Crecimiento y Cultivo Vegetal

Biorreactores

La explotacin del cultivo de clulas vegetales como un proceso biotecnolgico para

la produccin comercial de compuestos de inters es uno de los objetivos de esta poca. Los
primeros en discutir el uso de cultivos de clulas vegetales para la produccin de compuestos
que generalmente se extraen de plantas fueron Routier y Nickell en 1956.

Teniendo en cuenta que este tipo de cultivos ha demostrado ser capaz de producir un
amplio rango de fitoqumicos, en particular frmacos y de la estimacin de Farnsworth y
Morris (1976) que cerca del 25% de la prescripciones mdicas en EEUU contenan
ingredientes bioactivos provenientes de plantas, es que este tipo de procesos ha sido
considerado como una alternativa importante para la produccin de algunos compuestos.

Los cultivos de clulas vegetales a gran escala tuvieron sus comienzos en 1959 con
Tulecke y Nickell, los que iniciaron un gran nmero de lneas celulares en frascos agitados y
fue en 1965 con Bryme y Koch que se puso en funcionamiento los primeros biorreactores
comerciales de 7,5 y 15 litros, utilizando clulas de Daucus carota.

En la dcada de los 70, se mostr gran inters en el cultivo de clulas de tabaco as

como de Glycine max, las que llegaron a cultivarse en tanque agitados de 300 litros. En esta
misma poca (1972) Mandels reconoci que las clulas vegetales eran ms sensibles al
esfuerzo de corte que los microorganismos y Dalton en 1978 sugiri que el problema
encontrado en la utilizacin de tanques agitados poda tener su origen en esta sensibilidad, por
lo que dise un reactor de bajo esfuerzo de corte denominado air lift.

En la actualidad se encuentran desarrollados a escala industrial de produccin los

procesos para obtencin de Shikonina (colorante) por cultivo de clulas de Lithospermun
erythrohizon, puesto a punto por la Industrias Petroqumicas Mitsui, as como la produccin
de berberina y biomasa de ginseng en otras industrias.

Los procesos industriales requieren de tres puntos fundamentales:

Crecimiento eficiente en grandes volmenes.

Acumulacin de metabolitos secundarios en el cultivo.

Si el proceso implica bioconversin o produccin de enzimas, que esto ocurra en las

condiciones de operacin del proceso.

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Para el control de estos puntos es necesario ajustar algunos parmetros tales como,
tensin de oxgeno, dixido de carbono, pH, agitacin, mezclado y densidad del cultivo entre
otros.

Es importante tener en cuenta que si bien en varios aspectos las suspensiones celulares
vegetales pueden ser tratadas de la misma manera que los cultivos microbianos, existen
caractersticas particulares de estos cultivos que pueden afectar su crecimiento en
biorreactores, esto puede verse claramente en el cuadro siguiente:

Caractersticas clulas clulas vegetales consecuencias en el biorreactor

microbianas dediferenciadas

Tamao 2-10 m 10-200 m Rpida sedimentacin, mayor

sensibilidad al corte

Clulas pueden obtenerse forman agregados Rpida sedimentacin

individuales

Velocidad de Alta Baja Largos procesos, problemas

crecimiento para mantener esterilidad
td 1-2 horas td 2-5 das

Densidad del pequeo 5-20 % Problemas de manipuleo.

inculo Dificulta la posibilidad de
escalado

Sensibilidad al no sensitivo sensitivo/tolerancia Disminucin de la velocidad

esfuerzo de corte de agitacin

Aireacin alta baja Baja demanda de oxgeno,

bajo KLa

Tamao celular: las clulas vegetales en su ciclo de crecimiento en principio son

pequeas y redondeadas, con denso citoplasma y pequea vacuola, sin embargo a medida que
crecen, se alargan y el tamao de la vacuola aumenta hasta llegar a ocupar casi un 90 % del
volumen total de la clula. Durante este crecimiento, se producen polisacridos extracelulares
que pueden ser los causantes de la formacin de agregados.

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El tamao y frecuencia de formacin de agregados, puede encontrarse afectado por

constituyentes del medio o por la aireacin. Los mismos pueden minimizarse por el agregado
de pectinasas, mediante la reduccin de la concentracin de calcio en el medio de cultivo, o
bien por mtodos mecnicos como es la mayor velocidad de agitacin.

Uno de los inconvenientes que pueden presentar los agregados de gran tamao es la
generacin de gradientes de nutrientes a travs de los mismos, lo que trae aparejado una
disminucin de oxgeno y glucosa, sin embargo esto puede resultar beneficioso en algunos
casos de produccin de metabolitos secundarios en los que la misma aumente con la
formacin de agregados.

Velocidad de crecimiento y densidad del inculo: este es uno de los puntos crticos para
el trabajo en biorreactores. Se requiere de gran atencin en el mantenimiento de la
esterilidad en el reactor y vasos accesorios que contienen medio de cultivo, muestras a
inocular y tamao de muestreo en el proceso. En algunos casos es posible llegar a
diminuir el tiempo de proceso y aumentar la produccin si se determina el tamao de
inculo adecuado, pero debe tenerse en cuenta que algunos metabolitos son acumulados
en la fase final de crecimiento, por lo que la disminucin de tiempo de proceso se
encuentra sumamente limitada. El tamao del inculo generalmente debe ser de al menos
un 10%, este hecho es crtico ya que disminuye la posibilidad de escalado, por lo que se
trata de minimizarlo hasta su lmite inferior o en algunos casos se recurre a la utilizacin
de medios condicionados que favorecen al proceso.

Produccin de espuma: El cultivo de clulas vegetales en biorreactores y en particular en

los denominados air lift, est acompaado casi habitualmente de la formacin de espuma
que constituye una costra que se denomina "merengue" en la parte superior del reactor,
este merengue puede cubrir la superficie del cultivo y afectar la circulacin, entrampar
clulas o agregados celulares que quedan imposibilitados de acceder al fuente nutricia y
de oxigenacin e imposibilitar las operaciones de muestreo. Esta espuma esta constituida
de polisacridos y protenas formando una red. La manera de controlarlo es mediante el
agregado de antiespumantes como las siliconas o el propilenglicol, pero es necesario
evaluar el efecto de ellos sobre el desarrollo del cultivo.

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Configuracin de Biorreactores

Existen varias configuraciones bsicas de biorreactores que pueden ser utilizadas en

cultivos de suspensiones aerbicas, pero la eleccin de la ptima para un sistema depende de
varios factores. Entre ellos presentan gran importancia la transferencia de oxgeno, el
mezclado y el esfuerzo de corte. Consecuentemente el diseo de un biorreactor involucra un
balance para lograr satisfacerlos en su conjunto. En el caso de suspensiones celulares es
necesario un buen mezclado, generalmente se requiere un bajo esfuerzo de corte y un
moderado suministro de oxgeno.

Dentro de los diseos bsicos de biorreactores para mltiples propsitos encontramos:

Tanque agitado

Columna de burbujas

Air lift

aire aire aire

Tanque agitado Columna de air lift
burbujas

Diseos bsicos de reactores

Factores que afectan al diseo de reactores

Aireacin o transferencia de oxgeno: La baja velocidad metablica de los cultivos de

clulas vegetales conduce a bajos requerimientos de oxgeno. Estos estn en el orden de
1-10 mmol.h-1l-1, mientras que para microorganismos oscilan entre 5-200 mmol.h-1 l-1.

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El oxgeno es un nutriente poco soluble, lo que lo transforma en un sustrato limitante

para el crecimiento. Por lo general se trata de satisfacer el necesario suministro del mismo
conjuntamente con la agitacin necesaria para homogeneizar un cultivo. La medida de
transferencia de oxigeno es el Kla (coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno) que
puede ser calculado a partir de la ecuacin que describe la concentracin de oxigeno disuelto

dCL/dt = K La (C* - CL)

de donde se llega a que:

ln (C* - CL ) = KLa . t

Donde:

CL es la concentracin de oxigeno disuelto en el medio de cultivo (mmol. l-1)

C* es la concentracin de saturacin de oxgeno (mmol. l-1)

KL es el coeficiente de transferencia de masa (cm/ tiempo)

a es el rea de la interfase gas/lquido por volumen de lquido ( cm2/volumen)

dCL / dt es la variacin de la concentracin de oxgeno en el tiempo (mmoles.l-1.hora-1)

El valor de KLa se encuentra afectado por diferentes factores entre los que se cuentan,
la velocidad del flujo de aire, el grado de agitacin, las propiedades reolgicas de un cultivo y
los antiespumantes.

La agitacin asiste a la transferencia de oxgeno en los siguientes aspectos:

Aumenta el rea de transferencia de oxgeno por la formacin de pequeas burbujas.

Retarda el escape de burbujas desde el lquido.

Previene la coalescencia de las burbujas de aire.

Disminuye el grosor de la interface gas/lquido al crear un flujo turbulento.

Efecto de corte: En biorreactores del tipo tanque agitados, se ha encontrado como

inconveniente la sensibilidad de muchos cultivos de clulas vegetales al esfuerzo de corte,
que tiene su origen en el gran tamao de las clulas o agregados celulares, la rigidez de la
pared celular y la gran vacuola que las mismas poseen.

Este esfuerzo o estrs de corte generado por las paletas de agitacin en un tanque
agitado puede resultar en inconvenientes que afectan el crecimiento de las suspensiones
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celulares vegetales. Por ello se utilizan con gran frecuencia reactores "air lift" que presentan
un bajo estrs de corte y actualmente se estn desarrollando para procesos a gran escala.

La sensibilidad al esfuerzo de corte se mide en funcin de la viabilidad celular, para lo

que se utilizan las tcnicas descriptas con anterioridad para cultivos sumergidos en batch y
clulas inmovilizadas.

El Mezclado: En los biorreactores tanque agitado el mezclado presenta un efecto dual,

diseminar las burbujas de aire y homogeneizar el cultivo, siendo el segundo el de mayor
importancia dados los bajos requerimientos de oxgeno y la necesidad de que no se
generen marcados gradientes en el seno de un reactor.

El mezclado se encuentra afectado por dos puntos fundamentales, la viscosidad del

cultivo y la sensibilidad al esfuerzo de corte.

Cuando los cultivos presentan una alta densidad celular, es necesaria una elevada
velocidad de las paletas de agitacin o de un gran caudal de aireacin, para suplir las
necesidades de mezclado y oxgeno, pero esto trae como consecuencia un elevado dao
celular si la especie es sensible al esfuerzo de corte. De esto deriva que ningn tanque
agitado o air lift es completamente satisfactorio en cuanto a mezclado de suspensiones de alta
densidad.

Para disminuir los inconvenientes referidos a este punto se han diseado una serie de
impellers o paletas de agitacin entre los que encontramos anclas, espirales, clulas
ascendentes y paletas planas.

ancla espiral paletas planas celulas ascendente

Diferentes diseos de impellers

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Sin embargo, a pesar de la aparicin de estos nuevos diseos de impellers, no siempre

es posible minimizar los inconvenientes provocados por los mismos, por lo que se han
desarrollado diseos alternativos de air-lift y tanques agitados para cultivos celulares
vegetales en pos de optimizar las condiciones de bajo esfuerzo de corte y un adecuado
mezclado. Entre esto puede ser citado el biorreactor tambor agitado, diseado por Tanaka y
col. en 1983, que resulto mucho mas efectivo que el tanque agitado para la produccin de
shikonina.

Biorreactores para cultivos de tejidos organizados y clulas inmovilizadas.

Cultivo de rganos: Los cultivos de estructuras como races, vstagos o embriones son
ms susceptibles a sufrir daos cuando son cultivados en biorreactores debido a su
tamao. Si bien no hay numerosas experiencias reportadas es evidente que este tipo de
rganos es sensible al efecto de corte. Los biorreactores diseados para estos fines son los
denominados spin filter y mist system. En ambos diseos es posible reemplazar el medio

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sin remover las estructuras organizadas.

Cultivo de races: Los cultivos de races se comportan muchas veces como estructuras
miceliares. Las races largas suelen ser sensibles a ser seccionadas por los impellers y si
estos cortes son muy frecuentes pueden revertir en la formacin de callos. Existen diseos
especficos que mantienen el desarrollo de races en cabellera separado del sistema de
agitacin como mallas de acero inoxidable o espumas de poliuretano. Como en el caso de
cultivo de rganos es prcticamente imposible realizar muestreos representativos por lo
que los parmetros de desarrollo se toman en forma indirecta.

Cultivo de clulas inmovilizadas: La inmovilizacin

celular es una estrategia ideal para permitir la
realizacin de sistemas de operacin continua. Aqu la
biomasa permanece naturalmente separada del medio de
cultivo, su vida til se extiende por perodos
prolongados y esta protegida de los esfuerzos de corte.
El mtodo ms utilizado son las perlas de alginato que
pueden aplicarse a reactores que funcionen en forma
empaquetada o fluidificada. Tambin hay diseos de
reactores que permiten trabajar con clulas entrampadas
en poliuretano tanto en forma tubular como fluida si las
lminas de material inerte son contadas en pequeos
cubos.

Operacin de Biorreactores

Para que un proceso de produccin resulte econmicamente rentable es necesario que

presente una alta productividad, o sea un alto rendimiento y concentracin de producto. La
productividad esta determinada por el tamao del biorreactor y la acumulacin del producto
determina la manera de operar el mismo.

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Los procesos pueden ser simples o en dos etapas. Si el producto de inters es un

metabolito que se obtiene una vez culminada la fase de crecimiento exponencial, resulta ms
ventajoso trabajar con en dos etapas.

Los bioreactores pueden ser operados de diferentes maneras de acuerdo al tipo de

cultivo o condiciones necesarias para la produccin. Dentro de las formas de operar los
biorreactores se tienen batch, batch alimentado, draw-fill y continuo.

Batch: El caso ms comn los frascos agitados. Son sistemas cerrados que se
caracterizan por cambiar las condiciones fisiolgicas y ambientales. No hay entrada ni
salida de medio de cultivo.

Batch alimentado: Estos sistemas operan adicionando medio fresco, pero sin remocin
del existente. Son muy tiles cuando se requiere una elevada densidad celular en la
etapa de iniciacin del proceso que implica un alto consumo de nutrientes,
especialmente de fuente hidrocarbonada que suele funcionar como sustrato limitante.

Draw-fill o semicontnuo: Consiste en remover, al final de la operacin entre un 80 y

un 90 % del cultivo y reemplazarlo por medio fresco. De esta manera puede eliminarse
el perodo lag, satisfacerse sencillamente la necesidad de contar con inculos de gran
tamao y a su vez evitar la esterilizacin del reactor entre dos ciclos.

Continuo: Son sistemas donde el caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida
de medio utilizado. Son utilizados en cultivos donde la velocidad de crecimiento celular
es constante por lo que existe un suministro constante de nutrientes o para la remocin
permanente de producto sobre todo en sistemas inmovilizados. Este tipo de operacin
presenta grandes inconvenientes con respecto al mantenimiento de las condiciones de
asepsia del proceso, y se dificulta debido a la tendencia a formar agregados de las
clulas vegetales en cultivo, la formacin de merengue y el lento crecimiento celular.
Para su buena aplicacin se requiere del diseo de sistemas que permitan suplementar
continuamente el medio de cultivo evitando la remocin de las clulas y as minimizar
lo que se denomina lavado del cultivo. Un buen sistema es el de Perfusin que implica
la remocin y suministro de medio dejando la biomasa ocluida en una malla.

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