Cultivo de chlorella vulgaris en biorreactor no convencional y aislamiento de

microalgas

Maira A Pedraza-Miranda1*, Cterin L Vanegas-Cardenas1, Anamaria Romero-

Rodriguez, Marlyn J Rivera-Avils.

1. estudiante programa de medicina veterinaria y zootecnia, Escuela de

Ciencias Animales, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos
Naturales, Universidad de los Llanos, Villavicencio, Colombia

RESUMEN

Se estudi el crecimiento de la microalga chlorella vulgaris en biorreactores no

convencionales, utilizando como medio de cultivo complejo NPK (Abocol,
Cartagena, Colombia) (1.0 g/L de agua destilada), se evalu la tasa de crecimiento
y el rendimiento. Se obtuvieron muestras de cuerpos de agua en la ciudad de
Villavicencio para obtener cepas de microalgas endmicas. Con una tasa de
crecimiento del 6% para los cultivos realizados en biorreactores no convencionales
comparados con una tasa de crecimiento del 5% para los frascos se puede concluir
que estos mtodos pueden ahorrar dinero de instalacin y funcionan
adecuadamente elevando la produccin de microalgas sin embargo se debe tener
en cuenta los factores ambientales. Con el fin de describir la utilizacin de
biorreactores no convencionales y realizar una comparacin, adems de
caracterizar las cepas de microalgas que pueden encontrarse en la ciudad de
Villavicencio.

ABSTRACT

The growth of the microalgae Chlorella vulgaris in unconventional bioreactors was

studied, using as NPK complex growth medium (Abocol, Cartagena, Colombia) (1.0
g / L of distilled water), the growth rate and performance was evaluated. Bodies of
water samples were collected in the city of Villavicencio for endemic strains of
microalgae. With a growth rate of 6% for crops grown on non-conventional
bioreactors compared with a growth rate of 5% for the bottles it can be concluded
that these methods can save money on installation and functioning properly raising

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production of microalgae however You must take into account environmental factors.
In order to describe the use of conventional bioreactors and not a comparison, in
addition to characterize the strains of microalgae to be found in Villavicencio.

Palabras clave: chlorellla, microalga, biorreactor, crecimiento.

Key words: chlorellla, microalgae, bioreactor, growth.

INTRODUCCIN

Las algas unicelulares representan un porcentaje muy notable del fitoplancton de

los ocanos y aguas dulces, que es donde se lleva a cabo no menos del 50% del
total de la fotosntesis que se realiza en nuestro planeta. Son muy importantes
especialmente las diatomeas, dinoflagelados y clorofitas unicelulares porque son
los principales productores de alimentos del ecosistema marino, que es donde se
encuentra la principal reserva de alimentos y fuente renovadora del oxgeno de la
atmsfera terrestre (Gama Fuentes, 2004). Las microalgas representan alrededor
del 0,5% de la biomasa global, adems presentan ventajas tales como la alta tasa
de crecimiento, alta eficiencia fotosinttica y alta produccin de biomasa comparada
con otros cultivos terrestres (Sostarie M, 2009).

La produccin comercial de microalgas tiene alrededor de 50 aos, siendo los

principales gneros de inters comercial: Chlorella, Spirulina, Dunaliella y
Haematococcus. A partir de 1990 aument el inters por el uso de la biomasa
microalgal en la produccin de biocombustibles, convirtindose esta en una
alternativa factible por muchas razones: la rpida tasa de crecimiento de los cultivos
algales, el contenido lipdico elevado de la biomasa algal, dependiendo de las
condiciones de cultivo y la especie cultivada, la versatilidad de las microalgas, la
posibilidad que ofrece el cultivo para usar tierras no cultivables y aguas no potables,
incluso aguas residuales, entre otras (Liliana Gmez Luna, 2011).

Chlorella apareci en la Tierra hace aproximadamente 1.5 o 2 mil millones de aos.

Es un alga verde unicelular de agua dulce; de forma esfrica, cerca de 2-10 micras
de dimetro que es extensamente encontrada en lagos y pantanos por todo el
mundo. El nombre Chlorella proviene del griego Chloros, que significa verde, y del

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latn ella, que significa cosa pequea, y fue descubierta y nombrada por el holands
M.W. Beyerinck en 1890. Comparada con otras plantas, Chlorella tiene una alta
concentracin de clorofila, as que su capacidad de fotosntesis es muchas veces
mayor que la de otras plantas. Chlorella vulgaris puede dividirse en cuatro clulas
cada 20 horas. (Kanno, 2005).

Chlorella est siendo investigada como un nuevo recurso alimenticio (ya que una
clula de Chlorella contiene cerca de 50% de protenas, 5% de clorofila y un gran
nmero de vitaminas y carotenos) para utilizarse en las poblaciones humanas
pobres de todo el mundo y para proveer comida y oxgeno en viajes al espacio y en
submarinos. (Lee R E, 1995)

Las concentraciones de protenas bruta y verdadera detectadas en un estudio

revelaron una calidad razonablemente buena en contraste con otras fuentes
protenicas reconocidas; asimismo, los carbohidratos presentes (16,00 %) suelen
formar parte del material de reserva y desempean una importante funcin en la
digestibilidad de la biomasa total de microalgas. Los niveles de lpidos, inferiores al
1 %, son una consecuencia lgica de la extraccin de muchos de los compuestos
lipoflicos de la biomasa con etanol. Este tratamiento se realiz para atenuar la
coloracin verde intensa de la biomasa, con la consiguiente mejora de las
propiedades organolpticas e incremento de la aceptabilidad. (Humberto Joaqun
Morris Quevedo, 1999).

En aos recientes, la demanda de infraestructura para producir protenas

recombinantes teraputicas, ha inferido en el desarrollo biorreactores desechables,
lo cuales han llamado especial atencin por su simplicidad y facilidad de uso. El
primero y ms conocido es el denominado biorreactor de olas (Wave Biorreactor)
introducido por el Dr. Vijay. El biorreactor consiste en una bolsa desechable,
preesterilizada, flexible en forma de almohada y colocada en una superficie que
se mueve de un lado a otro La bolsa se llena con medio de cultivo hasta la mitad de
su capacidad y es inflado con aire (oxgeno o mezclas de gases) usando un filtro
tambin desechable de 0.22 m. Como cualquier sistema desechable, se eliminan
los costos de las operaciones asociadas a las buenas prcticas de fabricacin.

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Actualmente, los birreactores de bolsa abarcan una capacidad desde 500 mL hasta
500 L (trujillo-roldn & valdez-cruz, 2009).

Con el fin de evaluar el comportamiento de chlorella vulgaris en biorreactores no

convencionales, se evalu la tasa de crecimiento y el rendimiento para determinar
que el cultivo en estos sistemas tambin puede mostrar buenos resultados para
investigadores y productores que deseen bajos costos de inversin a la hora de
cultivar microalgas en condiciones de temperatura y humedad no controladas.

MATERIALES Y MTODOS

rea de estudio

La investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Alimento Vivo del Instituto de

Acuicultura de la Universidad de los Llanos, localizado a 12 km de la ciudad de
Villavicencio, capital del departamento del Meta, Colombia. El clima lo caracteriza
una altura de 418 msnm, 25 C de temperatura ambiental, 4050 mm de precipitacin
pluvial promedio anual y 75% de humedad relativa. Se utilizaron las instalaciones
del laboratorio de biotecnologa para los cultivos en frascos. Para los cultivos no
convencionales se colocaron al aire libre.

Cultivo

Para el cultivo de la microalga chlorella vulgaris se utilizaron biorreactores en bolsas

plsticas 50X90X020, se utilizaron 3 biorreactores en bolsas a los cuales se aadi
20 gr de fertilizante complejo NPK (Abocol, Cartagena, Colombia) disueltos en 20
Lt de agua destilada y 500 ml de microalgas. Se colgaron al aire libre a temperatura
ambiente, oxigenacin contina mediante un blower (Sweetwater S-41, Florida,
USA). Por otra parte se utilizaron dos frascos de vidrio uno pequeo de una
capacidad de 300 ml y otro grande de 3 Lt, se utiliz tambin el medio de cultivo
fertilizante NPK (Abocol, Cartagena, Colombia) (1.0 g/L de agua destilada) en el
frasco pequeo se agreg 1,2 ml de chlorella vulgaris, en el frasco grande se
agregaron 12 ml de chlorella vulgaris estos cultivos estuvieron dentro del laboratorio
con luz artificial mediante lmparas (Phillips, 72 Watts, Amsterdam, Holanda),
oxigenacin continua mediante un blower (Sweetwater S-41, Florida, USA). Para

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determinar la densidad celular se realizaron conteos cada dos das haciendo uso de
la cmara de Neubauer (Boeco Brightline, Hamburgo, Alemania) bajo un
microscopio ptico (Nikon Eclipse E200, Tokyo, Japon) en 40x siguiendo la
metodologa de (Sipaba-Tavares LH, 2003), Patrn de conteo para clulas con
tamao inferior a 6 m. los conteos se realizaron para los frascos de 300 ml 17 das,
los frascos de 3 Lt 16 das y las bolsas durante 15 das. El stock del cual se tom la
microalga fue de un monocultivo que se encontraba aislado en medio complejo NPK
(Abocol, Cartagena, Colombia) en el laboratorio de alimento vivo de la estacin
pisccola de la Universidad de los Llanos para el frasco pequeo y los biorreactores
en bolsa, sin embargo la muestra de algas para el frasco de 3 Lt fue colectada
directamente del frasco de 300ml.

Obtencin y aislamiento de microalgas

Primero se obtuvieron las muestras de agua en la ciudad de Villavicencio, los sitios

fueron elegidos por la coloracin verdosa y turbidez mayor a 30cm, se colectaron y
se transportaron en frascos de vidrio cubiertos con papel peridico.

Para el aislamiento se utiliz la tcnica de diluciones seriadas (velasco, 1995) en la

que se utiliz como medio de cultivo fertilizante NPK (Abocol, Cartagena, Colombia)
(1.0 g/L de agua destilada) y la tcnica de agar (Trujillo, 1997) se utilizaron los
mtodos de siembra rayado paralelo en placa de agar y rallado en zig-zag. Se
mantuvieron en crecimiento durante 15 das y se montaron muestras en placas con
una gota de solucin salina para determinar la presencia de algas en la muestra
bajo un microscopio ptico (Nikon Eclipse E200, Tokyo, Japon). Todos los
procedimientos de preparacin de soluciones y siembra de microalgas se realizaron
en la cabina de flujo laminar horizontal marca Telstar, modelo AH-100.

Formulas

Tasa de crecimiento (k). K= (ln (NF) ln (No)) / t

Ln = logaritmo natural

Nf = nmero final de clulas en el tiempo

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No = nmero inicial de clulas

T = tiempo en das

Rendimiento (r). r= (Nt1 Nt0) /t

Nt1 = nmero final de organismos por ml

Nt0 = nmero inicial de organismos

T= tiempo en das

RESULTADOS

El tiempo influyo directamente en la densidad, teniendo en cuenta el da de conteo

inicial y el da de conteo final, se gener un aumento significativo de la densidad de
microalgas de las bolsas versus recipiente de 300 ml y recipiente de 3 litros, se
obtuvo mayores fluctuaciones en el tiempo en el recipiente de 300 ml, (grafica 1)

Tabla.1 Densidad de microalgas Chlorella vulgaris expresado en cm3/ml

Recipiente
DIAS 300ml Recipiente 3 Litros Bolsas 20 Litros
26 de junio 2750 2750 2500
30 de junio 31000 24500 25250
2 de julio 12000 47000 39500
3 de julio 38750 54250 33000
6 de julio 35500 55750 65750
8 de julio 32250 48000 90750
10 de julio 13250 49000 74000

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 DENSIDAD
300ml 3litros bolsas (20l)

100000
80000
60000
40000
20000
0
26 de 30 de 2 de julio 3 de julio 6 de juilo 8 de julio 10 de
junio junio julio

Figura 1. Densidad de Chlorella vulgaris expresado en cm3/ml.

Se observ el mayor crecimiento en las bolsas de 20 lt con un porcentaje del 5.5%

seguida del recipiente de 3 lt con 5.12% y por ltimo el recipiente de 300 ml con
4%, presento un decrecimiento en el transcurso de los das, aunque se debe tener
en cuenta que fue el frasco que se dej por ms tiempo. (fig. 4)

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Figura 2. Crecimiento de c. vulgaris. A: preparacin de frasco de 300 ml adicin de
stock de microalga, B: frasco de 300 ml da 1, C: frasco de 300 ml da 10, D: frasco
de 3 Lt da 15.

Figura 3. Crecimiento de c. vulgaris en biorreactores no convencionales. A: da 1,

B: da 15

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 TASA DE CRECIMIENTO

bolsas (20l)

3litros

300ml

0% 2% 4% 6%

Figura 4. Tasa de crecimiento C. vulgaris a travs del tiempo

La tasa de crecimiento para las bolsas de un 6% supero los resultados presentados

por los cultivos en frascos de 3lt y de 300 ml, sin embargo la diferencia entre el
frasco de 3 lt y las bolsas no fue muy marcada con una diferencia de un 1%.

RENDIMIENTO
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
300ML 3LITROS BOLSAS (20L)

Figura 5. Rendimiento C. vulgaris.

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Segn el nmero de microalgas producidas diariamente en 1ml el rendimiento fue
mayor en las bolsas de 20 lt con un valor significativamente superior de 73833 ml
comparado con el recipiente de 3litros de 48828ml y el recipiente de 300 ml
13147ml.

Figura 6. Aislamiento de microalgas. Medio de cultivo complejo NPK de las

diferentes muestras tomadas en la ciudad de Villavicencio.

Las placas observadas de las diferentes muestras no presentaron microalgas, los

cultivos en agar presentaron un crecimiento muy pobre, sin embargo los cultivos por
el mtodo de diluciones seriadas presento al finalizar el proyecto cambios de
coloracin y crecimiento.

ANALISIS DE RESULTADOS

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REFERENCIAS
Barajas Andrs, F. S. (2012). Mejoramiento del secuestro de CO2 por Chlorella
vulgaris UTEX 1803 en fotobiorreactores a escala laboratorio. Rev. ion vol.25
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Gama Fuentes, M. d. (2004). Biognesis y microorganismos. Mxico.

Humberto Joaqun Morris Quevedo, M. M. (1999). Composicin bioqumica y

evaluacin de la calidad proteica de la biomasa autotrfica de chlorella
vulgaris. Cubana Aliment Nutr .

Kanno, T. U. (2005). Chlorella vulgaris: The Powerful Japanese Medicinal Green

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Lee R E. (1995). Phycology. Cambridge, University Press.

Liliana Gmez Luna, I. . (2011). Cultivo de Chlorella vulgaris sobre residual de soja
con la aplicacin de un campo magntico . colombiana de biotecnologia .

Sipaba-Tavares LH, R. O. (2003). Produo de Plncton (Fitoplncton e

Zooplncton) para alimentao de Organismos Aquticos. So Carlos, Brasil.

Sostarie M, G. J. (2009). Studies on the growth of chlorella vulgaris in culture media

with different carbon sources. Chem. Biochem.

Trujillo, V. (1997). Manual de tecnicas de aislamiento de cepas de microalgas.

trujillo-roldn, m. a., & valdez-cruz, n. a. (2009). EL USO DE BIORREACTORES

DESECHABLES EN LA INDUSTRIA BIOFARMACUTICA Y SUS
IMPLICACIONES EN LA INGENIERA. Red de Revistas Cientficas de
Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal.

velasco, M. (1995). manual de cultivo de fitoplancton . . ecuador , guayaquil.

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