MICROBIOLOGIA APLICADA

Manual de Laboratorio

PRACTICA Nm. 18

INVESTIGACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

EN AGUA RESIDUAL

I. OBJETIVO

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en agua residual por el

mtodo del Nmero Ms Probable, utilizando la tcnica de tubos de fermentacin
mltiple.

II. INTRODUCCION

Debido a que las aguas residuales son de composicin variada provenientes de

descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrcolas,
pecuarios, domsticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier uso,
as como la mezcla de ellas, contienen diferentes tipos de microorganismos
contaminantes y las diferentes concentraciones, dependiendo de su fuente.

La variada poblacin de microorganismos en esta agua, proviene del suelo y de

origen intestinal, incluyen aerobios y anaerobios estrictos y facultativos as como
tambin numerosos virus como:

Poliovirus y virus de la hepatitis. Igualmente pueden contener formas parasitarias

variables como quistes de Protozoarios y huevecillos de Helmintos (Metazoarios).

Asimismo, existe en nuestro pas el grave problema de contaminacin de ros,

lagos acuferos y costas debido a que estos son utilizados como depsito de todos
los desechos generados por las actividades humanas.

Estos microorganismos pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que su reuso p.ej.,

en riego agrcola, actividades recreativas:

Aguas de piscinas, baos de hidromasaje, aguas potables naturales, actividades

pisccolas y aguas marinas superficiales (playas), representan un riesgo potencial
a la salud pblica.

Por todo lo anterior, adems del estudio de las caractersticas fisicoqumicas del
agua se requiere de un estudio microbiolgico.

Para este propsito se debern obtener muestras representativas usando los

procedimientos de toma de muestras establecidos en las Normas Oficiales
Mexicanas.

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Para la determinacin del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de

aguas, es necesario proceder a preparar diluciones decimales de la muestra,
debido a que se espera que la concentracin de coliformes sea superior en stas
que en un agua potable.

El nmero de diluciones vara mucho, dependiendo del origen de la muestra a

tratar. Por lo dems, para su anlisis de procede en la misma forma que para una
muestra de agua potable.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS

Muestra de agua de diferente naturaleza.

Mechero Bunsen.
Cerillos encendedor.
7 tubos de 18 x 150 mm conteniendo 9 mL de agua de dilucin estril.
7 Pipetas de 1 mL estriles.
15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo lactosado
estril de concentracin sencilla.
15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo Caldo Lactosa
Bilis Verde Brillante estril.
10 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo E.C.
estril.
2 Cajas de Petri conteniendo Agar Endo estril.
5 Tubos de 18 x 150 mm conteniendo agar nutritivo inclinado estril.
Agitador de tubos Vortex.
Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 13 x 100 mm.
Asa Bacteriolgica.
Incubadora a 35 C.
Bao Incubador para Coliformes fecales a una temperatura constante de 44 C
(0.5 C).

IV. TECNICA

PRUEBA PRESUNTIVA

Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de

asepsia.

1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una

distribucin uniforme de los microorganismos.

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2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado,

preparar diluciones.

3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estril tomar una alcuota de 1 mL
de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 mL de agua
de dilucin estril, obteniendo de esta manera una dilucin de 10-1. (Fig. 18.1)

4. Agitar el tubo de la dilucin 10-1 y con otra pipeta estril tomar una alcuota de
1 mL y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilucin estril para obtener
una dilucin de 10-2.

5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilucin de 10-3 o hasta

donde sea necesario.

6. Inocular aspticamente con 1 mL de muestra por quintuplicado, tubos de

fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de las
ltimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeracin por si se
requiere su utilizacin posterior.

7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24-48 horas.

8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para observar

si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el medio contiene
un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en el interior de la campana
Durham.

9. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de gas

sea resultado de la fermentacin de la lactosa, en cuyo caso se observar
turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de aire.

10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas
Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos tubos cuyas
campanas contengan burbujas de aire de alguna manera eliminar stas y as
poder utilizarlos.

11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las
pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.

12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarn en

incubacin 24 horas ms.

13. Despus de 48 horas (2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura final.

14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni produccin de gas, los

tubos se toman como negativos.

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INTERPRETACION:

Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado,

reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la
muestra analizada.

Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarn
convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA
para Coliformes Totales y Fecales.

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).

2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C.

3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas.

INTERPRETACION:

Si se observa turbidez y produccin de gas:

La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos

positivos para posteriormente hacer el clculo del NMP.

Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando

se observe turbidez:

Se consideran NEGATIVOS, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del

clculo del NMP

Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en los
grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el anlisis a
partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de muestra)
mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.

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PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).

2. Incubar durante 24 horas a 44.5 0.2 C. y despus de este perodo, observar

presencia de turbidez y gas.

INTERPRETACION:

Si se observa turbidez y produccin de gas:

La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos

positivos y establecer el cdigo para posteriormente hacer el clculo del NMP,
(Figs. 18.2 y 18.3)

Si no se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez:

Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del

clculo del NMP.

Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en los
grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el anlisis a
partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de muestra)
mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.

CALCULOS

De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes

Totales y Fecales, establecer los cdigos correspondientes para calcular por
referencia en las tablas estadsticas (Tablas 17.1-17.4) el NMP de Coliformes
Totales y Fecales en 100 mL de agua.

En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada,

emplear para los clculos la siguiente ecuacin:

No. De tubos positivos x 100

NMP/100 mL =
mL de muestra en tubos negativos mL de muestra en todos los tubos

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ELABORACION Y PRESENTACION DE RESULTADOS.

Los resultados se elaboran de la siguiente manera:

Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor cero.

A continuacin se establece el triplete de valores correspondiente a las tres

series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del NMP.

Para efectos de expresar el valor obtenido basndose en 100 mL de muestra

habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de muestra
inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete escogido. Ver
ejemplo (2) de la prctica anterior.

En general se tiene:

NMP ledo en la tabla

NMP/C =
Volumen real de muestra inoculada
en cada tubo de la serie central (mL)

Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera:

NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL

NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 mL

V. CUESTIONARIO

1. Cules son los lmites mximos permisibles de C. Fecales para las descargas
de aguas residuales vertidas a aguas y bienes nacionales as como a suelo?

2. Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua, indicando el agente

etiolgico correspondiente.

3. Adems de representar un riesgo para la salud pblica el vertido de aguas

residuales tratadas inadecuadamente o sin tratar a los depsitos naturales,
Qu otros efectos indeseables puede representar?

4. Cules son los lmites mximos permisibles de Coliformes Fecales en aguas

residuales tratadas que se reusan en servicios al pblico? Indicar NOM.

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