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LABORATRIO A3ERTO L

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A tua atividade para hoje


Herana gentica
Etapa 1: Extrao de ADN a partir de clulas de esfregao
bucal

NOTA I N T R O D U T R I A : Para fazer a recolha das clulas pressionar a zaragatoa contra a


parte interna da bochecha e rodar para cima e para baixo umas 20 vezes de cada lado, de
modo a passar a zaragatoa por toda a superfcie.
Para transporte: Mantenha a zaragatoa seca na embalagem original a 22-37C at proceder
extrao de ADN, at 7 dias no mximo. Para armazenamentos mais longos coloque a zaragatoa na
embalagem original a -20C at 6 meses, no mximo.
A quantidade total de ADN obtido proporcional quantidade de clulas recolhidas. Caso no
seja necessrio obter uma grande quantidade de ADN utilize apenas uma zaragatoa para ambas as
bochechas, caso contrrio use uma zaragatoa diferente para cada lado da boca e se necessrio uma
terceira zaragato a para recolher material adicional de ambos os lados.

1. Rotular o nmero adequado de microtubos necessrios para as


amostras a analisar

2. Adicionar 500 pi de soluo "QuickExtract DNA Extraction Solution 1.0"


a cada tubo;

3. Cortar um pequena poro da ponta da zaragatoa para um microtubo;

4. Fechar o tubo e agitar no vortex durante 10 segundos.

5. Incubar o tubo a 65C durante 1 minuto.

6. Voltar a agitar no vortex por 15 segundos.

7. Incubar o tubo a 98C durante 2 minutos.

8. Voltar a agitar no vortex por 15 segundos.


9. O ADN est pronto para ser utilizado. Manter a 4C (ou a -20C para
armazenamento mais prolongado).

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Herana Gentica

Etapa 2: Amplificao do ADN - PCR

1. No microtubo de PCR j se encontram 5 pi de primers.

2. Adicionar a cada microtubo 15 pl de MasterMix PCR ('utilizar


sempre uma ponta nova).

3. Transferir 20 pl de ADN (Controlos ou Amostras) para cada


microtubo de PCR (utilizar sempre uma ponta nova). ^

4. Colocar os microtubos de PCR no termociclador (o programa de


amplificao j se encontra inserido).

Tabela 1. Programa de amplificao das amostras

Desnaturao Desnaturao Hibridao Extenso Extenso Final


Inicial

94C 94C

\
2 min 1 min \ 72C 72C
! 1 min 10 min \
U
60 C
1 min \ 4C
IX 40X 00

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Etapa 3: Eletroforese e observao dos resultados

1. No gel de agarose (1%), que se encontra na tina de eletroforese,


carregar as amostras pela seguinte ordem:

POO AMOSTRAS QUANTIDADE

1 Controlo Homozigtico Positivo ( + / + ) 10 pl

Cl
Controlo Homozigtico Negativo ( - / - ) 10 pl
Controlo Heterozigtico ( + / - ) 10 pl
4 Amostra A l 10 Ml
5 Amostra A2 10 Ml
6 Amostra A3 10 Ml
l

2. Fechar a tina de eletroforese e ligar a fonte de (' -


alimentao.

3. Programar a fonte para 100V durante 40 minutos.

4. Desligar a fonte de alimentao e proceder colorao/revelao


do gel de agarose com soluo de Fast Blast DNA Stain (100x).

5. Observar/interpretar os resultados.

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