AGROBIOLOGIE

La transgenese
au secours de

la lutte bioi ogrque
Certains microorganismes, interessants pour la lutte biologique contre
des parasites ou des maladies des plantes, survivent mal dans le sol. Pour
pallier cet inconvenient, des chercheurs ont inuente la symbiose arti-
ficielle . It s'agit de modifier le genome des plantes a proteger afin que
leurs racines produisent des molecules que "
les bacteries benefiques, elles-memes
transgeniques, seront seules
pouvoir assimiler:

C .es dernieres annees, des traite-

. .. ments phytosanitaires d'un genre
nouveau sont apparus dans ks
champs: les agents de lutte biolo-
gique. Bacteries, champignons, plus
rarement insectes, capables de detruire
les ravageurs ou les vecteurs des ma-
ladies vegerales, sont recrutes pour
proreger les recoltes (1, 2). Outre la
celebre - mais anecdotique - cocci-
nelle devoranr les pucerons des ro-
siers, ou la bacterie Bacillus thurin- Institutdes
giensis, un insecticide microbien sciences vegetales,
massivement epandu depuis des de- CNRS, av dela
cennies, les agriculteurs peuvent de- Terrasse, bat 23,
91198 Gif-sur-
sormais employer des organismes plus Yvette, France.
esoteriques. Par exemple Trichoderma E-mail: yves.des-
sp, un champignon protegeant les saux@isv.cnrs-giUr
arbres des attaques d'un autre cham- Department of
Crop Sciences,
pignon nomrne Chondrosterum pur- 361 ERML, 1201 W
pureum, ou les bacreries du genre Lorsque la bacterle Agrobacterium tumefaciens envahit une cellule vege- Gregory Drive,
Streptomyces, qui luttent contre les tale (ici de tabac), elle induit chez cette derniere la production d'opines, University of Illinois,
ravages exerces sur les arbres par Ie des molecules qu'elle utilise comme source de carbone et d'azote. Cela Urbana-Champaign,
lui contsre un avantage selectif important sur Ie reste de la population Urbana, IL 61801,
champignon Alternaria brassicola.
Etats-Unis. E-mail:
bacterienne. Ce mecanisme a inspire une nouvelle methode de
oger@ux1.cso.uiuc.
protection biologique des cultures. edu.

BIOFUTUR 174 Janvier 1998 25

 AGROBIOLOGIE
(1) JW Oaecon etal
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phere andplant
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Publisher, Betsville,
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(1988) Ann Rev
Genet 22,1-30
(61 Y Oessaux et a/
(1993) Phytoche-
mistry34,31-38
(7) Composes extre-
mement rares dans
tanature, roctopine
et ses derives sont
egalement presents
dans lesmuscles du
poulpe (Octopus,
d'ou Ie nom d'octo-
pine) et I'hultre
Crassostrea gigas.
(8) P Guyon etal
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Microbe Interact 6,
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Microbia/59, 2064-
2070
co
c
z
u
.g
26 BIOFUTUR 174 Janvier 1998
Traitements biologiques commercialises en 1989
Nom Commercial Agent de contr6le Organisme clble-plante h6te Compagnie
BINAB-T Trichoderma Chondrosterum purpureum-arbre Biolnnovation AB,
Verticilium malthousei-champignon Toreboda, Suede
de couche
Endothia parasitica-chataignier
Dagger Pseudomonas fluorescens Pythium ultimum-coton Ecogen, Inc, langhorne,
Rhizoctonia solani-coton Pennsylvanie, Etats-Unis
Galltrol Agrobaeterium radiobaeter Agrobacterium tumefaciens- AgBio Chern Inc, Orinda,
cruciteres California, Etats-Unis
Mycostop Streptomyces sp. Alternaria brassico/a-arbres Kemira Oy,Vass, Finlande
Norbac 84-C Agrobaeterium radiobaeter Agrobaeterium tumefaeiens-arbres New Bio Products Inc,
Corvalis, Californie,
Etats-Unis
P.g. suspension Phlebia gigantea Heterobasidion annosum-arbres Ecological labs., ltd,
Dover, Royaume-Uni
(Source: d'apres JA Lewis [1991] The rhilosphere andplantgrowth, Kluwer Academic Publisher, Betsville, pp 279-288).
La listeexhaustive desproduits commerclaltses figuredans l'lndexphytosanitaire 1998(Ed: Association de coordination technique agricole, 1997).
Puisque les microorganismes utilises agrochimiques. Cela explique sans chelatent le fer, Ie rendant ainsi indis-
sont en general deja presents dans Ie doute Ie decollagc previsiblc de ponible pour les autres microorga-
milieu naturel, voire associes aux la lutte biologique : Ie marche mon- nismes, d'autres encore entrent en
plantes, on peut considerer la dial des biopesticides, qui ne repre- competition avec le vecteur de mala-
methode comme non polluante en scnta it que 50 millions de dollars en die pour les sites d'entree dans la
regard de I'utilisation de produits 1987, devrait atteindre plusieurs plante. Ce ne sont que quelques
exemples : d'autres mecanismes
milliards au
debut du siecle interviennent probablement, mais
prochain (3). restent inconnus a ce jour.
Les agents biolo- La plupart des especes observees uti-
giques deploient lisent d'ailleurs plusieurs strategies
des mecanisrnes simultanernent, ce qui rend extreme-
de lutte tres ment faible la probahilite d'appari-
varies, mais qui tion d'une resistance chez l'agenr
aboutissent tous pathogene. Cependant, si plusieurs
au mernc microorganismes sont d'ores et deja
resultat : modi- exploires en tant que rraiternents
fient-ils l'equi- phytosanitaires (voir tableau), la
libre des popula- liste des produits disponibles tarde a
tions rrucr o- s'allonger, En effet, beaucoup d'es-
biennes, avec peces candidates, pourtant pro met-
pour corollaire teuses lars dexperiences menees in
une diminution vitro, ont fait preuve d'une efficacite
marquee de la pour Ie moins limitee lors d'essais en
presence des champ. En general, leur faible capa-
especes patho- cite de survie dans Ie milieu nature I
genes et donc de les cmpeche d'arteindre des niveaux
l'incidence de la de population suffisants pour rivali-
maladie sur la ser avec l'agent pathogene (4).
culture. Certains Pour que la protection biologique des
microorganismes cultures devienne pleinement efficace,
benefiques pro- il faudrait done faciliter l'implanta-
duisent des anti- tion des organismes de lutte dans
biotiques diriges I'environncment irnrnediat des
contre I'agent plantes, par exemple en leur confe-
Des genes gouvernant la synthese d'opines ont pathogene, rant un avantage selectif sur le reste
ete lnseres dans Ie genome de plants de lotiers d'autres syntheti- de la population microbienne. Cette
(Lotus eornieulatus), ce qui favorise dans la rnizo- sent des mole- derniere idee provient de l'etude de la
sphere de ces derniers la croissance de bacteries cules appelees galle du collet, une maladie due a la
consommatrices d'opines. siderophores qui bacterie tell uri que Agrobacterium
tumefaciens (5). Lors de l'infecrion, ce
microorganisme opere une modifica-
tion generique na turelle en transte-
rant a la cellule vegetale, sur laquelle
il se fixe, un fragment d'ADN porteur
a la fois des genes responsables de
l'apparition des syrnptomes de la
maladie (formation d'une tumeur) et
des genes codant la synthese de com-
poses particuliers, les opines, sou vent
derives d'acides arnines (6,7).
A tumefaciens dispose d'enzyrnes lui
permettant d'utiliser ces molecules
com me sources de carbone et d'azo-
te, ce qui lui confere un important
avantage selectif sur les autres bacte-
ries du milieu (8). Nous inspirant de
ce mecanisme, no us avons evalue la
possibilite de modifier la population
microbienne du sol en faveur d'un
organisme benefique, en jouant sur
la quantite et la nature des nutri-
ments disponibles dans I'environne-
ment irnrnediat de la plante.
Une telle operation sera it particuliere-
ment efficace dans la population des
microarganismes associes aux racines.
Ces dernieres constituent, en effet, une
surface primordia le d'echanges entre
la plante et son environnement. Elies
prelevent les nutriments dans Ie sol et
y relachent nornbre de composes orga-
niques provenant de la photosynthese,
ou de cellules endommagees au cours
de la penetration dans Ie sol. La plan-
te crce ainsi une . zone d'influence ,
appelee rhizosphere, qui a fait l'objet
de recherches particulieres. Cette
influence du vegetal sur les microorga-
nismes saprophytes, benefiques (bac-
teries symbiotiques fixatrices d'azote
telles que Rhizobium ou bacteries
dites promotrices de croissance relles
que Pseudomonas putida, P [luores-
cens ou Azopsirillum sp) ou deleteres,
s'exerce en particulier via la produc-
tion de nombreux composes carbones.
> Modifier la mic:rollore
Avec une population microbienne
dense et entretenanr d'erroites rela-
tions trophiques avec la plante, la
rhizosphere constitue donc un lieu
d'experience tout indique. Pourquoi
ne pas tenter d'y modifier la micro-
flare en ajoutant dans le sol un ou
plusieurs substrars nouveaux favori-
sant la croissance de bacteries prea-
lablement choisies ?
Plusieurs resultats experimentaux
ont ouvert la voie, suggeranr que
notre proposition ctait realisable.
Ainsi, la colonisation des legumi-
neuses par des bacteries du genre
Rhizobium se rraduit par la produc-
tion de molecules specifiques de l'in-
teraction : les fla vonoides - un signa I
de reconnaissance synrhetise par l.i
plante - et les rhizopines - sources
carbonees produites par les bacterics
ayant deja penetre dans les racines (9.
10, 11). Le mecanisme decouvert chez
A tumefaciens n'est donc pas unique
dans la nature. En 1993, Stephen
Colbert, qui travaillait alors a I'uni-
versite de Californie (Berkeley, [tats-
Unis), a monrre que l'apporr volon-
taire d'un substrat nutritif specifique
d'une souche bacterienne modifie
profondernent I'equilibre micro bien
(12). II a introduit deux souches diffe-
rentes de Pseudomonas [iuorescens,
l'une consommant du salycilate er
l'autre incapable de l'uriliser, dans un
meme sol experimental. En amen-
dant la parcelle avec ce produit, il a
multiplie par cent la population des
bacteries capables de l'assimiler, De
tels resultats montrent que I'on peut
effectivement controler la population
microbienne de la rhizosphere en
jouant sur la disponibilite de mole-
cules sources de carbone.
> Symbiose arlilicielle
Cependant la methode utili see par S
Colbert ne saurait conferer une pro-
tection durable aux cultures: la selec-
tion des microorganismes est en effet
ponctuelle, lirnitee a la periode d'ap-
port du nutriment. C'est pourquoi
nous avons opte pour une tout autre
voie : modifier generiquernenr la plan-
te pour qu'elle produise elle-merne le
ou les substrats de croissance speci-
fiques des bacteries, Cette methode
presente plusieurs avantages. Ces
molecules, devenues des composants
des exsudats racinaires, sont presentes
rout au long de la croissance de la
plante et non plus uniquernent lars
d'un apport initial. Ensuite, la pres-
sion de selection est limitee a la rhizo-
sphere, sans affecter le sol environ-
nant. Enfin, la presence de ces com-
poses dans la rhizosphere s'obtienr au
cour relativement modeste de la modi-
fication generique du vegetal.
Nous avons choisi de demonrrer la
faisabilite de la methode en utilisant
precisernent les opines, dont les voies
de synthese dans la plante sont
connues. Puisqu'on connait egale-
ment les voies du catabolisme bacte-
rien des opines, on peut fort bien ima-
giner l'ingenierie genetique des deux
partenaires (planre er microorganis-
me), pour crcer ce que nous appelons
une symbiose artificielle ,
PHASE I LEPOINT SUR.... ~7 MAl 1998 LE VESINET (I'ARIS)
Objectifs
Exposer les derniers proqresacquis dans Ie domainede la synthese
de peptides, de pseudopeptides et peptidornirnetiques, de peptides
modifies. Presenter les strategies de production chimique de
banques de peptides. Introduire les methodes de synthese de
mimes non peptidiques. Aborder les problernes de biodisponibilite
et ciblage de peptides. IIlustrer largement l'interet des sondes
peptidiques dans differents domaines de la biologie et la rnededne
en couvrant des applications allant des aspects tres fondamentaux
jusqu'aumedicament.
Public
Chercheurs, rnedecins, thesards, inqenleurs travaillant dans Ie
domaine de la pharmacologie, I'immunologie, les maladies
infectieuses, les neurosciences, et interesses par I'utilisation des
peptideset mimes peptidiques dans leurchamp d'application.
Conferences en anglais ou en trancais.
Nombre maximum de participants: 60
Programme
Nouveaux conceptsen chimie phase solide : basesde la chimie des
peptides ; syntheses paralleles ; banques combinatoires. Peptides
modifies et peptido-rnirnetiques : lipopeptides et glycopeptides ;
pseudopeptides et autres peptidomlrnetiques ; rnodelisation de
peptides; peptldornirnetiques non peptidiques. Peptides et mimes
peptidiques a proprietes immunologiques : aspects dynamiques de
I'interaction antiqene-anticorps ; diagnostic et vaccins synthetiques
a I'aide de pseudopeptides ; immunomodulation de la reponse
Iymphocytaire T a I'aide d'analogues peptidiques ; biodisponibilite
et ciblage des peptides.Peptides comme agents therapeutiques :
mimes non peptidiques comme medicaments.
Avec la participation de : G.L. Amidon (Ann Arbor, USA), J.A.
Boutin (Suresne, France), I.L. Fauchere (Suresne, France), C. Granier
(Montpellier, France), H. Gras (Lille, France), J.G. Guillet (Paris,
France), I. Hoebeke (Strasbourg, France),j. Martinez (Montpellier,
France), S. Muller (Strasbourg, France), C. Rubin-Carrez (Vitry-sur-
Seine, France), I. Schneider-Mergener (Berlin, Allemagne), M. Van
Regenmortel (Strasbourg, France)
PHASE" MAITRISE TECHNIQUE.3 lOURS ENOCT08RE1998
Programme
Montpellier (3 jours) : Technique Spot: Logiciel Multipeps et
rnultisynthese manuelle ; automate ASP22 ; synthese
conventionnelle et combinatoire ; protocoles de revelation de la
liaison aux peptides.
et / ou
Strasbourg (3 [ours) : Synthese multiple de peptides. Chimie et
synthese de liaisons pseudopeptidiques ; mesure de l'affinite de
I'interaction anticorps-peptides/pseudopeptides.
Selection
Les stagiaires (12 maximum) seront selectionnes parmi les
participants de la phase I.
Renseignements et inscription: Ateliers de formation INSERM
101 rue de Tolbiac e 75654 PARIS cedex 13
Telephone: 33 (0)1 44 23 62 05 Fax: 33 (0)1 44236293
E-mail: atelierstolbiac.inserm.fr
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INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
Date limite d'inscription : 9 mars 1998
BIOFUTUR 174 Janvier 1998 27
 AGROBIOL.OGIE
nismes a fortement augmente -
de 100 a 5 000 fois - autour des
racines des plants transgeniques
(13). Leur nombre s'est stabilise a
un niveau correspondant,
semble-t-il, ala capacite d'accueil
maximale de la rhizosphere pour
ces especes, puisque la popula-
tion totale de chacun des trois
groupes observes est demeuree
comparable a celie entourant les
plants temoins. La culture de
plantes rransgeniques produisant
une opine affecte done specifi-
quement les souches bacteriennes
catabolisant cette molecule.
Cette etude constitue, a notre
connaissance , la premiere
demonstration experirnentale de
l'impact de la culture de plantes
transgeniques sur leur environne-
ment microbien.
u:
c contre certaines maladies fongiques.
8 > Application ala
::;
'i protection des plantes
co
...
c
~ Que conclure de ces resultats
"" quant a l'application d'une telle
production des substrats de croissan-
Les bacteries fixatrices d'azote du genre Rhizobium vivent strategic a la phytoprotection ? II
en syrnbiose avec certaines legumineuses (ici la Uwe, Vicia convient de souligner que si la
faba) dont elles colonisent res racines, ou plus preclsernent modification des populations
les nodosites fixatrices d'azote dont elles induisent la for- microbiennes semble considerable,
mation. De rnaniere generale, la zone entourant les racines, elle reste modeste en regard du
dite rhizosphere, est Ie lieu de nombreux echanqes bouleversement observe lors de la
moleculalres entre la plante et la rnlcrotlore tellurique. rotation des cultures (14, 15). Par
ailleurs, l'extrerne specificite de
l'eHet observe - ce qui est vrai
Le premier pas consistait cependant pour une opine donnee, done un
a dernontrer que la production transgene donne, ne l'est plus pour un
d'opines par une plante transgenique autre transgene - oblige a rechercher
peut modifier la population micro- precisement Ie substrat qui correspond
(13) POger etal bienne de sa rhizosphere. A l'aide de au microorganisme dont on souhaite
(1997) Nature Bio- plasmides d' Agrobacterium rhizo- favoriser la croissance. Or les especes
techno/15, 369-372
genes, nous avons introduit des connues pour leur capacite a Iutter
(14) A Clays-Jose- genes codant une opine - la manno- contre les agents parhogenes ne cata-
rand et a/(1995) pine, la nopaline ou la cucumopine bolisent pas forcement les opines, et ne
App/ Environ Micro- selon les lots -, dans Ie genome de sont pas toujours naturellement pre-
bio/61,1745-1749.
plantules de lotier (Lotus cornicula- sentes dans la rhizosphere,
(15) X Latour etal tus). A ce stade de l'experimentation, A ce stade, le genie genetique des
(1996) App/ Environ la nature des microorganismes cibles bacteries cibles pourrait intervenir.
Microbio/62, 2449- importait peu. Aussi nous avons Utilisant un modele similaire au
2456 choisi d'observer trois types de bac- notre, Michael Savka et Stephen
terics naturellement presentes dans la Farrand, de l'universite d'Illinois
(16) MA Svaka, SF
Farrand (1997) Na- rhizosphere, et que nous pourrions (Urbana-Champaign, Etats-Unis),
ture Biotechno/15, aisernenr cultiver et denornbrer en ont effecrue la premiere transforma-
363-368. laboratoire : Pseudomonas [luores- tion generique conjointe d'une plante
cens, identifiable sous lumiere ultra- et d'une bacterie associees (16). lis
(17) CKuhlrneier et
a/(1987) Ann Rev violctte, et les populations de bacre- ont introduit dans une souche de
Plant Physio/38, ries sporulees et thermotolerantes, Pseudomonas fluorescens des genes
211-257. facilement detectables. lui permettant de cataboliser quatre
En situation norrnale, les individus opines, l'acide mannopinique, la
capables d'assirniler les opines sont mannopine, l'acide agropinique et
rares. La production de ces mole- l'agropine, puis ont inocule cette
cules par Ies lotiers modifies allait- souche - ou P fluorescens ternoin -
elle faire apparaitre et croitre des autour des racines de plants de
souches utilisatrices ? Comme atten- tabac, eux-memes modifies pour
du, la population de tels microorga- produire ces molecules. Resultat :
28 BIOFUTUR 174 Janvier 1998
dans la rhizosphere des plants trans-
geniques, la bacterie modifiee atteint
des niveaux de population netternent
plus imporrants que la souche inca-
pable d'utiliser les opines.
II est done possible non seulement de
favoriser une souche deja presente
dans la rhizosphere, comrne nous
l'avons nons-memes montre, mais d'y
introduire un organisrne nouveau,
pour peu qu'on I'air modifie de facon a
Ie rendre capable d'uriliser une mole-
cule produite par la plante transge-
nique. La strategie dite de symbiose
artificielle ", c' est -a -dire la fa brica-
tion " de couples plante-agent de pro-
tection, est done techniquernenr pos-
sible et viable en termes d'ecologic
microbienne. Nous travaillons ainsi
actuellement a la mise au point de
couples transgeniques plante-
Pseudomonas fluorescens afin de lutter
Differenrs obstacles restent cepen-
dant a surmonter avant d'envisager la
commercialisation de tels produits .
Premierement, la localisation de la
ce bacrerienne dans la plante doit erre
plus specifique - par exernplc, Iimiree
aux tissus racinaires si l'on souhaite
installer un agent de lutte biologique
dans la rhizosphere -, afin de dimi-
nuer au maximum la pression de
selection sur les populations natu-
relies. Cctte specificite est desorrnais
possible, car differents prornoteurs de
genes ayant une expression lirnitee a
certains organes vegetaux ont ete
identifies (17).
II faut, par ailleurs, s'assurer que les
plantes transgeniques ne disserninent
pas les genes determinant les voies de
synthese des substrats carbones vers
des plantes sauvages. En effet, si ces
dernieres se mertaient elles aussi a
produire ces molecules, cela creerait
une pression de selection importante
et difficilement controlable sur les
populations bacreriennes et pourrait
conduire, in fine, a la perte de la spe-
cificite du substrat. De plus, il faudra
absolurnent prouver l'innocuite pour
l'Homme et pour les animaux de la
molecule nouvellement synthetisee
par la plante.
Resteront alors a determiner, parmi
les traiternents possibles, ceux qui
seronr effie aces et techniquement
viables en conditions reelles de cultu-
re. Et lorsqu'ils seront identifies, il
faudra evaluer la rentabilite de ces
traitements en regard de leur interet
ecologique, une appreciation tout
autant politique qu'economique, qui
pourrait fort bien echapper aux
scientifiques.