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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

PRCTICA 1: SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE


MICROBIOLOGIA

Los laboratorios de microbiologa constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden


presentar riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o
cerca de ellos. El trabajo diario en el laboratorio es un trabajo de grupo, en donde la actitud
de cada uno de los integrantes ante las prcticas, as como el entrenamiento que posean en
las tcnicas requeridas para el manejo de material contaminado, determinan su propia
seguridad, as como la de sus compaeros y la de la colectividad en general.

Es por ello que antes de comenzar con las actividades prcticas, todas las personas
involucradas (estudiantes y profesores) tenemos la obligacin de conocer cules son las
normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con
un riesgo mnimo de exposicin, tanto para las personas que lo ejecutan como para el
medio ambiente.

El objetivo de esta prctica, es ofrecerle al estudiante una gua que contribuya a lograr un
ambiente de trabajo adecuado y seguro, durante la ejecucin de las actividades prcticas en
el Laboratorio de Microbiologa.

PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD

Bioseguridad
La seguridad biolgica o bioseguridad, es la aplicacin del conocimiento, de las tcnicas y
de los equipos necesarios para prevenir la exposicin del personal, del rea de laboratorio y
del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos.

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Agentes Biopeligrosos
Son todos aquellos agentes biolgicos y materiales que son potencialmente peligrosos para
los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus,
hongos, parsitos, productos recombinantes, alergenos, etc.

Riesgo Microbiolgico
El Riesgo Microbiolgico se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad
prctica en el Laboratorio, donde se requiera la manipulacin de cultivos de
microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden
llegar a provocar una infeccin si no son manipulados adecuadamente.

Para que se produzca un accidente por un agente biolgico deben estar presente
bsicamente 4 elementos: un husped susceptible, un agente infeccioso, una concentracin
suficiente de ste y una ruta de transmisin adecuada; siendo este ltimo punto el que mejor
se puede controlar en el laboratorio.

Vas de Infeccin

Los microorganismos pueden ingresar al organismo a travs de: la boca, los pulmones, la
piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. Las vas de contaminacin ms frecuentes en el
laboratorio se dan a travs de:

La boca
Comer, beber y fumar en el laboratorio.
Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados
(lpices, bolgrafos, etc.).

La piel
Inoculacin accidental con una aguja hipodrmica u otros instrumentos punzantes o de
vidrio.

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Cortaduras o rasguos.
Los ojos
Salpicaduras de materiales infecciosos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos
contaminados.
Los pulmones
Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos
personales en el lugar que se les indique para tal fin.

Llevar puesta el guardapolvo de laboratorio en todo momento. La misma debe


permanecer completamente cerrada.

Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin


prctica.

Lavar las manos con agua y jabn antes de realizar las actividades programadas, antes de
salir del laboratorio y siempre despus de manejar materiales que se sabe o se sospeche que
son contaminantes.

Trabajar cerca de la mesa, adoptando una buena postura y


estando fsicamente cmodo.

Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de


suela antideslizante en las reas de laboratorio.

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Evitar llevar en el laboratorio accesorio que podran ser fuente de contaminacin (por
ejemplo joyas).

Recoger el cabello.

No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse


cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningn rea del laboratorio.

Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear


antes de iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted
tiene alguna duda, dirjase al profesor.

Mantener el rea de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,


exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realizacin del trabajo
prctico.

Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar ste
desatendido.

Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de


manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier
dao de los mismos al profesor.

Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin,
por ejemplo: las pipetas, tubos en frascos de boca ancha con solucin de hipoclorito de
sodio al 1% por 30 minutos; luego verter el hipoclorito al dejando correr bastante agua,
lavar con solucin jabonosa y enjuagar; las placas de Petri en las ollas de desecho, para
luego ser esterilizados en autoclave.

No usar ningn reactivo que no est debidamente identificado, verificar las etiquetas de
los mismos y estar seguro de cmo emplearlo.

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No devolver sustancias a sus envases originales.

Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca; usar peras de succin De igual manera
las pipetas tendrn tapones de algodn para reducir la contaminacin de estos dispositivos
de pipeteo.

Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo


experimentos no autorizados.

Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material


contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.

Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo


prctico.

Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculacin
accidental y la generacin de aerosoles durante su manipulacin y desecho.

Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

A continuacin mencionaremos los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los
siguientes accidentes:

Derrame de material biolgico sobre el cuerpo:

- Remover la ropa inmediatamente.

- Lavar vigorosamente el rea expuesta con agua y jabn por un minuto.

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- Reportar el incidente al profesor.

- Buscar atencin mdica si es necesario.

- La ropa contaminada debe ser colocada en una solucin desinfectante antes de ser
lavada.

Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos:

- Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del prpado con


abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar
efectivamente el lavado, comenzando por los prpados.

- Reportar el incidente al profesor.

Cortadas menores y heridas por pinchazo:

- Lavar vigorosamente la herida con agua y jabn por varios minutos.

- Aplicar un antisptico adecuado

- Reportar el incidente al profesor.

En el caso de derrames:

- Reportar el incidente al profesor.

- Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el rea del derrame.

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- Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario.

- Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente


para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con
los guantes utilizados.

- Limpiar y desinfectar nuevamente el rea empleando nuevas toallas de papel y


desinfectante.

- Lavarse las manos con abundante agua y jabn.

El xito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia, la


participacin activa y cooperativa de cada estudiante, por ello antes de asistir al
laboratorio, deben leer el fundamento y las actividades a realizar, para as
evitar posibles accidentes, con el conocimiento y las tcnicas de trabajo
apropiadas.

BIBLIOGRAFA

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH. U.S. Department


of Health and Human Services, Public Health Service (4 ed.). Washington; 1999.

Mahon, Conni and Manuselis, George. Textbook of Diagnostic Microbiology. Second


edition. USA: W.B. Saunders Company; 2000.

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Organizacin Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Ginebra:


OMS; 2005

PRCTICA 2: ESTERILIZACIN DE MEDIOS SECOS Y HMEDOS PARA USO


EN MICROBIOLOGA

I. INTRODUCCIN

Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes fsicos,
agentes qumicos, o por procesos fsicos y agentes quimioteraputicos. Se dispone de
una gran variedad de tcnicas y agentes que actan de maneras diferentes y cada uno
tiene su aplicacin y lmite de uso.

Un agente qumico es una sustancia que causa una reaccin especfica y que se
caracterizan por una estructura molecular tpica, por ejemplo tenemos los compuestos
fenlicos, los alcoholes, algenos (cloro y yodo), aldehdos, oxido de etilo, fenoles.

Un agente fsico es una propiedad o condicin que causa un cambio, por ejemplo la
temperatura, la presin, radiacin, desecacin y filtracin.

Es un factor de enorme importancia ya que la temperatura influye mucho en las


velocidades de reaccin de todos los procesos qumicos metablicos ligados al
crecimiento de todo organismo. El aumento o la disminucin de la temperatura
pueden retardar en algunos casos el crecimiento, e incluso pueden destruir al
microorganismo contaminante.

Calor hmedo:

El efecto que causa este calor es matar al microorganismo por la coagulacin de sus
protenas cuando se encuentran en una zona de atmsfera hmeda y sometidos a altas
temperaturas, adems, es mucho ms rpido y efectivo en su accin.

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Este calor se aplica en forma de vapor de agua y a temperaturas mayores o menores
de 100C combinadas con un aumento de la presin en algunos casos.

El uso de temperatura de 100C se logra con el uso de equipos especiales (Autoclave)


que combinan el efecto de la temperatura con la presin, as, a una presin de 760
mm de Hg el agua hierve a 100C, pero si la presin es superior la temperatura del
agua sube (Vapor de agua), por encima de los 100C, por ejemplo, a 10 lb/pulg de
presin la temperatura del vapor de agua es de 105C y a 15 lb/pulg es de 121C. El
uso de vapor de agua a temperaturas de 121C por 15 minutos mata todos los
microorganismos incluyendo las esporas bacterianas.

Calor seco:

En una atmsfera seca, totalmente exenta de humedad, las bacterias como muchas
protenas son ms resistentes y no mueren hasta que tiene lugar la oxidacin de sus

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componentes, lo cual ocurre a temperaturas mucho ms elevados que la que se
requiere para coagular las protenas.

Se recomienda el calor seco siempre que el vapor de agua que se emplea no sea
deseable o no sea posible que entre en contacto directo con el material que se va a
esterilizar. Este tipo de calor comprende: esterilizacin al rojo vivo, el flameado,
aparatos que usan aire caliente y las radiaciones infrarrojas.

Esterilizacin al rojo: Mtodos usados para esterilizar asa metlicas, esptulas.


Estos mtodos consisten en la exposicin directa del material a la accin de la
llama hasta alcanzar una coloracin roja.

Flameado: Mtodo utilizado para esterilizar bistures, agujas hipodrmicas,
boca de tubos de ensayo, porta y Cubreobjetos, etc. Consiste en pasar varias
veces el objeto (de 3 a 4 veces) a travs de la llama sin permitir que este alcance
el rojo.

Aire caliente: Mtodo usado para esterilizar material de vidrio y objetos
metlicos. Se debe envolver todo el material de laboratorio en papel, adems,
los tubos, erlemeyeres, pipetas y todo material en forma cilndrica deben ser
cubiertos por un tapn de algodn en su boca. Se usan temperaturas de 160C
por 2 horas y es suficiente para esterilizar el material.

II. OBJETIVOS
- Reconocer cuales son los agentes de control ms empleados para combatir los
microorganismos.
- El alumno debe estar diestro en el uso de medios de esterilizacin.

III. MATERIALES
- Autoclave
- Horno de Pasteur.
- Medios de cultivo (Prctica N 1)

IV. PROCEDIMIENTO

PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN

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Lavado de material de vidrio e instrumental
a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las
cajas de Petri, el material plano y el instrumental metlico lavar el material que se va
a esterilizar, utilizando dextran.
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave.
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a
temperatura ambiente.

PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR


HMEDO

TUBOS DE ENSAYO
a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodn siguiendo las indicaciones
del profesor.
b) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con
una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

Formas de preparacin de tubos de ensayo para esterilizacin por calor seco y


hmedo

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CAJAS DE PETRI

a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor.
Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo
de laboratorio y grupo.

Pasos a realizar para preparar cajas de


Petri para ser esterilizado por calor
hmedo

PIPETAS

a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando


que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip.

b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el
exceso de algodn.

c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft,
fijar el extremo con masking tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la
fecha, el grupo y el nmero de equipo de laboratorio. Con una flecha indicar el
sentido de la punta de la pipeta.

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MATRACES
a) Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con
gasa, siguiendo las instrucciones del profesor.
b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de
algodn.

c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el


Maskingtape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel.

Colocacin del tapn de algodn al matraz y gorro de papel Kraf para matraz para ser
esterilizado por calor hmedo

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PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la
punta.

b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

PREPARACIN DE AUTOCLAVE

1. Retira el colador del autoclave. Limpiar el colador enjuagndolo con agua y retira
todos los elementos que hayan quedado de otros usos previos.

2. Carga el autoclave con los elementos que vayan a ser esterilizados. Coloca los
elementos slidos en bolsas. Usa las bandejas para los elementos puntiagudos.

3. Coloca etiquetas en todos los elementos, no en las bolsas. Pon una bandeja
metlica por debajo de stos para recoger los derrames.

4. Cierra la puerta del autoclave. Progrmalo para el tiempo e exposicin y la


temperatura especificada por el manual. Normalmente es una temperatura por encima
de 121 grados Celsius y un tiempo de al menos 15 A 20 minutos.

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5. Elige un ciclo basndote en el tipo de materiales a esterilizar. Busca en el manual
del autoclave; los ciclos varan entre los diferentes autoclaves.

6. Usa guantes protectores, delantal y protector facial al final del ciclo del autoclave.
Retira los elementos y asegrate de que los indicadores del autoclave hayan sido
activados.

7. Desecha los lquidos y las bolsas del autoclave usando los mtodos de flujo de
residuos normales. Limpia las trampillas y filtros del autoclave eliminando los
residuos slidos y enjuagando con agua.

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V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.

PRACTICA 3: PREPARACIN DE MEDIOS Y SIEMBRA

I. INTRODUCCIN

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Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes, que en concentraciones
adecuadas y condiciones ptimas, permiten el crecimiento de microorganismos, con
el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas u hongos, para luego proceder a
su identificacin.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un


tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de
microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras
del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se quieren cultivar.

Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser


medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos.

Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos deriva-dos


de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de
sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas
de los microorganismos.

II. OBJETIVOS

Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de


medios de cultivo deshidratados.

III. MATERIALES
- Placas de Petri
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Medio de cultivo deshidratado.

IV. PROCEDIMIENTO:
A. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno


de sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos
asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se

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prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de
simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener
resultados reproducibles.

Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

Los ingredientes debern ser medidos en cantidad exacta y en recipiente


adecuado.
Agregar el volumen de agua necesario, preferentemente en 2 partes,
primero aproximadamente la mitad del volumen necesario para disolver
los ingredientes, y se aade despus el resto. El agua debe ser destilada o
desmineralizada, de reaccin neutra.
Si se trata de disolver un medio que contiene agar, ser necesario el calor.
No se recomienda el calentamiento sobre la llama, se debe preferir el
empleo del bao Mara o de vapor. Una disolucin completa se reconoce
por la ausencia de grnulos de agar en las paredes del recipiente.
Para evitar la formacin de agua de condensacin, no deben verterse
demasiado calientes los medios de cultivo a las placas si no despus de
enfriarlos a T entre 50 y 45 C, en bao de agua.
Los medios de cultivo deshidratados se fabrican de tal manera que si se
sigue las normas de preparacin, no necesitan clarificarse por filtracin ni
corregir de pH despus de su esterilizacin. Pero es oportuno que despus
de su preparacin listos para su uso, se compruebe su pH final.
El mtodo normal para la inmediata esterilizacin de los medios de
cultivo es utilizando el autoclave, en el cual el vapor de agua o presin es
el agente esterilizante.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede


almacenarse a temperatura ambiente por un periodo mximo de 2 semanas
protegido de la luz, o por periodos mayores a temperaturas entre 12 -15C. Sin
embargo, almacenados bajo refrigeracin entre 2 y 8C se prolonga la vida til
de los mismos, (nunca por debajo de 0C porque se destruye la estructura del
gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipien-tes bien cerrados

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para evitar su deshidratacin y cuando se usa tapn de algodn, se debe colocar
por encima una envoltura de papel (Kraft).

Preparacin de un medio slido en placa.

1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos


aadirlo a una concentracin de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada
en una botella.
2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapn de rosca.
3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir la botella en
un bao a 40C al menos durante 30 minutos.
4. Distribuir el medio en las placas de Petri que estn estriles dentro de una
campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando
bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones.
5. Dejar que el medio solidifique.

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Preparacin de medio slido en tubo (slant).

1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un


matraz.
2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. El
medio debe hervir hasta que se vuelva transparente.
3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que comience a
solidificar. Para ello se emplear una pipeta y los tubos no se llenarn ms
de un tercio de su volumen.
4. Autoclavar.
5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la gradilla para obtener
tubos con medio en slant.

Preparacin de medio lquido en tubo (caldo).

1. Pesar y rehidratar el medio.


2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos (sin llenarlos ms de 1/3 de su
volumen).
3. Autoclavar.
4. Sacar del autoclave y dejar enfriar

B. REALIZACIN DE LA SIEMBRA

1. Marcar el material con el nombre de grupo.


2. Realizar la siembra, como sigue:

a) Siembra en medio lquido

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Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un
inculo que se lleva al tubo estril con medio lquido (agitndola en el
seno del medio), tomando las precauciones mencionadas anteriormente.

b) Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inculo tomado
de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con
cultivo crecido y se toma una gota de inculo que se extiende sobre el
agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag.

c) Siembra en agar inclinado:


Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un
inculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la
siembra se deber realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la
profundidad del agar (anaerobiosis).

V. RESULTADOS

Presentar los resultados con imgenes.

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VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.
Ratto, M., Vega, C. y Garrido, T. 1983. Control Microbiolgico de Leche y
Productos Lcteos. Mtodos Recomendados. Edit. Tipografa SESATOR Lima-
Per.

PRACTICA 4: RECUENTO TOTAL DE AEROBIOS MESFILOS VIABLES

I. INTRODUCCIN

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El nmero de bacterias aerobias mesfilas encontrado en los alimentos es uno de los
indicadores microbianos de calidad de los mismos (ste ndice no es vlido para
alimentos fermentados: queso, leche fermentada, yogurt, mantequilla).

Esta determinacin se utiliza para:

a) Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfeccin y, averiguar la


temperatura a que fueron mantenidos los alimentos durante los procesos de
tratamiento industrial, transporte y almacenamiento.
b) Tener una idea sobre la alteracin incipiente de los alimentos de su probable
vida til, de la descongelacin no controlada de los alimentos congelados o de
las fallas en el mantenimiento de la temperatura de refrigeracin en los
alimentos refrigerados.

c) Poner de manifiesto las fuentes de contaminacin durante el proceso de


elaboracin de los alimentos.

II. OBJETIVO

- El alumno ser capaz de realizar diferente diluciones decimales.


- Adiestrar al estudiante con el mtodo de recuento en placa.
- Determinar el nmero de total microorganismos aerobios mesfilos viables
presentes en una muestra de alimento.

III. MATERIALES

- Muestra de alimento
- Diluciones de la muestra.
- Medio de Cultivo PCA
- Diluyente para la muestra.(Caldo peptonado)
- Placas de Petri
- Pipetas bacteriolgicas de 1ml,5ml y 10ml
- Licuadora de una o dos velocidades
- Vasos de licuadora con tapa, resistentes a temperaturas de esterilizacin.
- Balanza de capacidad no inferior a 2,500 g y una sensibilidad de 0.1 g
- Instrumentos para preparacin de muestras: tenedores, cuchillos, pinzas, tijeras,
cucharas, esptulas, previamente esterilizadas en autoclave o aire caliente.

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- Bao de agua regulado 44 46 C para mantener el agar licuado.
- Incubadora regulada a 29 -31 C.
- Contador de colonias.

IV. PROCEDIMIENTO

A. Para Preparacin y Dilucin de la muestra

a) Preparacin

- Tarar el vaso y pesar en l 10g representativos de la muestra del alimento


- Aadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra (90ml).As se
obtiene la dilucin 10-1.
- Hacer funcionar el homogeneizador con escasas revoluciones y
gradualmente en pocos segundos aumentar hasta la velocidad total. El
tiempo del homogeneizado debe medirse escrupulosamente y debe ser de 2
minutos a velocidad alta (no debe exceder de 2.5 minutos an a bajas
velocidades).

b) Dilucin

- Agitar el homogeneizado (dil 10-1) y pipetear una porcin de 1ml en un tubo


- con 9 ml de diluyente, obtenindose la dilucin 10-2.
- Mezclar el lquido cuidadosamente aspirando 10 veces con pipeta estril.
- Transferir con la misma pipeta 1ml a otro tubo conteniendo 9 ml de
diluyente
- y mezclar con nueva pipeta estril, se obtendr la dilucin 10-3.
- Repetir.

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B. Sembrado

a) Siembra por incorporacin

- Segn la carga microbiana esperada elegir las diluciones a sembrar. Realizar


no menos de tres diluciones consecutivas 1:10 1:100, 1:1000. Cada vez que
prepara una dilucin cargar y descargar la pipeta cuando menos tres veces.
- Depositar 1ml de cada dilucin en placas estriles, vacas por duplicado.
- Adicionar a cada placa 15 ml del medio de cultivo a emplear, previamente
licuado y enfriado a 45C. Entre la preparacin de la dilucin y adicin del
agar no deben transcurrir ms de 10 minutos.
- Mezclar cuidadosamente el medio y el inculo mediante una combinacin de
movimientos giratorios y de vaivn, sobre la superficie de la mesa de
trabajo. Deben de tomarse las precauciones para que durante stos
movimientos, el agar no toque la tapa de la placa de Petri. Dejar solidificar.
- Despus de solidificado el agar, incubar las placas a 37C durante 24 a 48
horas.

b) Siembra por extensin en superficie

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Si la siembra es en superficie, se deposita en la superficie de las placas que ya
contiene el medio de cultivo solidificado, 0,1 ml de cada dilucin. Se siembra
por duplicado para cada dilucin. Luego de colocada la muestra, se procede a
extenderla sobre la superficie de las placas con una asa adecuada. Incubar las
placas a 37C por 24 a 48 horas, luego hacer la lectura e informar el resultado.

La tcnica de siembra por extensin en superficie es ms adecuada para


recuentos de psicrtofos y psicrfilos, o muestras en las que se supone hay
patgenos para que los microbios no se inactiven con la temperatura del agar
licuado.

C. Numeracin

a) Para el recuento, escoger 2 placas correspondientes a una dilucin que contenga


entre 30 y 300 colonias utilizando un contador de colonias.

b) Tomar la media aritmtica de los 2 recuentos y multiplicar por el factor de


dilucin utilizada. Reportar segn el caso, el resultado como nmero de
microorganismos aerobios mesfilos por gramo o mililitro

26
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Ejemplo: Dilucin 10-2

Placa 1 : 72 colonias x 102 = 7,200


Placa 2 : 77 colonias x 102 = 7,700

Se promedia : 7,200 +7,700 = 7,450


2
Se reporta 7,450 colonias

c) Si las placas de 2 diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y


mayores que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos.

Ejemplo: Dilucin 10-2


N de colonias contadas: 350
Dilucin 10-3
N de colonias contadas: 27
Se promedia: 350 x 102 35,000
27 x 103 = 27,000
35,000 + 27,000 = 31,000
2
Se reporta 31,000 colonias/g ml

d) Si el nmero de colonias de las placas de 2 diluciones consecutivas estn dentro


del rango de 30 300 computar el recuento para cada una de las diluciones y
establecer la relacin de los 2 recuentos. Si el cociente es menor que 2, reportar
el promedio de los 2 valores, pero, si el recuento mayor contiene 2 veces o ms
al menor, en este caso se reportar el recuento del menor.

Ejemplo 1: Dilucin 10-1


N de colonias contadas: 290
Dilucin 10-2
N de colonias contadas: 35
Se relaciona el cmputo de los 2 recuentos:
3,500 = 1.2
2,900
En este caso se reporta el promedio
2,900 + 3500 = 3,200
2

Ejemplo 2 : Dilucin 10-2


N de colonias contadas: 170
Dilucin 10-3

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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
N de colonias contadas: 45
Se relaciona el cmputo de los 2 recuentos:
45,000 = 2.2
17,000
En este caso se reporta el recuento menor, es decir:
17,000 colonias por g ml.

e) Cuando los recuentos, se hacen en aquellas placas en las que han desarrollado
entre 30 y 300 U.F.C. estamos ante un recuento estndar en placa. Si en todas
las placas hubiera ms de 300 U.F.C., se estima el resultado contando las U.F.C.
en un rea conocida de la placa y llevndola al rea total de la placa. Si slo
hubiera placas con menos de 30 U.F.C., se informa igualmente el resultado,
expresndolo por g ml de muestra.

V. RESULTADOS
Presentar los resultados en cuadros.

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.

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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.

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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

PRCTICA 5: NUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES


FECALES Y E. Coli.

I. INTRODUCCIN

La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos


microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o
anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas.
La presencia de Coliformes fecales y Escherichia coli se utiliza para indicar una
contaminacin potencialmente peligrosa por el hecho de que el hbitat natural de
estos microorganismos son las heces humanas y de animales de sangre caliente.
E. coli es aceptada como el indicador ms positivo de contaminacin fecal reciente.
Esta contaminacin se produce, de modo general, por deficiencias en la limpieza y
desinfeccin en las industrias y por falta de higiene de los manipuladores.

II. OBJETIVOS

- Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP.

- Detectar bacterias coliformes totales, fecales y E.coli de un alimento.

III. MATERIAL
- Muestra (Agua)
- Placas de Petri
- Tubos de ensayo 16 x 150
- Tubos de ensayo 13 x 100
- Pipetas de 10 y 1 ml.
- Campanas Durham de 10 x 75
- Gradilla
- Mechero Bunsen

- Caldo lactosa bilis verde brillante (BRILLA)


- Caldo triptonado o peptonado.
- Estufa regulada a 35 37 C.
- Bao mara regulado a 44 C.

30
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
- Reactivo KOVACS.

IV. PROCEDIMIENTO
El procedimiento a seguir, depende del tipo de microorganismo que se quiere
enumerar en la muestra de alimento. As para la presente prctica, se determinar en
una muestra de agua el nmero de coliformes totales, coliformes fecales
(termotolerantes) y E. coli fecal.

A. DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES

1. Desinfectar la mesa de trabajo con alcohol yodado.


2. Agitar el frasco que contiene la muestra.
3. Pipetear 10 ml de la muestra original a cada uno de los tres primeros
tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILLA doble concentrado, 1 ml a los
tres siguientes tubos conteniendo BRILLA a concentracin normal, y 0,1
ml a los tres tubos restantes con BRILLA concentracin normal.
4. Homogeneizar la siembra adecuadamente e incubar los tubos a 35 37 C
durante 24 a 48 horas.
5. Anotar como positivos los tubos que muestren produccin de gas en las
campanas Durham.
6. Obtener el Nmero Ms Probable (NMP) ver tabla.

B. DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES Y E. coli


1. De cada tubo positivo (presencia de gas) del paso anterior, sembrar una
alcuota en caldo BRILLA (concentracin simple) y otra alcuota en caldo
triptonado.
2. Incubar en bao mara a 44 C durante 24 a 48 horas.
3. Luego del tiempo de incubacin, efectuar la prueba del Indol en los tubos
con caldo triptonado, para lo cual se adiciona 2 a 3 gotas de reactivo de
Kovacs.
4. Agitar el tubo y observar la formacin de un anillo color grosella en la
interfase del medio de cultivo (reaccin positiva); un color naranja, indica
la presencia probable de escatol y puede ser reportado tambin como una
prueba positiva.

31
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
5. Los cultivos (tubos) que muestren produccin de gas en caldo BRILLA y
formacin de Indol en caldo triptonado son positivos a E. coli fecal.
6. Los cultivos que slo muestren produccin de gas ms no produccin de
Indol se consideran coliformes fecales.
7. Determinar el NMP de coliformes fecales y E. coli en la tabla de NMP.

TABLA DEL NMERO MS PROBABLE


ndice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de
POSITIVO
Presencia
resultados positivos y negativos cuando de E.coli
se utilizan en caldode 10, 1 y 0,1 ml.
tres alcuotas
triptonado
Lmite de
10 ml 1 ml 0,1ml NMP/100ml confianza
0 0 1 3 0,5 9
0 1 0 3 0,5 13
1 0 0 4 0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
32
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3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800

TABLA DEL NMERO MS PROBABLE

Nmero Ms Probable (NMP) de bacterias; tres tubos de cada dilucin

Nmero de tubos positivos en cada nivel Lmites de confianza


NMP por g.
de dilucin
Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 99% 95%
0 1 0 3 <1 23 <1 17
1 0 0 4 <1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 28
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 50 2 38
2 0 1 14 3 62 5 48
2 1 0 15 3 65 5 50
2 1 1 20 5 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 510
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 100 1900 100 1400
3 3 1 500 100 3200 200 2400

33
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
3 3 2 1100 200 6400 300 4800

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.
Ratto, M., Vega, C. y Garrido, T. 1983. Control Microbiolgico de Leche y
Productos Lcteos. Mtodos Recomendados. Edit. Tipografa SESATOR Lima-
Per.

PRCTICA 6: NUMERACIN DE Staphilococcus aureus, COAGULASA


POSITIVO

I. INTRODUCCIN
Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se
presentan solos, en pares o racimos, no son mviles, ni esporulados; algunos biotipos
34
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
son capaces de producir una toxina altamente termoestable, as por ejemplo,
Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas
intoxicaciones en el hombre.

Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a la


neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de microorganismos
competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es
competitivo en presencia de otros microorganismos.

La presencia de Staphilococcus aureus en un alimento se interpreta por lo general


como indicativo de contaminacin a partir de la piel, la boca y las fosas nasales de los
manipuladores de los alimentos, si bien el material y el equipo no bien limpios
pueden ser el origen de la contaminacin.

Los alimentos sometidos a intensa manipulacin durante su preparacin y que se


mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 C y por debajo de 60 C)
despus de su preparacin, son los alimentos ms involucrados en la intoxicacin
estafilocccica.

Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son:


- Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de
intoxicaciones.
- Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de
este microorganismo enterotoxignico.
- Demostrar la contaminacin post proceso, la cual es usualmente debida a
contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.
-
II. OBJETIVOS
- Realizar adecuadamente la cuantificacin de Staphylococcus aureus en
alimentos.
- Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de
Staphylococcus aureus en alimentos.
-

III. MATERIAL

- Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la muestra.


- Placas de Petri

35
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
- Pipetas de 1ml graduadas al 0.1
- Extensores de vidrios
- Bao de agua regulado a 44 46 C
- Incubadora regulada a 35 37 C.
- Agar Baird Parker
- Caldo de Infusin Cerebro Corazn
- Tubos de 75 x 10 mm conteniendo 0.3 ml de plasma de conejo.

IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar diluciones 10-1,10-2,10-3 y 10-4.
2. Pipetear, por duplicado, 0.1 ml del homogeneizado y las diluciones sobre la
superficie de Agar Baird Parker previamente secadas y, distribuir el inculo con
un extensor de vidrio hasta que la superficie del medio aparezca seca.
3. Incubar las placas en posicin invertida a 37C durante 30 y 48 horas.
4. Despus de 30 horas de incubacin seleccionar las placas que presenten entre
20 y 200 colonias y contar todas aquellas colonias negras y brillantes con borde
blanco angosto rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco.
Estas colonias corresponden a S. aureus.
5. Marcar la posicin de estas colonias e incubar las placas durante 18 horas
adicionales.
6. Al final del perodo de incubacin (48 horas) contar las colonias con las
caractersticas descritas anteriormente y adems aquellas colonias negras
brillantes con o sin borde blanco y sin zonas claras; someter un nmero
significativo (no menor de 5) a la prueba de la coagulasa. Esta prueba servir
para distinguir aquellos cultivos de S. aureus (coagulasa positivo)de S.
epidermis (coagulasa negativo).

36
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

PRUEBA DE COAGULASA

a. Sembrar las colonias seleccionadas en Caldo Infusin Cerebro Corazn e


incubar los tubos a 35 37 C durante 20 a 24 horas.

b. Adicionar 0.1 ml del cultivo a tubos de 75 x 10 mm que contengan 0.3


ml de plasma de conejo a incubar a 35 -37 C.

c. Examinar despus de 4 horas de incubacin si el plasma ha perdido su


fluidez o se encuentra un cogulo ms o menos grande. Si la reaccin es
negativa, incubar los tubos a temperatura de laboratorio y reexaminar
despus de 24 horas.

Tabla de Puntuacin
Negativo = Ningn tipo de formacin de fibrina
1+ Positivo = Pequeos cogulos no organizados
2+ Positivo = Pequeos cogulos no organizados
3+ Positivo = Gran cogulo organizado

4+ Positivo = Todo el contenido aparece coagulado y se invierte el tubo.

37
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

POSITIVO

7. Calcular el total de colonias caractersticas, la proporcin de colonias positivas


a la prueba de la coagulasa teniendo en cuenta la dilucin empleada y expresar
el nmero de estafilococos positivo por gramo o ml de muestra.

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.

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Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.
Ratto, M., Vega, C. y Garrido, T. 1983. Control Microbiolgico de Leche y
Productos Lcteos. Mtodos Recomendados. Edit. Tipografa SESATOR Lima-
Per.

PRCTICA 7: RECUENTO TOTAL DE HONGOS Y LEVADURAS

I. INTRODUCCIN

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,


pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en
equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la
elaboracin de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la
descomposicin de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el
crecimiento bacteriano es menos favorables. Estas condiciones pueden ser bajos
niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja
temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del
alimento a la irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos
lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales
y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas,
etc. Pueden tambin causar malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies
de alimentos.

II. OBJETIVOS

39
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
- Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de
mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al
consumo humano.
- Comprender el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin y
cuantificacin de mohos y levaduras en alimentos

III. MATERIALES

1. Muestra biolgica y diluciones necesarias (10-4)


2. Agar Oxitetraciclina Glucosa (OGA)
3. Incubadora graduable.

IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar las diluciones necesarias (hasta 10-4)
2. Depositar por duplicado 1ml de cada dilucin en cada caja de Petri.
3. Adicionar 15 ml de Agar Oxitetraciclina Glucosa (OGA)
4. Incubar a 20 24 C por 3,4 5 das.
5. Seleccionar placas que contengan entre 30 a 100 colonias y contar
separadamente colonias de hongos y de levaduras.
6. Calcular el nmero y reportar como el Nmero de Hongos y Levaduras por
gramo o ml.

40
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V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
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Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
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PRCTICA 8: DETECCIN DE Salmonella sp. EN ALIMENTOS

I. INTRODUCCIN

Las salmonelas pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram(-),


oxidasa(-), mviles o inmviles. Hasta el momento existen ms de 2,200 tipos
serolgicamente diferentes y continuamente se aaden a la lista serotipos nuevos. No
obstante se observan de manera regular unos 100 serotipos. La presencia de
cualquiera de los serotipos de salmonelas en un alimento deber se considerado como
peligro.
La presencia en los alimentos de cualquier tipo de Salmonella es potencialmente
peligrosa como fuente de enfermedad para el hombre, debido a que la va oral es
virtualmente la puerta de entrada exclusiva de estas bacterias al organismo humano,
sea de modo directo por el consumo de alimentos contaminados o indirectamente
mediante la contaminacin secundaria por utensilios o equipo utilizado en el
procesamiento de alimentos.

42
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
Los mtodos para el aislamiento e identificacin de Salmonella a partir de los
alimentos pueden considerarse divididos en siete etapas sucesivas:

1. Enriquecimiento no selectivo
2. Enriquecimiento selectivo
3. Aislamiento selectivo
4. Bioquma presuntiva
5. Bioqumica confirmativa.
6. Serologa
7. Tipificacin por medio de bacterifago.

El enriquecimiento no selectivo tiene por finalidad la revitalizacin de las salmonelas


daadas por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de
almacenamiento.

El enriquecimiento selectivo sirve para favorecer el crecimiento de las salmonelas en


un ambiente que puede contener gran nmero de bacterias diferentes de ellas mismas.

La siembra en placa (aislamiento selectivo), permite la visualizacin de las colonias


sospechosas, por su aspecto caracterstico.

El valor de los resultados, como en cualquier procedimiento analtico, depender de


la adecuada eleccin de la muestra en representacin del lote y de la cantidad de
alimento muestreado.

II. OBJETIVO:

Adiestrar al estudiante con la metodologa para el aislamiento de Salmonella.

III. MATERIAL

- Muestra de alimento
- Tubos de ensayo de 13 x 100

43
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
- Tubos de ensayo de 15 x 150
- Pipetas de 5 ml.
- Placas de Petri estriles
- Matraz de 500 ml.
- Caldo Lactosado
- Caldo de Selenito
- Caldo tetrationato verde brillante
- Agar Salmonella-Shigella (SS)
- Agar VRBA Mac Conkey
- Agar TSI
- Agar LIA
- Agar comn.
- Solucin de yodo y yoduro de potasio
- Solucin de verde brillante.
- Estufa regulada a 35-37C

IV. PROCEDIMIENTO

1. Enriquecimiento no selectivo
El siguiente mtodo se basa en el anlisis de 25.0 g de la muestra, que se
considera como una unidad analtica, en una proporcin de 1:9 de
muestra/caldo lactosado. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga
la misma proporcin de 1:9 en el medio de pre enriquecimiento. La mnima
muestra recomendada es de 25.0 g, es decir, una unidad analtica. Para algunos
casos donde el riesgo es mayor, se utilizan dos unidades analticas (50.0 g) o
ms. Incubar 18 a 24 horas a 35 37 C.

2. Enriquecimiento selectivo
Llevar 1ml del cultivo anterior a 10ml de caldo selenito y a 10 ml de caldo
tetrationato verde brillante al que se le ha aadido 0.1 ml de solucin yodo
yodurada. Incubar a 37 C por 24 horas.

44
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3. Aislamiento en medios slidos selectivos


a. A partir de los cultivos incubados sembrar en agar SS y agar VRBA
Mac Conkey por estra. Incubar a 35 37 C por 24 a 48 horas.
b. Despus del perodo de incubacin examinar en las placas las colonias
sospechosas de Salmonella.
En agar SS las colonias incoloras y transparentes corresponden a la
mayora de Shigellas; las colonias transparentes con centro negro
corresponden a Salmonelas.
En agar VRBA se eligen las colonias transparentes (lactosa negativas).

Medio de cultivo selectivo, las colonias de Salmonella se muestran


transparentes con centro negro por produccin de H2S.

c. Sembrar en agar comn inclinado e incubar a 35 37 C por 24 horas.


d. Inocular en agar TSI y LIA incubar a 35 37 C por 24 horas.
(Bioqumica Presuntiva).
Los cultivos sospechosos de ser Salmonella en agar TSI presentan
reaccin alcalina en la parte superior del medio (color rojo, lactosa y
sacarosa negativos) y reaccin cida en la columna de agar (color
amarillo a consecuencia de la degradacin de la glucosa) con o sin
produccin de H2S (ennegrecimiento del medio).

45
__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
En Agar LIA los tubos son de color prpura con o sin ennegrecimiento.

TSI
Si fermenta:
Glucosa:
(+) fondo se torna amarillo.
(-) fondo se mantiene rojo.
Lactosa, Sacarosa:
(+) superficie torna amarillo
(-) se mantiene rojo.
Ennegrecimiento en tubo:
Produccin de H2S, impide ver
fondo amarillo.
Rotura de medio:
Produccin de gas

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.

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Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.

PRCTICA 9: RECUENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS


ESPORULADOS

I. INTRODUCCIN

Los microorganismos esporulados son responsables de la alteracin de las leches


hervidas o insuficientemente esterilizadas, de los quesos fundidos, quesos de pasta
blanda, leches concentradas, etc. No suelen causar mayores problemas en la leche
cruda o en productos lcteos que no hayan sufrido calentamiento.

Estn representados por dos gneros:


- El gnero Bacillus que en su mayora contiene especies mesfilas, aunque
algunas especies son psicrfilas y termfilas.
- El gnero Clostridium contiene especies mesfilas y termfilas, estos ltimos
son de gran importancia en la industria conservera por la extrema resistencia de
sus esporas al calor. Son responsables de la acidificacin, coagulacin y
protelisis.

El medio utilizado es selectivo para grmenes sulfito- reductores. El sulfito sdico,


por la accin sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a
sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, da lugar a sulfuro de hierro,
que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La
sulfadiazina sdica es selectiva e inhibe el crecimiento de grmenes Gram negativos.

II. OBJETIVO
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Determinar el nmero de microorganismos viables (anaerobios esporulados)
presentes en una muestra de alimentos.

III. MATERIALES

- Muestra biolgica diluda a 10-1.


- Tubos de ensayo de 15 x 150 ml vacos estriles.
- Pipetas de 1 y 5 ml.
- Gradilla
- Termmetro
- Agar SPS
- Agar agar
- Incubadora de aire regulado a 35-37C.

IV. PROCEDIMIENTO

1. Preparar la dilucin 10-1 en caso de la muestra sea slida; luego diluciones 10 -2


y 10-3.
2. De cada una de las 3 diluciones pipetear por duplicado 1 ml en cada uno de los
tubos estriles.
3. Verter en cada tubo 12 ml de Agar SPS fundido a una temperatura
aproximadamente de 45 C y homogenizar suavemente sin agitar. Dejar
solidificar los tubos en posicin vertical.
4. Adicionar una capa de 2 a 3 ml se Agar agar.
5. Dejar solidificar. Incubar a 37C por 24 a 48 horas.
6. Despus del perodo de incubacin, contar las colonias negras, seleccionando
los tubos que presenten entre 1 a 20 colonias, sacar el promedio y multiplicar
por el inverso de la dilucin.

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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBILIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.
Ratto, M., Vega, C. y Garrido, T. 1983. Control Microbiolgico de Leche y
Productos Lcteos. Mtodos Recomendados. Edit. Tipografa SESATOR Lima-
Per.

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PRACTICA 10: PRUEBA DE ESTERILIDAD COMERCIAL

I. INTRODUCCIN

La incidencia de daos en alimentos enlatados es baja, pero cuando ocurre debe ser
investigada apropiadamente. Las latas hinchadas indican que el producto est
daado. Durante el dao las latas pueden ir de normales a levemente hinchadas.
Como fuere el dao microbiano no es la nica causa de latas anormales, el
sobrellenado, el mal sellado, las abolladuras o el cerrado al fro pueden ser tambin
las responsables. El desarrollo microbiano y el hidrgeno producido por la
interaccin del cido del alimento con los metales de la lata, son las principales
fuentes de hinchazn. Algunos microorganismos que crecen en los alimentos
enlatados no producen gas y por lo tanto no causan una apariencia anormal de la lata,
no obstante causan dao en el producto.

La prueba ms segura para determinar la esterilidad comercial de una lata, es la


incubacin de sta, por un perodo de tiempo suficiente que permita que cualquier
microorganismo significativo desarrolle y manifieste su presencia. Si los
microoganismos proliferan bajo condiciones establecida, el producto no es
comercialmente estril y deber examinarse bajo pruebas que determinen la
alteracin.

CONTROLES RECOMENDADOS

1. Material de vidrio
Esterilizar todo el material de vidrio a 121C por 20 minutos como mnimo, el
equipo envuelto en papel Kraft deber esterilizarse en un horno a 170C por 2
horas.

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2. Medios de cultivo
Chequear la esterilidad de los medios lquidos por incubacin durante 48 horas
a temperaturas apropiadas y examinar ausencia de crecimiento microbiano.
Preparar placas control de medios no inoculados por cada lote de medio
empleado.
3. Requisitos del personal
Antes de comenzar el examen de conservas, el personal se deber lavar manos y
cara con jabn germicida, deber usa guaradapolvo de laboratorio limpio. El
personal que tenga abcesos, fornculos u otros problemas de salud similares, no
debe ejecutar esos exmenes.

II. OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con el control de esterilidad comercial.

III. MATERIAL
- Latas de conserva
- Recipientes para muestras
- Papel de filtro
- Abridor de latas estril
- Pipetas graduadas de 10 ml
- Incubadoras reguladas a 35C y a 55C
- Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI)
- Agar nutritivo
- Agar cisteinado
- Colorante Gram
- Parafina

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IV. PROCEDIMIENTO
1. Incubacin
Se lavarn y secarn bien las superficie de las latas y se incubarn entre dos
hojas de papel de filtro una a 55C por 10 das y la otra a 35C por 10 das.
Si durante la incubacin de las latas se presentaran manifestaciones de
crecimiento microbiano, ejemplo, abombamiento o microfugas, retirar las latas
con tales alteraciones y proceder a su examen.
2. Al trmino del perodo de incubacin, retirar las latas del incubador y aplicar
un agente sanitizante sobre el extremo no codificado de la lata. Dejar actuar
por 10 minutos, eliminar el exceso de lquido, secar y flamear (no flamear las
latas hinchadas).
3. Proceder a la apertura de la lata usando abrelata estril.
4. Inmediatamente despus abierta la lata transferir 5gramos del contenido a cada
uno de tres tubos conteniendo 30 ml de caldo BHI con almidn soluble al 0,1%
para aerobios e incubar a la temperatura de pre incubacin y 5 gramos da cada
uno de otros tres tubos conteniendo BHI con almidn soluble y cistena al 0,1%
para anaerobios; en este ltimo caso, cubrir la superficie del caldo con 2 a 3 ml
de parafina estril e incubar hasta por 5 das.
Si no hay crecimiento en uno y otro medio reportar como producto estril y
descartar. En el momento en que se note crecimiento estriar dos placas de agar
casoy o agar nutritivo de cada tubo positivo en aerobiosis e incubar a la misma
temperatura de pre incubacin. Si los tubos positivos fueran de anaerobiosis
sembrar en dos placas de agar cisteinado e incubar a la temperatura de pre
incubacin y en condiciones anaerbicas.

5. Preparar frotis directos a partir del contenido de cada lata despes del cultivo.
Secar, fijar y teir con azul de metileno o colorante Gram. Examinar bajo
microscopio, registrar los tipos de bacterias vistos.

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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgicos. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.

PRACTICA 11: CONTROL HIGINICO DE SUPERFICIES

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I. INTRODUCCIN

Una inspeccin preliminar de las instalaciones, preferiblemente durante el horario de


trabajo, viene a ser una ayuda de gran valor al establecer el significado
microbiolgico de los mtodos de organizacin general, modelo particular de equipo
y los mtodos de transformacin usados.

Se puede obtener informacin sobre la condicin microbiolgica del equipo


comparando los resultados con muestras tomadas en los puntos adecuados del primer
producto que pasa y que en efecto supone como un enjuague del equipo desde la
ltima limpieza y proceso de esterilizacin.

Deben realizarse exmenes microbiolgicos peridicos de verificacin de limpieza y


desinfeccin de las superficies en las maquinarias, mesas de trabajo, cuchillos, etc.
As como de las manos de los manipuladores los que sin duda constituyen el mayor
riesgo de contaminacin.

II. OBJETIVOS

1. Familiarizar al estudiante con la toma de muestra, transporte y anlisis de


muestras de superficie.
2. Realizar el control microbiolgico de superficies.

III. MATERIAL
- Muestras de superficies.
- Torundas
- VRBA glucosado
- PCA (Agar cuenta en placa)
- Agar Baird Parker
- OGA (Agar Glucosa Oxitetraciclina)
- Agua peptonada al 0.1%.
- Estufas reguladas a 35-37C
- Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO

Mtodo de la torunda
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1. Pasar las torundas estriles humedecidas en solucin salina triptonada mas twen
80 al 1/100 en un rea de 25 cm 2 cuatro veces hasta tener un rea de 100 cm 2:
sobre la mesa de laboratorio y las partes de maquinaria que estn en contacto
directo con el alimento.
2. Poner las torundas en 10 ml de solucin salina triptonada y homogeneizar.
Realizar diluciones necesarias.
3. Realizar los siguientes anlisis:
a. Recuento de aerobios mesfilos: mediante el Mtodo de Recuento en Placa
en PCA.
b. Recuento de Staphylococcus aureus: Mtodo de Recuento en Placa en Agar
de Baird Parker.
c. Recuento de hongos y levaduras: Mtodo de Recuento en Placa en OGA.

V.

RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFA

ICMSF. 1982. Microbiologa de los alimentos. Tcnicas de anlisis


microbiolgios. Vol. I 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.

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ICMSF, 2000. Microbiologa de los alimentos 1. Su significado y mtodos de
enumeracin. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Jay, J., Loessner, M.y Golden, D. 2009. Microbiologa de los alimentos.
Mossel, D., Moreno, B. y Strujik, C. 2006. Microbiologa de los alimentos.
Edit. Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa.
Pascual, M. y Caldern, V. 2000. Microbiologa Alimentaria 2da ed. Edit. Daz
de Santos, S.A. Madrid, Espaa.
Ratto, M., Vega, C. y Garrido, T. 1983. Control Microbiolgico de Leche y
Productos Lcteos. Mtodos Recomendados. Edit. Tipografa SESATOR Lima-
Per.

PRCTICA 12: PRUEBA DE ESTABILIDAD MICROBIOLGICA O DE


ESTERILIDAD COMERCIAL

I. INTRODUCCION

Estos estudios se llevan a cabo en tiempo real durante el desarrollo de los medios de
cultivo. Son realizados usando lotes producidos en condiciones reales de fabricacin.
Durante cada prueba de estabilidad se someten sistemticamente a choques trmicos.

Estos choques trmicos reproducen las condiciones a las que puede estar sujeto un
producto durante la produccin o el transporte.

Los estudios de estabilidad permiten definir las fechas de caducidad (fecha tras la
cual las prestaciones de los medios no pueden ser garantizadas durante ms tiempo).
Estas fechas de caducidad proporcionan a los clientes la seguridad de que las
prestaciones del producto han sido totalmente optimizadas y son fiables.

II. OBJETIVO:

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Familiarizar al alumno con la realizacin de prueba de estabilidad microbiolgica.

III. MATERIALES

- Estufas reguladas a 37C y 55C.


- Medidor de pH con sensibilidad de 0,01.
- 3 unidades de conserva normales de baja acidez pH >4.5 (mismo lote).
- 2 unidades de conserva normales acidificadas pH <= 4.5 (mismo lote).

IV. PROCEDIMIENTO
Registrar las diferentes caractersticas de cada unidad seleccionada; naturaleza
del producto, tipo y forma de envase, indicaciones reglamentarias y marcas
sobre el envase, la etiqueta o la ilustracin.
Marcarlas correctamente de tal manera que se asegure la trazabilidad hasta
redactar el informe de ensayo. Retirar la etiqueta, si hubiera alguna, y
asegurarse, mediante un examen cuidadoso, de que estas unidades son
normales.
Limpiar y/o quitar la grasa si es necesario, teniendo en cuenta la naturaleza del
envase.
Si las unidades estn abolladas, pero sin fugas, el informe del ensayo deber
indicar esto y se harn observaciones respecto al significado de los resultados.
Incubacin a 372C durante 7 das. Examinar cada da y retirar unidades que
presenten hinchamiento.
Incubacin a 552C durante 7 das (no se realiza en las conservas con pH <
4.6; en tomate, pimiento del piquillo y conservas acidificadas no es muy
aconsejable, salvo por razones comerciales como exportacin). Examinar cada
da y retirar unidades que abulten o presenten fugas.

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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
Testigo sin incubacin (7 das a temperatura ambiente: 18-25C). Examinar
cada da y retirar unidades que presenten hinchamiento.

Criterio de aceptacin:
Se detalla en ANEXO A

Antes de proceder con los exmenes, se debe dejar las unidades a temperatura
ambiente (inferior a 25C) a fin de obtener el equilibrio de temperaturas. Los
exmenes deben realizarse en condiciones idnticas para todas las unidades
incubadas.
Abrir las unidades y observar los cambios que puedan haber ocurrido con respecto al
olor, aspecto y textura del producto. ADVERTENCIA: No probar los productos
cualquiera que sea la unidad.

No puede haber modificaciones de las caractersticas del alimento durante la


incubacin (a 55C, se admite un pardeamiento), ni abombamiento de los envases o
rezumado de producto y la variacin mxima de pH entre las incubadas y la testigo
debe ser de 0.5 puntos.
Adicionalmente y a modo complementario a la prueba de estabilidad, se determinan:

En la muestra incubada a 37C y en la muestra Testigo mantenida a


Temperatura ambiente:

- Deteccin de Mesfilos Aerobios


- Deteccin de Mesfilos Anaerobios
- Deteccin de Clostridium sulfito-reductores (slo en conservas de pH 4.6).
- Deteccin de Lactobacilos (slo en conservas de pH <4.6).
- Deteccin de Mohos y Levaduras (slo en conservas de pH <4.6).

En la muestra incubada a 55C:

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- Deteccin de Termfilos aerobios
- Deteccin de Termfilos anaerobios.

Los valores recomendables y que usualmente se obtienen, para todos los parmetros
citados, son de <1 UFC/g <10 UFC/g segn sea el lmite de deteccin de la tcnica.
En el caso de conservas cidas, pueden detectarse mesfilos aerobios y anaerobios en
muestras comercialmente estriles, debido a que el pH de los medios de cultivo (en
torno a 7) utilizados en la deteccin de los citados microorganismos no son limitantes
para el crecimiento microbiolgico, mientras que el pH del producto (<4.5) s lo es.
En determinadas ocasiones, en conservas de baja acidez (pH4.5) comercialmente
estriles tambin se han detectado mesfilos aerobios en bajo nmero (<100 UFC/g).

En caso de sospecha, realizar tincin microbiolgica del producto y no tiene que


observarse en la tincin de la muestra incubada flora microbiolgica 100 veces
superior (cuantitativa o cualitativamente) respecto de la muestra testigo.

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIN

VII. CONCLUSIONES
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__________________________________MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL

VIII. BIBLIOGRAFIA

Larraaga y Col, 1998 Control e higiene de los alimentos. 3era ed. Edit. Mac
Graw Hill, Interamericana de Espaa. Madrid-Espaa.
Norma Tcnica Peruana 209.403-2007 ESPRRAGOS. Control de la
Estabilidad de conservas vegetales. Mtodo de Rutina.

ANEXO A
DIAGRAMA DE INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Deformacin del envase

Presencia Ausencia

Cambio de color - Aspecto

Presencia Ausencia Sospechoso


verdadera

Medicin de pH

> 0.5 > 0.3 y 0.5 0.3

Examen microscpico

Positivo Negativo

No estable 60 Estable

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