Resumen: clonacin de ADN

Definicin, propsito y pasos bsicos de la clonacin de ADN.

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Puntos ms importantes:
La clonacin de ADN es una tcnica de biologa
molecular que hace muchas copias idnticas de un
fragmento de ADN, como un gen.

En un experimento tpico de clonacin, se inserta un

gen blanco en un fragmento circular de ADN
llamado plsmido.

El plsmido se introduce en bacterias mediante un

proceso llamado transformacin y las bacterias que
contengan el plsmido se seleccionan mediante
antibiticos.
 Las bacterias con el plsmido correcto se utilizan
para hacer ms ADN plasmdico o, en algunos casos, se
induce la expresin del gen para hacer protena.

Introduccin
Cuando escuchas la palabra "clonacin" tal vez pienses en
la clonacin de organismos completos, como Dolly la
oveja. Sin embargo, lo nico que significa clonar algo es
hacer una copia genticamente exacta de ese algo. En un
laboratorio de biologa molecular, lo que se clona con ms
frecuencia es un gen u otro fragmento pequeo de ADN.

Si tu amiga la biloga molecular dice que su "clonacin"

no est funcionando, es casi seguro que est hablando de
copiar fragmentos de ADN, no de hacer la siguiente
Dolly!

Resumen de la clonacin de ADN

La clonacin de ADN es el proceso de hacer mltiples
copias idnticas de un fragmento particular de ADN. En un
procedimiento tpico de clonacin de ADN, el gen u otro
fragmento de ADN de inters (tal vez el gen de una
protena humana mdicamente importante) se inserta
primero en un fragmento circular de ADN
llamado plsmido. La insercin se realiza con enzimas
que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molcula
de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos
provenientes de mltiples fuentes.

Diagrama que muestra la construccin de una molcula

de ADN recombinante. Un fragmento circular de ADN
plasmdico tiene extremos irregulares que coinciden con
los de un fragmento del gen. El plsmido y el fragmento
de gen se unen para producir un plsmido que contenga
el gen. Este plsmido que contiene el gen es un ejemplo
de ADN recombinante, una molcula de ADN ensamblada
a partir de ADN de mltiples fuentes.

A continuacin, se introduce el plsmido recombinante en

bacterias. Se seleccionan las bacterias que contengan el
plsmido y se cultivan. Al reproducirse, estas replican el
plsmido y lo pasan a su descendencia, y de esta forma
hacen copias del ADN que contienen.

Qu sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia

de ADN en un plsmido? En algunos casos, necesitamos
muchas copias de ADN para realizar experimentos o
 construir nuevos plsmidos. En otros casos, el fragmento
de ADN codifica una protena til y las bacterias se
utilizan como "fbricas" para producir la protena. Por
ejemplo, el gen de la insulina humana se expresa en
bacterias E. coli para producir la insulina que usan los
diabticos.
[Ms sobre la insulina y la diabetes]

Los pasos de la clonacin de ADN

La clonacin de ADN se utiliza para muchos propsitos.
Como ejemplo, veamos cmo la clonacin de ADN se
puede utilizar para sintetizar una protena (como la
insulina humana) en bacterias. Los pasos bsicos son:

1. Abrir el plsmido y "pegar" el gen dentro. Este

proceso depende de enzimas de restriccin (que cortan el
ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).

2. Transformar bacterias con el plsmido. Se usa

seleccin con antibiticos para identificar las bacterias
que incorporaron el plsmido.

3. Cultivar bacterias portadoras de plsmido en gran

cantidad y usarlas como "fbricas" para producir la
protena. Recolectar la protena de las bacterias y
purificarla.

Revisemos con ms detalle cada paso.

1. Cortar y pegar el ADN
Cmo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes
fuentes? Un mtodo habitual utiliza dos tipos de
enzimas: enzimas de restriccin y ADN ligasa.

Una enzima de la restriccin es una enzima que

reconoce una secuencia blanco especfica y corta el ADN
en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar,
muchas enzimas de restriccin producen extremos de
cadena sencilla cortos que sobresalen. Si dos molculas
tienen extremos sobresalientes que se empatan, pueden
complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se
combinan para formar una molcula de ADN completa
hasta que la ADN ligasa las une sellando los espacios en
el esqueleto del ADN.
[Observa un diagrama de las enzimas de restriccin y la ADN ligasa]
 Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de
la insulina humana, por ejemplo) en un plsmido. Con
ayuda de una enzima de restriccin cuidadosamente
elegida, digerimos:

El plsmido, que solo tiene un sitio de corte.

El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de
corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la
cual los une para formar un plsmido recombinante que
contenga el gen.
 Diagrama que representa la digestin con enzimas de
restriccin y la ligacin en un esquema simplificado.

Empezamos con un plsmido bacteriano circular y un gen

blanco. En ambos extremos del gen blanco hay sitios de
restriccin, secuencias de ADN reconocidas por una
enzima de restriccin particular. En el plsmido, tambin
hay un sitio de restriccin reconocido por esa misma
enzima, justo despus de un promotor que dirigir su
expresin en bacterias.

El plsmido y el gen blanco (por separado) se digieren con

la enzima de restriccin. Los fragmentos se purifican y se
combinan. Ambos tienen "extremos cohesivos", o
salientes de ADN de cadena sencilla, por lo que pueden
pegarse.

La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos

complementarios para formar una nica molcula
completa de ADN. Esto produce un plsmido
recombinante que contiene el gen blanco.

2. Transformacin y seleccin
bacteriana
Mediante el proceso llamado transformacin pueden
introducirse plsmidos y otros tipos de ADN en bacterias,
como la inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios.
Durante la transformacin, clulas bacterianas
preparadas especialmente se someten a un choque (como
alta temperatura) que las anima a incorporar ADN
extrao.

El ADN producido en la ligacin (que puede ser una

mezcla de plsmidos deseados, plsmidos de productos
secundarios y fragmentos de ADN lineal) se agrega a las
bacterias. Las bacterias se someten a un golpe de calor,
que mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la
transformacin. Sin embargo, solo una pequea minora
de las bacterias incorporar con xito un plsmido.
[Por qu un golpe de calor hace que las bacterias tomen el ADN?]

^1start superscript, 1, end superscript

Tpicamente, los plsmidos contienen un gen de

resistencia a antibiticos que permite a las bacterias
sobrevivir en presencia de un antibitico especfico. As,
las bacterias que incorporan el plsmido
pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que
contenga el antibitico. Las bacterias sin plsmido
morirn, mientras que las bacterias que contienen
plsmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria
sobreviviente dar lugar a un pequeo grupo con forma
de punto, o colonia, de bacterias idnticas que contienen
el mismo plsmido.

Panel de la izquierda: diagrama de un plsmido que

contiene un gen de resistencia a antibiticos.

Panel de la derecha: todas las bacterias de la

transformacin se colocan en una placa con antibiticos.
Las bacterias sin plsmido mueren a causa del antibitico.
Cada bacteria que tenga plsmido forma una colonia, un
grupo de bacterias clonales que contienen el mismo
plsmido. Una colonia tpica se ve como un punto
pequeo y blanquecino del tamao de una cabeza de
alfiler.
No necesariamente todas las colonias contendrn el
plsmido adecuado. Eso es porque, durante una ligacin,
los fragmentos de ADN no siempre se "pegan"
exactamente como queremos. Por el contrario, debemos
recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una
contiene el plsmido correcto. Se usan mtodos como
la digestin con enzimas de restriccin y la PCR para
revisar los plsmidos.

3. Produccin de protenas
Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias
con el plsmido adecuado, podemos hacer crecer un gran
cultivo de bacterias que contengan el plsmido. Luego le
damos a las bacterias una seal qumica que les ordena
producir la protena blanco.

Las bacterias sirven como "fbricas" miniatura que

producen grandes cantidades de protena. Por ejemplo, si
nuestro plsmido contuviera el gen de la insulina humana,
las bacterias comenzaran a transcribir el gen y traducir el
ARNm para producir muchas molculas de la protena de
la insulina humana.
[Ms acerca de la expresin de genes humanos en bacterias]
 La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un
matraz de 1 litro, por ejemplo). Se induce la expresin del
gen contenido en el plsmido en las bacterias de ese
cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y
el ARNm se traduce en protena. La protena codificada
por el gen se acumula dentro de las bacterias.
 Una vez que se ha producido la protena, las clulas
bacterianas pueden romperse para liberarla. Hay muchas
otras protenas y macromolculas flotando en las
bacterias adems de la protena blanco (la insulina en
nuestro ejemplo). Debido a esto, la protena blanco debe
ser purificada o separada del resto del contenido de las
clulas con tcnicas bioqumicas. La protena purificada
puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la
insulina, administrarse a pacientes.
[Realmente es tan simple hacer insulina?]

Usos de la clonacin de ADN

Las molculas de ADN construidas mediante tcnicas de
clonacin se utilizan para muchos fines en la biologa
molecular. Una breve lista de ejemplos incluye:

Productos biofarmacuticos. La clonacin de ADN

puede utilizarse para producir protenas humanas con
aplicaciones biomdicas, como la insulina mencionada
anteriormente. Otros ejemplos de protenas
recombinantes incluyen la hormona del crecimiento
humana, que se administra a pacientes que son incapaces
de sintetizarla, y el activador tisular del plasmingeno
(tPA), que se utiliza para tratar infartos y prevenir
cogulos sanguneos. Protenas recombinantes como
estas suelen producirse en bacterias.

Terapia gnica. En algunas transtornos genticos,

los pacientes carecen de la forma funcional de un gen en
 particular. La terapia gnica intenta proporcionar una
copia normal del gen a las clulas del cuerpo del paciente.
Por ejemplo, la clonacin de ADN se utiliz para construir
plsmidos que contuvieran una versin normal del gen
que falla en la fibrosis qustica. Cuando se suministraban
los plsmidos a los pulmones de pacientes con fibrosis
qustica, la funcin pulmonar se deterioraba ms
lentamente^22start superscript, 2, end superscript.

Anlisis gentico. En laboratorios de bsica

investigacin, los bilogos suelen usar la clonacin de
ADN para crear versiones recombinantes artificiales de
genes que les ayudan a entender cmo funcionan los
genes normales de un organismo.
[Mira un ejemplo.]

Estos son solo algunos ejemplos de cmo hoy en da se

utiliza la clonacin de ADN en la biologa. La clonacin de
ADN es una tcnica muy comn que se utiliza en una gran
variedad de aplicaciones de la biologa molecular.

2. Transformacin y seleccin
bacteriana
Mediante el proceso llamado transformacin pueden
introducirse plsmidos y otros tipos de ADN en bacterias,
como la inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios.
Durante la transformacin, clulas bacterianas
preparadas especialmente se someten a un choque (como
alta temperatura) que las anima a incorporar ADN
extrao.

El ADN producido en la ligacin (que puede ser una

mezcla de plsmidos deseados, plsmidos de productos
secundarios y fragmentos de ADN lineal) se agrega a las
bacterias. Las bacterias se someten a un golpe de calor,
que mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la
transformacin. Sin embargo, solo una pequea minora
de las bacterias incorporar con xito un plsmido.
[Por qu un golpe de calor hace que las bacterias tomen el ADN?]

^1start superscript, 1, end superscript

Tpicamente, los plsmidos contienen un gen de

resistencia a antibiticos que permite a las bacterias
sobrevivir en presencia de un antibitico especfico. As,
las bacterias que incorporan el plsmido
pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que
contenga el antibitico. Las bacterias sin plsmido
morirn, mientras que las bacterias que contienen
plsmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria
sobreviviente dar lugar a un pequeo grupo con forma
de punto, o colonia, de bacterias idnticas que contienen
el mismo plsmido.

Panel de la izquierda: diagrama de un plsmido que

contiene un gen de resistencia a antibiticos.

Panel de la derecha: todas las bacterias de la

transformacin se colocan en una placa con antibiticos.
Las bacterias sin plsmido mueren a causa del antibitico.
Cada bacteria que tenga plsmido forma una colonia, un
grupo de bacterias clonales que contienen el mismo
plsmido. Una colonia tpica se ve como un punto
pequeo y blanquecino del tamao de una cabeza de
alfiler.
No necesariamente todas las colonias contendrn el
plsmido adecuado. Eso es porque, durante una ligacin,
los fragmentos de ADN no siempre se "pegan"
exactamente como queremos. Por el contrario, debemos
recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una
contiene el plsmido correcto. Se usan mtodos como
la digestin con enzimas de restriccin y la PCR para
revisar los plsmidos.

3. Produccin de protenas
Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias
con el plsmido adecuado, podemos hacer crecer un gran
cultivo de bacterias que contengan el plsmido. Luego le
damos a las bacterias una seal qumica que les ordena
producir la protena blanco.

Las bacterias sirven como "fbricas" miniatura que

producen grandes cantidades de protena. Por ejemplo, si
nuestro plsmido contuviera el gen de la insulina humana,
las bacterias comenzaran a transcribir el gen y traducir el
ARNm para producir muchas molculas de la protena de
la insulina humana.
[Ms acerca de la expresin de genes humanos en bacterias]
 La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un
matraz de 1 litro, por ejemplo). Se induce la expresin del
gen contenido en el plsmido en las bacterias de ese
cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y
el ARNm se traduce en protena. La protena codificada
por el gen se acumula dentro de las bacterias.
 Una vez que se ha producido la protena, las clulas
bacterianas pueden romperse para liberarla. Hay muchas
otras protenas y macromolculas flotando en las
bacterias adems de la protena blanco (la insulina en
nuestro ejemplo). Debido a esto, la protena blanco debe
ser purificada o separada del resto del contenido de las
clulas con tcnicas bioqumicas. La protena purificada
puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la
insulina, administrarse a pacientes.
[Realmente es tan simple hacer insulina?]

Usos de la clonacin de ADN

Las molculas de ADN construidas mediante tcnicas de
clonacin se utilizan para muchos fines en la biologa
molecular. Una breve lista de ejemplos incluye:

Productos biofarmacuticos. La clonacin de ADN

puede utilizarse para producir protenas humanas con
aplicaciones biomdicas, como la insulina mencionada
anteriormente. Otros ejemplos de protenas
recombinantes incluyen la hormona del crecimiento
humana, que se administra a pacientes que son incapaces
de sintetizarla, y el activador tisular del plasmingeno
(tPA), que se utiliza para tratar infartos y prevenir
cogulos sanguneos. Protenas recombinantes como
estas suelen producirse en bacterias.

Terapia gnica. En algunas transtornos genticos,

los pacientes carecen de la forma funcional de un gen en
 particular. La terapia gnica intenta proporcionar una
copia normal del gen a las clulas del cuerpo del paciente.
Por ejemplo, la clonacin de ADN se utiliz para construir
plsmidos que contuvieran una versin normal del gen
que falla en la fibrosis qustica. Cuando se suministraban
los plsmidos a los pulmones de pacientes con fibrosis
qustica, la funcin pulmonar se deterioraba ms
lentamente^22start superscript, 2, end superscript.

Anlisis gentico. En laboratorios de bsica

investigacin, los bilogos suelen usar la clonacin de
ADN para crear versiones recombinantes artificiales de
genes que les ayudan a entender cmo funcionan los
genes normales de un organismo.
[Mira un ejemplo.]

Estos son solo algunos ejemplos de cmo hoy en da se

utiliza la clonacin de ADN en la biologa. La clonacin de
ADN es una tcnica muy comn que se utiliza en una gran
variedad de aplicaciones de la biologa molecular.

Puntos ms importantes:
Las enzimas de restriccin son enzimas que cortan
ADN. Cada enzima reconoce una o un nmero pequeo de
secuencias blanco y corta el ADN en o cerca de esas
secuencias.

Muchas enzimas de restriccin hacen cortes

escalonados que producen extremos sobresalientes de
 ADN de cadena sencilla. Sin embargo, algunos producen
extremos romos.

La ADN ligasa es una enzima que une ADN. Si dos

fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, la
ligasa puede unirlos para formar una molcula nica e
intacta de ADN.

En la clonacin de ADN, se utilizan enzimas de

restriccin y ADN ligasa para insertar genes y otros
fragmentos de ADN en plsmidos.

Cmo se corta y pega el ADN?

En la clonacin de ADN de ADN, los investigadores hacen
muchas copias de un fragmento de ADN especfico, como
un gen. En muchos casos, la clonacin consiste en
introducir el gen en un fragmento de ADN circular
llamado plsmido que puede copiarse en bacterias.

Cmo se pueden unir fragmentos de ADN de diferentes

fuentes (como un gen humano y un plsmido bacteriano)
para hacer una sola molcula de ADN? Un mtodo comn
utiliza enzimas de restriccin y ADN ligasa.

Una enzima de restriccin es una enzima que

corta ADN y que reconoce sitios especficos en l. Muchas
enzimas de restriccin hacen cortes escalonados en o
cerca de su sitio de reconocimiento y producen extremos
sobresalientes de cadena sencilla.
 Si dos molculas de ADN tienen extremos
complementarios, la enzima ADN ligasa puede unirlos.
La ADN ligasa sella el espacio entre las molculas para
formar un solo fragmento de ADN.

Las enzimas de restriccin y la ADN ligasa se suelen usar

para insertar genes y otros fragmentos de ADN en
plsmidos durante la clonacin de ADN.

Enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin se encuentran en bacterias (y
otros procariontes). Reconocen secuencias especficas de
ADN, llamadas sitios de restriccin, y se unen a ellas.
Cada enzima de restriccin reconoce solo uno o unos
pocos sitios de restriccin. Cuando encuentra su
secuencia blanco, la enzima de restriccin cortar las dos
cadenas de una molcula de ADN. Por lo general, el corte
es en o cerca del sitio de restriccin y ocurre en un patrn
ordenado y predecible.
[Por qu las bacterias tienen enzimas de restriccin?]

Como un ejemplo de cmo una enzima de restriccin

reconoce y corta en una secuencia de ADN, veamos
a EcoRI, una enzima de restriccin de uso comn en el
laboratorio. EcoRI corta en el siguiente sitio:
 5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'

Sitio de EcoRI

Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace

en un patrn muy especfico que produce extremos
sobresalientes de ADN de cadena sencilla:

Una enzima EcoRI se une a un sitio EcoRI en un fragmento

de ADN y hace cortes en ambas cadenas del ADN. El
patrn de corte es:

5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'

De esta manera se produce un extremo de 5'-AATT-3' que

sobresale en cada extremo del ADN cortado.

Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes

complementarias (porque tambin se cort con EcoRI, por
ejemplo), los extremos pueden unirse por
complementariedad de bases. Por esta razn se dice que
las enzimas que dejan extremos de cadena sencilla
producen extremos cohesivos. Los extremos cohesivos
son tiles en la clonacin porque mantienen dos
fragmentos de ADN juntos para que la ADN ligasa los
pueda unir.
No todas las enzimas de restriccin producen extremos
cohesivos. Algunas producen "extremos romos", cortes a
la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de
cadena sencilla. La enzima de restriccin SmaI es un
ejemplo de enzima que corta as:

La enzima SmaI se une aI sitio de restriccin de SmaI ,

que es:

5'-...CCCGGG...-3' 3'-...GGGCCC...5'

La enzima corta en medio de esta secuencia en ambas

cadenas y produce extremos romos. Los sitios de corte
son:

5'-...CCC|GGG...-3' 3'-...GGG|CCC...5'

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre s. Sin

embargo, es ms difcil ligar fragmentos romos (la
reaccin de ligacin es menos eficiente y es ms probable
que falle) porque no hay secuencias sobresalientes de
cadena sencilla que sostengan a las molculas de ADN en
su posicin.
[Por qu las enzimas de restriccin tienen esos nombres tan raros?]

3,3, comma000000
 5GAATTC33 5GAATTC33
CTTAAG3 CTTAAG3
5GGATCC33 5GGATCC33
CCTAGG3 CCTAGG3
5AAGCTT33 5AAGCTT33
TTCGAA5 TTCGAA5
5CCCGGG33 5CCCGGG33
GGGCCC5 GGGCCC5
5GAGCTC33 5GAGCTC33
CTCGAG5 CTCGAG5

La ADN ligasa
Si ya conoces la replicacin del ADN, tal vez ya te hayas
encontrado con la ADN ligasa. En la replicacin del ADN,
el trabajo de la ADN ligasa es unir fragmentos de ADN
recin sintetizados para formar una cadena continua. Las
ligasas utilizadas en la clonacin de ADN hacen
bsicamente lo mismo. Si dos fragmentos de ADN tienen
extremos complementarios, la ADN ligasa puede unirlos
para formar una molcula sin interrupciones.
 Fragmento de ADN 1:

5'-...G 3'-...CTTAA

Fragmento de ADN 2:

AATTC...-3' G...-5'

Las regiones de cadena sencilla de las dos molculas

pueden unirse por puentes de hidrgeno, pero an hay
huecos en el esqueleto:

5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'

La ADN ligasa sella los huecos para producir una molcula

de ADN intacta:

5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'

Cmo logra esto la ADN ligasa? Mediante el uso de ATP

como fuente de energa, la ligasa cataliza una reaccin en
la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de
ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra
cadena. Esta reaccin produce un esqueleto de azcar-
fosfato intacto.
Ejemplo: construccin de un
plsmido recombinante
Vamos a ver cmo la digestin con enzimas de restriccin
y la ligacin pueden utilizarse para insertar un gen en un
plsmido. Supongamos que tenemos un gen blanco,
flanqueado por los sitios que reconoce EcoRI, y un
plsmido que contiene un solo sitio de EcoRI:

Comenzamos con un gen blanco y un plsmido circular. El

gen blanco tiene dos sitios de restriccin para EcoRI cerca
de sus extremos. El plsmido tiene un sitio para EcoRI
justo despus de un promotor que estimula la expresin
en bacterias. La secuencia de los sitios de EcoRI es:

5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'

Nuestro objetivo es utilizar la enzima EcoRI para insertar

el gen en el plsmido. Primero, digerimos (cortamos) por
separado con EcoRI el fragmento del gen y el plsmido.
Este paso produce fragmentos con extremos cohesivos:

Por separado, digerimos (cortamos) con EcoRI el

fragmento del gen y el plsmido. Este paso produce
fragmentos con extremos cohesivos. Todos los extremos
tienen un extremo sobresaliente de cuatro nucletidos con
la secuencia 5'-AATT-3'. Eso es porque el patrn de corte
de EcoRI es:

5'-G|AATTC-3' 3'-CTTAA|G-5'

A continuacin, tomamos el fragmento del gen y el

plsmido linearizado (abierto) y los combinamos con ADN
ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se
unen por apareamiento complementario de bases:
 Ahora, tomamos el fragmento del gen y el plsmido
linearizado (abierto) y los combinamos con ADN ligasa.
Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por
apareamiento complementario de bases. Sin embargo,
todava existen huecos en el esqueleto de azcar-fosfato
de la doble hlice del ADN en los sitios de unin entre el
gen y ADN del plsmido.

Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se

convierten en un solo fragmento de ADN sin
interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el
plsmido y tenemos un plsmido recombinante.
 Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se
convierten en un solo fragmento de ADN sin
interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el
plsmido y tenemos un plsmido recombinante. En el
plsmido, el gen ahora est flanqueado por dos sitios
de EcoRI que se generaron cuando los extremos cortados
se ligaron entre s.

En la digestin con enzimas de

restriccin y la ligacin participan
muchas molculas de ADN
En el ejemplo anterior, vimos un resultado de la ligacin
entre un gen y un plsmido con EcoRI. Sin embargo, en
esta misma reaccin de ligacin podran ocurrir otros
resultados. Por ejemplo, el plsmido cortado podra
recircularizarse (cerrarse en su estado original) sin
incorporar el gen. Asimismo, el gen podra entrar al
plsmido, pero en direccin contraria (puesto que sus dos
extremos cohesivos de EcoRI son idnticos).

Izquierda: plsmido recombinante producido cuando el

gen entra en sentido hacia adelante ("apuntando" en la
direccin del promotor que se encuentra en el plsmido).

Centro: plsmido no recombinante que se produce cuando

el plsmido cortado simplemente se vuelve a cerrar (sus
extremos se ligan entre s).

Derecha: plsmido recombinante producido cuando el gen

entra en sentido inverso ("apuntando" en direccin
contraria al promotor que se encuentra en el plsmido).

La digestin con enzimas de restriccin y la ligacin como

esta se realiza con muchas copias de ADN del plsmido y
del gen. De hecho, en una sola ligacin se utilizan miles
de millones de molculas de ADN! Todas estas molculas
 estn chocando entre s y con la ADN ligasa al azar y de
diferentes maneras. Por lo tanto, si es posible formar
varios productos, todos se producirn con cierta
frecuencia, incluyendo los que no queremos.

Cmo podemos evitar plsmidos "malos"?

Cuando transformamos bacteriascon el ADN de una
ligacin, cada una toma un fragmento diferente de ADN.
Despus de la transformacin, podemos revisar las
bacterias y usar solo aquellas que tengan el plsmido
correcto. En muchos casos, el plsmido de las bacterias
transformadas se analiza mediante otra digestin con
enzimas de restriccin para ver si contienen el inserto
correcto en la orientacin correcta.

Puntos ms importantes:
Las bacterias pueden recolectar ADN de otros
organismos en un proceso llamado transformacin.
La transformacin es un paso clave en la clonacin
de ADN. Ocurre despus de los tratamientos de digestin
con enzimas de restriccin y ligacin y transfiere
plsmidos recin hechos a las bacterias.
Despus de la transformacin, las bacterias
se seleccionan en placas con antibiticos. Las bacterias
con un plsmido son resistentes a los antibiticos y cada
una formar una colonia.
Las colonias con el plsmido adecuado pueden
cultivarse para producir grandes cultivos de bacterias
idnticas que se utilizan para producir plsmido o hacer
protena.

Visin general: la clonacin de

ADN
La transformacin y la seleccin de bacterias son pasos
clave en la clonacin de ADN. La clonacin de ADN es el
proceso de hacer muchas copias de un fragmento de ADN
especfico, como un gen. Con frecuencia, las copias se
hacen en bacterias.

En un experimento de clonacin tpico, los investigadores

primero insertan un fragmento de ADN especfico, como
un gen, en otro fragmento circular de ADN llamado
plsmido. Este paso usa enzimas de restriccin y ADN
ligasa, y se llama ligacin.

Despus de una ligacin, el siguiente paso es transferir el

ADN a las bacterias en un proceso
llamado transformacin. Luego, podemos utilizar
una seleccincon antibiticos y mtodos de anlisis de
ADN para identificar las bacterias que contienen el
plsmido que estamos buscando.

Los pasos de la transformacin y

la seleccin bacteriana
 Este es un procedimiento tpico para la transformacin y
seleccin de bacterias:

1. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con

ADN (de una ligacin, por ejemplo).
 2. Se aplica un choque de calor a las bacterias que las
"convence" de recolectar el plsmido. La mayora de las
bacterias no recolecta plsmido, pero algunas s lo hacen.
3. Los plsmidos que se usan en la clonacin contienen
un gen de resistencia a antibiticos. Por lo tanto, todas las
bacterias se colocan en una placa con antibiticos para
seleccionar las que recolectaron plsmido.
4. Las bacterias sin plsmido mueren. Cada
bacteria conplsmido da lugar a una comunidad de
bacterias idnticas que contiene el plsmido
llamada colonia. Una colonia tpica se ve como un
pequeo punto blanquecino del tamao de una cabeza de
alfiler.
5. Varias colonias se analizan para identificar una con el
plsmido adecuado.
6. Una colonia que contenga el plsmido adecuado se
deja crecer a mayor escala y se utiliza para producir
protena o plsmido.
1. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con
ADN (de una ligacin, por ejemplo).
2. Se aplica un choque de calor a las bacterias lo que
provoca que algunas recolecten el plsmido.
[Cmo funciona eso?]

3. Los plsmidos que se usan en la clonacin contienen

un gen de resistencia a antibiticos. Por lo tanto, todas las
bacterias se colocan en una placa con antibiticos para
seleccionar las que recolectaron plsmido.
Diagrama de un plsmido. El plsmido contiene un gen de
resistencia a antibiticos, un promotor para estimular la
expresin gnica en las bacterias y el gen blanco que se
insert durante la ligacin.
4. Las bacterias sin plsmido mueren. Cada
bacteria con plsmido da lugar a una colonia o
comunidad de bacterias idnticas que contiene el
plsmido.
5. Varias colonias se analizan para identificar una con el
plsmido adecuado (por PCR o con enzimas de restriccin,
por ejemplo).
6. Una colonia que contenga el plsmido adecuado se
deja crecer a mayor escala y se utiliza para producir
protena o plsmido.

Por qu necesitamos analizar las

colonias?
Todas las bacterias que forman colonias deberan
contener un plsmido (que proporciona resistencia a los
antibiticos). Sin embargo, no necesariamente es el caso
que todas las colonias que contienen plsmidos tendrn
el mismoplsmido.

Cmo es que pasa eso? Al cortar y pegar ADN, es posible

la formacin de productos secundarios adems del
plsmido que se pretende construir. Por ejemplo, al tratar
de insertar un gen en un plsmido con una enzima de
restriccin en particular, puede haber casos donde el
plsmido se cierra en su forma original (sin incorporar el
gen) o casos donde el gen est en direccin inversa.
 Izquierda: el gen entra al plsmido en sentido hacia
adelante (apuntando en la misma direccin que la
secuencia del promotor). Este es el plsmido deseado de
la ligacin.

Centro: el plsmido se cierra sin incorporar el gen. Este no

es un plsmido til.

Derecha: el gen entra al plsmido en sentido inverso

(apuntando hacia la secuencia del promotor). Este no es
un plsmido til si queremos expresar el gen en bacterias.
[Explicacin ms detallada]
 Starting materials:

Target gene digested at both ends with a particular

restriction enzyme.
Plasmid cut with the same restriction enzyme at a
site following a promoter for bacterial expression. The
promoter "points" towards the right, meaning that it will
drive transcription of the DNA sequence that lies to the
right.
What we want to get is:

A recombinant plasmid where the target gene is

inserted after the promoter, pointing in the forward
direction (oriented so that it's transcribed to make an
mRNA that specified the desired protein).
 Left: gene goes into plasmid forwards (pointing in the
same direction as the promoter sequence). This is the
desired plasmid from the ligation.

Middle: plasmid closes back up without taking in the gene.

This is not a useful plasmid.

Right: gene goes into plasmid backwards (pointing back

towards the promoter sequence). This is not a useful
plasmid if we want to express the gene in bacteria.

Qu importa si un gen entra al revs en el plsmido? En

algunos casos, no importa. Sin embargo, si queremos
expresar el gen en las bacterias para producir una
protena, el gen debe apuntar en la direccin correcta en
relacin al promotor, o la secuencia control que induce la
expresin gnica. Si el gen estuviera al revs, se
transcribira la cadena equivocada de ADN y no se
producira ninguna protena.
Debido a estas posibilidades, es importante recolectar
ADN plasmdico de cada colonia y comprobar si coincide
con el plsmido que intentbamos construir. Para analizar
el ADN plasmdico de colonias bacterianas, se utiliza
digestin con enzimas de restriccin, PCR y secuenciacin
de ADN.

Produccin de protenas en
bacterias
Supongamos que identificamos una colonia con un
plsmido "bueno". Qu sigue? Qu sentido tiene
transformar, seleccionar y analizar?

Posibilidad 1: bacterias = fbricas

de plsmido
En algunos casos, las bacterias simplemente se utilizan
como "fbricas de plsmido" para hacer una gran
cantidad de ADN plasmdico. El ADN plasmdico se puede
utilizar en pasos posteriores de clonacin de ADN (por
ejemplo, para construir plsmidos ms complejos) o en
diversos tipos de experimentos.

En algunos casos, los plsmidos tienen aplicaciones

prcticas directas. Por ejemplo, recientemente en un
ensayo clnico de terapia gnica para pacientes con el
trastorno gentico fibrosis qustica, se utilizaron plsmidos
para administrar un gen humano en tejido pulmonar^11
start superscript, 1, end superscript.

Posibilidad 2: bacterias = fbricas

de protena
En otros casos, las bacterias se pueden utilizar como
fbricas de protenas. Si un plsmido contiene las
secuencias de control adecuadas, se puede inducir a las
bacterias a expresar el gen que contienen al agregar una
seal qumica. La expresin del gen conduce a la
produccin de ARNm que se traduce en protena. Luego,
las bacterias pueden lisarse (reventarse) para liberar la
protena.

La colonia elegida crece en un cultivo grande. Se induce la

expresin del gen blanco en las bacterias de ese cultivo
mediante la adicin de una seal qumica al medio de
 cultivo. Dentro de cada bacteria, el gen blanco se
transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en protena. La
protena codificada por el gen blanco se acumula dentro
de las bacterias.

Las bacterias contienen muchas protenas y

macromolculas. Debido a esto, la protena recin hecha
se debe purificar (separar de las dems protenas y
macromolculas) antes de poder utilizarla. Hay una
variedad de tcnicas diferentes que se usan para purificar
protenas.

Las clulas que fabricaron protena se revientan (lisan) y

liberan la protena y otros contenidos celulares. Las
molculas extradas de las clulas se aplican a una
columna que contiene anticuerpos especficos para la
 protena blanco. As, la columna retiene la protena y deja
pasar las dems molculas de la bacteria. En el ltimo
paso, despus de que todas las protenas que no nos
interesan se han lavado, las protenas blanco se liberan de
los anticuerpos de la columna y se recolecta la protena
pura para su uso.

En una tcnica llamada cromatografa de afinidad, una

mezcla de molculas extradas de las bacterias lisadas
fluye a travs de una columna, un cilindro que contiene
perlas. Las perlas estn recubiertas con un anticuerpo,
una protena del sistema inmunitario que se une
especficamente a una molcula blanco.

El anticuerpo de la columna est diseado para unirse a

nuestra protena de inters y no a cualquier otra molcula
de la mezcla. De esta manera, la columna retiene la
protena de inters, mientras que las otras molculas son
arrastradas por el flujo. En la etapa final, la protena de
inters se libera de la columna y se recolecta para su uso.
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como se producen enzimas y si hay 2 genes inactivos