelcartuchodeslica
los2mLdeacetatodeetiloeluidosdelcartuchoOasisHLByrecuperandoloscompuestoscon5mL
delmismodisolvente.Acontinuacin,esos5mLsernconcentradosencorrientedenitrgenohasta
unvolumende2mLparaprocederasuderivatizacinydeterminacincromatogrfica.

Una vez optimizadas las condiciones de extraccin de las muestras de agua conteniendo
parabenes,figuraIII.12,sepresentanlascaractersticasdelmtododedeterminacin(GCMS)enlo
referenteaexactitud,precisinylmitesdecuantificacin.
141
FiguraIII.12.EsquemadepreparacindemuestramedianteSPEparaladeterminacindeparabenes
enagua.
AcondicionamientoOasisHLB60mg:
3mL AcOEt,MeOH,H2OpH2
Pasodelamuestra:
1L,pH2,filtrada
confibradevidrio
SecadoconN214psi/30min
Elucin PurificacinSepPak0.5g
2mLacetatodeetilo (sloaguasresiduales)
Derivatizar 0.5mL con40L Eluir 5mLAcOEt y

MTBSTFAa70C,60min concentrara2mL
3.4.3.1. Caracterizacin del mtodo de determinacin (GCMS): linealidad, repetibilidad y

lmitesdecuantificacininstrumentales

La linealidad del sistema GCMS para parabenes fue estudiada inyectando una serie de
patronescuyasconcentracionesestabancomprendidasentre20ng/mLy2g/mL.Loscoeficientes
dedeterminacindelasrectasobtenidasoscilaronentre0.9970.998.
ParalaobtencindelosLOQsdelequiposeprocedideformaidnticaqueenelestudio
realizado con el triclosn. La repetibilidad de inyeccin se evalu con un patrn de concentracin
100ng/mLparacadaanalito,inyectadoseisvecesenelsistemacromatogrfico.Losparmetrosque
caracterizanalsistemaGCMSsemuestranenlasiguientetabla(tablaIII.10).
TablaIII.10.Rectasdecalibrado,coeficientesdedeterminacin,LOQsyrepetibilidadparaparabenes
utilizandoGCMScomotcnicadedeterminacin.
MeP Y=306X+6812 0.998 5 6.1
EtP Y=274X+6361 0.998 5 4.1
142
PrP Y=264X+6597 0.998 3 4.6
BuP Y=405X5289 0.998 2 7.1
BzP Y=256X10705 0.997 13 8.3
Los lmites de cuantificacin para los parabenes en muestras acuosas se obtuvieron

considerandolosblancosdelprocesoascomolosLOQsproporcionadosporelsistemadedeteccin
(GCMS), considerando un factor de concentracin de 500 veces (1 L a 2 mL de acetato de etilo),
tabla III.11. En el caso de matrices sencillas (aguas superficiales), estos LOQs se podrn reducir
incrementando el volumen de muestra hasta 2 L. Para aguas residuales no es posible concentrar
volmenessuperioresa1LdebidoalaobturacindeladsorbenteenelcartuchodeSPE.
TablaIII.11.LmitesdecuantificacindelmtododeSPE(Vol.1000mL).
LOQ MeP EtP PrP BuP BzP
ng/L 10 10 6 3 26
LosLOQsobtenidosutilizandoSPEcomotcnicadeconcentracinfueronsimilaresquelos
obtenidosparaSPME(tablaII.7)conexcepcindelMePparaelquenosedetectaronsealesenlos
blancosdeSPE.

Laexactitudyprecisindelmtodoanalticofueronevaluadasconunconjuntodemuestras
de agua ultrapura, agua de grifo (tratada previamente con tiosulfato sdico para eliminar el cloro
presenteenlamisma),aguadero,aguaresidualtratadaysintratar.Paraello,seprocesaronpor
cuadruplicado1litrodecadatipodemuestraconadicindelosparabenesanivelde0.5ng/mL.Las
concentracionesenmuestrafueroncuantificadasmediantecalibradoexterno,sustrayendolaseal
delasfraccionessinadicinenelcasodelasmuestrasdeaguaderoyresidual.Lasrecuperaciones
obtenidassemuestranenlatablaIII.12.Losextractoscorrespondientesamuestrasdeaguaresidual
fueron purificadas con 500 mg de slica, tal como se ha descrito en el apartado 3.4.2.2. de este
captulo.
143
Tabla III.12. Recuperaciones (%) del mtodo para 1 L de muestra con adicin de los compuestos a
nivelde0.5ng/mL(N=4).
Matriz MeP EtP PrP BuP BzP
AguaMilliQ 1062 1093 1121 1071 999
Aguadegrifo 805 943 984 973 812
Aguadero 1075 1045 1122 1102 885
Res.tratada 1054 1124 1195 1082 1084
Res.sintratar 796 916 964 1031 1182
144
HalogenacinTriclosn
3.5.Halogenacindeltriclosn
3.5.1.Pruebaspreliminares

Eltriclosnesunfenoxifenoltricloradoque,dadaasuestructura,essusceptibledesufrir
reaccionesdehalogenacinenelanillofenlicocuandoseponeencontactoconelectrfiloscomoel
hipoclorito sdico. Inicialmente, se llevaron a cabo una serie de experimentos con objeto de
confirmar esta hiptesis. Se emplearon alcuotas de agua ultrapura con una cantidad conocida de
triclosn,40ng/mL,yconcentracionesvariablesdeclorolibre(0.08,0.2,0.4y8mg/L).Todasestas
pruebasserealizaronatemperaturaambiente(temperaturadelagua152C),enausenciadeluzy
sin ajuste del pH del medio, seleccionando un tiempo de reaccin de 1 hora. Tras ese tiempo, se
concentraron las muestras aplicando la metodologa de SPE y se inyectaron en el sistema GCMS,
obteniendoloscorrespondientescromatogramas,figuraIII.13.
FiguraIII.13.CromatogramasdeGCMSobtenidosenlosestudiospreviosdecloracindeltriclosn.
kCts
750 345+347
0mg/LClorolibre kCts
500 200
219+221
250
0 150
750
100
500 0.08mg/LClorolibre
250
50
0
750
0
500 0.2mg/LClorolibre 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 15.9 16.0 16.1 16.2
250 minutos
0 kCts
750 250
253+255
500 0.4mg/LClorolibre
200
250
0 150
750
8mg/LClorolibre 100
500
250 50
0
22.5 23.0 23.5 24.0 0
minutos 17.2 17.3 17.4 17.5 17.6 17.7
minutos

Comosepuedecomprobar,trasunahora,eltriclosnreaccioncuantitativamenteconel
agente oxidante a las cuatro concentraciones evaluadas. Por otra parte, result significativa la
formacinde2,4diclorofenol,ascomodeuntriclorofenol,a17.4minutos,quenosecorresponde
145
con el 2,3,4triclorofenol (tr 18.2 minutos). La seal de estos ltimos aument con la cantidad de
cloroenelmediodereaccin.
Tal como se aprecia en estas pruebas iniciales, el triclosn es susceptible de sufrir una
degradacin relativamente rpida en presencia de niveles bajos de cloro libre, formndose varios
subproductos durante este proceso. Por tanto, se procedi al estudio sistemtico de aquellos
factoresqueinfluyenenlareactividaddeltriclosnenpresenciadeclorolibre.
3.5.2.EstudiodedegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibre

LainfluenciadelpHydelaconcentracindeclorolibreenladegradacindetriclosnfue
investigada utilizando alcuotas de 100 mL de agua ultrapura, tamponada a cinco pHs diferentes,
comprendidosentre5y9,yconconcentracionesdeclorolibrecrecientes,de0a2.4mg/L.Trasla
adicin de triclosn, la mezcla se dej reaccionar durante 5 minutos en botellas cerradas y en
ausenciadeluz.Pasadoesetiempo,seeliminelexcesodeagenteoxidantecon10mgdetiosulfato
sdico(reductor)yseprocedialaconcentracindelasmuestrasmediantelametodologadeSPE
desarrolladaenestecaptulo.EnlafiguraIII.14,sepuedeobservarlaestabilidaddeltriclosnfrente
alasdistintasconcentracionesdecloroyelpHdelagua.

FiguraIII.14.EstabilidadrelativadeltriclosnadistintospHsyconcentracionesinicialesdeclorolibre.
ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
pH5 pH6 pH7 pH8 pH9
120%
100%
Sealrelativa
80%
60%
40%
20%
0%
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
mg/LClorolibreinicial
En la figura III.14 se puede apreciar un aumento de la degradacin del triclosn con la

concentracin de agente oxidante. Adems, el pH ejerci un efecto notable en su estabilidad,
observndose la mxima reactividad en el intervalo entre pH 7 y 8, lo cual concuerda con la
informacin existente para especies fenlicas. En general, este tipo de reacciones son ms
favorablescuandoelcompuestoseencuentraenformafenolato,mientrasqueeloxidante(pKa7.5)
146
HalogenacinTriclosn
seencuentraensuformacida.Enelcasodeltriclosn,pKade7.80,elrangoentrepH7y8result
serelmsfavorableparasudegradacin.
3.5.3.Cinticasdecloracinenaguaultrapura
LacinticadecloracindeltriclosnenaguaultrapurafueestudiadaatrespHsdiferentes
(6.3,7.3y8.3)alosquepuedenencontrarselasaguassuperficiales.Laconcentracindeclorolibre
semantuvoen0.4mg/L,concentracinmediaestipuladaparaelaguadegrifo.Cabedestacarqueel
clorolibreestenexcesofrentealtriclosn(9ng/mL),portanto,lavelocidaddereaccinesfuncin
nicamentedelaconcentracindetriclosnpresenteenelmedio.Puestoquelarepresentacindel
logaritmoneperianodelaconcentracindetriclosnfrentealtiempodereaccinrespondeauna
lnearecta,laecuacindevelocidadseajustaaunacinticadepseudoprimerorden.Aspues,el
tiempodevidamediadeltriclosnpuedecalcularsesegnlaexpresin:
Ln(0.5)
t 1/2 =
k
DondekeslapendientedelarectaobtenidacuandoserepresentaelLn[TCS]frentealtiempo.
LasecuacionesdelarectaobtenidasparaesostrespHssemuestranenlafiguraIII.15,junto
conlostiemposdevidamedia.
Figura III.15. Cinticas de cloracin y tiempos de vida media para el triclosn, obtenidos para 0.4
mg/LdeclorolibreapHs6.3,7.3y8.3.ConcentracininicialdeTCS9ng/mL.
pH6.3 pH8.3 pH7.3
3.5
y=0.0705x+3.3196
3 2
R =0.9959
2.5
pH t1/2(min)
Ln[TCS]
2 y=0.1845x+3.3058
6.3 9.8
2
1.5
R =0.9932
7.3 2.2
8.3 3.7
1
y=0.3109x+3.5691
0.5 2
R =0.9871
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo(min)
Lostiemposdevidamediaobtenidosconfirmanquelamximareactividaddeltriclosnse
observapH7.3.

147
3.5.4.Identificacindelosproductosdetransformacin
Los experimentos realizados por Onodera y colaboradores en 1987 [Onodera S; 1987],

pusierondemanifiestolaexistenciadedosderivadostetracloradosdeltriclosn(TetraIyII)yuno
pentaclorado(Pentaclosano),ascomolarupturadelenlaceterdelfenoxifenoldandolugaral2,4
diclorofenol y el 2,3,4triclorofenol. En los estudios de cloracin del triclosn se identificaron los
siguientescompuestos:
Atiemposderetencinsuperioresaltriclosn,seencontrarontrespicoscromatogrficos.
Los dos primeros presentaron el mismo espectro de masas, con una distribucin isotpica
correspondiente a un compuesto tetraclorado, cuyo pico base (m/z 379+381+383) aparece 34
unidadesporencimadelin[M57]+deltriclosn(m/z345+347).Estosdospicosseasignaronalos
dos ismeros posicionales 4,5dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol y 5,6dicloro2(2,4
diclorofenoxi)fenol,loscualesprovienendelasustitucinelectrfilaaromticadeunH,porunCl,en
lasposiciones ortoo paraalgrupohidroxiloenlaestructuradeltriclosn.Enelespectrodemasas
delafiguraIII.16,semuestraelpatrndefragmentacinparaestoscompuestos.Dadoquenoestn
disponibles comercialmente, no se ha podido confirmar su identidad con patrones, y por lo tanto
establecercualdelosdosismerostetracloradosemergeantesdelacolumnacromatogrfica.Por
estarazn,loshemosdenominadoTetraIyTetraII,enbaseasustiemposderetencin.
FiguraIII.16.CromatogramayespectrodemasasparalosclosanosTetraIyTetraII,comoespecies
sililadas.
kCts
m/z=379+381+383
150 Cl OH
O 381
Cl 100%
Cl Cl 75%
100 50%
234
25%
346
0%
200 250 300 350 400 m/z
50
24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5

minutos
148
HalogenacinTriclosn
Atiempoderetencintresminutosymedioporencimadeltriclosn,seidentificotropico
cromatogrfico cuyo espectro de masas corresponde a una especie pentaclorada de masa 68
unidadessuperioraladeltriclosn,provenientedelasustitucindedoshidrgenospordostomos
decloro.TalcomodescribiOnodera,correspondealderivadopentacloradodeltriclosn,el4,5,6
tricloro2(2,4diclorofenoxi)fenol,figuraIII.17.
FiguraIII.17.Cromatogramayespectrodemasasparaelpentaclosanosililado.
kCts m/z=413+415+417
400
Cl OH
415
O Cl 100%
300 75%
Cl Cl
Cl
50%
25%
200 268
380
0%
250 300 350 400 m/z
100
26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5

minutos

Junto con estos tres compuestos, aparecen tambin dos clorofenoles procedentes de la
rupturadelenlaceterenlaestructuradeltriclosn.Eldiclorofenolpresentaelmismotiempode
retencinqueel 2,4diclorofenol, mientras que el triclorofenol obtenido no se corresponde con el
descrito en la bibliografa. Para identificar el triclorofenol y confirmar que el diclorofenol
correspondealismerosustituidoenlasposiciones2,4,seinyectaronpatrones,enacetatodeetilo,
delosdistintosismerosdediclorofenolesytriclorofenoles,derivatizadosconMTBSTFAyBSTFA,as
como extractos de estas pruebas de cloracin sililados con ambos derivatizantes. Los tiempos de
retencinobtenidossemuestranenlasiguientetabla(tablaIII.13).

149
Tabla III.13. Tiempos de retencin de los dicloro y triclorofenoles tertbutildimetilsililados y

trimetilsililados.
Clorofenol trtertbutildimetilsililado(min) trtrimetilsililado(min)
3,5diclorofenol 15.38 12.45
2,3,4triclorofenol 18.22 15.28
Diclorofenoldetectado 15.83 12.63
Triclorofenoldetectado 17.41 14.22
ComosepuedeobservarenlatablaIII.13,lautilizacindeMTBSTFAcomoderivatizanteno
permiti resolver varios ismeros a lnea base. Experimentos adicionales, usando BSTFA,
posibilitaronlaidentificacindeldicloroytriclorofenolprocedentesdeladegradacindeltriclosn.
Paraelcasodetriclorofenol,elusodeMTBSTFAindica3posiblescandidatos:el2,3,5;2,4,5y2,4,6
TCF. La utilizacin del BSTFA permiti resolver mejor estos compuestos, y confirmar que la seal
para el compuesto trimetilsililado a 14.2 minutos presente en el extracto de los experimentos de
halogenacin,correspondeconel2,4,6triclorofenol.Losderivadostertbutildimetilsililadosdel2,4
DCF y 2,6DCF presentaron el mismo tiempo de retencin. La derivatizacin del extracto y de los
patronesconBSTFAconfirmqueelpicoqueemergea12.6minutoscorrespondeconel2,4DCF.
Lapresenciadel2,4,6triclorofenolenelmediodereaccin,envezdel2,3,4triclorofenol,
indicaqueestecompuestoprovienedelacloracindel2,4diclorofenol,procesocinticamentemuy
favorable.El2,4diclorofenolseformaporlarupturadelenlaceterenlaestructuradeltriclosn.
Adems de estos cinco productos, se detect tambin la presencia de otras especies
halogenadasentrelostiemposderetencindel2,4,6triclorofenolyeltriclosn.Estasespeciesson
minoritarias,yaparecenaconcentracionesdecloroelevadas,cuandonoseaadaelagentereductor
(tiosulfatosdico)paraeliminarelexcesodeoxidante.Experimentosadicionalesutilizandoelcido
ascrbico (vitamina C) como agente reductor, tampoco mostraron la presencia de estos
subproductos. En la siguiente figura (fig. III.18) se muestran los cromatogramas de esas especies,
150
HalogenacinTriclosn
obtenidosparauntiempodereaccinde1horaydistintasconcentracionesdecloro(entre0y1.6
mg/L), as como los espectros de masas correspondientes. Para estas pruebas no se detuvo la
reaccinconunreductor,sinoqueunaveztranscurridoeltiempoestablecido,seajustelpHa2.5e
inmediatamente, las muestras se concentraron mediante SPE. De acuerdo con los espectros de
masas obtenidos se identificaron como derivados tertbutildimetilsililados de dihidroxifenoles
(resorcinoles) sustituidos con uno, dos o tres tomos de cloro. Estos se forman por la ruptura del
enlaceterdelTCSolosclosanostetraypentaclorados,permaneciendolosdosgruposhidroxiloen
el mismo anillo aromtico. El pico base en los espectros corresponde a la prdida del grupo tert
butilodeunodelosdoshidroxilossililados.Elrestodefragmentacionesprocedendelaprdidade
cloro (35 unidades), tertbutilo (57 unidades), cloro y tertbutilo (92 unidades) cloro y tert
butildimetilsilil(150unidades).
Figura III.18. Cromatogramas, espectros de masas y estructuras propuestas para los productos
minoritariosdecloracindeltriclosn,adistintasconcentracionesdeclorolibre.
kCts
[M57]+
315
10.0 100%
OTBDMS
OTBDMS 75%
[M5735]+
[M5757]+
50%
258
Cl 280
7.5 25% [M57150]+ [M]+
165 372
0%
150 200 250 300 350 400
0mg/LClorolibre m/z
5.0 0.04mg/LClorolibre
0.08mg/LClorolibre
0.2mg/LClorolibre
0.4mg/LClorolibre
2.5 0.8mg/LClorolibre
1.6mg/LClorolibre
0.0
19.9 20.0 20.1 20.2 minutos
151
kCts
OTBDMS
40 OTBDMS
[M57]+
349
Cl2 100%
75%
30 [M5735]+
0mg/LClorolibre 50%
[M5792]+ 314
0.04mg/LClorolibre 25% [M57150]+ 257 [M]+
0.08mg/LClorolibre 199 293
0% 406
0.2mg/LClorolibre
20 150 200 250 300 350 400
0.4mg/LClorolibre m/z
0.8mg/LClorolibre
1.6mg/LClorolibre
10
21.25 21.30 21.35 21.40 21.45 21.50 minutos
kCts
4
OTBDMS
OTBDMS [M57]+
100% 385
3
75%
Cl3
[M5792]+
50%
291
[M57150]+
25% 233
2 0mg/LClorolibre 0%
0.04mg/LClorolibre 150 200 250 300 350 400 450
m/z
0.08mg/LClorolibre
0.2mg/LClorolibre
1 0.4mg/LClorolibre
0.8mg/LClorolibre
1.6mg/LClorolibre
0
22.80 22.85 22.90 22.95 23.00 23.05 23.10 minutos
152
HalogenacinTriclosn
Enlabibliografanoexistenreferenciasdescribiendolaformacindeestosresorcinolesen
presenciadeclorolibre,sibienesciertoqueFerrerycolaboradores[FerrerI;2004]detectaronel
clorofenoldihidroxiladocomounintermedioinestableenlafotodegradacindeltriclosn.
Adems de los compuestos sealados, en algunas pruebas realizadas con elevadas
concentraciones de cloro y tiempos de reaccin largos, se encontr a19.5 minutosun compuesto
cuyoespectrocorrespondeconuntetraclorofenol.Debidoaquelasealresultserpocointensay
puesto que slo apareci tras un tiempo de reaccin elevado, no se consider en el estudio de
evolucin de los subproductos de cloracin del TCS, al igual que los resorcinoles. En la siguiente
figura(figuraIII.19),semuestraelpicocorrespondientealtetraclorofenolascomosuespectrode
masas.
Figura III.19. Cromatogramas para el tetraclorofenol (producto minoritario) a distintos tiempos de

reaccin,enaguaapH7.3con0.4mg/Ldeclorolibrey10ng/mLdetriclosn.
kCts
3.0 60% 289
Ominutos
50%
2minutos
6minutos 40%
2.5
10minutos 30%
1hora 20%
2.0 2horas 223 254
10% 323
3horas 0%
1.5 200 250 300 350
m/z
1.0
0.5
0.0
19.00 19.25 19.50 19.75 20.00 minutos
3.5.5.Evolucintemporaldelosproductosmayoritarios
Unavezidentificadosloscompuestosdehalogenacindeltriclosn,formadosenpresencia
de cloro libre, se investig su evolucin temporal para poner de manifiesto la estabilidad de los
mismos.Parallevaracaboesteestudio,seprepararonunaseriedemuestrasdeaguaultrapuracon
distintas concentraciones de cloro libre (0.4 y 1.4 mg/L), a pH 7.3, y con una cantidad inicial de
triclosnde50ng/mL.Losresultadosobtenidosparadistintostiemposdereaccinseobservanen
lasfigurasIII.20.AyIII.20.B,endondeserepresentalasealrelativaalreadepicodeltriclosnpara
tiempo0minutos.
153
Figura III.20.A. Evolucin temporal de los cloroderivados del TCS con 0.4 mg/L de cloro libre.
2,4DCF 2,4,6TCF TetraI TetraII Penta
0.6
0.5
Respuestanormalizada
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo(min)
Figura III.20.B. Evolucin temporal de los cloroderivados del TCS con 1.4 mg/L de cloro libre.
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 50 100 150 200
Tiempo(min)
Como se puede comprobar en las figuras anteriores, a tiempos relativamente cortos los
fenoxifenoles tetraclorados fueron los subproductos predominantes. La respuesta del Tetra II fue
mayorfrentealTetraI,demodoquesepresumequeelTetraIIcorrespondeconelderivado4,5
dicloro2(2,4diclorofenoxi)fenol, puesto que la posicin para al hidroxilo presenta menor
impedimento estrico frente a la posicin orto. En un momento dado, la seal del Pentaclosano
aumenta exponencialmenteen detrimento de la seal de los Tetraclosanos hastaque desciende a
154
HalogenacinTriclosn
favor de los clorofenoles. Como productos finales, el 2,4diclorofenol y el 2,4,6triclorofenol, se

mantuvieronanivelesprcticamenteconstantesdentrodelintervalodetiempoconsiderado.

Experimentos adicionales, realizados con el 2,4DCF para observar su comportamiento en
presencia de cloro, as como estimar su tiempo de vida media con 1.44 mg/L de cloro libre y 50
ng/mLde2,4DCF(t1/27.8minutos)mostraronlaconversinntegradel2,4DCFen2,4,6TCFen1
hora. A partir de ese momento la concentracin de 2,4,6TCF comenz a decaer hasta la mitad,
mantenindoseprcticamenteconstanteapartirdelas2horas,figuraIII.21.

FiguraIII.21.Evolucintemporaldel2,4DCFa2,4,6TCFcon1.44mg/Ldeclorolibre.Concentracin
inicialde2,4DCF50ng/mL.
1.2 2,4DCF 2,4,6TCF
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tiempo(min)

ElrendimientomolardelaconversindelTCSen2,4DCFy2,4,6TCFseestudiatrespHs
diferentesusando0.4mg/Ldeclorolibre,yunaconcentracininicialdetriclosnde50ng/mL,para
tiemposdereaccinde5y15minutos.LosporcentajesdeconversinsemuestranenlatablaIII.14.

Tabla III.14. Rendimientos molares (%) de conversin del triclosn en los clorofenoles relacionados
para0.4mg/Ldeclorolibre(N=3).ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
pH6.3 pH7.3 pH8.3
Compuesto 5min 15min 5min 15min 5min 15min
2,4DCF 2.80.2 7.10.6 4.40.5 8.80.8 1.00.2 5.00.7
2,4,6TCF 0.300.05 0.590.05 0.90.1 2.50.4 0.220.04 1.80.3
155
El mecanismo de degradacin de triclosn y su conversin final en 2,4DCF y 2,4,6TCF se

muestraenlasiguientefigura,figuraIII.22.Cabedestacarquetantoel2,4DCFcomoel2,4,6TCFson
considerados por la EPA como candidatos a la lista de disruptores endocrinos y posibles
carcingenos[http://www.epa.gov].
FiguraIII.22.Mecanismodedegradacindeltriclosnenaguascloradas.
Cl OH
O Cl Pentaclosano
Cl OH
Cl Cl
OH O Cl
Cl Tetraclosanos
O Cl OH
Cl Cl
O Cl
Cl Cl
TCS Cl Cl
Cl Cl
Cl
Cl
OH Cl OH
OH
2,4,6TCF
Cl Cl
Cl Cl 2,4DCF 2,3,4TCF

3.5.6.Estudiosdecloracinenaguadegrifo
Lareactividaddeltriclosnenaguaultrapura,conuncontenidoconocidodeclorolibre,fue
confirmadarealizandoexperimentossimilaresenaguadegrifo.Lamuestraserecogienunabotella
mbary,previamentealarealizacindelosexperimentos,sedeterminlaconcentracindecloro
libre con un fotmetro tal como se ha indicado en la seccin 3.1.4. La concentracin obtenida de
clorolibreenlamuestrafuede0.430.3mg/L.Setomaronvariasalcuotasde250mL,lascuales
fuerondistribuidasenbotellasmbarde300mL.SetamponaronapH7.3yseadicionunpatrnde
triclosnenmetanolparatenerunaconcentracinenaguade50ng/mL.Trasuntiempodereaccin
debidamentecontrolado,seaadielagentereductoreliminandoaselexcesodecloroenelmedio,
y se concentr la muestra mediante la metodologa de SPE desarrollada. En estas condiciones, el
tiempodevidamediadeltriclosnfuede1.9minutos,datoanlogoalobtenidoparaaguaultrapura
conconcentracindeclorosimilar(t1/22.2minpara0.4mg/Ldeclorolibre).EnlafiguraIII.23,se
muestraelperfildeformacindeloscompuestosderivadosdeltriclosnenaguadegrifo.
156
HalogenacinTriclosn
FiguraIII.23.Perfildeformacindeloscompuestoscloradosenaguadegrifoconteniendo0.43mg/L
declorolibre.ConcentracininicialdeTCS50ng/mL.
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Tiempo(min)

Laevolucintemporaldeloscompuestossiguiunperfilanlogoalmostradoenlafigura
III.20.A, pudiendo extrapolar los resultados obtenidos con agua ultrapura a agua de grifo. De este
modo,seponedemanifiestoqueeltriclosnpuedesufrirprocesosdecloracinenaguadegrifo,lo
que se traduce en la potencial exposicin por va drmica a sus productos de reaccin y, por
supuesto,enladescargadestosalmedioacuticoatravsdelasaguasresiduales.

3.5.7.Presenciadecompuestoshalogenadosenmuestrasreales
Dadoqueeltriclosnreaccionarpidamenteenaguascloradas,seevalulapresenciade
los productos de cloracin en muestras de agua residual debido al uso de PPCPs, conteniendo
triclosnensuformulacin,ysucontactodirectoconaguadegrifoclorada.Enlasmuestrasdeagua
residual, se detectaron 2,4diclorofenol y 2,4,6triclorofenol. Con respecto a la presencia de los
closanospoliclorados,susnivelessonmuybajosaunqueenalgunasmuestras,conunaltocontenido
de triclosn, se encontraron trazas de los mismos. En la figura III.24, se puede observar la seal
cromatogrfica de estos derivados halogenados del triclosn en una muestra de agua residual sin
tratar,conunaconcentracinmedidadetriclosnde14ng/mL.
157
Figura III.24. Cromatogamas de GCMS mostrando la presencia de triclosn, tetra I, tetra II y

pentaclosanoenunamuestradeaguaresidualsintratarconaltocontenidoentriclosn.
MCts
347
TCS
1.5 100%
75%
200
50%
1.0
25% 310
0%
0.5 150 200 250 300 350 400 m/z
0.0
kCts
Tetraclosanos IyII
10.0 381
100%
7.5 75%
50% 234
5.0 25%
0%
2.5 150 200 250 300 350 400 m/z
0.0
kCts
6
Pentaclosano
415
100%
5 75%
4 50% 270
25% 381
3
0%
2 150 200 250 300 350 400 m/z
0
23 24 25 26 27
minutos
158
HalogenacinParabenes

3.6.Halogenacindeparabenes
3.6.1.Pruebaspreliminares
Al igual que el triclosn, los parabenes son compuestos fenlicos susceptibles de sufrir
sustituciones electrfilas aromticas en la posicin orto al grupo hidroxilo. Para verificar este
comportamiento,serealizaronunaseriedepruebasenaguaultrapura,tamponadaapH7.3,con
adicindeclorolibreanivelde0.4mg/L.Traslaadicindelospatronesenmetanoldemetilparaben
y propilparaben, las muestras se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos,
tras los cuales el exceso de cloro libre fue eliminado con tiosulfato sdico. Las muestras fueron
concentradas, mediante la metodologa de SPE desarrollada para el anlisis de parabenes en
muestrasacuosasy,trasladerivatizacindelosextractos,seinyect1LenelsistemaGCMSen
full scan.En los cromatogramas obtenidos se observunaclara disminucin en la seal de ambos
parabenes(tablaIII.15),loqueindicqueestostambinreaccionanenmediosclorados.Enbasea
estosprimerosresultados,sellevacaboelestudiosistemticodelosparmetrosqueafectanala
halogenacin los parabenes ms comunes en PPCPs (MeP, EtP, PrP y BuP) cuando entran en
contactoconaguaconteniendoclorolibre.
TablaIII.15.SealdeMePyPrPtras30minutosdereaccin.Concentracindeclorolibre0.4mg/Ly
40ng/mLparacadaanalito,aliniciodelareaccin.
Sealrelativaatiempo0minutos
MeP 11%
PrP 13%
3.6.2.DegradacinadistintospHsyconcentracionesdeclorolibreenaguaultrapura
El pH del medio y la concentracin de cloro fueron dos de los factores estudiados

previamente a la evaluacin de la cintica de reaccin. Del mismo modo que para el triclosn, se
consideraronpHscomprendidosentre6y9unidades,ascomoconcentracionesdeclorolibreentre
0 y 2.4 mg/L. Se realizaron una serie de experimentos usando muestras de 100 mL de agua,
tamponadas a los pHs anteriores, con una concentracin inicial de 40 ng/mL para uno slo de los
analitosconsiderados(MeP,EtP,PrPyBuP).Trasuntiempodereaccinde10minutos,seaadieron
10mgdetiosulfatosdicoparaeliminarelexcesodeclorolibrepresenteenelmedio.Lasmuestras
159
se ajustaron a pH cido y se concentraron con la metodologa desarrollada para la extraccin de

estos compuestos en muestras acuosas mediante SPE, descrita en este captulo. Los resultados
obtenidos para los cuatro compuestos fueron idnticos. En la figura III.25, se muestra el
comportamientoparaelMePyelPrP.

Figura III.25. Perfil de degradacin de MeP y PrP para concentraciones de cloro y pHs variables.
Tiempodereaccin10minutos,concentracininicialdeanalito40ng/mL.
pH6.8 pH7.3 pH8 pH8.6 pH6.3
1.2 1.2
Sealnormalizada(MeP)
Sealnormalizada(PrP)
1 1
0.8 0.8
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.08 0.2 0.4 0.8 1.6 2.4 0 0.08 0.2 0.4 0.8 1.6 2.4
mg/Lclorolibre mg/Lclorolibre
Enambasfiguras,seobservaunaclaradisminucindelasealdeloscompuestoscuandola
concentracin de cloro libre sobrepasa 0.4 mg/L. Este comportamiento fue ms acusado a pHs
comprendidosentre7.3y8.0,puestoqueelcidohipoclorosotodavaestpresenteenelmedio,
mientrasqueelequilibriofenolfenolatodelosparabenes(pKa8.28.3)comienzaadesplazarsehacia
laformabsica.
3.6.3.Cinticasdehalogenacinenaguaultrapurayaguadegrifo
Lacinticadedegradacindelosparabenesenaguaultrapurafueestudiadaconsiderando
dos concentraciones de cloro libre diferentes: 0.4 y 1.6 mg/L (5.63 y 22.53 M como hipoclorito,
respectivamente). Para la realizacin de estos experimentos, alcuotas de 250 mL de agua
tamponadaapH7.3fueronfortificadasindividualmenteconcadacompuestoaunaconcentracin
de 910 ng/mL (4570 nM). Tras un tiempo dado, se detuvo la reaccin y se concentraron las
160
muestras. Los extractos obtenidos, una vez derivatizados, fueron inyectados en el sistema GCMS.
Dado que la concentracin de cloro presente en el medio se mantuvo en exceso, la velocidad de
reaccin fue funcin nicamente de la concentracin de cada paraben. La representacin del
logaritmo neperiano de la concentracin de analito frente al tiempo de reaccin transcurrido,
proporcion las siguientes representaciones, figura III.26. De nuevo la desaparicin de los analitos
obedeceaunacinticadeorden1.
FiguraIII.26.CinticasdedegradacinparaEtPyBuPcon0.4y1.6mg/Ldeclorolibre.Concentracin
inicialdeanalito10ng/mL.
EtP,0.4mg/Lcl orol i bre BuP,0.4mg/Lcl orol i bre
y=0.0266x+3.9453 y=0.0251x+3.9806
4.5 2
4.5
4 R =0.9961 2
R =0.991
4
Ln[EtP]
Ln[BuP]
3.5
3 3.5
2.5 3
2
2.5
0 10 20 30 40 50 60
0 20 40 60
Ti empo(mi n)
Ti empo(mi n)

EtP,1.6mg/Ldeclorolibre BuP,1.6mg/Lclorolibre
5 5 y=0.1384x+3.8854
y=0.1307x+4.1597
4 2
R =0.9968 4 2
R =0.9914
Ln[BuP]
Ln[EtP]
3 3
2 2
1 1
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Tiempo(min) Tiempo(min)

Losestudiosdevelocidaddereaccintambinserealizaronutilizandoaguadegrifocondos
concentraciones de cloro libre diferentes. Las muestras empleadas en estos estudios contenan
originalmente0.46y0.2mg/Ldeclorolibre.Laprimeraseutiliztalcomoseobtuvo,paracomparar
conlostiemposdevidamediaparaaguaultrapuracon0.4mg/Ldecloro,mientrasquelasegunda
fuefortificadaconladisolucindehipocloritosdicoparaobtenerunaconcentracinfinaldecloro
librede1.6mg/L.TraselajustedelpHdelmedioa7.3ylaadicindelcorrespondientecompuesto
161
(910 ng/mL en agua) se dejaron reaccionar los mismos tiempos seleccionados para los
experimentosconaguaultrapura.Losresultadosobtenidosmostraronqueparaelaguadegrifo,la
cintica de reaccin sigue el mismo comportamiento que para agua ultrapura, obteniendo los
tiemposdevidamediaqueserecogenenlatablaIII.16.
TablaIII.16.Tiemposdevidamedia(minutos)delosparabenespara0.4y1.6mg/Ldeclorolibre.
Concentracininicialdeanalito10ng/L.
t1/2(min)

AguaUltrapura Aguadegrifo
Clorolibre
0.4 1.6 0.46 1.6
(mg/L)
MeP 33.8 4.6 31.5 4.7
EtP 26.1 5.3 31.5 4.7
PrP 30.9 4.2 30.3 4.6
BuP 27.6 5.0 29.9 4.4
Talcomosepuedecomprobar,lostiemposdevidamediaparaaguaultrapuraconadicin
de hipoclorito y agua de grifo clorada fueron muy similares. Teniendo en cuenta que los
experimentossellevaronacaboendistintosdas,ysincontrolexactodelatemperaturadelagua(15
2C),lasdiferenciasentrelosvaloresencontradosparaambasmuestrassonmnimas.
3.6.4.Identificacindelosproductosdetransformacin:Parabenescloradosybromados.
Lahalogenacindelosparabenesenaguadegrifodilugaralaformacindecincotiposde
derivadoshalogenados.Losespectrosdemasasparalosdosproductosmayoritarios,presentesenel
medio,tienenunperfilisotpicotpicodecompuestosmonocloradosydiclorados.Lospicosbaseen
susespectrosaparecena34y68unidadesdem/zporencimadeloscorrespondientesalparabende
partida,porloquesededucequeprocedendelasustitucinelectrfilaaromticadeuntomode
hidrgenoporuntomodecloroenlaposiciones ortoalhidroxilo,puestoquelaposicin paraest
bloqueadaconelgruposter,figuraIII.27.
162
FiguraIII.27.Cromatogramasyespectrosdemasasparaloscompuestosmonocloradosydiclorados
procedentesdelosparabenesestudiados.
kCts
150 243
100%
O
125 75% TBDMSO
50%
100
25% 119 163 OMe
Cl
75 0%
100 150 200 250 m/z
50
25
0
kCts
257
100%
150
O
75%
TBDMSO
50% 149
100 25% OEt
0%
Cl
50 100 150 200 250 m/z
0
kCts
271
150 100%
O
75% TBDMSO
100 50%
25% 149 OPr
Cl
50 0%
100 150 200 250 m/z
0
kCts
285
150 100%
75%
O
TBDMSO 50%
100 25% 149
OBu
Cl 0%
100 150 200 250
50 m/z
0
17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0
minutos
163
kCts
277
150 100% Cl
75%
O
100 50%
25%
TBDMSO
183 218
0% OMe
50 100 150 200 250 m/z Cl
0
kCts
Cl 291
200 100%
75%
O
150 TBDMSO 50% 183

25%
100 OEt 147
Cl 0%
150 200 250 300 m/z
50
0
kCts
200 305 Cl
100%
O
75%
150
50% TBDMSO
100 25% 183
147 OPr
0% Cl
50 150 200 250 300 m/z
0
kCts
250 Cl 319
100%
200 75%
O
TBDMSO 50%
150
25%
OBu 183
100 Cl 0%
150 200 250 300 m/z
50
0
18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0
minutos
La existencia de patrones comerciales de 3clorometilparaben (3ClMeP) y 3

cloroetilparaben (3ClEtP) permiti confirmar la identidad de estos dos subproductos en los
experimentosdecloracinrealizados.Paraello,seprepararondisolucionesindividualesenmetanol
de estos dos compuestos de 2000 mg/L y, por dilucin con acetato de etilo, dos patrones de
concentraciones0.7y2mg/L.Alcuotas(500L)estospatronesmsdiluidosfueronderivatizados
enlascondicionesutilizadasparalosparabeneseinyectadosenelsistemaGCMS.Elcromatograma
obtenidoparacadaunodelospatrones,muestraunpicocuyotiempoderetencinyespectrode
masascoincidenconloscorrespondientessubproductosdecloracinidentificadosparaelMePyel
EtP,figuraIII.28.
164
FiguraIII.28.Patrones(lneadiscontinua)de3ClMeP(0.7mg/L)y3ClEtP(2mg/L)solapadosconlos
subproductos monoclorados del MeP y EtP, detectados en las pruebas de halogenacin (lnea
continua).
kCts kCts
3ClMeP 800
3ClEtP
100
700
75 600
500
50 400
300
25 200
100
0 0
16.75 17.00 17.25 17.50 17.75 17.6 17.7 17.8 17.9 18.0 18.1 18.2
minutos minutos

Los tiempos de vida media para estos compuestos fueron estudiados en las mismas
condiciones de pH y concentraciones de cloro libre utilizadas para los parabenes. De nuevo, la
desaparicin de amboscompuestos obedeci aunacintica de pseudoprimer orden. Los tiempos
devidamediaevaluadosenaguaultrapurasemuestranenlatablaIII.17.
Tabla III.17. Cinticas de cloracin para3ClMeP y 3ClEtP junto con sus tiempos de vida mediaen
aguaultrapura.Concentracininicialdeanalito10ng/mL.
Clorolibre R2 t1/2(min)
0.4mg/L 0.9927 31.2
3ClMeP
1.6mg/L 0.9984 6.6
0.4mg/L 0.9907 31.9
3ClEtP
1.6mg/L 0.9935 8.1
Como se puede comprobar los tiempos de vida media fueron similares a los de los
compuestosdepartida(tablaIII.16)paralasdosconcentracionesdeclorolibreensayadas.Adems,
seconfirmlaformacindelosderivadosdicloradosapartirdel3ClMePy3ClEtP.
Los experimentos realizados con agua de grifo y parabenes revelaron la formacin de los
derivados clorados descritos anteriormente, as como tres productos adicionales para cada analito
de partida. En base a sus espectros de masas se identificaron como compuestos bromados. La
formacindeestosnuevosproductospodradebersealaexistenciadetrazasdebromuroenelagua
de grifo, el cual es oxidado a bromo en presencia de hipoclorito, reaccionando finalmente con el
anilloaromticodeloscompuestosfenlicosmedianteunasustitucinelectrfilaaromtica [Inaba
165
K;2006].EnlafiguraIII.29sepuedeobservarloscromatogramas,conlosrespectivosespectrosde
masas,paraloscompuestosbromadosascomosusestructuras.
Figura III.29. Cromatogramas de los derivados bromados de los parabenes encontrados en

experimentos realizados con agua de grifo, con sus respectivos espectros de masas y estructuras
propuestas.
kCts
15.0 289
100%
O
12.5 75% TBDMSO
50%
10.0 OMe
25% Br
7.5 0%
150 200 250 300 m/z
5.0
2.5
0.0
kCts
303
15 100%
75%
O
TBDMSO 50%
10 149
25% 313
OEt 0%
Br 150 200 250 300 m/z
5
0
kCts
317
100%
O
15
75% TBDMSO
50%
10 25% 149 OPr
273 Br
0%
150 200 250 300 m/z
5
0
kCts
331
100%
O
15 75%
TBDMSO
50%
OBu 25% 149 273
10 Br
0%
150 200 250 300 350 m/z
5
0
18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 minutos

166
kCts
323
100% Cl
25 75%
O
50% TBDMSO
20
25% 183 264
147 349
15 0% OMe
150 200 250 300 350 Br
m/z
10
0
kCts
100% 337
30
Cl 75%
O
50%
20 TBDMSO 25% 148 184 227 349
OEt 0%
Br 150 200 250 300 350
m/z
10
kCts
30 351
100%
Cl
75%
O
20 50%
25%
TBDMSO
147 184 313
0% OPr
10 100 150 200 250 300 350 m/z Br
0
kCts
30
365
25 Cl 100%
75%
O
20
TBDMSO 50%
15 25%
OBu 0%
10 Br 100 150 200 250 300 350 m/z
5
0
19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0
minutos
167

kCts
Br
1.25 367
O
25%
1.00 20% TBDMSO
15% 253
10% 188 329 389
OMe
0.75 5% Br
0%
200 250 300 350 400
0.50 m/z
0.25
0.00
kCts
313 Br
1.5 100%
75% 381
O
50% 351 TBDMSO
1.0 25% 227 252 281 337
OEt
0%
200 250 300 350 400
Br
m/z
0.5
0.0
kCts
Br
395
1.25 100%
O
75% TBDMSO
1.00 50% 327
25% 285 341 377 OPr
0.75 231 Br
0%
200 250 300 350 400
0.50 m/z
0.25
0.00
kCts
1.5 Br 341 409

100%
75%
O
TBDMSO 50%
1.0
25% 149 207
OBu
Br 0%
150 200 250 300 350 400 450
0.5
0.0
20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5
minutos
Paraverificarestahiptesis,sellevaronacabounaseriedeexperimentosconaguadegrifo
conuncontenidodeclorolibrede0.53mg/L.UnaveztamponadaapH7.3,lamuestrafuedividida
en dos alcuotas de 250 mL, adicionando a una de ellas 1 ng/mL de bromuro, como bromuro
potsico.Aambasalcuotasselesaadiunpatrnconteniendoloscuatroparabenes,demodoque
laconcentracindeestosenaguafuesede10ng/mL,ysedejreaccionardurante20minutos.Los
168
resultadosobtenidosmostraronunadisminucinsignificativadelasealdeloscompuestosclorados
a favor de los bromados en la muestra fortificada con bromuro potsico, lo que sugiri una
competencia entre ambos dentro de la reaccin de sustitucin electrfila aromtica. En la figura
III.30,seobservalainfluenciadelaadicinde1ng/mLdebromuroenlaformacindelosderivados
halogenadosparaelEtPyelBuP.
Figura III.30. Influencia de la adicin de 1 ng/mL de bromuro en la formacin de los derivados

halogenadosdelEtPydelBuP.Aguadegrifo(0.53mg/Lclorolibre)apH7.3,tiempodereaccinde
20minutos.
Aguadegrifo Aguadegrifo+1ng/mLdebromuro Aguadegrifo Aguadegrifo+1ng/mLdebromuro
3,5BrEtP 3,5BrBuP
ClBrEtP ClBrBuP
3,5ClEtP 3,5ClBuP
3BrEtP 3BrBuP
3ClEtP 3ClBuP
EtP BuP
0.E+00 1.E+05 2.E+05 3.E+05 4.E+05 5.E+05 6.E+05 0.E+00 2.E+05 4.E+05 6.E+05 8.E+05
readepico readepico

Para confirmar la mayor tendencia del bromo que el cloro para dar lugar a reacciones de
sustitucinconlosparabenes,serealizaronestudiosconaguaultrapuraconunaconcentracinfija
de cloro libre (0.4 mg/L) y niveles crecientes de bromuro (1, 10 y 65 ng/mL) como sal potsica. El
tiempodereaccinylaconcentracininicialdecadaparabensemantuvieronen20minutosy10
ng/mL,respectivamente.Losresultados,tablaIII.18,pusierondemanifiestoquelaadicindebromo
alanillofenlicoesmuchomsfavorablefrentealadecloro,loqueconcuerdaconlaspredicciones
deRichardson [RichardsonSD;2003].As,cuandolaconcentracininicialdebromuroes40veces
inferior a la de cloro libre (10 ng/mL frente a 400 ng/mL, respectivamente) predominan los
productosdetranformacinbromadosfrentealosclorados.
Comoconsecuenciadeestecomportamiento,lasespeciesbromadasseesperancomosub
productosmayoritariosdereaccinentrelosparabenesyaguadegrifocloradaenaquellasregiones
dondelascaptacionespresentannivelesdebromuroelevados,comosonzonascosterasoreascon
depsitossalinos,loscualespuedencontenerhasta1mg/Ldebromuro[vonGuntenU;2003][Inaba
K;2006].Cabeindicarque,deformagenrica,loscompuestosbromadospresentanmayortoxicidad
frente a los clorados [Hansch C; 1972], aunque no hay datos especficos sobre la toxicidad de los
derivadoshalogenadosdelosparabenes.

169
Tabla III.18. Relacin entre las reas de pico para los derivados halogenados de los parabenes en
aguaultrapuracon0.4mg/Ldeclorolibreydistintoscontenidosdebromuro.
Concentracininicialdebromuro(ng/mL)
Compuesto Relacinreas
1 10 65
3ClMeP/3BrMeP 2.19 0.13 <105
MeP 4
3,5DClMeP/3,5DBrMeP 9.67 0.02 2.3x10
3ClEtP/3BrEtP 2.51 0.16 <105
EtP 5
3,5DClEtP/3,5DBrEtP 10.32 0.02 <10
3ClPrP/3BrPrP 2.43 0.12 <105
PrP 4
3,5DClPrP/3,5DPrMeP 12.72 0.02 1.7x10
3ClBuP/3BrBuP 2.71 0.15 <105
BuP 5
3,5DClBuP/3,5DBrBuP 10.53 0.02 <10
3.6.5.Evolucintemporaldelosderivadoscloradosdelosparabenes
La estabilidad de los compuestos estudiados, tanto los de partida como los derivados
halogenados,fueestudiadaparavariasconcentracionesdeclorolibre(0.4,0.8,1.6y5mg/L).Enla
figura III.31 se muestra la estabilidad del EtP para esas concentraciones de cloro y tiempos de
reaccinrelativamentebajos.
FiguraIII.31.EstabilidadtemporaldelEtPenaguaultrapuracondistintasconcentracionesdecloro
libre.ConcentracininicialdeEtP10ng/mL.
1.2
0.4mg/L
1
Sealrelativa
0.8mg/L
0.8
0.6 1.6mg/L
0.4 5mg/L
0.2
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo(min)
Comosepuedeobservarenlafigura,aconcentracioneselevadasdeclorolibreenelmedio
dereaccin,eldecaimientodelasealdelcompuestodepartidaesmsrpido,talcomoyahaba
sidodescritoenlaseccin3.6.2.Laevolucintemporaldeloscompuestoshalogenadosseestudia
concentracioneselevadasdeclorolibre(5mg/L)yatiemposcomprendidosentre0y180minutos.
EnlafiguraIII.32,sepuedeobservarestaevolucinparalosderivadoscloradosdeletilparabenen
agua a pH 7.3. La especie predominante a tiempos de reaccin largos es el 3,5DClEtP, lo que
demuestra su escasa labilidad frente a sucesivas cloraciones o rupturas del anillo aromtico a
170
diferencia de lo que ocurra en el caso del triclosn. El resto de parabenes present un

comportamientoanlogo.
FiguraIII.32.EvolucintemporaldelosderivadoscloradosdelEtPenaguaultrapuraapH7.3,con5
mg/Ldeclorolibrey10ng/mLdeEtPiniciales.
2.5 EtP
3ClEtP
2
Sealrelativa 3,5DClEtP
1.5
0.5
0
0 50 100 150 200
Tiempo(min)
Enbasealainformacinexpuestaanteriormentelarutadehalogenacindelosparabenes
resultaextraordinariamentesencilla,figuraIII.33.
FiguraIII.33.Rutadelahalogenacindelosparabenesenmuestrasdeaguaconclorolibreytrazas
debromuro.
O O
Cl
C OR C OR
HO HO
Cl Cl
O
3,5ClPB
O 3ClPB Br
C OR
C OR
HO
HO
3Br5ClPB
Cl
PB O O
Br
C OR C OR
HO HO
Br Br
3BrPB 3,5BrPB

171
3.6.6.Formacindederivadoshalogenadosdelosparabenesenaguadegrifoencontacto
conproductosdecuidadopersonal
Desdeunpuntodevistaecotoxicolgicoesrelevanteconocersilasreaccionesdecloracin
y bromacin descritas anteriormente pueden tener lugar cuando productos de cuidado personal,
quecontienenensuformulacinparabenes,seponenencontactoconaguadegrifoclorada.Enesta
situacin,elclorodisponiblepuedeserconsumidoporotrosaditivosincluidosenlaformulacinde
losPPCPs,demodoquelosparabenespermaneceraninalterados.Parallevaracaboestosestudios,
seempleungeldebao(tablaIII.19),compradoenelsupermercado.Entodoslosexperimentosse
utilizaron250mLdeagua,yaseaaguaultrapura,degrifoodepiscina,alacualseleadicioneste
geldebaodemodoquelaconcentracinfinaldeloscompuestosfuelaindicadaenlatablaIII.19.
TablaIII.19.Concentracionesdelosparabenesenelgeldebaocomercialyenlasmuestrasdeagua.
MeP EtP PrP BuP

Gel(mg/kg) 2240 446 272 617
Agua(ng/mL) 22.4 4.5 2.7 6.2

Enunprimerensayo,seaadielgeldebaoaunaguadepiscinacon0.58mg/Ldecloro
libre.Bajoestascondiciones,seobtuvieronlostiemposdevidamediaparalosparabenespresentes
en el producto cosmtico que se indican en la tabla III.20, adems se identificaron los mismos
derivados halogenados encontrados en los experimentos realizados con patrones de estos
compuestos.
Tabla III.20. Tiempos de vida media (minutos) obtenidos al mezclar un gel de bao con agua de
piscinaconteniendo0.58mg/Ldeclorolibre.
t1/2(min)
MeP EtP PrP BuP
18.0 10.7 11.4 10.6

Paraestemismogel,seestudilacinticadedegradacinenaguadegrifo(0.83mg/Lde
clorolibre)termostatizadaa15y38C.Lostiemposdevidamediaobtenidasseresumenenlatabla
III.21.
172
Tabla III.21. Comparativa de tiempos de vida media (minutos) a 15C y 38C para los parabenes
presentesenungeldebaoencontactoconaguadegrifoconteniendo0.83mg/Ldeclorolibre.
t1/2(min)
Temperatura(C)
MeP EtP PrP BuP
15C 11.6 9.8 9.3 8.6
38C 7.8 5.8 5.4 4.9
A 38C, el tiempo de vida media disminuy prcticamente 1.5 veces con respecto a las
pruebas realizadas a 15C. Por otra parte, tal como se pone de manifiesto en la figura III.34, se
apreciunincrementodelasrespuestasmedidasparalassustanciasbromadasfrentealascloradas
cuandolatemperaturadelaguaaumentade15Ca38C.Entodocaso,estoscompuestosfueron
minoritariosconrespectoalosderivadosclorados.
FiguraIII.34.ComparacindelaevolucintemporaldelosderivadosbromadosdelMePa15Cy38
C.Datosparaaguadegrifo(0.83mg/Lclorolibre)yungeldebao.
3BrMeP
ClBrMeP
15C 38C 500000
200000 15C 38C
400000
readepico
150000
readepico
300000
100000 200000
50000 100000
0
0
0 10 20 30
0 10 20 30
Tiempo(min)
Tiempo(min)

3,5BrMeP
15C 38C
30000
25000
readepico
20000
15000
10000
5000
0
0 10 20 30
Tiempo(min)

173
Porltimo,seevalulainfluenciadelbromuroenlaformacindederivadoshalogenados
de los parabenes al mezclar agua de grifo con un colutorio bucal (concentracin de MeP de 1225
mg/LydePrPde489mg/L).Sellevaronacabodosensayosaadiendo25Ldeunadilucin1:10
del colutorio sobre 250 mL de agua de grifo conteniendo 0.77 mg/L de cloro libre. A una de las
muestrasseleaaditambin1ng/mLdebromurocomoKBr.Eltiempodereaccinconsiderado
conambosensayosfuede10minutos.
Al igual que sucedi con las muestras de agua ultrapura, la formacin de los compuestos
bromadossehizomssignificativaalaadirlasal(KBr)almedioacuoso,figuraIII.35.
Figura III.35. Influencia de la adicin de 1 ng/mL de bromuro en la formacin de los derivados

halogenadosparaelMePyelPrPapartirdeuncolutoriobucal.Aguadegrifo(0.77mg/Ldecloro
libre)apH7.3,tiempodereaccinde10minutos.
0ng/mLbromuro 1ng/mLbromuro 0ng/mLbromuro 1ng/mLbromuro
3,5BrMeP 3,5BrPrP
ClBrMeP ClBrPrP
3BrMeP 3BrPrP
3,5ClMeP 3,5ClPrP
3ClMeP 3ClPrP
MeP PrP
0.E+00 5.E+04 1.E+05 2.E+05 2.E+05 3.E+05 3.E+05 0.E+00 2.E+04 4.E+04 6.E+04 8.E+04 1.E+05
reasdepico reasdepico
3.6.7.Presenciadeparabeneshalogenadosenmuestrasreales
Losderivadosdihalogenadosprocedentesdelosparabenespresentanunagranestabilidad
enmedioacuoso(figuraIII.32).Adems,losestudiosrealizadossobrelareactividaddeproductosde
cuidado personal, que contiene en su formulacin los parabenes, en agua de grifo y de piscina,
pusieron de manifiesto que el comportamiento descrito para analitos puros puede producirse
diariamente en cualquier hogar, implicando una continua introduccin de estos compuestos en el
aguaresidual.Seanalizaronvariasmuestrasdeaguaresidual,sintratar,enlascualessedeterminla
concentracin del paraben de partida as como la relacin existente entre ste y los compuestos
halogenadosdetectadosenlasmuestras.LosresultadosobtenidosparaMePyPrPsemuestranenla
tablaIII.22.
174
Tabla III.22. Concentraciones de MeP y PrP y relaciones de reas de pico medidas para los
compuestoshalogenadosdetectadosenaguaresidual(500mLmuestra).
Cod Concentracin(g/L)SD Relacinreadepico(%)
MeP PrP 3ClMeP/MeP 3,5DClMeP/MeP 3ClPrP/PrP 3,5DClPrP/PrP
1 nd 0.980.09 nd nd nd 18.4
2 0.060.01 10.840.64 14.0 520.7 4.9 6.6
3 0.490.05 12.960.65 nd 323.0 nd 15.9
4 nd 0.940.08 nd nd nd 32.0
5 1.880.12 0.670.06 4.8 4.2 3.8 3.4
nd:pordebajodelosLOQ

Tal como se observa en la tabla anterior, dos de las muestras (cdigos 2 y 3) presentan
respuestaspara3,5DClMePmuysuperioresalasdelMeP,mientrasqueenlasmuestrasnmero2y
5sedetecttambinel3ClMeP.ParaelPrPtambinseencontraronlasformasmonoydicloradas.
Para el BuP y EtP, compuestos utilizados minoritariamente en las formulaciones de PPCPs, no se
detectaronloscorrespondientesderivadoshalogenados.EnlafiguraIII.36,sepuedenobservarlos
cromatogramas,consusrespectivosespectrosdemasas,paralosderivadoshalogenadospresentes
enlamuestra2.
Figura III.36. Cromatogramas correspondientes a una muestra de agua residual (cdigo 2, tabla
III.22)paralosderivadoscloradosdelMePyPrP.
kCts
243 kCts
200 3ClMeP 80%
3ClPrP 100% 271
60% 500
40% 137 163 75%
150 20% 50% 283
400
0% 25% 129 149 243
163 193
125 150 175 200 225 250 0%
m/z 300
100 125 150 175 200 225 250 275
m/z
200
50
100
0 0
16.8 16.9 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 18.25 18.50 18.75 19.00 19.25 minutos
minutos
MCts MCts
277 1.75
100% 305
3.0 3,5DClMeP 100%
75% 1.50 3,5DClPrP 75%
2.5 50%
25% 1.25 50%
303 323
2.0 0% 25% 183 279
150 200 250 300 m/z 1.00 0%
1.5 175 200 225 250 275 300 325
0.75 m/z
1.0 0.50
0.5 0.25
0.0 0.00
17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 minutos 19.5 20.0 20.5 21.0 minutos
175
La presencia de estos compuestos halogenados en agua residual puede justificarse

nicamente debido a lacloracinde parabenes,puesto queno hay ningn producto comercial de
usocotidianoqueloscontengaensuformulacin,demodoquesuidentificacinenaguaresidual
sirve para poner de manifiesto la evidencia de las reacciones de transformacin descritas. Otra
evidenciadelaformacindeestossubproductoshalogenados,fuelapresenciadel3,5DClPrPenun
agua de piscina con un contenido en cloro libre de 0.78 mg/L y un pH de 7.3. El cromatograma
correspondientesemuestraenlafiguraIII.37.

FiguraIII.37.Cromatogramacorrespondienteaunamuestradeaguadepiscinaprocesadamediante
SPE(500mLdemuestra).
kCts 305
25
Espectrodel
m/z=305+307 100%
3,5DClPrP
75%
20
50%
15 25% 183
0%
10 175 200 225 250 275 300 325 350
m/z
5
0
19.50 19.75 20.00 20.25 minutos
176
Determinacindetriclosn,compuestosrelacionadosyparabenesenmuestrasacuosas
IV. APLICACIN DE LAS METODOLOGAS DESARROLLADAS A LA DETERMINACIN DE

TRICLOSN,COMPUESTOSRELACIONADOSYPARABENESENAGUASRESIDUALESYSUPERFICIALES

4.1.Triclosnycompuestosrelacionados

Las metodologas de extraccin y microextraccin en fase slida, desarrolladas para la
determinacindetriclosn,metiltriclosnyclorofenoles,fueronaplicadasavariasmuestrasdeagua
residual. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV.1, indicando el tipo de muestra, el
mododemuestreoylatcnicadeconcentracinempleada.Todaslasmuestrasseprocesaronpor
triplicado, utilizando como tcnica de determinacin GCMS. Los especmenes de agua residual
fuerontomadosendistintospuntosdelareddealcantarillado,ascomoenlaentrada(influente)y
salida(efluente)deunaplantadepuradoradeaguasresidualesurbanas,equipadacontratamientos
primario y secundario (lodos activos). Las muestras compuestas corresponden a muestreos
realizadosduranteunperodode12horas,tomandounaalcuotadeaguacada60minutos.Puesto
que en el apartado anterior se ha demostrado que el triclorofenol relacionado con ladegradacin
deltriclosneselismero2,4,6ynoel2,3,4TCF,comosepensabainicialmente,lasmetodologas
de SPME y SPE, validadas para el ltimo compuesto, se aplicaron a la determinacin de ambas
especiesenmuchasdelasmuestrasprocesadas.Losnivelesmedidosparatriclosnfueronanlogos
a los encontrados por varios autores en Estados Unidos, Europa y Asia (tabla I.2 del captulo I),
aunque inferiores a los publicados por Agera y colaboradores para muestras tomadas en Espaa
[AgeraA;2003].

TablaIV.1.ConcentracionescuantificadasdeTCS,2,4DCFy2,4,6TCFenmuestrasdeagua.
Cdigo Tipodeaguaymodode Concentracin(ng/L)
Tcnicaextraccin
muestra muestreo 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
1 Efluentecompuesta SPME(PA) 18318 na 72943

1 Efluentecompuesta SPE 16317 na 69035
2 Influentepuntual SPME(PA) 14411 na 24218
2 Influentepuntual SPME(PDMSDVB) 15117 na 22940
3 Sintratarcompuesta SPME(PA) 945 na 19031
4 Sintratarpuntual SPME(PDMSDVB) 842250 25437 2000440
5 Influentecompuesta SPME(PA) nd na 43352
6 Efluentecompuesta SPME(PA) nd na 20922
177
Cdigo Tipodeaguaymodode Concentracin(ng/L)

Tcnicaextraccin
muestra muestreo 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
8 Sintratarcompuesta SPME(PA) 2222277 37516 139441760
9 Influentecompuesta SPME(PA) 545 na 966164
10 Efluentecompuesta SPME(PA) 34827 na 32140
11 Sintratarcompuesta SPE 951 na 20910
13 Influentecompuesta SPE 2721 323 25016
14 Efluentecompuesta SPE nd 7810 4315
16 Sintratarcompuesta SPE 81328 39012 3450103
18 Efluentecompuesta SPE 4531 1194 1022
21 Efluentecompuesta SPE nd 254 5210
24 Efluentecompuesta SPE 436 686 788
25 Ropuntual SPE nd nd 8010
26 Influentepuntual SPE nd 432 80624
27 Efluentepuntual SPE nd 373 72876
28 Sintratarpuntual SPME(PA) 17113 na 709
33 Influentepuntual SPME(PA) 586 na 2998
34 Efluentepuntual SPME(PA) 542 na 26526
35 Efluentepuntual SPME(PA) 295 na 18621
36 Efluentepuntual SPME(PDMSDVB) 8914 na 16515
na:noanalizado nd:pordebajodelosLOQ
178
Enlasmuestrasprocesadasnosedetectnuncani2,3,4TCFniMTCS.Sinembargo,elTCS
estuvo presente en el 100 % de las mismas. Con respecto al 2,4diclorofenol, se cuantific en la
prcticamayoradelasmuestras,conunporcentajedepositivosdelordendel80%.El2,4,6TCFfue
encontradoenel95%delamuestrasenlasquefueanalizado.Enalgunasmuestras,sedetect,a
tiemposderetencininferioresaldel2,4diclorofenol,otropicoconunespectrodemasasidntico.
Paraverificarlaidentidaddelospicosasignadosa2,4DCFy2,4,6TCF,enlasmuestrasdeagua,as
comoidentificareldiclorofenolpresenteenalgunasdeellas,seinyectaronpatronesindividualesde
diferentes dicloro y triclorofenoles sililados empleando MTBSTFA y BSTFA. Los extractos de las
muestrastambinsederivatizaronconambosreactivos,figuraIV.1.
FiguraIV.1.Cromatogramassuperpuestosparapatronesyextractosdeunamuestrareal(cdigo17,
tablaIV.1)derivatizadosconMTBSTFAyBSTFA.
m/z=219+221
MCts MTBSTFA
2,4DCF
1.00
2,5DCF
0.75
0.50
0.25 Muestra
0.00
16.00 16.25 16.50 16.75 17.00 17.25
minutos
m/z=253+255 m/z=253+255
kCts kCts BSTFA
MTBSTFA
2,4,6TCF 350
500 2,4,6TCF
300
400
250
2,3,4TCF 2,3,4TCF
300 200
200 150
Muestra
100
100 Muestra
50
0
0
18.25 18.50 18.75 19.00 19.25 19.50 19.75 14.0 14.5 15.0 15.5
minutos minutos
179
Comoseindicanteriormente,el2,4,6TCFpresentaelmismotiempoderetencinqueel
2,4,5TCFyel2,3,5TCFcomoderivadostertbutildimetilsililados(tablaIII.13),aunquelas3especies
sepuedenresolvercuandoseutilizaelBSTFA,loquehapermitidocomprobarqueeltriclorofenol
identificado de forma sistemtica en las muestras analizadas es el 2,4,6TCF. Adems, ambos
derivatizantes dan lugar a picos perfectamente resueltos para los ismeros 2,3,4 y 2,4,6TCF de
manera que no existe riesgo de realizar asignaciones errneas entre ambas especies (fig. IV.1). El
diclorofenolqueapareceenalgunosdelosextractos,atiemposderetencininferioresal2,4DCF,se
identificcomoel2,5DCF.Enprincipio,noexisteningunarelacinentreestecompuestoyelTCS.
Las mayores concentraciones de 2,4DCF y 2,4,6TCF se detectaron en aquellas muestras

quepresentaronniveleselevadosdetriclosn(4,8,12,16,30,31y32)loqueratificalahiptesisde
que estos compuestos procedan, al menos en parte, de la cloracin del TCS, cuando PPCPs
conteniendo este bactericida entran encontactocon elagua clorada.La muestra nmero 25 es la
nicacorrespondienteaaguaderoenlatablaIV.1.Hasidotomadaunos5Kmdespusdelpunto
dedescargadelasaguasresidualesprocedentesdelaestacindepuradora.Esemismodasehan
obtenido tambin las muestras nmero 26 y 27, correspondientes al influente y el efluente de la
planta.ElniveldeTCSenelrorepresentadelordendeun10%desuconcentracinenelefluente
delaestacindepuradora.

Usando los datos para los pares de muestras compuestas de agua residual, tomadas a la
entradaysalidadelaplantadepuradora(56,910,1314,1718,2021y2324),seestimaronlos
porcentajesdeeliminacindelTCS,2,4DCFy2,4,6TCF,enloreferentealasfraccionespresentesen
disolucin,tablaIV.2.Cabedestacarqueestosparesdemuestrasfuerontomadosconunadiferencia
de 12 horas, equivalentes al tiempo de residencia del agua en la planta. Los porcentajes de
eliminacinpromediooscilanentreel45yel68%,sinembargoparaTCSy2,4DCFseobservaron
variacionesmuyimportantesenlaeficaciadelaplantadepuradora.
TablaIV.2.Porcentajedeeliminacindetriclosn,2,4DCFy2,4,6TCFparalasmuestrastomadasa
laentradayalasalidadeladepuradoradeaguaresidual.
Cdigomuestra 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
56 0% na 52%
910 0% na 67%
1314 100% nc 83%
1718 84% 47% 69%
180
Cdigomuestra 2,4DCF 2,4,6TCF TCS

2021 100% 43% 79%
2324 56% nc 24%
Eliminacinmedia 6862 456 6235
na:noanalizado
nc:porcentajesnegativosnoconsideradosparaelclculo
Con objeto de verificar la exactitud de las metodologas de SPE y SPME con muestras
contaminadas de forma real, la muestra nmero 1 fue procesada con ambas tcnicas (N=3) y los
resultados obtenidos, para los dos compuestos que se encuentran por encima de los LOQs del
mtodo,comparadosestadsticamenteutilizandolostestsFdeFisherytdeStudent,tablaIV.3.La
conclusin a la que se lleg es que no existen diferencias estadsticamente significativas entre las
concentraciones obtenidas con ambas metodologas, tabla IV.4. De forma anloga, la muestra
nmero 2 se concentr mediante SPME, empleando fibras de PA y PDMSDVB. De nuevo, las
concentracionesencontradaspara2,4DCFyTCS,empleandoambasfibras,fueronequivalentespara
unniveldeconfianzadel95%.
TablaIV.3.ExpresionesparaeltestFyeltesttdeStudent.
Test Frmula
2
s
F F = 12 s1>s2
s2
tdeStudent
t=
x1 x 2
s
2
=
(n 1)s + (n 1)s
1
2
1 2
2
2

(varianzascomparables n 2 + n1 n1 + n2 2
s
estadsticamente,testF) n1n2
Tabla IV.4. Valores deF y t de Student tabuladosy calculados para ambos mtodos de extraccin,
muestra1.
Fexperimental Ftabulada texperimental ttabulada Conclusin
2,4DCF 1.10 39 1.36 2.78 Resultadoscomparables

(95%confianza)
TCS 1.50 39 1.21 2.78 Resultadoscomparables
(95%confianza)
181
TablaIV.5.ValoresdeFytdeStudenttabuladosycalculadosparaambasfibrasdeSPME,muestra2.
Fexperimental Ftabulada texperimental ttabulada Conclusin
2,4DCF 2.38 39 0.59 2.78 Resultadoscomparables

(95%confianza)
TCS 4.90 39 0.51 2.78 Resultadoscomparables
(95%confianza)

4.2.Parabenes

La presencia de parabenes se investig en muestras de agua de ro y agua residual. En el
primer caso se realizaron muestreos puntuales en la zona de Pontevedra, Lugo y Santiago de
Compostela (Ver Anexo, pgina 187188, para la localizacin de las muestras). Todas las muestras
fueronprocesadasportriplicado,utilizandolatcnicadeextraccinenfaseslida.Enalgunoscasos
seincrementelvolumendemuestraconcentradohasta2L,enlugarde1L,yelextractofinalse
concentraunvolumende0.5mLconobjetodereducirloslmitesdecuantificacinpresentadosen
la tabla III.11en un factorde 8 veces. Adems se realizaron blancosde muestreoyde extraccin,
paradetectarposiblesproblemasdecontaminacinambientalodelmaterial.

Losvaloresencontradospara10muestrasdeaguasepresentanenlatablaIV.6.MePyPrP
estuvieronpresentesentodaslasmuestras,mientrasqueelBzPnosedetectenningunadeellas.
Las muestras codificadas como 1, 2, 3 y 4 fueron tomadas en los alrededores de Santiago de
Compostela.LasdosprimerascorrespondenalroSar,tomadasprevia(muestra1)yposteriormente
(muestra2)alpuntodevertidodelefluentedelaplantadepuradoradeaguaresidual.Lamuestra3
correspondeaunafluentedelSar.Comopodemoscomprobar,lasmuestras1y3presentanniveles
bajosdelosparabenes,mientrasqueenlamuestra2,seobservunnivelsuperiordePrP(100ng/L).
Las muestras codificadas como 6 y 7 son de un ro de Pontevedra (Lrez) y dos de sus afluentes
(cdigos5y8).TodasellaspresentaronnivelessimilaresdeMePyPrP.
Lasmuestrasnmero9y10correspondenaroscuyocaucetranscurrepordosciudades,
unadelascuales(Vigo,cdigo9)presentaunagranindustrializacinascomounelevadonmero
dehabitantes(400000habitantes),mientrasquelaotraprocededeunapequeaciudadinteriorde
lazonadeLugo(cdigo10).
182
TablaIV.6.Concentracindeparabenesenmuestrasdeaguadero(ng/L).N=3rplicas.
Cdigo Concentracin(ng/L)
Localizacin Muestreo
muestra MeP EtP PrP BuP BzP
Lat:425210.54N
1 18/01/06 273 5.40.1 292 191 nd
Lon:83443.12O
Lat:425136.06N
2 18/01/06 263 7.10.4 1022 nd nd
Lon:83715.11O
Lat:42537.12N
3 18/01/06 5.40.8 3.30.1 142 201 nd
Lon:83420.31O
Lat:42505.90N
4 27/02/06 171 nd 142 nd nd
Lon:8358.11O
Lat:422657.14N
5 27/02/06 7.30.3 nd 8.30.7 nd nd
Lon:83840.32O
Lat:42263.16N
6 28/02/06 131 nd 151 nd nd
Lon:8389.04O
Lat:42276.89N
7 28/02/06 152 nd 213 nd nd
Lon:83718.33O
Lat:42258.71N
8 27/02/06 181 nd 201 1.40.1 nd
Lon:83811.84O
Lat:42131.25N
9 28/02/06 131 nd 343 nd nd
Lon:84232.64O
Lat:423622.95N
10 01/02/06 121 nd 183 nd nd
Lon:74636.14O

Las muestras de agua residual, salvo indicacin contraria, han sido integradas durante un
periodo de 12 horas y se procesaron utilizando tanto SPE como SPME. En el primer caso, la
cuantificacinserealizmediantecalibracinexternayenelsegundohaciendoadicionesalagua.La
figuraIV.3muestraloscromatogramasparaunblancodeSPME,unamuestradeaguaresidualyla
misma matriz fortificadacon los analitos de inters. Losdatos de concentracin para las muestras
medidas se recogen en la tabla IV.7. Las muestras codificadas como 1, 2, 3, 4, 9, 12 y 16,
corresponden a distintos puntos de la red de alcantarillado en la ciudad de Santiago. Al igual que
ocurraenelaguadero,MePyPrPfueronlasespeciespresentesamayorconcentracin,mientras
quenosehadetectadoelBzPenningunadeellas.

183
Figura IV.2. Cromatogramas de GCMS/MS para un blanco del proceso (rojo), una muestra de
influente(verde,cdigo7,tablaIV.7)ylamismamuestrafortificadaa0.5ng/mL(naranja).
kCts MeP kCts

12.5 EtP
10.0
10.0 m/z151+177+195
m/z177
7.5
7.5
5.0 5.0
2.5
2.5
0.5
0.0 0.0
14.75 15.25 15.75 16.25 16.00 16.50 17.00
minutos minutos
PrP kCts
BzP
kCts
3.5
BuP
40
3.0
m/z151+195 m/z163+241
2.5
30
2.0
20 1.5
1.0
10
0.5
0 0.0
17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 21.5 22.0 22.5 minutos
minutos
TablaIV.7.Cuantificacindeparabenesenmuestrasdeaguaresidualmediantelasmetodologasde
SPEySPME.Concentracinenng/L(N=3).
Tipodeaguaymodode Tcnicade Concentracin(ng/L)
Cod.
muestreo concentracin MeP EtP PrP BuP
1 Sintratar SPME 2400190 nd 980100 nd
2 Sintratar SPME 658 566 81070 nd
3 Sintratar SPME 733 nd 18030 nd
4 Sintratar SPME 1480170 101 1220110 191
184
Tipodeaguaymodode Tcnicade Concentracin(ng/L)

Cod.
muestreo concentracin MeP EtP PrP BuP
5 Influente SPME 2920200 21010 810140 8615
6 Efluente SPME nd nd nd nd
7 Influente SPME 43040 524 23020 201
8 Efluente SPME nd nd nd nd
9 Sintratar SPE 651 561 80723 nd
10 Influente SPE 532 91 161 nd
11 Efluente SPE 181 11 71 nd
12 Sintratar SPE 172686 1593 129460 203
13 Influente SPE 2000105 2421 71512 742
14 Efluente SPE 81 nd 141 21

1
15 Influente SPE 1667 1164 43122 401
1
16 Sintratar SPE 2401110 nd 97835 nd
1
ndpordebajodelosLOQ Muestraspuntuales

LafiguraIV.3representalasconcentracionesparalasparejasdemuestras56,78,1011y
1314, correspondientes a muestreos realizados en diferentes fechas en la entrada y salida de la
estacindepuradora,conunadiferenciade12horasparatenerencuentaeltiempoderesidencia
delaguaenlaplanta.

FiguraIV.3.Nivelesdeparabenesenlaentradaysalidadelaestacindepuradoradeaguaresidual.
Influente Efluente Influente Efluente
3500 300
3000 250
2500 200
2000
ng/L
ng/L
150
1500
100
1000
500 50
0 0
10,11
13,14
10,11
13,14
5,6
7,8
5,6
7,8
5,6
7,8
10,11
13,14
5,6
7,8
10,11
13,14
MeP PrP EtP BuP

185
Enconjunto,losparabenessoneliminadosdemaneraprcticamentecuantitativaduranteel
tratamientodelaguaresidual,ysusnivelesenefluentesondelmismoorden,oinclusoinferioresa
losencontradosenlasmuestrasdeaguaderoprocesadas.
186
Anexo
Anexo:Puntosdemuestreoparaladeterminacindeparabenesenrosgallegos(tablaIV.6)
187
Anexo
188
CAPTULOIV
MAEaplicadaalaextraccindeTCSyclorofenolesenlodoysedimento
I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y CLOROFENOLES EN MUESTRAS DE SEDIMENTO Y

LODOMEDIANTEEXTRACCINASISTIDAPORMICROONDAS
1.1.Introduccin
EnelcaptuloIIIdeestaTesisDoctoralsehapuestodemanifiestolapresenciadetriclosny
dos clorofenoles relacionados en aguas residuales. Dado que el triclosn tiene un carcter
medianamente lipoflico (Log Kow 4.8), una parte del mismo puede permanecer asociado a los
residuos slidos (lodos) generados en las estaciones depuradoras de aguas residuales. En estas
plantassegenerandistintostiposdelodossegneltipodetratamientoaplicado.Eneldenominado
tratamientoprimario,seeliminalamateriaensuspensinpresenteenelaguamedianteunaseriede
operaciones de tipo fsico. Incluye la eliminacin de gruesos, el desarenado, el desengrasado y la
decantacin,dandolugarallododenominadoprimario.Eneltratamientosecundariosellevaacabo
el ataque a la fraccin disuelta en agua, recurriendo a bacterias que se alimentan de la materia
orgnica en disolucin. Tras un nuevo proceso de decantacin, se separa el lodo biolgico o
secundario. En algunas plantas depuradoras, se realiza adems un tratamiento fsicoqumico
(tratamientoterciario)paramejoraralgunasdelascaractersticasdelefluentefinal.
Los lodos generados en la planta depuradora procedentes del tratamiento primario y
secundario, normalmente son reutilizados como fertilizantes, despus de su tratamiento con
agentes qumicos (por ejemplo, cal viva o carbonato clcico) para eliminar bacterias y otros
microorganismos. Este uso, hace posible que los contaminantes qumicos retenidos en la matriz
slida,pasendirectamentealsuelo[XuJ;2008].Portanto,esimportanteconocerquecompuestos
permanecenenellodoascomosuconcentracin.
Ladeterminacindecompuestosorgnicosenmatricesslidas,yprincipalmenteenlodos,
presenta un grado de dificultad considerable. La complejidad de la matriz y la fuerte interaccin
existente entre los sitios activos del lodo y las molculas de los analitos, hacen que las
recuperacionesobtenidasseangeneralmentebajasysometidasaunagranvariabilidad.Porlotanto,
es necesario la utilizacin de tcnicas de extraccin exhaustivas como Soxhlet [Bester K; 2003],
extraccincondisolventespresurizados[SingerH;2002][ChuS;2007][AgeraA;2003],extraccin
con fluidos supercrticos [Mc Avoy DC; 2002] o extraccin asistida por microondas [Morales S;
2005]. Por otro lado, debido a la gran capacidad de extraccin de estas tcnicas, no slo
recuperamosloscompuestosdeinters,sinoque,unaparteimportantedelcontenidoorgnicode
estasmuestraspasaadisolucinporloqueseobtienenextractosmuycomplejosquenopuedenser
analizadosdirectamenteyprecisandeunaetapadepurificacin.EnlatablaI.1seresumenvarios
mtodosdesarrolladosparaladeterminacindetriclosnenmuestrasdelodoysedimentos.Cabe
destacarqueenningunadelasreferenciassehacemencinalaextraccinsimultneadetriclosny
191
Lodosdedepuradoraysedimentos
los clorofenoles derivados de la halogenacin de este bactericida: 2,4diclorofenol y 2,4,6

triclorofenol.
Tabla I.1. Resumen de mtodos para la determinacin de Triclosn en muestras de lodos y

sedimentos.
Analitosy LOD RSD
Procedimiento Deteccin Rec.(%) Ref.
matriz (ng/g) (%)
TCSyotros
PPCPsen Soxhletasistidopormicroondas:1gde
liofilizadoy100mLdeDCMdurante75min. GCMS 0.5 10 96 (1)
sedimentos
EvaporarasequedadyreconstituirconAcOEt.
marinos
PLE:10gdeliofilizado+2ghidromatrixenceldas
TCSybifenilol de22mL.DCM,100C,1500psi,1ciclode5
en min.Evaporara5mLypurificacincon1gde GCMS
3.5 7 100 (2)
sedimentos slica,eluyendoconacetonaymetanol. LCMS/MS
marinos Concentrarasequedadyreconstituirconfase
mvil.
TCSenlodos Soxhlet:10gdeliofilizadoconAcOEt6h.
de Limpiezaconslicaypurificacinmediante GCMS 4 27 94 (3)
depuradora cromatografadepermeacinengel.
TCSyMTCS
PLE:1gliofilizadoDCM,100C,1500psi,3ciclos
en de5min.Purificacincon2gdeslicayelucin
sedimentosy con2mLdeDCM,evaporandoasequedad. GCMS/MS 1.5 3 95 (4)
lodosde Derivatizarcondiazometano.Eliminacinde
depuradora disolvente,reconstitucinconAcOEt.
PLE:0.10.2gdeliofilizado,dispersadocon3g
dehidromatrix,DCM,60C,1500psi,3ciclosde
TCSyTCCen 5min.PurificarconOasisHLB500mg,lavando LCMS/MS 1.5 6 98 (5)
lodos conhexano,DCMyagua,eluircon
MeOH:Acetona(1:1).Concentrarasequedady
reconstituirconMeOH.
TCS, Sonicacin:20mgdelodosecoa50Ccon5mL
nonilfenoly deMeOHy3mLaguadurante30min.Dilucin
derivados, con100mLaguaultrapuraySPEconC18. GCMS 150 15 85 (6)(7)
Elucincon8mLDCM:Hexano(4:1).Concentrar
bisfenolAen asequedadyderivatizarconBSTFAypiridinaa
lodos 65C/20min.
Extraccinconfluidossupercrticos:0.5gde
TCS,MTCS, liofilizado+0.5gdeslica,40C,5500psi,200
Tetrasy Ldecidofrmicoenesttico15minyCO2a1 GCMS 21 7984 (8)
Pentaclosano mL/minendinmico45min.TrampadeC18y
enlodos extraccindelamismaconhexanoa1020C,
concentracina0.5mLyderivatizarconBSTFA.
192
LOD RSD Rec.

Analitosymatriz Procedimiento Deteccin Ref.
(ng/g) (%) (%)
MAE:3gsuelosecoa115C,15mina800Wcon2:1
TCS,AINEs,PPCPs deDCM:MeOH.Dividiren2elextracto, GCMS 10 90 (9)
ensuelos derivatizandounodeellosconBSTFA,ypurificar
ambosconslica,eluyendocondistintosdisolventes.
TCSyPPCPsen PLE:0.5gliofilizado+materialinerteenceldasde33 70
lodosde mL.ExtraccinconAcOEta130C,2ciclosde45min. GCMS 31 (10)
130
depuradora Evaporara1mL,ydiluir1:9contolueno.
Extraccinlquidoslido:0.5gliofilizadocon30mL
TCSyPPCPsen deNaOH1M,agitandoa700rpm30min.
Centrifugara3000rpm10min.AjustedepHa2. 70
lodosde GCMS 31 (10)
Aadir20mLtolueno,agitara700rpm/30min.LLE 130
depuradora paraobtencindelafaseorgnica,yderivatizacin
conagentesililante.
TCSyfrmacosen PLE:2.7gsuelo1glodoliofilizado+arenaen
lodosysuelos celdasde33mL.ExtraccinconMeOH:agua(1:1)a 3.0
LCMS/MS 20 100 (11)
enriquecidoscon 60C/1500psicon2ciclosestticosde5min. 4.6
lodos ConcentracinseguidadeSPEOasisHLB200mg.
(1)MoralesMuozS,2005;(2)AgeraA,2003;(3)BesterK,2003;(4)SingerH,2002;(5)ChuS,2007;(6)GatidouG,2007;(7)
StasinakisAS,2008;(8)McAvoyDC,2002;(9)RiceSL,2007;(10)LigonAP,2008;(11)BarronL,2008.
Paralaextraccindetriclosn,2,4diclorofenoly2,4,6triclorofenoldelodosdedepuradora
y sedimentos, se seleccion la extraccin asistida por microondas (MAE) puesto que presenta un
gran poder extractante, derivado de la aplicacin de la energa de microondas sobre una muestra
impregnada con un disolvente que presenta un momento dipolar distinto de cero. Los extractos
obtenidos, generalmente fueron complejos, de modo que, al igual que ocurre con los mtodos
descritos en la tabla I.1, es necesario establecer una estrategia de purificacin para eliminar
potencialesinterferencias.
1.2.1. Viabilidad de la extraccin de TCS, 2,4DCF y 2,4,6TCF de muestras de lodos

medianteMAE
Previamentealaoptimizacindelascondicionesdeextraccin,sellevaronacabounaserie
depruebasinicialesparaponerdemanifiestolapresenciadeloscompuestosdeintersenlamatriz
estudiada,ascomoelgradodecomplejidaddelosextractosobtenidos.
193
Las muestras de lodo sin adicin, previamente liofilizadas, fueron extradas con tres
disolventesdistintos:acetatodeetilo,acetonaymetanol,enbasealabibliografaexistenteparala
determinacin de triclosn y otros frmacos en esta matriz [Bester K; 2003][Ternes TA; 2005]. La
extraccin (0.5 g de muestra liofilizada) se realiz con 30 mL de disolvente a 110C durante 20
minutos, con una potencia del magnetrn de 500 W. Una vez enfriados, los extractos fueron
centrifugados y el sobrenadante fue recogido en un vial, realizando un cambio de disolvente a
acetato de etilo. En todos los casos, los extractos presentaron un color muy intenso, con lo cual
previamente a la inyeccin de los mismos en el sistema cromatogrfico (GCMS), seprocedi a su
purificacin con 500 mg de slica, eluyendo los analitos con acetato de etilo en las condiciones
descritasenelcaptuloanteriorparamuestrasdeagua.EnlafiguraI.1semuestrauncromatograma
de GCMS correspondiente a la extraccin con acetona. Independientemente del disolvente de
extraccin,elperfildecorrienteinicatotal(TIC)presentunagrancomplejidaddebidoalelevado
nmero de impurezas coextradas, lo que repercute en que el tiempo de vida til de la columna
disminuya.
Figura I.1. Cromatograma de corriente inica total para un extracto de lodo. MAE a 110C con
acetona.
MCts
1.50
TCS
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5
minutos

AdemsdelagrancomplejidaddeloscromatogramasdeGCMS,enelespectrodemasas
deltriclosnseapreciaunaseala327unidadesdem/zpertenecienteaunainterferenciaqueco
eluyeconelanalitoyquedificultasuidentificacin,sobretodoparamuestrasconnivelesbajosdel
compuesto.EnlafiguraI.2seobservalaintensidaddelainterferenciafrentealasealdeTCS,as
comoelespectrodemasasparaelpicodeltriclosnenlamuestrasinadicin.
194
FiguraI.2.Cromatogramacorrespondienteaunamuestradelodoprimarioreconstruidoam/z327
(impureza,lineacontinua)y345+347(TCS,lneadiscontinua).
327
MCts
7 75%
6 50%
5 25% 131 313 347
4 0%
3 150 200 250 300 350 m/z
2
1
0
22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 minutos
En base a estos datos preliminares, se decidi desarrollar una estrategia de purificacin

exhaustivadelosextractosobtenidospormicroondas,ademsdeoptimizarladeteccinenmodo
MS/MS para aumentar la sensibilidad y la selectividad en la determinacin de los compuestos de
inters.Porotrolado,estosexperimentospusierondemanifiestolaexistenciadeconcentraciones
significativasdeTCSenellodo.
1.2.2.Identificacincromatogrfica(GCMS/MS)
LaidentificacindelospicoscromatogrficoscorrespondientesaTCS,2,4DCFy2,4,6TCF
sellevacaboconsiderandosustiemposderetencin,ascomolosespectrosdeMSyMS/MS.Las
condiciones de deteccin en modo MS fueron descritas en la seccin III del captulo anterior. La
optimizacindelascondicionesdeMS/MSparael2,4diclorofenol,2,4,6triclorofenolytriclosnse
realiz con ayuda de la herramienta de desarrollo automatizado de mtodos (AMD). Los iones
precursoresseleccionadosfueronlosfragmentoscorrespondientesalaprdidadelgrupotertbutilo
dem/z[M57]+parael2,4DCFy[M+257]+parael2,4,6TCFyelTCS.Laeleccindelinprecursor
[M+257]+ para compuestos triclorados, da lugar a dos iones producto para cada transicin que
implicaunaprdidadecloro.Laventanadeaislamientosefijen3unidadesdem/z,yseutilizla
fragmentacin en modo resonante. En el caso de los clorofenoles, los espectros obtenidos
mostraronlaprdidade36y72unidadesdemasa,correspondientesalaeliminacindeunoodos
molculasdeHClenlaestructuradelosanalitos.Paraeltriclosn,lafragmentacinresultserun
pocomscompleja,puestoqueademsdeperderuntomodeCl(transicin347a310),suenlace
terserompe,dandolugaraunfragmentode200unidadesdem/z.
En la figura I.3 se presentan los espectros de MS/MS obtenidos para 2,4DCF, 2,4,6TCF y
TCScomocompuestostertbutildimetilsililados.
195
FiguraI.3.EspectrosdeMS/MSpara2,4DCF,2,4,6TCFyTCS.
183 217
100% 2,4DCF 100% 2,4,6TCF
75%
75%
50%
50%
25% 201 235
125 147 25% 183
219 159 255
0%
0%
125 150 175 200 225 125 150 175 200 225 250 m/z
m/z
200
100%
TCS
75%
50% 310
25% 185 219 345

0%
175 200 225 250 275 300 325 350
m/z
Las condiciones instrumentales de medida en GCMS/MS para TCS y dos clorofenoles se

resumenenlatablaI.2.
TablaI.2.CondicionesinstrumentalesdemedidaenGCMS/MS.
In Nivelde
Tr Amplitudde Ionesproducto Intensidades
precursor almacenamiento
(min)1 excitacin(V) (m/z)2 relativas(%)
(m/z) (m/z)
183 100
2,4DCF 15.67 219 96 0.53
147 10
217 100
2,4,6TCF 17.26 255 110 1.10 235 34
183 15
200 100
TCS 23.04 347 140 1.50 310 50
219 10
1
ColumnaHP5MS.
2
Losionessubrayadosseutilizanparacuantificacin.
Lasiguientefigura,correspondienteaunextractodeunlodobiolgicosinadicin,ponede
manifiestoladisminucindelacomplejidaddelperfilcromatogrficocuandoseutilizaMS/MScomo
tcnicadedeteccinfrenteaMS,figuraI.4.
196
FiguraI.4.Cromatogramas(TIC)deMSyMS/MScorrespondientesaunextractodeunamuestrade
lodobiolgico.
MCts
6 MS
5
4
3
2
1
0
kCts
500 MS/MS
400 2,4DCF TCS
2,4,6TCF
300
200
100
0
15 16 17 18 19 20 21 22 23
minutos

1.3.Estrategiadepurificacindelosextractos
Tal como hemos descrito en las pruebas preliminares, los extractos de microondas
correspondientes a muestras de lodo fueron muy complejos, conteniendo gran cantidad de
interferencias. Aunque el uso de la deteccin en modo MS/MS oculta su presencia en los
cromatogramas, es evidente que a medio plazo provocarn la contaminacin irreversible de la
columna capilar. Para reducir estos problemas, se desarroll una estrategia de purificacin de los
extractosmselaborada,evitandosiemprerecurriralacromatografadepermeacinengel[Bester
K;2003].
Dado que los compuestos objeto de estudio, tienen caractersticas cidas (pKa
comprendidos entre 6.6 y 8.1) pueden ser separados de especies de naturaleza bsica y neutra
utilizando extraccin lquidolquido. ApHs bsicos,cabeesperar que en un procesode extraccin
lquidolquidotenganmayorafinidadporelmedioacuosoqueporlafaseorgnica.Paraevaluarla
viabilidaddeestaestrategiadepurificacin,seinvestigladistribucindeestoscompuestosentre
unafaseorgnicayotraacuosaapHbsico.Paraestaspruebas,seprepararonalcuotasde100mL
de agua ultrapura con adicin de los analitos a nivel de 50 ng/mL, ajustando el pH con hidrxido
sdicoavaloresde11.5y13unidades.Estasmuestrasfueronextradascondosalcuotasde15mL
197
de hexano o acetato de etilo. La fase orgnica se concentr a 2 mL, y una alcuota de 500 L fue
derivatizada con MTBSTFA. La fase acuosa, se acidific a pH 2.5 y se extrajo mediante SPE con la
metodologadescritaenelcaptuloII,seccin2.1.1.Traslaelucindeloscartuchos,yderivatizacin
delosextractosenacetatodeetilo,seinyectaronlosextractosobtenidos(1L)paraambasfases
enGCMS.Lassealesparacadaanalitoenlafaseacuosaylafaseorgnicasecompararonconlos
obtenidos para una referencia (muestra de agua no sometida al proceso de LLE) concentrada por
SPE.LatablaI.3muestralosresultadosobtenidosparatriclosn,elmslipoflicodelostresanalitos
consideradosy,portanto,elqueapriorivaapresentarmayoresdificultadesparapermanecerde
formacuantitativaenlafaseacuosaapHbsicoduranteelprocesodeLLE.
TablaI.3.Porcentajes(%)detriclosnenlasfasesorgnica(FO)yacuosa(FA)considerandodospH
diferentes (11.5 y 13) y dos disolventes distintos (acetato de etilo y hexano). Valores normalizados
respectoaunamuestradeaguanosometidaaLLE.
pH11.5 pH13
Disolvente FO FA FO FA
Acetatodeetilo 92.5 0.5
Hexano 41.5 59.1 1.4 92.6
DeacuerdoconlosresultadosmostradosenlatablaI.3,usandohexanocomofaseorgnica
yaguaajustadaapH13,eltriclosnpermaneceprcticamenteenelmedioacuosoandespusde
lasetapasdeLLEconestedisolvente.
LadistribucindeloscompuestosentrelaFAylaFOdehexanoapH13,fuereevaluadaen
presenciade30mLdemetanoloacetona,omezcladeambosdisolventesal50%.Losresultados
obtenidos,tablaI.4,muestranquenohubodiferenciasenladistribucindelosanalitosentrelafase
acuosaylaorgnica.Adems,lareferencia,realizadasinadicindedisolventesysinllevaracabola
LLE,pusodemanifiestoquelapresenciadeesevolumendedisolventenoafectalarecuperacin
delaetapadeSPE.

TablaI.4.Porcentajes(%)delosanalitosenlaFOyFAconteniendometanoloacetona,conrespecto
alareferencia.
Disolvente 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
presenteenlaFA FO FA FO FA FO FA
Acetona 0.04 96.1 0.02 96.0 0.48 94.0
Metanol 0 97.5 0 97.5 0.92 97.1
Act:MeOH(1:1) 0 92.5 0 99.9 0.49 112.4
198
Enbaseaestosresultados,sellevacabolaextraccindeunamuestradelodocon20mL
demetanola110Cdurante20minutos.Trascentrifugarelextractoydiluirlocon100mLdeNaOH
0.2MapH13,seextrajodosvecescon15mLdenhexano,aadiendoclorurosdico(0.5g)para
facilitar la separacin de ambas fases. La fase orgnica present una gran complejidad,
probablementedebidoalapresenciadegrasasyotrasespeciesdecarcterapolarybsico.Lafase
acuosa, en cambio, present una apariencia menos compleja (prcticamente incolora) despus de
estaetapadeLLE.EstafaseacuosafueajustadaapH2.5,concentradamedianteSPEypurificadacon
500mgdeslicaneutra(protocolodescritoenelcaptuloII,seccin2.1.1).Enesteltimopaso,la
slicaretieneaquellasinterferencias,denaturalezamspolarquelosanalitos,quenohayanpodido
sereliminadasenlasanterioresetapasdeLLESPE.Elextractofinalpresentunamenorcoloracin,
yporlotantocomplejidad,frenteaaquelenelqueseomitilaetapadeLLEypurificacinconslica
neutra,figuraI.5.

FiguraI.5.CromatogramasdeGCMS(TIC)deunlododedepuradoracon(lneacontinua)ysinetapa
delimpiezamedianteLLE(lneadiscontinua).
MCts
TCS
SinLLE
7.5
ConLLE
5.0
2.5
0.0
15 16 17 18 19 20 21 22 23 min

En la figura I.6 se resume el protocolo de purificacin para los extractos de MAE

procedentesdelodosdedepuradora.
199
FiguraI.6.Esquemadepurificacinparaextractosdelodos.
ExtractoMAE
Centrifugar5000rpm/5min
Mezclarcon100mL NaOH 0.2M(pH13)
LLE2X15mL hexano
FA FO
AjustarapH2.5
Residuo
SPE:OasisHLB60mg
(2mL AcOEt)
Purificacin:SepPak500mg
(5mL AcOEt)
Concentrara2mL yderivatizar 0.5mL

con50L MTBSTFAaT Amb.5min

1.4.Optimizacindelascondicionesdeextraccinasistidapormicroondas
La optimizacin de los factores que afectan al proceso de extraccin asistida por

microondas se realiz mediante diseo de experimentos. La temperatura, el tipo y volumen de
disolvente, la agitacin y la adicin de modificadores son factores que pueden influir
significativamenteenelrendimientodelprocesodeextraccin.
1.4.1.Temperatura,disolvente,volumendedisolventeyagitacin
Los efectos del tipo de disolvente y su volumen, la temperatura y la agitacin fueron

estudiadosmedianteundiseofactorialfraccionaldescreeningdeltipo241.Paralarealizacinde
los 8 experimentos implicados en estediseo, seprepar una muestramezclando lodo primario y
biolgico (previamente liofilizados) en proporcin 8:2 (p/p). Estudios previos mostraron que la
cantidadnativadetriclosnenlamuestraeraconsiderable,encambio,losclorofenolespresentaron
200
nivelesmuchomsbajos,porloquelamatrizfuefortificadacon2,4DCFy2,4,6TCF.Paraello,se
prepar una suspensin mezclando el slido con un patrn de 2 g/mL de ambos clorofenoles en
acetona.Traslaevaporacindeldisolvente,lamuestrasealmacendurante5dasatemperatura
ambiente,parafavorecerlainteraccinentrelosanalitosylamatriz.
Paralarealizacindecadaexperimentodeldiseo,sepesaron0.5gdelodoyseextrajeron
enlascondicionesindicadas(tablaI.5),durante20minutos,aplicandounapotenciade500W.Una
vezobtenidoslosextractos,secentrifugaron,yelsobrenadantesediluya30mLconeldisolvente
correspondiente, para posteriormente proceder a la etapa de limpieza, concentracin y
derivatizacin, figura I.6. Los extractos, una vez derivatizados fueron analizados mediante GC
MS/MS.Lascondicionesdeextraccin,ascomolosresultadosobtenidos(readepico)paracada
compuesto,semuestranenlatablaI.5.
Tabla I.5. Condiciones de extraccin y respuestas (reas de pico) obtenidas en el diseo factorial
fraccionaltipo241.
Exp.N Agitacin T(C) Disolvente Vol.(mL) 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
1 S 130 Acetona 15 37421 66061 66334
2 No 130 Metanol 15 69878 101959 59088
3 No 130 Acetona 30 36347 58759 101671
4 S 130 Metanol 30 66412 87226 41164
5 S 90 Metanol 15 61843 87689 64864
6 No 90 Metanol 30 63386 85721 68419
7 No 90 Acetona 15 39997 75163 64774
8 S 90 Acetona 30 41794 55060 101807

Una vez introducidos estos resultados en el programa estadstico (Statgraphics 5.1), se
calcularonlosvaloresdelosefectosprincipalesasociadosacadafactorestudiado(tablaI.6).

TablaI.6.Efectosprincipalesasociadosacadafactorparaeldiseofactorialfraccionaldescritoenla
tablaI.5.
Factor Nivelbajo Nivelalto 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
Disolvente Acetona Metanol 528 164 1164
Volumen(mL) 15 30 16 40 285
Temperatura(C) 90 130 50 60 192
Agitacin No S 43 27 36
201
Acontinuacin,seoptporeliminaraquelfactorquepresentabaunefectomenorqueel
resto,obtenindoseassuficientesgradosdelibertadparacalcularlasignificacinestadsticadelos
efectosrestantes(tablaI.7).
Tabla I.7. Efectos principales normalizados asociados a cada factor tras eliminar aquellos factores
menossignificativos.
Factor Nivelbajo Nivelalto 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
Disolvente Acetona Metanol 32.4a 6.0 32.3a
Volumen(mL) 15 30 1.5 7.9
Temperatura(C) 90 130 3.1 2.2 5.3
Agitacin No S 2.6
a
Factorestadsticamentesignificativoaunniveldeconfianzade95%
El tipo de disolvente es el factor que ejerce una mayor influencia en la eficacia de

extraccin. Para el TCS y el 2,4,6TCF, la acetona permiti obtener respuestas significativamente
mejores(principalmenteenelcasodelTCS)queelmetanol,mientrasqueparaelmspolardelos
tres analitos, el 2,4DCF, la utilizacin de metanol fue ms favorable. Con respecto al volumen, el
triclosn requiere volmenes elevados de disolvente a diferencia de los clorofenoles, aunque su
comportamientonoquedaclaro.Latemperaturadeextraccinjugunpapelimportanteaunqueno
significativo en la recuperacin de los compuestos, ejerciendo una influencia positiva en el
rendimientodelaextraccin.Porltimo,laagitacinnopresentunpapelimportanteparaninguno
de ellos. En base a estos resultados, se fij la temperatura en 130C, mientras que se opt por
prescindirdelaagitacindelamuestradentrodelosvasosdelextractordemicroondas.
1.4.2. Optimizacin del volumen de extractante, proporcin metanol:acetona y

modificadororgnico
Con el primer diseo de experimentos no se obtuvieron conclusiones claras sobre la

influenciadeciertosfactoresenlaeficaciadeextraccin.Enunsegundodiseo,seestudiaroncon
ms detalle, el efecto del volumen de extractante y la composicin del mismo (mezclas
metanol:acetona), junto con un tercer factor, el cido frmico, utilizado como modificador del
disolvente de extraccin. La adicin del cido frmico hace que el pH del medio sea cido,
favoreciendolaextraccindeloscompuestoscongruposcidos,comolosclorofenolesyeltriclosn,
sobretodoenaquelloslodosquehansidoestabilizadosconcarbonatoclcico.
Losfactoresvolumendedisolvente(1530mL),porcentajedemetanolenacetona(2575%)
yvolumendecidofrmico(0300L)fueronestudiadosmedianteundiseofactoriala2niveles
202
con un punto central. La muestra empleada para la realizacin del diseo fue la misma que en el
casoanterior.Losresultadosobtenidos(reasdepico)semuestranacontinuacin,tablaI.8.

TablaI.8.Condicionesexperimentalesyresultadosobtenidosenelsegundodiseoexperimental.
%metanolen Ac.frmico
Exp.N Volumen(mL) 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
acetona (L)
1 22.5 50 150 46570 64963 40929
2 15 75 0 40444 47689 35256
3 30 75 0 37057 53742 50249
4 15 25 300 42770 57122 60909
5 15 25 0 43960 54972 42991
6 30 75 300 44293 62250 61198
7 30 25 0 37874 63901 73214
8 30 25 300 34702 71845 75032

9 15 75 300 46265 52802 33562
EnlacartaParetoobtenida,figuraI.7,sepuedeobservarqueelvolumendedisolventeyel
porcentaje de metanol son estadsticamente significativos para TCS y 2,4,6TCF. Para ambos
compuestos, un incremento en el volumen de extractante y una disminucin de su polaridad
(reduccindelporcentajedemetanol)conllevanunamejoraenlaeficaciadeextraccin.Enelcaso
del2,4DCFningnfactorfueestadsticamentesignificativo.
FiguraI.7.CartaParetoobtenidaparael2,4DCF,2,4,6TCFyTCS.
Volumen %MeOH Ac.Frmico
TCS
2,4,6TCF
2,4DCF
4 3 2 1 0 1 2 3 4 5
203
El cido frmico, aunque no alcanz el nivel de significacin estadstica (95 % confianza)

paraningunodelosanalitos,afectpositivamentealaextraccin.Elmayorefectoseobservparael
compuestoquepresentaunmenorpKa,el2,4,6triclorofenol,justificandolaadicindelmodificador
paralaobtencindemejoresrecuperacionesdeloscompuestospresentesenlamatrizslida.
Lassuperficiesderespuestaestimadascidofrmicofrenteaporcentajedemetanolparael
triclosnyel2,4DCF,conunvolumende30mLdedisolvente,sepresentanenlafiguraI.8.Enellas
seobservaclaramenteuncomportamientoopuestoenfuncindelapolaridaddelamezcla.El2,4
DCFesmspolarqueel2,4,6TCFyelTCS,extrayndosemsfcilmenteconporcentajeselevados
demetanol,mientrasqueTCSprefieremezclasdeextraccinconunmayorcontenidoenacetona.
Se opt por una solucin de compromiso seleccionando una mezcla 1:1 de metanol:acetona para
realizarlaextraccin.
FiguraI.8.Superficiesderespuestaestimadasparael2,4DCFyTCS,considerandounvolumende30
mLdedisolvente.
2,4DCF
Volumen30mL
(X1000)
45
reas2,4DCF
43
reasdepico
41
39
37 300
35 200
100 c.Frmico (L)
25 35 45 55 0
65 75
MeOH (%)
TCS
Volumen30mL
(X1000)
82
77
reasdepico
reasTCS
72
67
62
57 300
52 200
100 c.Frmico (L)
25 35 45 0
55 65 75
MeOH (%)
204

En base a los resultados obtenidos con ambos diseos, las condiciones de extraccin
seleccionadashansidolasquesemuestranenlatablaI.9.
Tabla I.9. Condiciones de extraccin (MAE) para TCS, 2,4DCF y 2,4,6TCF en muestras de lodo de
depuradoraysedimento.
Potencia(W) 500
Metanol:acetona(1:1)con300L
Masamuestra(g) 0.51 Disolvente
cidofrmico
Temperatura(C) 130
Tiempo(min) 20 Volumen(mL) 30
1.5.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad
yLOQs
LacaracterizacindelmtododeGCMS/MS,comotcnicadedeteccin,fuellevadaacabo
utilizando patrones mezcla de los tres compuestos preparados en acetato de etilo a distintas
concentraciones. Los patrones se derivatizaron en las mismas condiciones descritas para los
extractosdemuestrasacuosasobtenidasmedianteSPE(500Ldeextractoy20LdeMTBSTFAa
temperaturaambientedurante5minutos).
Elrangolinealseevaludesde1hasta1500ng/mL,inyectandolosanalitosa6nivelesde
distinta concentracin en triplicado, y la repetibilidad de inyeccin fue estudiada realizando cinco
inyeccionesconsecutivasdedospatronesde5y250ng/mL(tablaI.10).
TablaI.10.Linealidad,precisinyLOQsdelmtododedeterminacin,GCMS/MS.
2,4DCF 2,4,6TCF TCS
Linealidad(R2) 0.998 0.996 0.999
Repetibilidad 5ng/mL 4.2 4.4 8.3
(%RSD,n=5) 250ng/mL 4.1 3.6 5.3
LOQ(ng/mL) 0.2 0.2 0.2

Los coeficientes de determinacin obtenidos oscilaron entre 0.996 y 0.999. En todos los
casos,loscoeficientesdevariacinfueroninferioresal8%.Porltimo,loslmitesdecuantificacin
205
instrumentales,hansidode0.2ng/mL(figuraI.9),10vecesinferioresalosobtenidoscondeteccin
porGCMS(tablaIII.6,captuloIII).
FiguraI.9.Patrnde1ng/mLconlascorrespondientesrelacionesS/Npara2,4DCF,2,4,6TCFyTCS.
S/N:185 S/N:165
Cts Cts S:165 N:1
m/z183 S:185 N:1 m/z217
200 150
2,4DCF 2,4,6TCF
150
100
100
50 50
0 0
15.4 15.6 15.8 16.0 minutos 16.75 17.00 17.25 17.50 17.75 minutos

S/N:129
Cts S:129 N:1
125
m/z310+200
100 TCS
75
50
25
0
22.50 22.75 23.00 23.25 23.50 23.75 minutos

1.5.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico

La exactitud, precisin y lmites de cuantificacin del mtodo analtico propuesto fueron
evaluadosconcuatromatrices:lodoprimario,lodosecundario,lodotratadoconcarbonatoclcico
(lodo estabilizado) y sedimento de ro. Todas estas muestras fueron liofilizadas previamente y
caracterizadas en cuanto a su contenido de carbono. En general, los lodos presentaron niveles de
carbono orgnico (TOC) delorden de3638 %, mientrasque en sedimentos de ro se encontraron
prximosal1%.
Paraevaluarlaexactituddelmtododepreparacindemuestra,sepreparunasuspensin
de cada muestra con un patrn de concentracin conocida de los analitos en acetona, realizando
una mezcla 1:1 (1 mL de patrn por cada gramo de muestra) entre ambos. La mezcla se dej
evaporar,teniendoespecialcuidadodenocalentarniexponeralaluz.Unavezseca,secerryse
dej envejecer a temperatura ambiente durante varios das. Las concentraciones adicionadas
dependierondelamatrizestudiada.Paralasmuestrasdelodolaadicindelosclorofenolesfuede
300ng/g,mientrasqueparaeltriclosnfuede5g/g,dadoqueestoscompuestosseencontraron
enellodoaniveleselevados.Paraelcasodelossedimentos,laconcentracinadicionadafuede300
206
ng/g. Con objeto de evaluar la exactitud del mtodo a concentraciones inferiores, se prepararon
otrasmuestrasconnivelesdeadicindelordende40ng/gparalosclorofenolesy900ng/gparael
triclosn en lodo estabilizado qumicamente, y de 10 ng/g en una muestra de sedimento de ro
conteniendoslotrazasdetriclosn.

Paracadaunadelasmatricesconsideradasseprocesaronfraccionesconysinadicindelos
analitos.Lasrecuperacionessecalcularoncomoloscocientesentreladiferenciadeconcentraciones
parafraccionesconadicinysinadicin,ylaconcentracinaadidaacadamuestra,tablaI.11.Enel
casodelsedimento,eltamaodemuestraconsideradofuede1genlugarde0.5gparamejorarlos
LOQsenestamatriz.Esprecisodestacartambinquelosextractosdelodoestabilizado,obtenidos
sinaadircidofrmicoalamezcladeextraccin,nopresentaronsealesparaningunodelostres
analitosconsiderados.
TablaI.11.Recuperacionesobtenidas(%)paramuestrasdelodoysedimentoconadicin(N=4).
Nivelaadido RecuperacionesRSD(%)
Muestra %TOC
(ng/g) 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
Sedimentoro 0.8 10 81.85.7 96.04.9 98.78.5
Sedimentoro 0.8 300 79.18.2 92.08.9 99.76.5
a
Lodoprimario 38 300 79.18.2 98.93.2 81.76.5
a
Lodosecundario 36 300 78.38.1 87.65.1 94.06.5
a
Lodoestabilizado 11 300 106.67.5 88.35.0 82.211.5
b
Lodoestabilizado 11 40 82.99.2 97.413.0 97.310.5
a
5g/gparaTCS
b
0.9g/gparaTCS
Talcomosepuedecomprobar,engenerallasrecuperacionesobtenidasfueronsuperiores
al80%,condesviacionesestndarpordebajodel13%.

Ademsdeutilizarmuestrasconadicinparaevaluarlaexactituddelmtododesarrollado,
secompararonlosresultadosobtenidosparamuestrassinadicinprocesadasusandoSoxhlet,para
unamuestradelodoprimarioyotradelodobiolgico.LaextraccinSoxhletsellevacabodurante
24horascon100mLdeunamezclademetanol:acetona(1:1).Elextractoobtenidofueconcentrado
a 30 mL, y se procedi a la limpieza mediante LLE con hexano, posterior concentracin de la fase
acuosa, y purificacin del extracto final. Los resultados obtenidos fueron similares con ambas
metodologas,figuraI.10.
207
FiguraI.10.ComparacindeSoxhletconMAEparaladeterminacindeTCS,2,4DCFy2,4,6TCFen
lodoprimarioybiolgico.
Lodoprimario Lodobiolgico
6000
3500
3000 150 5000 400
2500 100 300
4000 200
2000
ng/g
ng/g
50 100
3000
1500 0
0
1000 2,4DCF 2,4,6TCF 2000 2,4DCF 2,4,6TCF
500 1000
0 0
2,4DCF 2,4,6TCF TCS 2,4DCF 2,4,6TCF TCS
MAE Soxhlet MAE Soxhlet
LoslmitesdecuantificacindelmtodopropuestocondeteccinmedianteGCMS/MS,se
calcularonteniendoencuentalosLOQsinstrumentales,lamasademuestra(1gparasedimento,0.5
gparalodo)yelvolumendelextractofinal(2mL).Losblancosdeprocesonomostraronproblemas
decontaminacin.EnbaseaestainformacinseestimaronunosLOQsde0.8ng/gy0.4ng/gpara
lodoysedimento,respectivamente.EnlafiguraI.11semuestrauncromatogramadeunamuestraa
nivelesprximosaloslmitesdecuantificacin.

FiguraI.11.CromatogramasyespectrosdeMS/MSparaunamuestradesedimentoconadicinde
loscompuestosestudiadosanivelde10ng/g.
kCts
183
1.50 100%
75% 2,4DCF
1.00 50%
25% 147 201 217
125
0%
0.50 125 150 175 200 225m/z
0.00
14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 min
kCts
1.25 2,4,6TCF 100%
217
75%
50%
0.75 25% 235
159 183
249 267
0%
0.25 150 175 200 225 250 m/z
16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 min

kCts
200
100%
75%
1.5 50%
310 TCS
25% 185
1.0 219 303 332
0%
200 225 250 275 300 325 m/z
0.5
0.0
22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 min
208
La utilizacin de GCMS/MS no solamente permite aumentar la selectividad, sino que

tambinpermiteobtenerLOQsdiezvecesmsbajosqueGCMS,dadoaqueaslaelinprecursoren
la trampa para proceder a su posterior fragmentacin. Esto permiti, en el caso del triclosn,
discriminarlasealdelanalito(345+347)delainterferenciadem/z327(figuraI.2).Engeneral,los
lmitessonmejoresquelosencontradosenlabibliografa.Porotraparte,unadelaslimitacionesde
esta metodologa con respecto a otras descritas en la bibliografa, ha sido la imposibilidad de
recuperar el metiltriclosn, puesto que este se pierde en la etapa de LLE con nhexano [Singer H;
2002][McAvoyDC;2002].

1.6.Aplicacinalanlisisdemuestrasreales
Lametodologadesarrolladaseaplicalanlisisdevariasmuestrasdelodo,desedimentos
de ro y marino. En todos los casos, las muestras fueron liofilizadas y homogeneizadas,
almacenndolasposteriormenteatemperaturaambientepreviamenteasuanlisis. Seprocesaron
0.5 g de muestra para lodo y 1 g para sedimento, realizando en todos los casos la extraccin por
triplicado.LasconcentracionesobtenidassemuestranenlatablaI.12.
Tabla I.12. Concentraciones de los analitos (ng/g) en sedimentos de ro, marino y lodos de
depuradora.
ConcentracinSD(ng/g)
Cdigo Tipomuestra
2,4DCF 2,4,6TCF TCS
1 Sedimentoro nd nd 4.40.8
2 Sedimentoro nd nd nd
3 Sedimentoro nd nd 35.71.1
4 Sedimentomarino nd nd nd
5 Lodoprimario 79.98.5 19.40.3 254350
6 Lodobiolgico 31633 38.19.2 5400125
7 Lodoestabilizado 77.98.5 15.82.4 1508196
8 Lodo 74.41.0 7.51.0 1474240
9 Lodo 55.23.3 14.50.5 41838
Dentro de las muestras analizadas se detect triclosn en la mayora de las mismas, a

concentraciones superiores a 1 g/g para cuatro de los cinco lodos estudiados. En el caso de los
clorofenoles,lasconcentracionesestuvieronpordebajodelosLOQsdelmtodoenlossedimentos,
mientrasqueenloslodoslasconcentracionesfueronentre10y100vecesinferioresalasmedidas
para triclosn. Los resultados son comparables a los descritos en la bibliografa, y la distribucin
209
existenteenellodopuedeexplicarseenbasealaspropiedadesdeloscompuestos,puestoqueapH
7,losclorofenolespresentanunasolubilidadentre3.2y3.9g/L,mientrasqueeltriclosntieneuna
solubilidad de 0.005 g/L. Adems, ste ltimo presenta niveles en agua superiores a los dos
clorofenoles(tablaIV.1,captuloIII).
En el caso de los lodos de depuradora, las muestras codificadas como 5, 6 y 7 se
correspondena muestraspuntualestomadas en la misma plantade tratamientodeagua residual.
Las mayoresconcentraciones de loscompuestos estudiados correspondieron a la muestra de lodo
biolgico,seguidodelprimario.Ellodoestabilizado,elcualprocededeunamezcladelodoprimario
ybiolgicotratadoconcarbonatoclcico,esutilizadoenlaagriculturacomofertilizante.Losniveles
deloscompuestosestudiados,aunqueinferioresquelosdetectadosenloslodosdepartida,sonlo
suficientemente considerables (sobre todo en el caso del triclosn) como para representar una
contribucin importante a su introduccin en el medio ambiente, de modo que es necesario el
controldeestosresiduosslidosutilizadosparausosagrcolas.Porotrolado,laincineracindeestos
lodos debe considerarse tambin con suma precaucin ya que el triclosn podra derivar en la
formacindedibenzodioxinas[KanetoshiA;1987].
Envistaalosdatospresentadosenlatablaanterior,resultaevidentequelosbalancesde
eliminacin de triclosn, realizados nica y exclusivamente en base a determinaciones en las
corrientesdeentradaysalida(influenteyefluente,respectivamente)delasestacionesdepuradoras,
resultanerrneos,yaqueunafraccinimportantedeestecompuestoesadsorbidaenloslodos.
210
CAPTULOV
TCSyParabenesenmuestrasdepolvo
I.DETERMINACINCONJUNTADETRICLOSNYPARABENESENMUESTRASDEPOLVO
1.1.Introduccin
El estudio de la presencia de compuestos orgnicos en atmsferas interiores ha

experimentadounaugeimportantedurantelosltimosaos.Estemedioconstituyeunafuentede
exposicin del ser humano (vas respiratorias y drmicas) a un nmero creciente de compuestos
qumicosusadosenmaterialesdeconstruccin,muebles,electrodomsticosyequiposelectrnicos,
ascomoenaerosolesyproductosdecuidadopersonal.Enelcasodeltriclosnylosparabenes,la
informacinrelativaasupresenciaenatmsferasinterioresesprcticamenteinexistente.Sloseha
encontrado una referencia en la que, junto con otros compuestos orgnicos, se estudiaron los
nivelesdeMeP,EtPyBuPenmuestrasdeaireypolvotomadasenatmsferasinteriores[RudelRA;
2003]. En este trabajo, el aire se pas a travs de un polmero XAD2, que posteriormente fue
extradocondiclorometano(150mL).Lasmuestrasdepolvoseobtuvierondebolsasdeaspiradora,
analizandolafraccinconuntamaodepartculainferiora150m.Paralaextraccindediversos
compuestosfenlicos,entreelloslosparabenes,serealizunataquecidodelasmuestrasdepolvo
conunamezcla1:1decidosulfrico:agua,traslocualseprocedialaextraccinslidolquidoen
triplicadocondiclorometano.Tantolosextractosdeairecomolosdepolvo,seconcentrarona1mL
ysederivatizaronconBSTFAa60C,durante60minutosparaseranalizadosmedianteGCMS.Los
nivelesdeparabenesencontradosfueroninferioresa21ng/m3 paraairey8g/gparapolvo.Enel
caso del triclosn, no se ha encontrado ninguna referencia relacionada con su determinacin en
atmsferasinteriores.
Dentro de las actividades realizadas en esta Tesis Doctoral se ha considerado relevante
evaluar los niveles de TCS y parabenes (MeP, EtP, PrP y BuP) en atmsferas interiores usando
muestrasdepolvo,procedentesdeaspiradoresdomsticos,comomatrizpararealizarelestudio.El
trabajo realizado se ha centrado en el desarrollo de dos metodologas de preparacin de muestra
diferentes (combinando las etapas de extraccin y purificacin) para a continuacin proceder a la
sililacin de los analitos y su posterior determinacin mediante GCMS/MS, en las condiciones
optimizadasenloscaptulospreviosparamuestrasdeaguasylodos.
Lastcnicasdepreparacindemuestraconsideradashansidolaextraccinpresurizadacon
disolventes(PLE)yladispersindelamatrizenfaseslida(MSPD).Laprimerapresentaunelevado
grado de automatizacin permitiendo procesar, sin necesidad de un usuario dedicado, un nmero
considerabledemuestras.DentrodelasaplicacionesdePLEparalaextraccindenuestrosanalitos,
slosehanencontradoreferenciascentradasenladeterminacindetriclosnenmuestrasdelodo
de depuradora y sedimento (tabla I.1). Por su parte, MSPD es una tcnica que no requiere la
adquisicin de instrumentacin especfica y, adems, precisa volmenes de disolventes
213
Atmsferasinteriores
relativamente bajos. Aunque su eficacia como tcnica de preparacin para alimentos y muestras
biolgicas ha sido evaluada de forma extensa [Barker SA; 2007] sus aplicaciones a otras matrices
slidas,porejemplosuelosymuestrasdepolvo,sonmuchomslimitadas[GarcaLpezM;2008].
TablaI.1.ResumendelasaplicacionesdePLEparalaextraccindeTCS.
LOD RSD Rec.
(ng/g) (%) (%)
PLE:5gdepescado+hidromatrixenceldade22mL.
Ciclohexano:DCM(1:1)aTAmb,1500psi,3ciclosde
TCSyMTCSen 13
9min.Adicionar C12PCB30,yhacerGPC.Purificar 76
GCMS 1 (1)
pescado con800mgdeslicaactivadacon5%deagua, 108
eluyendocon10mLdeHexano:AcOEt(10:1).
Concentrara50200L.
PLE:10gdeliofilizado+2ghidromatrix,enceldade
TCSybifenilolen 22mL.DCM,100C,1500psi,1ciclode5min. GCMS
sedimentos Evaporara5mLypurificacincon1gdeslica, 3.5 7 100 (2)
LCMS/MS
marinos eluyendoconacetonaymetanol.Llevarasequedady
reconstituirconfasemvil.
TCSyMTCSen PLE:1gliofilizado.DCM,100C,1500psi,3ciclosde
sedimentosy 5min.Purificacincon2gdeslicayelucincon2
mLdeDCM,evaporandoasequedad.Derivatizarcon GCMS/MS 1.5 3 95 (3)
lodosde
diazometano.Eliminacindedisolvente,reconstituir
depuradora conAcOEt.
PLE:0.10.2gdeliofilizado,dispersarcon3gde
TCSyTCCen hidromatrix,DCMa60Cy1500psi,3ciclosde5
min.PurificarconOasisHLB500mg,lavandocon LCMS/MS 1.5 6 98 (4)
lodos
hexano,DCMyagua,eluirconMeOH:Acetona(1:1).
ConcentrarasequedadyreconstituirconMeOH.
TCSyPPCPsen PLE:0.5gliofilizado+materialinerteenceldasde33 70
lodosde mL.ExtraccinconAcOEta130C,2ciclosde45min. GCMS 31 (5)
130
depuradora Evaporara1mL,ydiluir1:9contolueno.
TCSyfrmacosen PLE:2.7gsuelo1glodoliofilizado+arenaen
lodosysuelos celdasde33mL.ExtraccinconMeOH:agua(1:1)a 3.0
LCMS/MS 20 100 (6)
enriquecidoscon 60C/1500psicon2ciclosestticosde5min. 4.6
lodos ConcentraryhacerSPEOasisHLB200mg.
(1)BalmerME,2004;(2)AgeraA,2003;(3)SingerH,2002;(4)ChuS,2007;(5)LigonAP,2008;(6)BarronL,2008.

PLE presenta la ventaja de poder controlar la selectividad de la extraccin rellenando la
celdacondistintosadsorbentesenvezdematerialesinertes[CanosaP;2007A].Ladisposicindel
adsorbente puede tener mltiples propsitos. Colocado en la parte inferior de la celda,
inmediatamentedespusdelamuestra,tienelafinalidadderetenerlasinterferenciascoextradaso
destruirlas [Bjrklund E; 2006]. A modo de ejemplo, la utilizacin de adsorbentes de fase normal
qumicamente modificados, como la slice cida en combinacin con disolventes apolares como
hexano,permiteobtenerextractoslibresdegrasasenelanlisisdealimentos.
214
TCSyParabenesenmuestrasdepolvo
Homogeneizarlamuestra,previamenteasuempaquetamientoenlaceldadelequipo,con
unadsorbenteenfasenormaloreversatambinpermitemejorarlaselectividaddelaextraccin[de
laCalA;2003][GmezArizaJL;2002].

Con respectoa la tcnica de dispersin de la matriz en fase slida (MSPD) sus principales
virtudessonlasencillez,rapidez,selectividadybajocoste.Laadecuadacombinacindeadsorbentes
y disolventes permite obtener extractos libres de impurezas. Su aplicacin en matrices
medioambientales no es la ms habitual, aunque los resultados hasta ahora obtenidos son tan
buenoscomolosproporcionadosporPLEoMAE[GarcaLpezM;2008].
1.2.Condicionesexperimentalesdemedida
Como se ha comentado en el apartado anterior, GCMS/MS ha sido la tcnica de

determinacin utilizada para cuantificar los niveles de triclosn y parabenes en muestras de polvo
trassusililacin.Lascondicionesdetrabajoempleadasserecopilanenlasiguientetabla(tablaI.2).
Tabla I.2. Parmetros de determinacin para triclosn, metilparaben, etilparaben, propilparaben y

butilparaben.
Tr Tr Inprecursor Nivelde Amplitudde Ionesproducto

(min)1 (min)2 (m/z) almacenamiento(m/z) excitacin(V) (m/z)3
MeP 17.05 17.38 209 92 0.5 195,177,149
EtP 17.83 18.15 223 98 0.5 195,177,163,151
PrP 18.91 19.20 237 104 0.5 195,163,151
BuP 19.91 20.24 251 110 0.5 195,151
TCS 23.13 23.38 347 140 1.5 200,310,219
1 2 3
ColumnaHP5MS ColumnaCPSil8LowBleed Ionesutilizadosparalacuantificacin

Adems, en algunas ocasiones se ha utilizado GCMS como tcnica de deteccin,
principalmentepararegistrarelperfildecorrienteinicatotalqueproducenlosextractosobtenidos,
evaluandoassucomplejidadbajodiferentescondicionesdeextraccin.
215
Atmsferasinteriores
1.3.Extraccincondisolventespresurizados
La matriz empleada para evaluar la presencia de triclosn y parabenes en atmsferas

interiores correspondi al contenido de las bolsas de aspiradores domsticos. Con objeto de
incrementarlahomogeneidaddelamatriz,elcontenidodelasbolsasfuetamizadoylafraccinpor
debajodelas60mempleadaenesteestudio.
Paraoptimizarlosfactoresqueafectanalaeficaciadelosprocesosdeextraccinycleanup
sehautilizadounpooldedosmatrices(1:1)concontenidosdecarbonoorgnicode24.7y25.6%.
UnavezverificadalaexistenciadenivelesconsiderablesdeTCS,MePyPrPenlamuestracompuesta,
se procediasu fortificacin conEtPy BuP, a nivel de300ng/g. Paraello se aadi1 mL deuna
disolucin patrn de EtP y BuP de 300 ng/mL en acetona por cada gramo de polvo. Tras la
evaporacin del disolvente, la muestra se dej envejecer durante varios das a temperatura
ambiente.

1.3.1.Estrategiadepurificacin
La eficacia dela purificacinonline (en la celda de extraccin) de los extractos de PLE se

evalu considerando cuatro adsobentes diferentes, tres en fase normal (Florisil 60100 mesh,
almina150meshyslica230400mesh),previamenteactivadosa130Cdurante24horas,yunode
fasereversa(C1870230mesh).Entodosloscasos,0.5gdemuestrasehomogeneizaroncon1gde
sulfato sdico anhidro y 2.5 g del adsorbente considerado en un mortero de vidrio. Una vez se
obtuvounamezclahomognea,seintrodujoenlaceldadelextractordePLE,conteniendo,deabajo
aarriba,dosfiltrosdecelulosa,1gdesulfatosdicoanhidroy1.5gdelmismoadsorbenteutilizado
enladispersin.Laceldaserellenconsulfatosdicoysecompact,colocandounfiltrodecelulosa
enlapartesuperior.Cabedestacarque,paraelcasodelaalmina,debidoasumayordensidad,la
masautilizadafueeldoblequeparalosotrosadsorbentes.

Las condiciones de trabajo en estas etapas iniciales fueron seleccionadas teniendo en
cuenta aplicaciones de PLE al anlisis de sedimentos. La extraccin se llev a cabo con acetato de
etilo, a 130C considerando un ciclo de 10 minutos a 2000 psi (13.8 MPa). El volumen de lavado
(flush) y el tiempo de purga con nitrgeno de la celda fueron de 100 % y de 60 segundos,
respectivamente.Unavezobtenidoslosextractos,seconcentrarona5mL,yunaalcuotade500L
se derivatiz con 40L deMTBSTFA a 70C durante60 minutos. El perfil de corriente inica total
(TIC)obtenidoconcadaadsorbentesemuestraenlasiguientefigura(figuraI.1).
216
PLEaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo
FiguraI.1.CromatogramasdeGCMS(TIC)obtenidosparafraccionesdeunamismamuestradepolvo
enfuncindeltipodeadsorbente.
MCts
A:Arena
B:C18
10.0
C:Slica
D:Almina
E:Florisil
7.5
5.0
2.5 A
B
C
D
0.0 E
15.0 17.5 20.0 22.5 25.0
minutos
Comoseobservaenlafiguraanterior,laslicayelC18proporcionaroncromatogramasmuy
complejos,similaresalosobtenidosconarena.ParaFlorisilyalminaseobservunmenornmero
deinterferenciascoextradas,indicandoqueestasfueronretenidasenmayorextensinporestos
adsorbentes. Al inyectar estos extractos en GCMS/MS, se obtuvieron respuestas ligeramente
superiorescuandoseusaFlorisilcomodispersantedelamuestraycoadsorbenteenelfondodela
celda, tabla I.3. En base a estos resultados, se seleccion el Florisil como agente dispersante para
experimentosposteriores.
TablaI.3.reasdepicoenlosextractosdePLE.
MeP EtP PrP BuP TCS
Florisil 5126 2238 2357 4764 6441
Almina 2953 1711 1743 4590 4938
Paraincrementarlaselectividaddelmtodo,seplantelaposibilidadderealizarunaetapa
delavado,previaalprocesodeextraccin,conobjetodeeliminarcompuestosapolaresnoretenidos
por el Florisil y que contribuyen a incrementar la complejidad del extracto. Esta estrategia fue
descritaporPapagiannopoulos[PapagiannopoulosM;2002]enladeterminacindepolifenolesen
plantasyalimentos,realizandounlavadodelaceldadeextraccinconpentanoa60C,seguidadela
extraccindelosanalitosconacetonaencondicionesmsenrgicas.
Para este estudio, se seleccionaron dos disolventes de caractersticas apolares: hexano y
217
Atmsferasinteriores
diclorometano. La etapa de lavado se realiz en condiciones suaves de temperatura, presin y

tiempo(40C,1ciclode1minutodeextraccinestticaa500psi),conunvolumendeflushde50%
y un tiempo de purga de 1 minuto. Cada muestra fue extrada con cuatro ciclos consecutivos de
lavado en las condiciones fijadas, recogiendo las fracciones en distintos viales colectores. A
continuacin,seextrajoconacetatodeetiloparaponerdemanifiestolapresenciadelosparabenes
en la matriz. Todos los extractos (fracciones de lavado y extracto en acetato de etilo) fueron
evaporadosasequedadbajocorrientedenitrgenoyreconstituidoscon2mLdeacetatodeetilo,
procediendoasuderivatizacineinyeccinenGCMS/MS,figuraI.2.
Figura I.2. Distribucin de los analitos entre las fracciones de lavado (Fr 1Fr 4) y el extracto en
acetatodeetilo(Fr5).
120%
100% MeP
Searelativa
80% EtP
60% PrP
40% BuP
20% TCS
0%
Fr1 Fr2 Fr3 Fr4 Fr5 Fr1 Fr2 Fr3 Fr4 Fr5
Hexano DCM
Lautilizacindenhexanonoprovocprdidasdelosanalitosenlasfraccionesdelavado,
recuperndose en la ltima fraccin de acetato de etilo. Por su parte, el uso de diclorometano
ocasion la aparicin de seal de los compuestos en las fracciones sucesivas de lavado,
principalmente del TCS. Este comportamiento es coherente con la bibliografa existente para la
extraccin de triclosn en matrices slidas mediante PLE, ya que algunos autores utilizan
diclorometanocomodisolventedeelucin[AgeraA;2003].Enbaseaestosresultados,elhexano
se seleccion como disolvente de limpieza de la celda de PLE, previamente a la extraccin de los
compuestosdeinters.
Para la optimizacin de las condiciones de limpieza con hexano, en lo referente a
temperatura (40120 C), tiempo (110 minutos) y nmero de ciclos (15), se utiliz un diseo
factorialadosnivelesconunpuntocentral.Traslaetapadelavado,deacuerdoconlascondiciones
descritas en cada uno de los experimentos del diseo, las celdas fueron extradas con acetato de
etiloenlascondicionespropuestas(1ciclode10minutosa130Cy2000psi,flushde100%ypurga
de 1 minuto). Estos extractos (acetato de etilo), una vez concentrados y derivatizados, fueron
inyectadosenelsistemaGCMS/MS.Elobjetivodeesteestudiofueseleccionarlascondicionesde
lavado ms enrgicas que no impliquen prdidas de los analitos. La carta Pareto con los efectos
218
principalesestandarizadossemuestraenlafiguraI.3.

FiguraI.3.CartaParetoparaeldiseodelavadoconhexano.
Tiempo(min) Temperatura(C) Ciclos
TCS
BuP
PrP
EtP
MeP
5 4 3 2 1 0 1
Efectoestandarizado
Comosepuedecomprobar,latemperaturahasidolavariablemsrelevante.Elvalordesu
efecto estandarizado es superior a la lnea que describe el nivel de significacin, con un 95 % de
confianza,paratodoslosanalitos.Puestoquesuinfluenciaesnegativa,aaltastemperaturasparte
de los compuestos son coeludos con las interferencias apolares en el hexano. Experimentos
adicionales realizados a 80C y 120C, en los valores intermedios para el nmero de ciclos y el
tiempodeextraccin,pusierondemanifiestolapresenciadetriclosn,aunquenodelosparabenes,
enlafraccindelavado,inclusomanteniendolaceldaa80C,figuraI.4.
Figura I.4. Fracciones de hexano eludas a 80C y 120C en 3 ciclos de 6 minutos. Seal
correspondientealTCS.
kCts
6 120C 200
100%
5 75%
50% 310
4
25% 170 312
3 0%
150 200 250 300 350 400
2 m/z
1
0
Cts
80C 200
70 100%
75% 329
50 50% 310
267 328
25% 164
30 0%
150 200 250 300 350 400
m/z
10
23.00 23.25 23.50 23.75 minutos
219
Atmsferasinteriores
Enbaseaestosresultados,latemperaturadelaceldaenlaetapadelavadosemantuvoa
40C para evitar posibles prdidas de TCS. El tiempo y el nmero de ciclos, correspondientes a la
etapadelavado,sefijaronen4minutosy1ciclo,respectivamente,yaqueelusodetiemposms
largos o un nmero mayor de ciclos, aunque no provoc prdidas de los analitos, tampoco
contribuyareducirelniveldeinterferencias.
La comparacin de los cromatogramas de GCMS (TIC) obtenidos para los extractos de
muestras de polvo con y sin limpieza previa de la celda con hexano, mostraron una mejora
considerableenelperfildelcromatogramaobtenido,talcomosepuedeapreciarenlafiguraI.5.
FiguraI.5.CromatogramasdeGCMSparaunamuestradepolvo(extractoenacetatodeetilo)cony
sinetapadelavado.
MCts
3.0
Sinetapadelavado
2.5
Lavadopreviocon
2.0
hexano
1.5
1.0
0.5
0.0
17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 minutos

1.3.2.Optimizacindelascondicionesdeextraccin
Unavezverificadalaposibilidaddeintegrarunaetapadelimpiezaonline,consistenteenla
utilizacindeunadsorbenteenfasenormal(Florisil)enlaceldadeextraccinylaintroduccinde
una etapa de lavado previa a la elucin de los analitos, se procedi a la optimizacin de las
condicionesdeextraccin.

1.3.2.1.Disolventedeextraccin
El primer factor estudiado fue el tipo de disolvente empleado para la extraccin de los
compuestos.Enfuncindesuscaractersticasfsicoqumicas,seseleccionarontresdisolventescon
polaridad creciente que adems fuesen compatibles con la etapa posterior de sililacin:
220
diclorometano,acetatodeetiloyacetonitrilo.Paralarealizacindelosexperimentos,lasceldasse
rellenaron siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Tras una primera etapa de lavado con
hexanoa40C,seextrajeroncondiclorometano,acetatodeetilooacetonitrilo,empleandounsolo
cicloa130Cy2000psidurante10minutos.Losextractos,concentradosasequedadpararealizarel
cambiodedisolvente,fueronreconstituidoscon2mLdeacetatodeetilo,derivatizandounaalcuota
de500Lcon40LdeMTBSTFAduranteunahoraa70C.Losresultadosobtenidossemuestranen
lafiguraI.6.

Figura I.6. Eficacia de extraccin para diclorometano, acetato de etilo y acetonitrilo (N=3).
Respuestasnormalizadasfrenteaacetatodeetilo.
DCM AcOEt ACN
180%
160%
140%
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
MeP EtP PrP BuP TCS
Como se observa en la figura I.6, el diclorometano fue el disolvente que present menor
afinidadporloscompuestos.Paraacetatodeetiloyacetonitrilo,laeficaciadeextraccinesfuncin
de las caractersticas de los analitos. Los ms polares, MeP, EtP y PrP (Log Kow 1.9, 2.4 y 2.9,
respectivamente) mostraron una mayor afinidad por el acetonitrilo (ms polar que el acetato de
etilo),mientrasqueelBuPyTCS(LogKow3.5y4.8)seextrajeronenmayorextensinconacetatode
etilo. Dado que el acetato de etilo es ms fcil de concentrar mediante evaporacin que el
acetonitrilo,seseleccionfinalmentecomodisolventedeextraccin.
1.3.2.2.Temperatura,tiempoymasadecoadsorbente
Una vez establecido el disolvente de elucin, los valores correspondientes a temperatura,

tiempo de extraccin, as como masa de Florisil situado en la parte inferior en la celda como
adsorbenteparalaretencindeinterferenciaspolares,hansidooptimizadossimultneamentecon
un diseo experimental central compuesto (CCD) tipo 23 con 6 puntos estrella situados a una
distancia axial de =1.68. El nmero de puntos centrales fue de nueve para tener un diseo
221
Atmsferasinteriores
ortogonal y rotable. Los valores extremos para los factores temperatura, tiempo y masa de co
adsorbenteexploradoseneldiseofueron70180C,119minutosy02g,respectivamente.
EntodoslosexperimentoslamasatotaldeFlorisilenlaceldadeextraccin,considerandola
cantidaddedispersantemslacantidadusadacomocoadsorbente,semantuvoen4g.Lapresin
detrabajosefijen2000psi(13.8MPa),suficienteparamantenereldisolventeenestadolquido
dentrodelacelda,mientrasqueelnmerodeciclos,elvolumendeflushylapurgadenitrgenose
fijaronen1,100%y60segundos,respectivamente.
Una vez realizadas las 23 extracciones, en las condiciones descritas en la tabla I.4, se
analizaronlosextractosmedianteGCMS/MS,obteniendolossiguientesresultados.
Tabla I.4. Condiciones de extraccin y resultados (reas de pico) obtenidos para el diseo
experimentalcentralcompuesto.
Exp Temp(C) Tiempo(min) Coadsorbente(g) MeP EtP PrP BuP TCS
1 92 15.3 1.6 135929 44689 73782 33193 164254
2 125 10 2 129934 38969 70240 33717 137929
3 158 4.7 0.4 176215 52679 77508 33810 90158
4 125 1 1 164910 54029 88373 39284 152992
5 70 10 1 113152 39899 70569 37291 205416
6 125 10 1 159437 47251 78291 38697 162794
7 125 10 1 185439 59740 83262 40810 135083
8 125 10 1 192999 58385 84221 32803 139148
9 92 15.3 0.4 167593 53735 85501 40040 153719
10 125 19 1 156991 46300 70614 33317 165208
11 125 10 1 183301 51979 82352 35751 198693
12 92 4.7 0.4 153562 49683 75254 31909 174008
13 92 4.7 1.6 157553 52723 85592 38393 206420
14 158 4.7 1.6 164083 45740 65334 29771 112129
15 180 10 1 160886 43501 59774 23372 69899
16 125 10 1 173145 49024 78073 32584 177100
17 125 10 1 195747 60773 88360 36530 160151
18 158 15.3 1.6 198822 53355 71459 30289 112555
19 125 10 1 207497 64448 89157 39469 195846
20 125 10 1 191656 57142 78794 34479 160582
222
Exp Temp(C) Tiempo(min) Coadsorbente(g) MeP EtP PrP BuP TCS

21 158 15.3 0.4 207336 56411 83128 34314 78863
22 125 10 0 149781 42424 67458 30554 96820
23 125 10 1 149015 47545 80104 36700 143942
Una vez tratados los datos anteriores con el programa estadstico Statgraphics Centurin
XV.I, se obtuvieron los efectos principales, los trminos cuadrticos y las interacciones entre dos
factoresquesemuestranenlatablaI.5.
Tabla I.5. Valores normalizados para los efectos principales, los trminos cuadrticos y las
interaccionesdeordendoscorrespondientesaldiseotipoCCD.
MeP EtP PrP BuP TCS
A:Temperatura(C) 2.92a 0.62 1.68 3.23a 7.29a
B:Tiempo(min) 0.66 0.19 0.78 0.45 0.69
a
C:Coadsorbente(g) 1.10 0.91 0.90 0.26 2.30
a
AA 2.02 1.91 2.97 2.33a 1.84
AB 1.39 0.92 0.88 0.11 0.97
AC 0.19 0.15 1.17 0.77 0.31
BB 0.38 0.11 0.21 0.28 0.32
BC 0.52 0.39 1.13 1.40 0.09
a
CC 1.83 2.14 2.14 1.53 3.29
a
Factoresestadsticamentesignificativosaunniveldeconfianzade95%.
La variable tiempo no afect en gran medida a la eficacia del proceso de extraccin. La

temperatura jug un papel ms importante, siendo estadsticamente significativa para el MeP, el
BuPyTCS.Paralosdosltimos,elrendimientodelaextraccindisminuyatemperaturaselevadas,
mientras que para el MeP se observ el efecto contrario. Por otra parte, el trmino cuadrtico
asociado con la temperatura tambin result significativo para PrP y BuP, lo que sugiere que la
variacin en la eficacia de extraccin no sigue un modelo lineal dentro del dominio experimental
considerado para esta variable. Dado que la viscosidad de los lquidos disminuye al aumentar la
temperatura, cabe esperar que la solubilidad de los analitos en el disolvente de extraccin, y por
tantolaeficaciadesta,aumenteconlatemperatura,sinembargo,paraalgunoscompuestosseha
descritouncomportamientoopuesto,coincidenteconelobservadoenestetrabajoparaBuPyTCS
[Petrovic M; 2002][ConchaGraa E; 2004][Rodil R; 2006]. Prdidas por evaporacin de los
compuestoscuandoelextractocalienteestransferidodesdelaceldadeextraccinalvialcolector
y/odegradacintrmicadelosanalitosenlaceldadePLEpodranexplicarlareduccinenlaeficacia
223
Atmsferasinteriores
deextraccinalaumentarlatemperaturadelacelda.Enestecasoconcreto,paraelBuPyparael
TCS,lasprdidasporevaporacinnopuedenjustificarestadisminucin,puestoquesonlosmenos
voltiles de los cinco compuestos estudiados. Con respecto a la masa de coadsorbente, slo fue
estadsticamente significativa para el triclosn, al igual que el trmino cuadrtico asociado a la
misma.Porltimo,lasinteraccionesentrefactoresnoalcanzaronelniveldesignificacinestadstica
(95%deconfianza)paraningunodelosanalitosconsiderados.
Puesto que las condiciones ptimas de extraccin (sobre todo en lo referente a la
temperaturadelacelda)fuerondiferentesparaMePfrentealoscompuestosmsapolares(BuPy
TCS) se utiliz una funcin de deseabilidad global para estimar las mejores condiciones de trabajo
paraelconjuntodeloscincoanalitosconsiderados.Enprimerlugar,lasrespuestasobtenidaspara
cadaanalitoenlosdiferentesexperimentosimplicadoseneldiseotipoCCD,hansidonormalizadas
entre 0 y 1. A continuacin, la funcin de deseabilidad global se ha definido en base a su media
geomtrica. La representacin de esta funcin frente a la temperatura y masa de coadsorbente,
considerandoeltiempodeextraccinenelvalorcentraldeldiseo(10minutos),semuestraenla
figuraI.7.
Figura I.7. Representacin de la funcin de deseabilidad global temperaturacantidad de co

adsorbenteparauntiempodeextraccinde10minutos.
Tiempo10min
0.8
Valornormalizado
0.6
0.4
0.2
2
0 1
70 90 (g)
110 130 150 170 0
be nte
190 or
ads
Temperatura(C) Co

Como se puede observar, el mximo corresponde a una temperatura de 103C y una
cantidaddecoadsorbentede1g.Paraelvalorptimodetemperatura,eltiempodeextraccinque
proporcionmejoresresultadoscorrespondia1minuto,figuraI.8.

224
FiguraI.8.Funcindedeseabilidadglobaltiempomasadecoadsorbenteparaunatemperaturade
103C.
Temperatura103C
1
Valornormalizado
0.5
2
0 1 )
(g
1 6 nte
11 16 0 rbe
21 dso
Tiempo(min) C o a

En consecuencia, las condiciones finales de extraccin seleccionadas fueron 103C, 1
minutodetiempodeextraccin,1gdeFlorisilcomocoadsorbenteenlaceldadeextraccin,y,por
lotanto,3gdelmismomaterialdispersante.
1.3.2.3.Ciclosdeextraccin
El nmero de ciclos de extraccin por muestra, definido como el nmero de etapas de

extraccinestticaqueseaplicasobreunamismaceldaconunaporcinfrescadedisolvente,fueel
ltimoparmetroaoptimizar.
Paraevaluarelefectodeestefactor,seextrajeronunaseriedemuestrasconsiderandoun
nmero creciente de ciclos (de 1 a 5), en las condiciones ptimas estimadas anteriormente. Tras
cada ciclo de extraccin, la celda fue lavada con un volumen de acetato de etilo equivalente al
volumen total de flush (100 % del volumen de la celda) dividido entre el nmero de ciclos. Los
extractosobtenidos,usandounnmerocrecientedeciclos,seetiquetaroncomofraccin1.Despus
del ltimo ciclo de extraccin las celdas fueron purgadas y despresurizadas. A continuacin, se
volvieronaextraeraplicandounnicociclode1minuto,recogiendoelextractoenunsegundovial
etiquetadocomofraccin2.Ambasfraccionesfueronconcentradasa2mLy,unavezderivatizadas,
analizadasmedianteGCMS/MS.EnlafiguraI.9,serepresentalasrespuestasrelativas(readepico
para la segunda fraccin frente a la suma de las respuestas para ambas) para cada compuesto en
funcindelnmerodeciclosimplicadosenlaprimeraextraccin.
225
Atmsferasinteriores
FiguraI.9.Respuestarelativaobtenidaenlareextraccindelasmuestrasfrentealnmerodeciclos
consideradosenlaprimeraextraccin,103C,13.8MPay1minuto(N=2).
Sealrelativaparala2extraccin
MeP EtP PrP BuP TCS

12%
10%
8%
(%)
6%
4%
2%
0%
1 2 3 4 5
Ndeciclosenlaprimeraextraccin
Cuandoseaplicaron3msciclos,lasealrelativaparalassegundasfraccionesfueinferior
al5%deltotalparatodosloscompuestos.Adems,noseobservunareduccinmuysignificativa
enlarespuestaobtenidaparalasegundafraccin,considerandounnmeromayordeciclosenla
primera,portanto,sunmeroselimitatres.
1.3.3.Optimizacindelascondicionesdederivatizacin
Las condiciones de derivatizacin utilizadas hasta ahora fueron las consideradas para la
sililacindelosextractosdeaguaresidual.Dadalamayorcomplejidaddelosextractosdepolvose
consideroportunoreoptimizarlascondicionesdederivatizacin.

Paralarealizacindeesteestudio,seempleunamezcladeextractosobtenidosmediante
PLEparafraccionesdeunamuestradepolvoconadicindeEtPyBuPanivelde300ng/g.Alcuotas
de0.5mLdelpooldeextractossederivatizaronendiferentescondicionesdetemperatura,volumen
deMTBSTFAytiempo.DenuevoseutilizundiseoexperimentalfactorialdeltipoCCD,ortogonaly
rotable,paraestudiareldominioexperimentaldetrabajodeformaexhaustiva,tablaI.6.Elanlisis
delasrespuestasobtenidascondujoalosefectosprincipalesquesemuestranenlatablaI.6.
226
TablaI.6.Dominioexperimentalyefectosprincipalesestandarizadosparavolumendederivatizante,
tiempoytemperaturaparaeldiseotipoCCD.
Dominioexperimental Efectosestandarizados
Factores
1.68 1 0 +1 +1.68 MeP EtP PrP BuP TCS
A:Vol.(L) 20 36 60 84 100 0.92 0.39 0.31 0.72 1.15
B:Tiempo(min) 4 13 33 50 62 0.77 0.94 1.64 0.73 0.21
C:Temp.(C) 20 30 45 60 70 0.99 1.37 0.77 0.97 0.24
Ningunodelosfactoresresultserestadsticamentesignificativoaunniveldeconfianzade
95%.Detodosmodos,laeleccindelascondicionesdetrabajosehizoenbasealafuncinglobal
dedeseabilidadobtenidaparaloscincocompuestos,figuraI.10.Considerandounvolumenmnimo
dederivatizante(20L),lasuperficiederespuestaparalafuncindedeseabilidadglobalpermiti
visualizar los valores ptimos de temperatura y tiempo. Las condiciones de derivatizacin
seleccionadasfueron20LdeMTBSTFA,65Cy5minutos.
Figura I.10. Superficie de respuesta para la funcin de deseabilidad global correspondiente a la

derivatizacindeextractosdepolvo.
VolumendeMTBSTFA20L
1
Valornormalizado
0.5
70
60
0 50
40 )
4.4 30 (C
24.4 44.4 20 a tura
64.4 per
Tiempo(min) Tem

Una vez fijadas las condiciones de preparacin de muestra (figura I.11), se procedi a la
caracterizacin analtica del mtodo desarrollado, usando GCMS/MS como tcnica de
determinacin.
227
Atmsferasinteriores

Figura I.11. Condiciones ptimas de extraccin (PLE) y derivatizacin para la determinacin de
parabenesytriclosnenmuestrasdepolvo.
PreparacindelaceldadeASE(11mL):
0.5gde Filtro decelulosa

muestra
dispersadacon Rellenar conNa2SO4
3gdeFlorisil y 1gofNa2SO4
1gNa2SO4
Dosfiltros decelulosa
1gFlorisil
Limpieza: nhexanoa40C Extraccin: acetatode

y500psi (3.4MPa),1ciclo etiloa103C y2000psi
de4min,50%flush y1 (13.8MPa),3ciclosde1
min depurga min,100%flush y1min
depurga
Residuo Concentrara2mL
Derivatizar 0.5mL con20L de

MTBSTFAa65C durante5min

1.3.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad
yLOQs
El rango de respuesta lineal del equipo (GCMS/MS) fue evaluado con una serie de 10
patrones,preparadosenacetatodeetilo,enunintervalodeconcentracionescomprendidoentre2
ng/mLy1.5g/mL.
Para el clculo de los lmites de cuantificacin del sistema cromatogrfico se inyectaron
patrones de concentraciones comprendidas entre 0.1 y 1 ng/mL, obteniendo las relaciones seal
ruido de los picos correspondientes a cada analito. A concentraciones prximas a los LOQs e
intermedias en el rango de calibrado, se estim la variabilidad de la respuesta del equipo. Los
resultadosreferentesalosparmetrosquecaracterizanelsistemaGCMS/MSutilizado,semuestran
enlatablaI.7.
228

TablaI.7.Linealidad,repetibilidadyLOQsdelequipoGCMS/MSempleadoenesteestudio.Columna
CPSil8LowBleed.
MeP EtP PrP BuP TCS
Linealidad R2 0.998 0.994 0.996 0.996 0.997
8ng/mL 9.9 6.8 4.0 4.1 3.8

Repetibilidad
(%RSD,n=5)
500ng/mL 6.5 4.8 3.4 4.3 3.5
LOQ(ng/mL)a 0.4 0.5 0.6 0.6 0.3

a
ColumnaCPSil8LowBleed

La precisin intrada (repetibilidad) e interda (reproducibilidad) del procedimiento
propuestofueestudiadaconunamuestradepolvo,sinadicin,enlaquesedetectlapresenciade
todos los analitos. Para el estudio de repetibilidad se llev a cabo la extraccin de la muestra por
cuadruplicado dentro de un mismo da, mientras que para evaluar la reproducibilidad, la misma
muestra fue extrada por triplicado cuatro das consecutivos. Los resultados, expresados como
coeficientesdevariacin,mostraronvaloresinferioresal8%y11%respectivamente,tablaI.8.

Tabla I.8. Repetibilidad (N=4), reproducibilidad (N=12), recuperacin (N=4) y LOQs del mtodo
analticopropuesto.
RecuperacinSD
Repetibilidad Reproducibilidad LOQ
Analito Muestra1 Muestra2
(%RSD,n=4) (%RSD,n=12) (ng/g)
(TOC18%) (TOC20%)
MeP 5.0 6.1 985 948 1.6
EtP 5.8 10.6 856 886 2.2
PrP 4.7 9.7 867 8410 2.9
BuP 8.4 10.3 934 7613 3.6
TCS 6.6 8.6 925 9310 1.2
La exactitud del mtodo propuesto fue evaluada con dos muestras de polvo, una
procedente de un edificio pblico (TOC 18 %) y otro de una vivienda particular (TOC 20 %). Cada
muestrafuedivididaendosfracciones.Unadeellasfueenriquecidacon500ng/gdelosanalitos.La
229
Atmsferasinteriores
recuperacinsecalculcomoladiferenciadevaloresobtenidosparalasfraccionesconadicinysin
adicin, dividida por la concentracin aadida, tabla I.8. En general, las recuperaciones obtenidas
paraambasmuestraspresentaronvaloressuperioresal85%,convariacionesinferioresal13%,por
loquesepuedeafirmarqueelmtodopermiteextraerlosanalitoscuantitativamente.
Porltimo,loslmitesdecuantificacindelmtodoanalticoseestimaronconsiderandolos
blancos del proceso, as como los lmites de cuantificacin proporcionados por el equipo de GC
MS/MS.Teniendoencuentaquenosehadetectadolapresenciadeloscompuestosenlosblancosy
lacantidaddemuestradepartidafuede0.5g,losLOQsfueroninferioresa4ng/g.EnlafiguraI.12
semuestrauncromatogramareferentealamuestranmero1(tablaI.8)conysinadicin,ascomo
elblancodelproceso.

Figura I.12. Cromatogramas (m/z 177+151+195+200+310) de GCMS/MS para la muestra 1 (tabla
I.8)con(naranaja)ysinadicin(verde),ascomounblancodeproceso(azul).
kCts MeP
70
60
50
TCS
40
PrP
30 EtP BuP
20
10
17 18 19 20 21 22 23 minutos
230
MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo
1.4.Extraccinmediantedispersindelamatrizenfaseslida
AdicionalmenteaPLE,seevaluaronlasposibilidadesqueofreceladispersindelamatrizen
faseslida(MSPD)paralaextraccinconjuntadeparabenes(MeP,EtP,PrPyBuP)yTCSenmuestras
de polvo. Esta tcnica presenta un bajo coste, una gran sencillez y una considerable selectividad
derivadadelaposibilidaddeintegrar,aligualqueenelcasodePLE,etapasdepurificacinenlnea
con el proceso de extraccin, adems de emplear condiciones mucho ms suaves (temperatura
ambienteypresinatmosfrica)quePLE.Enestecaptulosedescribelaoptimizacinsistemticadel
procesodeMSPD,conelobjetodemaximizarlaselectividadyeficaciadelapreparacindemuestra.
ComotcnicadedeterminacinsehausadodenuevoGCMS/MSy,enalgunoscasos,GCMS.
1.4.1.Optimizacindelascondicionesdeextraccin

LosfactoresqueafectanalaeficaciadeextraccinenMSPDfueronoptimizadosmediante
el empleo de diseos experimentales factoriales, as como usando estudios univariantes para
determinados factores. La eleccin de C18 como agente dispersante fue un parmetro fijado de
antemano,yaqueeseladsorbenteempleadoenlamayoradelasaplicacionesdeMSPD[BarkerSA;
2007].

1.4.1.1.Eleccindelcoadsorbente
Como primer paso en la optimizacin de las condiciones de extraccin se estudi la

influencia de diferentes coadsorbentes en el perfil cromatogrfico obtenido en GCMS para
extractosdemuestrasdepolvo.LosmaterialesestudiadosfueronelFlorisil(60100mesh),almina
(150mesh),C18(70230mesh)yslica(230400mesh).Losadsorbentesenfasenormalseactivaron
a 130C durante 48horas, eliminando as las molculasde agua que pueden estar retenidas en la
superficiedesuspartculas.Entodosloscasosseemplearon2gdecoadsorbentesituadosbajo0.5
gdemuestra(polvotamizadoa60myfortificadoconlosanalitosanivelde100ng/g)previamente
dispersadaenunmorteroconsulfatosdicoanhidroy2gdeC18,figuraI.13.

FiguraI.13.DisposicindelamuestraenelcartuchodeMSPD.
0.5gdemuestra
dispersada con2g
deC18y0.5gde
Fritasde Na2SO4
polietileno
2gdecoadsorbente
231
Atmsferasinteriores
Laelucindelosanalitosserealizcon20mLdeacetatodeetilo.Unavezconcentradoa1
mL,sefiltrparaevitarlapresenciadepartculasenelextractofinal.Unaalcuotadelfiltrado(500
L)fuederivatizadaconMTBSTFAeinyectadaenGCMS.
Figura I.14. reas de pico y perfiles cromatogrficos para extractos de una muestra de polvo en
funcindelcoadsorbente(N=3).
Florisil C18 Almina Slica

3.E+05
MCts
2.E+05 30
25
2.E+05
20
reas
1.E+05 15
10
5.E+04
5
0.E+00 0
MeP EtP PrP BuP TCS 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5min
Como se puede comprobar, figura I.14, la seal de los compuestos es prcticamente

idntica en todos los experimentos con excepcin de MeP y TCS, utilizando la almina como co
adsorbente. Los cromatogramas de GCMS presentan menor complejidad para Florisil y almina,
frente al C18 y slica, por lo que finalmente se continu trabajando slo con los dos primeros
materialescomocoadsorbentes.
1.4.1.2.Disolventedeelucin
La eficacia de extraccin se evalu considerando cuatro disolventes con polaridades

crecientes (hexano, diclorometano, acetato de etilo y acetonitrilo) usando Florisil y almina como
coadsorbentes.Aligualqueenelapartadoanterior,lamuestrafuedispersadapreviamentecon2g
de C18. El volumen de disolvente se fij en 20 mL. Con objeto de evitar cambios aparentes en la
eficacia del proceso de preparacin de muestra, derivados de variaciones en el rendimiento de la
232
sililacin para extractos en diferentes disolventes, todos los extractos fueron concentrados a
sequedadyreconstituidoscon1mLdeacetatodeetilopreviamentealaadicindelagentesililante.
Los resultados obtenidos, como reas de pico, se muestran en la figura I.15 para cada
disolventeycoadsorbente.
FiguraI.15.reasdepicoenfuncindelcoadsorbenteyeldisolventedeelucinutilizadoenMSPD
(N=3).
Hexano DCM Acetatodeetilo Acetonitrilo

450000
400000
350000
reasdepico
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
MeP EtP PrP BuP TCS MeP EtP PrP BuP TCS
Florisil Almina
Engeneral,losresultadosrepresentadosenlafiguraI.15siguenlamismatendenciaquelos
observados para PLE. Por un lado, hexano y diclorometano no fueron capaces de recuperar los
analitos.Porotro,enacuerdoconlainformacinpresentadaenlatablaI.3ylafiguraI.14,laalmina
resultmsretentivaqueelFlorisil,porloqueseprefirielprimermaterialcomocoadsorbenteen
elcartuchodeMSPD.AunqueparaFlorisilseobtuvieronmayoresrespuestasusandoacetonitriloque
conacetatodeetilo,laeleccindeldisolventedeelucinsereservparaetapasposteriores.
Nihexanonidiclorometanopermitieronrecuperarlosanalitosdelamatriz,sinembargolos
cromatogramas obtenidos presentaronuna gran complejidad, especialmente para los extractos en
diclorometano. Por ello, se consider la posibilidad de realizar un lavado previo del cartucho con
diclorometano, para a continuacin proceder a la elucin de los compuestos usando acetonitrilo.
Planteadaestaestrategia,sepreparuncartuchodeMSPDdispersando0.5gdemuestracon0.5g
de sulfato sdico anhidro y 2 g de C18, con 2 g de Florisil como coadsorbente. En una primera
fraccin,serecogieron10mLdediclorometanoyacontinuacin,traselsecadodelcartuchoavaco,
se recuperaron los analitos con 10 mL de acetonitrilo. Una segunda muestra fue procesada en
condicionesidnticasperosinconsiderarlaetapadelavado.Loscromatogramasdecorrienteinica
total(TIC),inclusousandoadquisicinenmodoMS/MS,mostraronclaramentelosbeneficiosdela
etapadelavado,figurasI.16yI.17.
233
Atmsferasinteriores
Figura I.16. Cromatogramas de GCMS (TIC) para las fracciones de diclorometano y acetonitrilo
obtenidasdeunamuestradepolvo.
kCts
800
700 Diclorometano
600
500
400
Acetonitrilo
300
200
100
0
17.5 20.0 22.5 25.0 minutos

Figura I.17. Cromatogramas de GCMS/MS (TIC) para un patrn en acetonitrilo (A), un extracto de
MSPDenacetonitrilosinlimpiezaprevia(B)yunextractodeMSPDenacetonitriloconlavadoprevio
delcartuchousandodiclorometano(C).
kCts
MeP
150 A
EtP
100 PrP
BuP
TCS
50
0
17 18 19 20 21 22 23
minutos
kCts
kCts 300 MeP
800 B 250
C TCS
700
600 BuP 200 PrP
500
150
400 MeP
EtP PrP 100 EtP
300 TCS
200 50 BuP
100
0 0
17 18 19 20 21 22 23 minutos 17 18 19 20 21 22 23 minutos

1.4.1.3.Optimizacindelamasadedispersante,disolventedeelucinyvolumen
La cantidad de dispersante (C18), el tipo de eluyente (acetato de etilo o acetonitrilo) y
234
volumen del mismo fueron optimizados mediante un diseo factorial mixto tipo 3 x 22 con dos
puntoscentrales,tablaI.9.

TablaI.9.Dominioexperimentaldeldiseofactorial3x22.
Factor Bajo Medio Alto
Volumeneluyente(mL) 5 15 25
MasaC18(g) 0.5 2
Eluyente Acetatodeetilo Acetonitrilo
Los14experimentosdeldiseofueronllevadosacaboconunamezcla1:1dedosmuestras
de polvo procedentes de dos viviendas diferentes. Sus contenidos de carbono orgnico fueron de
24.7%y25.6%,respectivamente.DadoquelasconcentracionesnativasdeEtPyBuPenlamuestra
compuesta eran muy bajas, sta se fortific con ambos compuestos a nivel de 300 ng/g. A
continuacinsedejenvejeceratemperaturaambienteunperiodode10dasantesdeprocedera
suextraccin.
Los cartuchos de MSPD se prepararon usando 2 g de Florisil como coadsorbente,
dispersando0.5gdelpoolanteriorcon0.5gdesulfatosdicoanhidroylacantidaddeC18descrita
encadaexperimento.Trasellavadodeloscartuchoscon10mLdediclorometano,seeluyeroncon
el volumen indicado de acetonitrilo o acetato de etilo. Todos los extractos, incluidos los de
diclorometano,fueronconcentradosasequedadyreconstituidoscon1mLdeacetatodeetilo.Una
vezderivatizados,fueroninyectados,juntoconuncalibradoparasucuantificacin,enelsistemaGC
MS/MS. En ninguna de las fracciones de diclorometano, se detect la presencia de los analitos,
confirmandoquenoexistenprdidasenlaetapadelavado.Lamatrizdeexperimentos,juntoconlas
concentracionesobtenidasparacadaensayo,sepresentaenlatablaI.10.

Tabla I.10. Experimentos realizados en el diseo de MSPD (3 x 22) y respuestas (concentracin en
ng/g)obtenidasparacadacompuesto.
Exp. Vol.(mL) C18(g) Eluyente MeP EtP PrP BuP TCS
1 15 1.25 AcN 545.9 320.1 660.5 476.4 852.6
2 25 0.5 AcN 504.0 288.7 613.4 387.1 867.5
3 15 0.5 AcOEt 470.8 150.6 431.1 258.0 398.7
4 15 2 AcOEt 465.1 87.3 469.5 248.3 700.5
5 15 0.5 AcN 629.2 392.1 748.8 525.3 992.3
6 15 2 AcN 691.5 408.1 782.4 552.4 1012.4
7 5 0.5 AcN 372.9 191.1 527.3 396.4 1048.1
8 25 2 AcOEt 395.8 105.6 388.6 226.8 476.6
235
Atmsferasinteriores
Exp. Vol.(mL) C18(g) Eluyente MeP EtP PrP BuP TCS

9 15 1.25 AcOEt 485.4 288.6 471.9 224.9 306.6
10 5 2 AcN 721.0 458.8 979.8 744.5 928.9
11 5 2 AcOEt 25.0 9.1 16.3 8.6 12.2
12 25 2 AcN 572.2 361.6 796.5 564.4 1108.5
13 25 0.5 AcOEt 429.6 127.8 451.6 311.3 714.6
14 5 0.5 AcOEt 473.5 88.9 477.9 252.8 713.2

UsandoelprogramaestadsticoStatgraphics5.1,seobtuvieronlosefectosestandarizados
de cada variable, as como las interacciones entre factores. La carta Pareto para los efectos
principales,juntoconelniveldesignificacinaun95%deconfianza(lneavertical),semuestranen
lafiguraI.18.
FiguraI.18.CartaParetoconlosefectosprincipalesasociadosalosfactoresdeldiseoexperimental.
Volumen Eluyente Cantidaddispersante
TCS
BuP
PrP
EtP
MeP
2 0 2 4 6 8

Como se observa en la grfica anterior, el disolvente de elucin fue el nico factor
estadsticamente significativo (95 % de confianza). De nuevo se confirm que el acetonitrilo
proporcionaba mejores rendimientos que el acetato de etilo. La cantidad de dispersante
prcticamente no afect a la eficacia de extraccin, seleccionando finalmente el valor medio del
dominioexperimentalparaestavariable,1.25gdeC18.
El volumen de eluyente tampoco fue un factor significativo, por lo que, a priori, se podr
mantener en el nivel bajo del diseo (5 mL); sin embargo, su valor ptimo se estableci en un
estudioposterior,conjuntamenteconlamasadecoadsorbente.

1.4.1.4.Masadecoadsorbenteyvolmenesdedisolventesdelavadoyelucin

La masa de Florisil (coadsorbente en la columna de MSPD), as como los volmenes de
diclorometanoyacetonitrilofueronestudiadosconjuntamentecomoltimopasoenlaoptimizacin
236
delascondicionesdeextraccin.Sellevaronacabodosseriesdeexperimentosusando1y2gde
Florisil como coadsorbente. En la primera se evalu el volumen mximo de disolvente de lavado,
pasando atravs de los cartuchos deMSPD tres fracciones consecutivas de diclorometano(10 mL
cadauna)yunaltimade15mLdeacetonitrilo.Enlasegundaserie,seestudielvolumenmnimo
deacetonitriloparaeluircuantitativamentelosanalitos.Serecogiunanicafraccinde10mLde
diclorometano, y tras el secado de los cartuchos, cuatro fracciones consecutivas de 5 mL de
acetonitrilo.Todaslasfraccionesfueronconcentradasasequedadyreconstituidasconacetatode
etilo para su posterior anlisis mediante GCMS/MS. Los resultados obtenidos se muestran en la
figura I.19, donde se representa seal relativa para cada fraccin frente a la suma de seales de
todaslasfraccionesrecogidas.

FiguraI.19.Distribucindelosanalitosentrelasfraccionesdediclorometano(A)yacetonitrilo(B),
usando1y2gdeFlorisilcomocoadsorbente.Datosparaextraccionesenduplicado.
A
100%
80%
Fr1,10ml DCM
60% Fr2,10ml DCM
40% Fr3,10ml DCM
20% Fr4,15ml ACN
0%
1gFl ori s i l 2gFl ori s i l
100% B
Fr1,10mLDCM 80%
Fr2,5ml ACN 60%
Fr3,5ml ACN 40%
Fr4,5ml ACN 20%
Fr5,5ml ACN 0%
1gFl ori s i l 2gFl ori s i l
Elvolumendediclorometanonecesarioparaeluirlasinterferencias,sinquehayaprdidas
de los compuestos estudiados, ha sido dependiente del analito y de la masa de coadsorbente. El
triclosn, el ms lipoflico de los compuestos estudiados, aparece en la primera fraccin de
diclorometanocuandoseutiliz1gdecoadsorbente,mientrasque,usando2gdeFlorisil,fueron
237
Atmsferasinteriores
necesarias dos fracciones de 10 mL de diclorometano para detectar prdidas de este compuesto

(figura I.19 A). Para los parabenes, el perfil de elucin fue ms lento que para el triclosn,
aprecindose la seal de estos compuestos en la segunda y tercera fraccin de 10 mL de
diclorometanopara1gdeFlorisil,mientrasquenohuboprdidassignificativasenlasfraccionesde
lavadocuandolacantidaddecoadsorbentefuede2g(figuraI.19A).
Conrespectoaldisolventedeelucin,tantoconsiderando1como2gdeFlorisil,fueposible
recuperarel95%detodoslosanalitosconunanicafraccinde5mLdeacetonitrilo(figuraI.19B),
aunque finalmente se seleccionaron 10 mL para asegurar la recuperacin cuantitativa de los
compuestos.
En base a estos datos la cantidad de coadsorbente (Florisil) se mantuvo en 2 g, mientras
quelosvolmenesdediclorometanoyacetonitrilosefijaronen10mL.
1.4.2.Optimizacindelascondicionesdederivatizacinenacetonitrilo
Elacetonitriloresultundisolventeadecuadoparalaextraccindelosanalitosdemuestras
depolvo.Paraevitarlaetapadecambiodedisolvente,enelprocesodetratamientodemuestra,se
optimizladerivatizacindeloscompuestosenacetonitrilo.Lainfluenciadelatemperatura(2045
70C),elvolumendeagentederivatizante(20100L)yeltiempodederivatizacin(560minutos)
fueronestudiadosutilizandoundiseofactorialmixto3x22,condospuntoscentrales.Parallevara
cabolosexperimentos,seutilizunpooldeextractosenacetonitrilo,correspondientesamuestras
de polvo procesadas mediante MSPD. Los valores estandarizados para los efectos principales
correspondientesalasvariablesanterioressemuestranenlatablaI.11,ascomoaquellosfactores
quesonestadsticamentesignificativosal95%deconfianza.
TablaI.11.Dominioexperimentalyvaloresestandarizadosdelosefectosprincipalesparaeldiseode
derivatizacinenacetonitrilo.
Dominioexperimental Efectosprincipales
Factor
Bajo Medio Alto MeP EtP PrP BuP TCS
Temperatura(C) 20 45 70 0.52 0.83 0.05 0.77 0.24
Tiempo(min) 5 60 0.35 1.31 0.68 0.90 1.72
a
Volumen(L) 20 100 2.05 1.03 1.54 3.29a 7.91a
a
Factoresestadsticamentesignificativosaunniveldeconfianzade95%
Sloelvolumendederivatizanteresultserunavariableestadsticamentesignificativapara
tres de los compuestos estudiados (MeP, BuP y TCS). El signo positivo indica que son necesarios
volmeneselevadosdeMTBSTFAparatenerbuenosrendimientosenlaetapadederivatizacin.Las
238
otras dos variables afectaron en menor medida al proceso de derivatizacin y sus efectos no
alcanzaron el lmite de significacin estadstica. Sin embargo, el trmino cuadrtico asociado a la
temperaturafuerelativamenteimportante,principalmenteenelcasodelMeP.Elgrficodeefectos
principales para este analito, figura I.20, revel una importante curvatura en su respuesta con un
mximoa45C.

FiguraI.20.GrficodeefectosprincipalesparaelMeP.
(X1000) EfectosprincipalesparaelMeP
98
97
reasMeP
96
95
94
93
20.0 70.0 5.0 60.0 20.0 100.0
Temperatura(C) Tiempo(min) Volumen(L)
Enbaseaestosresultados,laderivatizacinsellevacaboa45Ccon100LdeMTBSTFA
durante5minutos.Enestascondiciones,seevalulaestabilidadtemporaldeloscompuestoster
butildimetilsililados en acetonitrilo, para lo cual se derivatiz un extracto de muestra de polvo,
obtenidomedianteMSPDyseinyectendistintosdas,utilizandoelPCB30comopatrninternode
inyeccin.Losresultadosobtenidos(sealesrelativasalpatrninterno),serepresentanenlafigura
I.21.
FiguraI.21.Estabilidadtemporaldelosanalitossililadosenelextractodeunamuestradepolvo.
Da1 Da2 Da3 Da6 Da7 Da9
1.2
SealrelativaPCB30
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
MeP EtP(reasX2) PrP(reasX2) BuP(reasX2) TCS
Comosemuestraenlafiguraanterior,loscompuestosderivatizadosenacetonitrilofueron
estables,almenosdurante9das,loquepermitesureinyeccinencasonecesario.

239
Atmsferasinteriores

El mtodo propuesto para la extraccin de parabenes y triclosn en muestras de polvo
englobunapreparacindelamuestrasencillabasadaenladispersindelamatrizenfaseslida,
con una etapa previa de lavado para eliminar especies poco polares y posterior extraccin de los
analitoscon10mLdeacetonitrilo(figuraI.22).Esteextractofueconcentradoa1mLyunafraccin
del mismo (0.5 mL) sililado en las condiciones descritas en el apartado anterior. La figura I.22
muestraunesquemadelmtodopropuesto.
FiguraI.22.EsquemadeextraccinderivatizacinenMSPD.
0.5gdemuestra
dispersada con1.25
gdeC18y0.5gde
Fritasde Na2SO4
polietileno
2gdeFlorisil
Lavado: 10mL DCM Extraccin: 10mL ACN
Residuos
Concentrara1mL yfiltrar
confiltrosde0.22m
Derivatizar 0.5mL con0.1mL

MTBSTFAa45C durante5min

Una vez optimizada la preparacin de las muestras empleando MSPD se procedi a la
caracterizacinanalticadelmtododesarrollado.
1.4.3.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad
yLOQs
ParaevaluarelrangoderespuestalinealdelsistemaGCMS/MSseprepararonpatronescon
concentraciones comprendidas entre 2 y 1500 ng/mL, inyectndolos por triplicado. La
representacindelasreasdepicofrenteaconcentracinproporcionrectasconcoeficientesde
determinacin (R2) comprendidos entre 0.996 y 0.999. La repetibilidad de inyeccin se evalu
240
mediante inyecciones consecutivas de un patrn de 5 ng/mL. Los coeficientes de variacin para

todos los compuestos fueron inferiores al 9 %. Por ltimo, los lmites de cuantificacin del equipo
fueron estimados con la inyeccinde patrones de concentraciones en un rango de 0.5 y 5 ng/mL,
obteniendo valores inferiores a 1 ng/mL para la mayora de los compuestos. En la tabla I.12 se
resumenestosresultados.
TablaI.12.Caractersticasdelsistemademedida(GCMS/MS)parapatronessililadosenacetonitrilo.
ColumnaHP5MS.
MeP EtP PrP BuP TCS
Linealidad 0.999 0.998 0.996 0.996 0.999
(R2)
Repetibillidad(% 7.5 3.9 8.5 2.1 6.3
RSD,n=6)
LOQ 0.5 1.3 0.3 0.3 0.7
a
(ng/mL)
a
HP5MS
Enconjunto,estosdatossonequivalentesalospresentadosenlatablaI.7paralosmismos
compuestos, empleando tambin GCMS/MS como tcnica de determinacin, a pesar de que se
utilizaron dos columnas y dos sistemas de GCMS/MS fsicamente diferentes, el disolvente y las
condicionesdederivatizacinfuerondistintos.
1.4.3.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodo
Laprecisindelmtodoanalticoseevaluconsiderandolasdesviacionesestndarrelativas
correspondientesalaextraccindeunamuestradepolvoenunmismoda(repetibilidad)yendas
consecutivos (reproducibilidad). Los resultados obtenidos mostraron coeficientes de variacin, en
condicionesderepetibilidadyreproducibilidad,inferioresal13%.

Los lmites de cuantificacin del mtodo fueron estimados considerando el factor de
concentracinobtenido(0.5gdemuestra,1mLdeextractofinal)ylosLOQsdelsistemaGCMS/MS.
Los valores obtenidos oscilaron entre 0.6 y 2.6 ng/g (tabla I.13). De nuevo no se observaron
problemasdecontaminacinenlosblancosdelproceso.

Paraelestudiodeexactitudsellevaronacabodosseriesdeexperimentos.Enlaprimera,se
utilizaron muestras discretas de polvo, con bajos contenidos de los analitos, fortificadas con una
concentracin conocida de los compuestos estudiados. Las recuperaciones fueron calculadas
241
Atmsferasinteriores
dividiendoladiferenciadeconcentracionesparamuestrasconysinadicin,entreelvaloraadido.
Losresultadosobtenidos,expresadoscomoporcentaje,oscilanentre84%paraelBuPy114%para
elMeP.Loscoeficientesdevariacinasociadosfueroninferioresal10%,tablaI.13.

TablaI.13.Repetibilidad,reproducibilidad,LOQsyrecuperacionesparalametodologadesarrollada.
RecuperacinSD
Repetibilidad(% Reproducibilidad(%
Analito LOQ(ng/g) 50ng/gPBs 300ng/gPBs
RSD,n=4)a RSD,n=12)a
300ng/gTCS 700ng/gTCS
MeP 4.7 8.6 1.3 1149 1023
EtP 4.5 4.4 2.6 8710 905
PrP 3.4 2.8 0.6 937 985
BuP 5.3 4.4 0.7 844 844
TCS 6.0 13.0 1.5 1086 1025
a
ParaestosestudioslamuestradepolvofuefortificadaconEtPyBuPanivelde300ng/g
En la segunda serie de experimentos, se compararon los resultados obtenidos para la

extraccindefraccionesdeunamismamuestradepolvo,sinadicindeloscompuestos,conMSPD
frente a Soxhlet, como mtodo de referencia, y la metodologa de PLE desarrollada en la primera
partedeestecaptulo.LaextraccinSoxhletserealizcon75mLdeacetonitrilodurante12horas.
Los resultados obtenidos para PLE y Soxhlet, expresados como recuperaciones frente a la
concentracin obtenida usando MSPD, se presentan en la tabla I.14. MSPD proporcion valores
anlogos a PLE y Soxhlet, siendo la primera tcnica ms sencilla y menos costosa, adems de
requerirunmenorconsumodedisolventes.
TablaI.14.Recuperacionesrelativas(%)proporcionadasporSoxhletyPLEfrentealmtododeMSPD
desarrollado.
MeP EtP PrP BuP TCS
Soxhlet 994 1116 8911 1004 11316
PLE 1243 1161 1034 1042 9512

242
DeterminacindeTCSyParabenesenmuestrasdepolvo
1.5.Anlisisdemuestrasreales

Empleando las dos metodologas desarrolladas en este captulo se analizaron varias
muestrasdepolvoprocedentesdeedificiospblicos(2,3y11)yviviendasparticulares(restantes).
LosresultadosobtenidossemuestranenlatablaI.15,juntoconelcontenidodecarbonoorgnico
(TOC)dealgunasdeellas.

Tabla I.15. Niveles de parabenes y triclosn en muestras de polvo (fraccin inferior a 60 m)
procedentesdeviviendasparticularesyedificiospblicos(N=3).
ConcentracinSD(ng/g)
Cdigo TOC(%) Extraccin
MeP EtP PrP BuP TCS
1 18 PLE 40941 432 21614 342 25150
2 14 PLE 11210 173 365 161 258
3 19 PLE 24212 5536 2108 434 1228223
4 27 PLE 49330 1083 1765 1341 2444426
5 33 PLE 13355 34616 83675 21328 66025
6 30 PLE 164022 30413 8349 2456 110031
7 20 PLE 13817 122 121 nd 56918
8 23 PLE 87812 52519 72428 17816 1724241
9 34 PLE 1092127 1629 76275 7410 1253107
10 22 PLE 32826 463 23520 1063 903
11 18 MSPD 19041 225 22031 294 29913
12 MSPD 44289 6713 39675 518 28445
13 20 MSPD 6821 51 41 11 6011
14 23 MSPD 78378 37012 52926 18811 2179175
15 24 MSPD 60858 846 46622 991 85336
16 25 MSPD 4708 232 42915 351 46523
17 MSPD 57717 1236 54038 21111 95774
18 MSPD 8910 28732 16220 286 2399
19 MSPD 19428 484 24827 153 58468
20 MSPD 97322 568 105234 1013 4449
Mximo 1640 553 1052 245 2444
Mnimo 68 5 4 1 25
Media 553 160 404 95 812
nd:pordebajoLOQ
243
Atmsferasinteriores
Entodaslasmuestrasanalizadas,aparecenlosparabenesyeltriclosnconexcepcindela
muestra nmero 7, en la cual no se ha podido cuantificar el BuP. Los niveles promedio de los
compuestosenlasmuestrasdepolvodecrecenenelordenTCS>MeP>PrP>EtP>BuP,demodoquesu
concentracin, al menos en el caso de los parabenes, guarda cierta relacin con los porcentajes
relativos de estos compuestos en los productos de cuidado personal. Las muestras 2, 3 y 11
corresponden a edificios pblicos. Las concentraciones de los compuestos estudiados en estas
muestrassoninferioresquelosexistentesenviviendasparticulares.LapresenciadeTCSyparabenes
en polvo puede estar asociada a derrames de productos cosmticos que los contienen en su
formulacin,clulasepitelialesy,enelcasodeltriclosn,difusindesdetextilesyotrassuperficies
tratadasconestebactericida.Enalgunasmuestras,elTCSqueseencuentraanivelesprximosalos
medidosenloslodos(tablaI.12,captuloIV)ypodrajustificarlapresenciadeestecompuestoen
fluidosbiolgicosdehumanosquehandeclaradonousarPPCPsconteniendoTCS[AllmyrM;2006].
244
CAPTULOVI
MSPDaplicadaalaextraccindeTCSyMTCSenpescadoyalimentos
I. DETERMINACIN DE TRICLOSN Y METILTRICLOSN EN MUESTRAS DE MATERIAL

BIOLGICO
1.1.Introduccin
1.1.1.Antecedentesbibliogrficos
Elusocontinuodetriclosn(TCS)enproductosdecuidadopersonalyotrosmaterialesde
usocotidianoprovocasudescargaenelmedioacutico.Lasaguasresidualesascomoloslodosde
depuradora, tal como hemos visto en los captulos III y IV, son los principales vectores de
introduccindeestecompuestoenelmedioambiente.Eltriclosn,unavezhaalcanzadoelmedio
acutico,puedesertransformadoporlosorganismosdandolugaralproductodebiometilacindel
mismo,elmetiltriclosn(MTCS)[BalmerME;2004],elcualadiferenciadelTCSnoessusceptiblede
eliminarseatravsdeprocesosdefotodegradacin[AranamiK;2007][MezcuaM;2004][Lindstrom
A;2002].
TantoTCScomoMTCSpresentanunaelevadalipofilidad(logKow4.8y5.4respectivamente)
loquehaceposiblesuacumulacinenmatricesdenaturalezaorgnica.Dehecho,laconcentracin
deamboscompuestosenlosslidos(lodosysedimentos)esmuysuperiorqueenelagua[BesterK;
2003]. En algas, se han detectado factores de bioacumulacin de hasta 1000 veces [Coogan MA;
2007].Tambinsehanencontradoamboscompuestosenmsculo[BalmerME;2004y2005],bilis
[AdolfssonErici M; 2002][Houtman CJ; 2004] y plasma de pescado [Valters K; 2005][Alaee M;
2003],demodoqueelriesgodeentradadeambasespeciesenlacadenatrficaesconsiderable.La
rapidez con la que se produce la bioacumulacin de TCS y MTCS se ha puesto de manifiesto en
experimentosconcaracolesdeaguadulce,expuestosdurantedossemanasaaguadeunlagocon
concentracionesmediasdeTCSyMTCSde100ng/Ly41ng/L,respectivamente.Laconcentracinde
TCSenestosorganismosaumentdiezveces,mientrasqueelfactordebioacumulacinfuede50
vecesparaelMTCS[CooganMA;2008].
Porotrolado,laincorporacindelTCScomoagentebactericidaenpolmerosyproductos
de cuidado personal (por ejemplo, pasta de dientes, jabones,) se ha convertido en una de los
principalesvasdeexposicinhumanaaestecompuesto.LaformulacinconocidacomoMicroban
es aadida a diferentes superficies tales como tableros de corte, films protectores, utensilios y
encimeras de cocina e incluso suelos en industrias dedicadas al procesado de alimentos
[http://www.silestone.com][http://www.microban.com], para proporcionarle propiedades
antibacterianas.Dadoquelosalimentosestnencontactoconestassuperficies,esfactiblequese
produzca la migracin del aditivo (TCS) a los alimentos, principalmente a aquellos con altos
contenidosenmateriagrasa[MoretroT;2006][SnchesSilvaA;2005][ChungD;2003].
247
Materialbiolgico
EnestecaptulodelaTesisDoctoralsedescribelaoptimizacinunprocedimientoparala
extraccindeTCSyMTCSenpescadoyenalimentosgrasos,aplicableasudeterminacinenpeces,
yvlidatambinparaestudiarlaposiblemigracindelTCSdesdelassuperficiestratadasconeste
bactericidaalosalimentosencontactoconlasmismas.
Con respecto a las metodologas descritas en la bibliografa para el anlisis de TCS en
muestrasbiolgicas,todasellaspresentanunaelevadacomplejidaddebidoaladificultadinherente
de la matriz. La presencia de macromolculas y grasas en las muestras hace necesario aplicar
tcnicas de purificacin, que no siempre estn al alcance de todos los laboratorios o que
simplementesonpocosostenibles.Denuevo,lacromatografadepermeacinengel(GPC)hasido
utilizada por diferentes autores para purificar extractos con contenidos en grasas relativamente
elevados [Valters K; 2005][Balmer ME; 2004]. Otras tcnicas menos complejas, se basan en la
mineralizacin (oxidacin) de las grasas con cido sulfrico adicionado directamente al extracto
[AdolfssonEriciM;2002],oimpregnadosobrepartculasdeslica[ValtersK;2005].Enningunade
estasaplicaciones,laetapadecleanupsehanintegradoenelprocesodeextraccindandolugara
mtodoscomplejos,largosyportanto,propensosaerrores,tablaI.1.
Tabla I.1. Metodologas de preparacin de muestra para la determinacin de triclosn y

metiltriclosnenmatricesbiolgicasyalimentos.
Analitosy LOD RSD Rec.
Procedimiento Deteccin Ref.
matriz (ng/g) (%) (%)
MTCSyfiltros LLEde1025gdegrasacon100mLdeaguaultrapura,2
solaresen mLdeoxalatopotsicoal35%,100mLetanol,50mL
dietiltery70mLdepentano.RecogerFOyrealizarGPC GCMS 2 (1)
grasade
(BiobeadsSX8),eluirconciclohexano:AcOEt1:1,a5
pescado mL/min.Evaporara1mL,limpiezacon5gdeslica.
MTCSyfiltros Mezclar20gdemsculodepescadoconNa2SO4.Extraer
solaresen conDCM:Hexano(1:1).PurificarusandoGPC(BiobeadsS GCMS 3 (2)
msculode X3),eluirconDCM:ciclohexano(35:65),a3mL/min.
pescado Evaporara1mL,limpiezacon5gdeslica.
Desnaturalizar4gdeplasmacon1mLHCl6My3mL
isopropanol.LLE3x3mLdeMTBE:Hexano(1:1).Recoger
PBDEsy
FOyaadirNaOH50%enMeOH.SeparacindeFA(TCSy
derivados, OHBDEs)yFO(BDEs,MeOBDEyMTCS).AcidificarFAy
TCSyMTCS reextraeramedioorgnico.SecarconNa2SO4y GCMS >85 (3)
enplasmade derivatizarcondiazometanoypurificarcon8gdeFlorisil.
pescado LaFOsepurificacon5gdeslicaconteniendo22%de
H2SO4,eluyendo50mLdeDCM:Hexano(1:1).Concentrar
ambasfraccionesa0.1mL.
248
LOD RSD Rec.

(ng/g) (%) (%)
Mezclar25gdemuestracon100gdeNa2SO4y150
13
mLdeDCM:hexano(1:1).Aadir C12PCB77como
MTCSenmsculo surrogado.Trasvasaracolumnadevidrio,eluircon 76
200mLdemezcla.Concentrarparadeterminar GCMS 3 (4)
depescado 108
residuolipdicoyrealizarGPC(Phenomenex
EnviroSepABCGuard).Eluirlosanalitoscon
DCM:Hexano(35:65)a3mL/min.
PLEde5gdemuestramezcladocon10gde
hidromatrix.Ciclohexano:DCM(1:1)aTAmb.y1500
MTCSenmsculo 13
psien3ciclosde9min.Adicinde C12PCB77yGPC 76
GCMS 3 (4)
depescado (PhenomenexEnviroSepABCGuard)utilizando 108
DCM:Hexano(35:65)a3mL/min.Purificarlos
extractoscon0.8gdeslica(5%deagua).
Desnaturalizar4gdeplasmacon1mLHCl6Ny3mL
isopropanol.LLEcon3X3mLdeMTBE:Hexano(1:1).
TCSyMTCSen RecogerFOypurificarconFlorisil.LaFAsebasifica GCMS
conKOH1MenMeOH50%yseextraecon (5)
plasmadepescado GCECD
MTBE:Hexano(1:1)traslaacidificacin.RecogerFO,
secarconNa2SO4yderivatizarcondiazometano.
PurificarconslicaH2SO422%.
TCSyotros
contaminantes Tratar1gdebilisconglucoronidasaysulfatasa.
RealizarlaLLEcon2X2mLdeDCM.Purificarpor GCMS (6)
estrognicosen
GPC.
bilisdepescado
Hidrolizar0.2gdebiliscon20Ldeglucuronidasa
TCSenbilisde en1mLdetampnaceticoapH5.Incubar2horasy
aadir2mLdeaguayrealizarLLEcon2X3mLde GCMS (7)
pescado
Hexano:MTBE(2:1).EvaporarlasFOasequedady
reconstituirconAcOEt.
LLEde10mLdelechecon10mLdecidofrmicoy2
X2mLdehexano.ConcentrarasequedadlaFO.
Reconstituircon2mLdehexanoyrealizarLLEcon2
TCSenleche mLdeKOH0.5Men50%EtOHy2X3mLdehexano. GCMS (7)
materna Aadir1mLdeHCl1MyLLEcon2X3mLde
Hexano:MTBE(9:1).EvaporarlaFOasequedad,
redisolveren2mLhexanoyaadirH2SO4.Evaporarla
FOyderivatizarconanhdridoactico.
Mezclar2gdealgascon35gdeNa2SO4,aadir
TCS,MTCSyTCC patronesinternosmarcadosisotpicamente,y LCMSy 80
realizarextraccinSoxhletdurante6horascon100 510 11.2 (8)
enalgas GCMS 107
mLdeDCM.Evaporara5mLyeliminarlpidos
medianteGPC,concentrandoa0.11mL.
249
Materialbiolgico
Analitosy LOD RSD Rec.

Procedimiento Deteccin Ref.
matriz (ng/g) (%) (%)
13
Hidrolizar35gdemuestra,conteniendo C12TCScomo
surrogado,conH2SO49Ma60Cdurante30min.Enfriar
yLLEcon6y4mLdehexano:acetona(9:1).Aadir2mL
TCSen KOH0.5MenEtOH50%.AcidificarFAcon1mLHCl2M, GCECD
0.009
plasmay yextraercon4y2mLdehexano:acetona(9:1).Tratarla GC 95 (9)(10)
0.018
lechehumana FOcon4mLdeH2SO413.7Myreextraercon2mLde NCI/MS
hexano:acetona(9:1).Combinarlasfasesorgnicas,
concentraryconvertirenderivados
pentafluorbencilados.
Zumodenaranja:LLEde10gcon3x10mLdehexano,
agitar10minutos.CombinarFOyconcentrara
sequedad.Redisolveren10mLdeACN90%.
TCSen Pollo:Mezclar10g+10mLhexano+2mLACN,agitar
10minutos.LLEcon2X10mLhexano.Combinary LCUV 83
alimentos 25 (11)
concentrarasequedad.ReconstituirconACN90%. LCMS 112
varios Queso:LLEde10gcon3X10mLdehexanodurante10
minutos.ConcentrarFOasequedadyaadiralresiduo
graso2x10mLdeACN.EvaporarelACNyreconstituir
con10mLdeACN90%.
Hidrolizarconenzimas0.1mLdeorinaenunmedio
TCS, tamponadoenacetatoamnico,incubandotodala
clorofenolesy nochea37C.Diluircon0.8mLdecidofrmicoy LCMS/MS 6 (12)
otrosenorina centrifugar.RealizarlaSPEconcartuchosdeC18,
eluyendoconMeOH:H2O(1:1).
(1)BuserHR,2006;(2)BalmerME,2005;(3)ValtersK,2005;(4)BalmerME,2004;(5)AlaeeM,2003;(6)HoutmanCJ,2004;
(7)AdolfssonEriciM,2002;(8)CooganMA,2007;(9)AllmyrM,2006A;(10)AllmyrM,2006B;(11)SanchesSilvaA,2005;
(12)YeX,2005.
Ennuestrotrabajoseeligiladispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)comotcnicade
extraccin,incorporandoenlaparteinferiordeloscartuchosdiferentesadsorbentesconobjetode
purificarlosextractosprimarios.Deestemodo,seintegrlaextraccinylaetapadecleanupenel
mismopaso,siguiendounaestrategiasimilaralaaplicadaamuestrasdepolvo.Losobjetivosbsicos
delmtododesarrolladofueron:maximizarlosnivelesdeTCSyMTCSenlosextractosyminimizarel
residuolipdicodelosmismos.
1.1.2.Determinacindecontenidograsodelasmuestras.MtodoBligh&Dyer
La determinacin del contenido graso de las muestras consideradas en este estudio:

msculo de salmn (Salmo salar) y de trucha (Oncorhynchuss mykys), fiambres y quesos, se ha
realizado con el denominado mtodo de Bligh & Dyer [Jensen S; 2003][Smedes F; 1996]. En un
embudodedecantacin,seintrodujeron2.5gdemuestrajuntocon10mLdemetanoly5mLde
cloroformo. Despus de agitar el embudo durante varios minutos, se aadieron otros 5 mL de
250
cloroformo y se volvi a agitar otros 2 minutos. Pasado este tiempo, se aadieron 10 mL de agua
ultrapura agitando de nuevo la mezcla. Tras la separacin de ambas fases, se recogi la fase
orgnicasituadaenlaparteinferiordelembudo.Lafaseacuosasevolviaextraerconunamezcla
demetanol:cloroformo(1:9),recogiendonuevamentelafaseorgnicaymezclndolaconlaanterior.
El extracto orgnico combinado se concentr a un volumen de, aproximadamente, 0.5 mL y se
trasvas a un vial previamente pesado, concentrndolo a sequedad hasta peso constante. La
variacinenlamasadelvial correspondealcontenidoengrasadelamuestra.Losporcentajesde
grasacorrespondientesatruchaysalmnfrescosyliofilizadossemuestranenlatablaI.2.
TablaI.2.Contenidograsodelasmuestrasdepescadoutilizadasparaoptimizarlametodologade
extraccindetriclosnymetiltriclosn.
Salmnfresco Truchafresca Salmnliofilizado Truchaliofilizada
17.9% 6.2% 58.8% 31.0%
1.1.3.Condicionesinstrumentalesdemedida
La determinacin de TCS y MTCS en matrices biolgicas exige una alta sensibilidad y

selectividadenlaetapademedida.Denuevo,seseleccionlacromatografadegasesacopladaala
espectrometrademasasentndemcomotcnicadedeteccinycuantificacindeloscompuestos.
LascondicionesinstrumentalesdemedidaseresumenenlatablaI.3.
Tabla I.3. Condiciones de GCMS/MS para la determinacin de triclosn y metiltriclosn en los

extractosdemuestrasbiolgicasyalimentarias.
Nivelde
Inprecursor Ionesproducto Amplitudde
Compuesto Tr(min)1 almacenamiento
(m/z) (m/z) excitacin(V)
(m/z)
MTCS 21.18 304 232,252,254 1.50 130
TCS 23.29 347 200,310 1.50 140
1
HP5MS
LosespectrosdeMS/MS,correspondientesaTCSyMTCS,semuestranenlafiguraI.1.La
fragmentacindeltriclosn,talcomosehadescritoenelcaptuloIV,consisteenlaprdidadeun
tomo de Cly la ruptura del enlace ter. Para el metiltriclosn se observa la prdidade CH3Cly 2
tomos de Cl, dando lugar a los fragmentos 252+254 y 232+234 con la relacin isotpica
correspondienteaespeciesconteniendo1y2tomosdecloro.
251
Materialbiolgico
FiguraI.1.EspectrosdeMS/MSparaelMTCSyelTCS.
100% 232 252 100%

200
[M2Cl]+ [MCH3 Cl]+ Cl OSi(CH3)2C4H9
[MC4H9Cl2C6H3]+
Cl OCH3 O
75% 75%
O
Cl Cl
Cl Cl
50%
50%
310
267 [MC4H9Cl]+
25%
25%
M+ 185 219
304 347 [MC4H9]+
0%
0%
200 225 250 275 300 m/z 200 250 300 350 m/z
252
MSPDconretencindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS
1.2.MSPDconretencindelpidos
Las muestras de pescado liofilizado tienen un alto contenido de grasa, especialmente el

salmn, que puede interferir en la determinacin de los analitos, usando columnas capilares para
cromatografadegases.Enlosestudiospreliminares,seevaluelporcentajedegrasa(comopeso
del residuo despus de evaporar a sequedad) existente en los extractos de muestras de salmn
liofilizado. La tcnica de preparacin de muestra usada fue la MSPD considerando acetonitrilo y
acetato de etilo como disolventes de elucin. Los materiales evaluados como dispersante y co
adsorbentesfueronC18(70230mesh),Florisil(60100mesh),almina(150mesh)yslica(230400
mesh),secadoslostresltimosa130Cdurante24horas.Mediogramodemuestrafuemezclado
con1gdesulfatosdicoanhidroparaeliminarposiblesrestosdeaguaquepudiesenquedarenla
matriz. Acontinuacin, sedispers con2g del adsorbente seleccionado, en un mortero de vidrio,
hasta obtener un polvo fino y uniforme. En el cuerpo de polipropileno de la jeringa de MSPD, se
depositaron2gdelcoadsorbentey,acontinuacin,lamuestradispersada.Seeluyeron15mLde
acetonitrilo o acetato de etilo. La tabla I.4 muestra los resultados obtenidos expresados como
cocienteentreelpesodelresiduoseco(obtenidoalevaporarlosextractosasequedad)ylamasade
muestra(0.5g),multiplicadopor100.

TablaI.4.Porcentajedelpidosenlosextractosdesalmn(0.5gdemuestraliofilizada)considerando
distintascombinacionesdeadsorbentesydisolventesdeelucinenelprocesodeMSPD.
Eluyente
Dispersante(2g) Coadsorbente(2g)
Acetonitrilo Acetatodeetilo
C18 C18 0.96%
C18 Florisil 2.80% 37.60%
C18 Almina 2.90% 34.29%
C18 Slica 3.05% 32.30%
Florisil C18 0.29% 35.10%
Almina C18 0.42% 32.90%
Slica C18 0.97% 44.11%
Comoseobservaenlatablaanterior,lautilizacindeacetatodeetilocondujoaextractos
con contenidos en grasa mucho ms elevados que el acetonitrilo. Para este disolvente, la
combinacindeunadsorbenteenfasenormalcomoagentedispersanteyC18comocoadsorbente
proporcion mejores resultados frente a la situacin inversa. Este comportamiento ya haba sido
descritoporPensadoycolaboradores[PensadoL;2005]enladeterminacindePAHsenmsculode
salmnyrodaballo.Detodosmodos,enlamejordelassituaciones(FlorisilcomodispersanteyC18
comocoadsorbente),lacantidaddegrasaenextracto(equivalentea1.5mg)siguesiendounvalor
253
Materialbiolgico
elevadoquepuedemermarengranmedidalavidatildelacolumna,ascomocrearproblemasen
elanlisiscromatogrfico.Enexperimentosposterioresconsalmnliofilizado,seaumentlamasa
de C18 usado como coadsorbente para intentar reducir los niveles de lpidos en los extractos.
Tambinseutilizaroncoadsorbentesdelimpiezamixtos,esdecir,combinacionesdeC18conFlorisil.
Losresultadosobtenidos,semuestranenlasiguientetabla(tablaI.5).
Tabla I.5. Residuo graso en los extractos de salmn liofilizado usando Florisil como agente
dispersanteyC18C18Florisilcomocoadsorbenteendistintascantidades.
Dispersante Coadsorbente %residuo
Florisil(2g) C18(3g) 0.37
Florisil(2g) C18(1g)+Florisil(2g) 0.37
Florisil(2g) C18(2g)+Florisil(2g) 0.32
Dado que el porcentaje de grasa en el extracto se mantuvo prcticamente invariable, se

continu trabajando con 2 g de Florisil como dispersante y la misma masa de C18 como co
adsorbente. En estas condiciones, se evalu el volumen de acetonitrilo necesario para eluir los
analitos de los cartuchos de MSPD. Para ello, se utilizaron dos tipos de muestra con distinto
contenidograso:salmnytrucha.Enamboscasos,0.5gdemuestrafuerondispersadoscon1gde
sulfatosdicoanhidroy2gdeFlorisilenunmorteropara,acontinuacin,transferirlosacartuchos
deMSPDconteniendocomocoadsorbente2gdeC18.Decadacartuchoserecogieronfracciones
consecutivasde5mL,concentrndolasa2mLyderivatizandounaalcuotade0.5mLcon100Lde
MTBSTFA en las condiciones descritas para las muestras de polvo. Los resultados obtenidos se
muestranenlafiguraI.2.
FiguraI.2.Extraccinconacetonitrilo(fraccionesde5mL)deTCSyMTCSenmuestrasdetruchay
salmnliofilizado.
MTCS TCS
120%
100%
Sealrelativa
80%
60%
40%
20%
0%
Fr1 Fr2 Fr3 Fr4 Fr1 Fr2 Fr3 Fr4
Salmn Trucha

254
MSPDconretencindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS
Como se puede apreciar en la figura anterior, el metiltriclosn se recuper con 5 mL de

disolvente, mientras que la distribucin del triclosn en las fracciones sucesivas de acetonitrilo
dependi de la matriz considerada, seleccionando finalmente 15 mL de este disolvente. En estas
condiciones, se evalu la recuperacin obtenida para una muestra de salmn con adicin de los
analitosanivelde300ng/g.Elextracto,unavezconcentradoa5mL,fuederivatizadocon100Lde
MTBSTFApreviamenteasuinyeccinenGCMS.Lasrecuperacionesobtenidas,paran=3,fueronde
97.011%y99.113%paraMTCSyTCS,respectivamente.
La figura I.3 muestra el cromatograma de GCMS (TIC) correspondiente a uno de los
extractos.Lospicosmsintensosqueaparecenenelmismofueronidentificadosporcomparacin
con la librera NIST, como derivados tertbutildimetilsililados de cidos grasos saturados e
insaturados.
FiguraI.3.CromatogramadeGCMS(TIC)paraunamuestradesalmnconadicindeTCSyMTCSa
nivel de 300 ng/g. Los picos nombrados como C8 a C18 corresponden a los derivados sililados de
cidosgrasosconelnmerodecarbonosindicado.
3.0
(x103Cts) 6
2.5 TCS
5
2.0 MTCS C16 C18
800 TIC 4
m/z345+347
m/z302+304
1.5 C14 3
700 1.0
C16 2
0.5 1
600
0.0 0
21.1 21.3 21.5 23.0 23.2 23.4 23.6
500 minutos
minutos
C15
400 C12
300 C11 C13 C17
C8 C9 C10
200
100
0
15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 minutos
Debidoalapresenciadenivelessignificativosdecidosgrasosenlosextractos,seplante
la posibilidad de llevar a cabo una etapa de purificacin offline de los mismos con cartuchos
comerciales(500mg)dediferentesadsorbentesenfasenormal(Florisil,slica,almina),ascomode
aminasprimariassecundarias(PSA),materialrecomendadoparalaeliminacindecidosgrasosen
extractosdeaceitesyaceitunas[GarcaReyesJF;2007].Parallevaracaboesteestudioseprepar
255
Materialbiolgico
un pool de extractos de muestras de salmn. Alcuotas de 0.5 mL se depositaron en cartuchos

comerciales, conteniendo 0.5 g de los adsorbentes anteriores, eluyendo 5 mL de acetonitrilo, que
posteriormente fueron concentrados a sequedad para determinar el residuo graso. Los resultados
obtenidosmostraronquelalimpiezaoffline,noproporcionunamejorasustancialenelcontenido
enlpidosdelosextractosfinalesyaque,enelcasodemuestrasdesalmnliofilizado,estostodava
contienendelordende0.8mgdelpidos,tablaI.6.
TablaI.6.Porcentajedelpidoseliminadosenlaetapaadicionaldelimpiezaoffline.
Slica Florisil Almina PSA
%eliminacin 54.9 60.7 41.2 38.9
256
MSPDconeliminacindelpidosaplicadaalaextraccindeTCSyMTCS
1.3.MSPDconeliminacindelpidos
Una alternativa a las estrategias de purificacin descritas anteriormente es el uso de

materialesenfasenormalimpregnadosconuncido.Enconcreto,lautilizacindeslicaimpregnada
conun44%decidosulfrico,hapermitidoobtenerextractoscompletamentelibresdelpidosenla
determinacin de PCBs y PBDEs en muestras biolgicas [Carro AM; 2005][Martnez A; 2005]. Los
mayoresproblemasderivadosdelempleodeestetipodecoadsorbentessonladestruccindelos
analitosolaretencindelosmismosenlacapadecarbnquesegeneraaloxidarloscidosgrasos
[PensadoL;2005][WellsDE;1994].Enelcasodeltriclosnyelmetiltriclosnslosehaencontrado
una referencia en la cual se utiliza la slica impregnada con cido sulfrico, al 22 % (p/p), para
purificarlosextractosobtenidosmediantelaextraccinlquidolquidodeplasmadepescado[Alaee
M;2003].

Enuna primera aproximacin a la optimizacinde estasegunda estrategia, se realiz una
MSPD de una muestra de salmn liofilizado en las siguientes condiciones: 0.5 g de muestra se
homogeneizaron con 2 g de sulfato sdico anhidro y 1.5 g de slica (activada a 130C durante 24
horas) en un mortero de vidrio. En el cartucho de MSPD se depositaron previamente 3 g de slica
impregnadaconun10%(p/p)deH2SO4.stasepreparmezclandoslicaactivada(130Cdurante
24horas)conelcorrespondientevolumendecidosulfricoconcentrado.Unavezhomogeneizada,
seintrodujodenuevoenunaestufaa110Cdurante12horas,almacenndolaposteriormenteenun
desecador.
El cartucho de MSPD fue eluido con 15 mL de diclorometano, concentrndolo
posteriormenteasequedad.Elresiduofueaproximadamente56vecesinferioralobtenidoconla
metodologadescritaenelapartadoanterior(0.050.06%delamasadelamuestra).Porotraparte,
se confirm que el triclosn y el metiltriclosn son capaces de resistir el proceso oxidativo,
obteniendo seales del mismo orden de magnitud que las correspondientes al patrn de adicin
utilizadoparafortificarlamuestra.ElcromatogramadeGCMS,paraunamuestradesalmn(figura
I.4),mostrunacomplejidadinferioralpresentadoenlafiguraI.3,endondeloscidosgrasoseran
coextradosjuntoconnuestrosanalitos.Enbaseaestosresultados,seprocedialaoptimizacinde
las condiciones de extraccin usando MSPD con oxidacin qumica del residuo graso sobre slica
cida.

257
Materialbiolgico
Figura I.4. Cromatograma de GCMS (TIC) para un extracto en diclorometano utilizando como co
adsorbenteslicacida(10%deH2SO4p/p).Salmnliofilizadoconteniendo300ng/gdeTCSyMTCS.
kCts
100
75
TCS
50
MTCS
25
0
15.0 17.5 20.0 22.5 25.0
minutos

1.3.1.Porcentajedecidosulfricoenelcoadsorbente
El primer parmetro optimizado fue la concentracin de cido sulfrico (5, 10, 20 % p/p)
necesariaparaoxidarporcompletoloslpidospresentesenlamatriz,sinafectaralaestabilidadde
los compuestos estudiados. Para la realizacin de este estudio, muestras de 0.5 g de salmn
liofilizado,conadicinde300ng/gdeMTCSyTCS,fuerondispersadasenunmorterodevidriocon2
gdesulfatosdicoanhidroy1.5gdeslicaactivada.EnlaparteinferiordelcartuchodeMSPDse
depositaron 3 g de slica cida con porcentajes variables de cido sulfrico. Dado que el
diclorometano fue capaz de extraer el TCS y el MTCS, se utiliz como disolvente de elucin,
recogiendovolmenesde15mLyconcentrndolosposteriormentea1mL.Unaalcuotade0.5mL
seempleparaladeterminacinderesiduoslido,mientrasquelaotraporcinfueevaporadaa
sequedad y reconstituida con 0.5 mL de acetato de etilo, para ser derivatizada e inyectada en el
cromatgrafo de gases. La respuesta obtenida para ambos compuestos se mantuvo constante
independientemente de la cantidad de cido sulfrico aadida a la slica, figura I.5. Estos datos
sugierenqueloscompuestos,ademsdeserestablesencondicionesaltamenteoxidantes,noson
retenidosenlacapadecarbnqueseformadebidoalaoxidacindeloslpidos,comosedescribi
para los PAHs [Pensado L; 2005]. Con respecto al residuo lipdico presente en el extracto final, se
apreci una ligera disminucin cuando se aument la concentracin de cido de 5 % a 10 %, sin
embargo, entre 10 % y 20 % los resultados fueron idnticos, por lo que se decidi emplear slica
impregnadaconun10%decidosulfricoenexperimentosposteriores.
258
FiguraI.5.InfluenciadelaconcentracindecidosulfricoenlasrespuestasobtenidasparaMTCSy
TCS.Datosparasalmnliofilizado(N=3rplicas).
MTCS TCS Residuolipdico
60000 0.15%
Residuolipdico
readepico
40000 0.10%
20000 0.05%
0 0.00%
5% 10% 20%
ConcentracindeH2SO4(%p/p)
1.3.2.Tipoyvolumendeextractante

Seevalulaeficaciadeextraccinusandodisolventesconpolaridadescrecientes:hexano,
cloroformoydiclorometano.Disolventesdemayorpolaridad,comoelacetatodeetilo,elmetanolo
acetonitrilo, no fueron considerados puesto que proporcionan extractos cidos al romper las
interaccionesexistentes entre la slicay el cido sulfrico. Elperfil deelucin de TCS yMTCS para
cada uno de los disolventes anteriores, fue estudiado con tres matrices que presentan distintos
contenidosdemateriagrasa(m.g.):salmnliofilizado(59%dem.g.),truchaliofilizada(31%m.g.)y
queso(40%m.g.),todasellosconadicindeMTCSyTCSanivelde300ng/g.
Para cada muestra y disolvente, se eluyeron fracciones consecutivas de 5 mL, las cuales
fueron evaporadas a sequedad y reconstituidas posteriormente con 1 mL de acetato de etilo.
Despusdesuderivatizacin,seinyectaronenGCMS/MS,obteniendolosresultadosmostradosen
lafiguraI.6.
ElhexanonofuecapazdeextraernielTCSnielMTCSdelcartuchodeMSPD,adiferencia
deldiclorometanoydelcloroformo.Paralastresmatricesconsideradas,elMTCSfuerecuperadocon
una nica fraccin de 5 mL de diclorometano o cloroformo. El comportamiento del TCS fue ms
complejo,puestoquesuperfildeelucindependiclaramentedeltipodedisolventeydelamatriz.
Elcloroformopresentmenorpoderextractantequeeldiclorometano,sobretodoparalamuestra
de trucha. Este comportamiento se explica en base a la diferencia de polaridades entre ambos
compuestos(MTCSyTCS)yelcoeficientedeparticinoctanolaguadelosdisolventesutilizados.El
analitomslipoflico(MTCS)serecupercon5mLdeambosdisolventes.ElTCS,ligeramentems
polar,presentunamayorafinidadporeldiclorometano(logKow1.19)queporelcloroformo(log
Kow1.76).
259
Materialbiolgico
Figura I.6. Distribucin de TCS y MTCS en fracciones consecutivas de diclorometano, cloroformo y

hexano(5mLcadauna)paramuestrasdesalmn,truchayqueso(N=3).
Salmn Trucha Queso
120
100
Sealrelativa(%)
80
60
40
20
0
F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3 F.1 F.2 F.3
MTCS TCS MTCS TCS MTCS TCS
Hexano Diclorometano Cloroformo

Finalmente,seseleccionaron10mLdediclorometanoparalaextraccinconjuntadelMTCS
ydelTCSdematricesbiolgicas.

1.3.3.EstabilidaddeTCSyMTCSenlasmuestrasconadicin

Unaspectoimportantealahoradellevaracaboeldesarrollodeunametodologaanaltica
es evaluar la estabilidad de los compuestos en la matriz, dado que la disminucin en la respuesta
analticapodraconfundirseconposiblesprdidasenlaetapadelimpiezaencondicionesoxidativas.
Adems, es necesario asegurar que no tiene lugar la metilacin parcial del TCS, durante el
almacenamientodelasmuestras.
Para investigar este aspecto, se fortificaron muestras de trucha liofilizada, a nivel de 300
ng/g,usandounadisolucinpatrndelosanalitosenacetona.Sedejevaporarlaacetona(12horas
en campana) y se evaluaron las recuperaciones obtenidas en funcin de las condiciones de
almacenamientodescritasenlatablaI.7.
Como se puede comprobar en los resultados obtenidos, no hay diferencias significativas
paralosexperimentos1,2y3,sibienesciertoque,larecuperacinparaelMTCSfuemayorque
paraelTCS.Paraevaluarsiesposiblequeseproduzcabiometilacindeltriclosndurantelaetapa
dealmacenamiento,serepitieronlosexperimentos2y3fortificandolasmuestrassloconTCS.Los
resultadosobtenidos,muestras4y5,reflejaronquenohayconversindeTCSenMTCS,ademslas
recuperacionesestuvieronprximasal100%enambosexperimentos.
260
TablaI.7.Recuperacionesparamuestrasdetrucha,fortificadasanivelde300ng/g,enfuncindelas
condicionesdealmacenamiento(N=3).
Condicionesdealmacenamiento %RecuperacinSD
Experimento
(tiempo,temperatura) MTCS TCS
1 Noalmacenadaa 107.87.3 80.07.4
2 7das,20C 94.88.6 92.112.9
3 7das,4C 106.85.5 97.97.6
b
4 7das,20C n.d. 101.13.3
b
5 7das,4C n.d. 108.72.6
a b
Extradaalas12horasdepracticarlaadicin Sloseaaditriclosn
Por lo tanto, se puede concluir que no existen problemas de degradacin, ni de

interconversinentreTCSyMTCS,enmuestrasdepescadoalmacenadasa4C,durante7das.
Una vez optimizadas las condiciones de extraccin de las muestras de material biolgico
mediante MSPD con eliminacin de lpidos, figura I.7, se procedi a la caracterizacin del mtodo
analticopropuesto.
FiguraI.7.EsquemadelprocesodeextraccindeTCSyMTCSenmuestrasdematerialbiolgico.
0.5gdemuestra
dispersada con1.5g
deslica y1gde
Fritasde Na2SO4
polietileno 3gdeslica 10%
(p/p)H2SO4
10mL DCM
Concentrarasequedad,
redisolvercon1mL de
AcOEt yfiltrar(0.22m)
Derivatizar 0.5mL con

0.05mL MTBSTFAaT
ambientedurante5
minutos
261
Materialbiolgico
1.4.1.Caracterizacindelmtododedeterminacin(GCMS/MS):linealidad,repetibilidad
yLOQs
LalinealidadenlarespuestadelsistemaGCMS/MSfueevaluadainyectandopatronesde
triclosn y metiltriclosn preparados en acetato de etilo en concentraciones crecientes desde 2
ng/mLhasta2g/mL.Larespuestasemantuvolinealenelrangoestudiado,obteniendocoeficientes
de determinacin de 0.998 y 0.999 para el MTCS y TCS respectivamente, con una repetibilidad de
inyeccin inferior al 4 %. Los lmites de cuantificacin, estimados para una relacinseal/ruido de
10,fueronde0.5ng/mLparaelTCSy1ng/mLparaelMTCS.
TablaI.8.Linealidad,repetibilidadyLOQsdeGCMS/MSparapatronesdeMTCSyTCS.
Linealidad(R2) Rep.25ng/mL(%RSD,n=4) LOQ(ng/mL)
MTCS 0.998 3.4 1
TCS 0.999 3.0 0.5
1.4.2.Exactitud,precisinylmitesdecuantificacindelmtodoanaltico
La eficacia de la metodologa de extraccin propuesta se evalu usando muestras con

distintoscontenidosgrasos.Lasmatricesempleadasfueronsalmn(59%m.g.)ytrucha(31%m.g.)
liofilizadosydosalimentosfrescos,quesoenlonchas(40%m.g.)yjamncocido(3%m.g.).Cada
muestra fue dividida en tres porciones. Dos de ellas fueron enriquecidas con los analitos a dos
concentraciones diferentes: 10 y 50 ng/g. La tercera se us como blanco. Las muestras, con y sin
adicin, fueron almacenadas a 4C durante una semana. Pasado este tiempo, fueron procesadas
mediantelametodologadesarrollada,aligualquelosblancosdeproceso.Losresultadosobtenidos
mostraronqueningunadelasmuestrassinadicinpresentabasealdelosanalitos,aexcepcindel
jamncocido.EnlafiguraI.8seobservanloscromatogramasparalamuestradejamnconadicin
(10ng/g),lamuestrasinadicinyunblancodeproceso.Entodocaso,losnivelesdeMTCSyTCSen
lamuestrasinadicinfueroninferioresalosLOQsdelmtodo.

Las recuperaciones obtenidas para las diferentes matrices estudiadas se presentan en la
tablaI.9,juntoconlosrespectivoscoeficientesdevariacindelprocesoanaltico.Talcomosepuede
comprobar, las recuperaciones oscilaron entre 77 y 120 %, con unos coeficientes de variacin
inferioresal12%.
262
FiguraI.8.CromatogramasdeGCMS/MSparajamncocidoconadicinde10ng/gdeTCSyMTCS
(C),muestrasinadicin(B)yblancodeproceso(A).
(x103 Cts)
(x103 Cts)
1.25
2.5
MTCS
TCS
1.0 m/z232+252+254 m/z200+310

2.0
0.75
1.5
0.5
1.0
0.25
C 0.5
C
B
0.0 A B
0.0 A
21.00 21.50 22.00
minutos
22.5 23.0 23.5 minutos

Lavariabilidadinterdaseestudiconunamuestradesalmnliofilizadoconadicinde25
ng/g para ambos analitos, realizando las extracciones en 4 das consecutivos. Los resultados
obtenidosmostraronreproducibilidadesde4.2%y7.2%paraMTCSyTCS,tablaI.9.
Los LOQs para la metodologa desarrollada fueron de 1 y 2 ng/g para MTCS y TCS. Estos
valores son del mismo orden que los estimados por Balmer y colaboradores utilizando masas de
muestrade525g[BalmerME;2004].
TablaI.9.Recuperaciones(n=4),reproducibilidad(n=12)yLOQs(ng/g)delmtodopropuesto.
%RecuperacinSD
Repr.(% LOQ
Salmn Trucha Queso Jamn
RSD,n=12) (ng/g)
(59%m.g.) (31%m.g.) (40%m.g.) (3%m.g.)
ng/g 10 50 10 50 10 50 10 50 25
MTCS 1203 1098 11112 9511 10312 1107 859 928 4.2 2
TCS 1129 987 1079 794 959 1139 7711 856 7.2 1
263
Materialbiolgico
Encomparacinconotrasmetodologasexistentesenlabibliografaparaladeterminacin
detriclosnenmatricesbiolgicasyalimentos,elmtodopropuestoessuperiorenrelacinalcoste
delprocedimientoylasrecuperacionesobtenidas.Porejemplo,Allmyrycolaboradores[AllmyrM;
2006AyB]precisarondetriclosnmarcadoisotpicamenteparacompensarprdidasdehastaun
50 % en la extraccin de TCS en muestras biolgicas. Por otra parte, las recuperaciones y la
repetibilidadobtenidassonsimilaresalasdescritasporSanchesSilva[SanchesSilva;2005]parala
determinacindetriclosnenzumo,pechugadepolloyqueso,aunqueloslmitesdecuantificacin
desumtodoson40vecessuperioresalpresentadoenestamemoria.
1.5.Aplicacindelametodologadesarrollada
Lametodologadescritaseaplicalanlisisdeseismuestrasliofilizadasdetruchaarcoiris
(Oncorhynchusmykiss),caballa(Scomberomoruscavalla)ymejilln(Mytilusedulis)procedentesde
pequeosrosdelazonadeLugoyestuariosdelaRadePontevedrayVigo,estosltimosprximos
aunazonaindustrializada.Ningunadelasmuestrasdepescadonidemoluscoanalizadaspresent
nivelesdeTCSyMTCSporencimadelosLOQsdelmtodo.
Porotraparte,lapresenciadetrazasdetriclosnenalgunasdelasmuestrasdealimentos
en lonchas (figura I.8), sugieren su posible contaminacin al entrar en contacto directo con
superficiesoutensiliosqueestuviesentratadosconestebactericida(cuchillos,tablerosdecorte,)
odeunmodoindirecto,debidoalusodeesponjasobayetas,conteniendotriclosn,paralimpieza
de mostradores, tablas de corte y otras superficies en contacto con los alimentos. En los ltimos
aos, los productos polimricos antimicrobianos han tenido un gran auge, existiendo un amplio
abanico de utensilios utilizados en la vida diaria que incorporan, dispersados en su estructura,
sustancias con propiedades antimicrobianas como el triclosn. Por ejemplo, el TCS es uno de los
posibles bactericidas que incorpora una conocida patente (Silestone) de encimeras de cocina y
bao. As pues, se evalu la posibilidad de que se produzca la migracin del triclosn desde
materialesslidoshastalosalimentosenuntiempodecontactorelativamentecorto.Pararealizar
un estudio preliminar de esta posibilidad, lonchas de dos alimentos (queso y jamn cocido), con
distintocontenidograso,sepusieronencontactoconuntablerodecortequecontieneTCScomo
agente bactericida (nivel estimado 245 24 g/g). Cada cierto tiempo, se tom una porcin de la
muestradealimentoparadeterminarelcontenidodetriclosn.Losresultadosmostraronqueexiste
migracin apreciable del compuesto desde las superficies tratadas con este bactericida a los
alimentos,figuraI.9.
264
FiguraI.9.Migracindetriclosndesdeunasuperficietratadaconelbactericidaadosalimentoscon
contenidosgrasosde43%(queso)y2.5%(jamn).
Queso43%m.g. Jamn2.5%m.g.
800
600
[TCS]ng/g
400
200
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempodecontacto(horas)
Comosepuedeobservarenlagrfica,lavelocidaddemigracindeltriclosnalosalimentos
dependedelacantidaddemateriagrasaqueestospresentan.Elqueso,conunacantidaddegrasa
muy superior a la del jamn cocido, acumul concentraciones de triclosn mayores. Este
comportamiento ya haba sido descrito por Chung y colaboradores [Chung D; 2003] al estudiar la
cintica de migracin del triclosn desde un copolmero de estirenoacrilato. En su estudio,
simularon distintas condiciones experimentales, poniendo el polmero en contacto con diferentes
disolventes.Usandoheptano,elcualrepresentabaalimentosconaltocontenidograso,lamigracin
deltriclosntenalugardeformamsrpidaqueempleandounadisolucinmetanol:agua,lacual
imitabalosalimentosconaltocontenidoacuoso.Ensuestudio,trasuntiempodecontactode20
horas,el65%deltriclosnpresenteenelpolmeromigrabaalheptano.
En nuestro experimento, como se puede observar en la figura I.9, la migracin ha sido
relativamente rpida puesto que para tiempos inferiores a 5 minutos, las concentraciones de
triclosnenlosalimentosfueronde4050ng/g,equivalentesaun0.02%delvalorexistenteenla
superficie slida. Estos valores aumentaron con el tiempo hasta alcanzar niveles del orden de 700
ng/g, tras 7 horas de contacto, en el caso de la matriz ms grasa. Evidentemente estas
concentraciones(<1g/g)todavaresultanmuyinferioresaloscontenidosdeTCSenproductosde
cuidado personal (entre 0.10.3 % en pasta de dientes) por lo que su contribucin a la exposicin
humanaaestebactericidaesbaja.

265

CONCLUSIONES

Conclusiones
CONCLUSIONES
En esta seccin se presentan las conclusiones ms relevantes derivadas de los diferentes

resultados obtenidos en este estudio, relativas a la determinacin y distribucin de triclosn y
parabenesenvariasmatricesmedioambientales:
DETERMINACIN,DISTRIBUCINYREACTIVIDADENMEDIOACUOSO
I.AplicacindeSPMEaladeterminacindetriclosnyparabenesenagua
LacombinacindelaSPMEconunaetapadesililacinonfiberpermitealcanzarlmitesde
cuantificacin(LOQs)aniveldelosbajosng/LenladeterminacindeTCSysusderivados,ascomo
parabenesenmuestrasdeaguasuperficialyresidualusandoGCMSyGCMS/MScomotcnicasde
medida.Laetapadederivatizacinonfiberrequieretanslodiezminutos,pudiendoserllevadaa
cabo a temperatura ambiente. Cabe destacar que las condiciones de sililacin ptimas fueron
comunesparaambosgruposdecompuestos.
Enrelacinalaetapadeconcentracin,lasmayoreseficaciasdeextraccinseobtuvieron
utilizando fibras de PA y PDMSDVB para el TCS y sus derivados, y PA para el caso de parabenes.
Aparte del tipo de fibra, la nica variable que afect de manera diferente al rendimiento de la
extraccin para ambas familias de compuestos fue la fuerza inica del medio. En base a estos
resultados esfactibledeterminar parabenes, TCSy sus derivados (clorofenoles y metiltriclosn) en
muestras de agua de forma conjunta, usando PA como recubrimiento de la fibra de SPME.
Considerandounvolumendemuestradetanslo10mL,yuntiempodepreparacinde40minutos,
se pueden alcanzar LOQs suficientemente bajos para la determinacin de estos bactericidas en
muestras reales de agua superficial y residual, con un rango de respuesta lineal de 3 rdenes de
magnitud y un rendimiento de extraccin escasamente dependiente del tipo de matriz. La mayor
limitacin del mtodo de SPME es la presencia de niveles moderados de MeP en los blancos de
extraccin.
II.ConcentracinmedianteSPE
ElusodecartuchosOASISHLB,60mg,permiticoncentrarvolmenesdeaguadehasta2
LenladeterminacindeTCSyparabenes.Despusdesuretencinsobreeladsorbente,losanalitos
puedenrecuperarseconslo2mLdeacetatodeetiloyacontinuacinprocederasuderivatizacin
(sililacin) sin la necesidad de realizar un cambio de disolvente. En general, los LOQs obtenidos
usando SPE como tcnica de concentracin se situaron en el mismo rango de valores que los
269
correspondientesaSPME,ademsnosehanencontradoproblemasdecontaminacinparaninguno
deloscompuestosestudiados.LaslimitacionesmsimportantesdelmtododeSPEsonlanecesidad
de mayores volmenes de muestra y la introduccin de una etapa adicional de purificacin en el
caso de aguas residuales. De nuevo, sera factible la determinacin conjunta de TCS y parabenes,
usandolascondicionesdederivatizacinalgomsenrgicasquenecesitanlossegundos.
III.Reactividadconclorolibre
TantoTCScomoparabenespresentanunareactividadconsiderableencontactoconagua,a
pH neutro, conteniendo niveles de cloro libre inferiores a 1 g/mL. Para los segundos se ha
demostradoquelareaccintienelugartambinentreaguacloradayproductosdecuidadopersonal
queincluyenparabenesensuformulacin.
TCSyparabenesreaccionanconunexcesodeclorodeacuerdoconunapseudocinticade
primer orden,sin embargo el primero presenta una vidamedia muchoms cortay adems de la
formacindederivados halogenados, resultadode reacciones de sustitucin electrfila, da lugar a
otros compuestos de reconocida toxicidad: 2,4diclorofenol y 2,4,6triclorofenol. Por su parte, los
derivados halogenados de los parabenes presentan una mayor estabilidad a concentraciones
elevadasdecloroy,portanto,unamenortendenciaaevolucionaratrihalometanos.
El uso de sistemas GCMS, tipo trampa de iones, es recomendable para identificar los
derivados formados en los procesos de halogenacin, sobre todo si no existe informacin previa
relativaasusestructuras.
IV.Distribucinenmedioacutico
ElTCSylosparabenesalquilados(MeP,EtP,PrPyBuP)fuerondetectadosenprcticamente
todas las muestras de agua residual no tratada procesadas, alcanzado en algunos casos
concentracionessuperioresa1ng/mLparaMeP,PrPyTCS.Sinembargo,nosedetectlapresencia
deBzP,nideMTCSenningunadeellas,tampocoseencontr2,3,4TCF,consideradoaliniciodeeste
trabajocomounproductodetransformacindelTCS.AdiferenciadelTCS,losparabenesseeliminan
de forma prcticamente cuantitativa durante la depuracin de aguas residuales urbanas. Su
presenciaenaguasuperficial,porejemploenlosros,esunclaroindicativodevertidosdirectosde
aguasnotratadas.TCS,2,4DCFy2,4,6TCFfuerondetectadosenvariasmuestrasdeaguaresidual
tratadaaconcentracionesdehasta0.20.3ng/mL,portantocabeesperarsupresenciaenrosque
recibenlasdescargasdedepuradorasequipadascontratamientosdelodosactivos.
270
Conclusiones
DETERMINACINDETCS,2,4DCFY2,4,6TCFENLODOYSEDIMENTO

El lodo de depuradora constituy la ms compleja de las matrices consideradas en este
estudio, requiriendo el desarrollo de una estrategia de limpieza intensiva, a la vez que obliga a la
utilizacin de GC acoplada a espectrometra de masas en tndem (MS/MS) como tcnica de
determinacin. En relacin al procedimiento de extraccin asistida por microondas (MAE)
optimizado,eltipodedisolventeysuvolumenhansidolosfactoresmssignificativosdesdeelpunto
devistadelaeficaciadeextraccin.
El mtodo desarrollado mostr recuperaciones aceptables, comparables con Soxhlet,
desviaciones estndar relativas inferiores al 13 %, y lmites de cuantificacin, 0.8 ng/g, adecuados
para el anlisis de lodos y sedimentos. Si embargo, implica una excesiva manipulacin de las
muestrasynoesaplicablealadeterminacindeMTCS.
El anlisis de muestras de lodos revel la presencia de concentraciones elevadas de TCS
(niveldelg/g)enestamatriz,ascomodelosdosclorofenolesaconcentracionesdelosaltosng/g.
Considerando las vas de transformacin medioambiental del TCS, este dato debe tenerse muy en
cuenta a la hora de decidir el destino final de este residuo (incineracin, utilizacin como abono,
etc.).Adems,conocerlosnivelesdeTCSretenidosenloslodosesimprescindiblepararealizarlos
balancesdeeliminacindeestebactericidaenestacionesdepuradorasdeaguaresidual.
DETERMINACINYDISTRIBUCINDETCSYPARABENESENMUESTRASDEPOLVO

Sehandesarrolladodosmtodos,aplicandolastcnicasdePLEyMSPD,paralaextraccin
deparabenesyTCSenmuestrasdepolvo.Enamboscasos,lasetapasdelimpiezasehanintegrado
enelprocesoextraccin,minimizandolamanipulacindelosextractos.Laestrategiadecleanupha
sidocomnenambosmtodos,losinterferentesconmenorpolaridadquelosanalitosseeliminan
enunaprimeraetapadelavadodelcartuchodeMSPDolasceldasde PLE,mientrasqueaquellos
quepresentanunapolaridadmselevadapermanecenretenidosenunacapadeFlorisil,situadaen
elfondodelcartuchoolacelda.EnelcasodePLE,debidoasugranpoderextractivo,losdisolventes
empleadostantoparalaetapadecleanupcomodeextraccinsonmenospolaresqueparaMSPD,
considerada sta ltima como una tcnica suave de extraccin. Con respecto a la etapa de
derivatizacin, se ha demostrado la posibilidad de realizar la sililacin conjunta de los analitos
estudiadosendosdisolventesdiferentes(acetonitriloyacetatodeetilo)utilizandocondicionespoco
enrgicas. Usando GCMS/MS como tcnica de determinacin, se obtuvieron LOQs inferiores a 4
ng/g para todos los analitos considerando ambos protocolos de preparacin de muestra. Las
recuperacionesobtenidasparamuestrasconadicinfuerontambinsimilaresysloenelcasode
271
MeP, el ms polar de los compuestos considerados, PLE result ligeramente superior a MSPD en
trminosdeeficaciadeextraccin.
Desdeunpuntodevistaoperativo,elmtododePLErequiereunamenorintervencindel
operadoryesposibleprocesarvariasmuestrasdeformasecuencial.Porsuparte,MSPDresultams
barataalnorequeririnstrumentacindedicadaynopresentariesgodecontaminacincruzadaentre
muestras,puestoquelaextraccinserealizaencartuchosdepolipropilenodesechables.
La aplicacin de ambas metodologas (PLE y MSPD) al anlisis de muestras de polvo,
procedentesdeviviendasparticularesyedificiospblicos,pusodemanifiestolapresenciadeestos
compuestosenconcentracionesdelordendelapartepormilln(g/g),similaresalosnivelesdeTCS
enlodos,loqueindicaunacontinuaexposicinaTCSyparabenesporvadrmicayrespiratoriaen
atmsferasinteriores.

DETERMINACINDETCSYMTCSENMATERIALBIOLGICO
Elprocedimientodedispersindelamatrizenfaseslida(MSPD)desarrolladoenestatesis
constituye la primera aplicacin que integra las etapas de extraccin y purificacin para la
determinacin de TCS y MTCS en muestras de material biolgico. Para este tipo de matriz, la
eliminacindelpidosrepresentlamayordificultadeneldesarrollodelametodologapropuesta.
De las dos estrategias inicialmente consideradas: (1) retencin de lpidos en el cartucho de MSPD
combinando acetonitrilo con Florisil y C18 como eluyente, dispersante y coadsorbente,
respectivamente y (2) oxidacin de lpidos sobre slica impregnada con cido sulfrico; la segunda
resultmsefectiva,permitiendoobtenerrecuperacionescuantitativascon10mLdediclorometano
yextractoslibresdegrasa,compatiblesconelusodeGCcomotcnicadedeterminacin.
Aunque en muestras de pescado no se ha detectado la presencia ni de TCS ni MTCS, la
capacidaddeTCSparamigrardesdesuperficiesslidashaciaalimentosdebeserconsideradadesde
el punto de vista de las aplicaciones permitidas de este bactericida. Ms preocupante an es la
estabilidad de ambas especies (TCS y MTCS) en presencia de cido sulfrico, comportamiento
anlogo al de otros contaminantes con una reconocida persistencia medioambiental como son los
PBDEs,conlosquecompartenunaciertasemejanzaensusestructurasqumicas.
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ACRNIMOS
Acrnimos
ACRNIMOS
2,3,4TCF2,3,4triclorofenol
2,4,6TCF2,4,6triclorofenol
2,4DCF2,4diclorofenol
ACNAcetonitrilo
AcOEtAcetatodeetilo
AMDDesarrolloautomatizadodemtodos
ANOVAAnlisisdevarianza
APCIIonizacinqumicaapresinatmosfrica
ASEExtraccinaceleradacondisolventes
BSTFABis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
BuPButilparaben
BzPBencilparaben
CARPDMSCarboxenPolidimetilsiloxano
CCDDiseoCentralCompuesto
CEComunidadEuropea
CWDVBCarbowaxDivinilbenceno
DCMDiclorometano
DVBCARPDMSDivinilbencenoCarboxenPolidimetilsiloxano
EIImpactoelectrnico
EPAAgenciadeProteccinMedioambiental
ESIElectrospray
EtPEtilparaben
GCCromatografadegases
GPCCromatografadepermeacinengel
LCCromatografadelquidos
LODLmitededeteccin
LOQLmitedecuantificacin
LLEExtraccinlquidolquido
MAEExtraccinasistidapormicroondas
MeOHMetanol
MePMetilparaben
MSEspectrometrademasas
MS/MSEspectrometrademasasentndem
289
Acrnimos
MSPDDispersindelamatrizenfaseslida
MTBSTFAN(tertbutildimetilsilil)Nmetiltrifluoroacetamida
MTCSMetiltriclosn
NISTInstitutoNacionaldeEstndaresyTecnologa
PAHHidrocarburopolicclicoaromtico
PBParaben
PBDEBifenilterpolibromado
PCBBifenilopoliclorado
PDMSPolidimetilsiloxano
PDMSDVBPolidimetilsiloxanoDivinilbenceno
PLEExtraccinpresurizadacondisolventes
POPsContaminantesorgnicospersistentes
PPCPsProductosfarmacuticosydecuidadopersonal
PrPPropilparaben
RDRealDecreto
RSDDesviacinestndarrelativa
SDDesviacinestndar
SIMRegistroselectivodeiones
SPEExtraccinenfaseslida
SPMEMicroextraccinenfaseslida
SSIIonizacinconsprayinico
TCCTriclocarban
TCSTriclosn
trTiempoderetencin
USUltrasonidos
290

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