Informe de PPP 3a

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
BIOTECNOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICAS PREPROFESIONALES III

(Del 27 de abril al 26 de mayo del 2017)
APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CELULOLÍTICAS
AISLADAS DE PILAS DE CASCARILLA DE ARROZ
(Oryza sativa). EN LA EMPRESA INCA'BIOTEC S.A.C.,
TUMBES
Autor:
Eymar Enrrique Correa Valverde
Asesor:
Blgo. Mblgo. José M. Villanueva Carlos
NUEVO CHIMBOTE - PERÚ, 2017

BIOTECNOLOGÍA


TUMBES
Autor:
Revisado y Aprobado por el Asesor:
…………………………………………..
Blgo. Mblgo. José M. Villanueva Carlos
BIOTECNOLOGÍA


TUMBES
Autor:
Revisado y Aprobado por el Jurado Evaluador:
…………………………
Dr. Carlos Azañero Díaz
Presidente
............................................. ……................................
M. Sc. Willian Capa Robles Dr. Walter Reyes Ávalos
Integrante Integrante
DEDICATORIA
A mis padres Dorotea y

Santiago.
A toda mi familia por

todo su amor, apoyo y
enseñanzas.
A todas las personas que

han contribuido en mi formación,
desarrollo académico,
profesional y humano.
i
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por esta bendición.
A Eric Mialhe, Ph.D., gerente general de INCA'BIOTEC S.A.C., por brindarme la

oportunidad para desarrollar mis habilidades y ampliar mis conocimientos en el campo
de la Biotecnología.
A todos mis compañeros y compañeras que laboran en la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.,

técnicos, compañeros (as) practicantes, tesistas y maestrantes, por los gratos momentos
compartidos dentro y fuera de los laboratorios.
A Melitza, Jimmy, Karina y Tatiana. Compañeros de investigación por su amistad,

enseñanzas y momentos compartidos.
Al profesor José Villanueva Carlos, por su asesoramiento en la redacción de este informe.
A mi familia por todo su cariño, apoyo y comprensión brindado durante el tiempo de

labores y aprendizaje. Y a Alisson por estar conmigo en los momentos difíciles.
ii
PRESENTACIÓN
Dando cumplimiento a lo dispuesto en el reglamento de Prácticas Preprofesionales de la

Escuela Académico Profesional de Biotecnología de la Universidad Nacional del Santa
para optar el grado académico de Bachiller en Biotecnología, presento ante ustedes
señores miembros del Jurado Evaluador el presente informe correspondiente a las
Prácticas Preprofesionales III, titulada: “Aplicación de técnicas moleculares para la
identificación de bacterias celulolíticas aisladas de pilas de cascarilla de arroz (Oryza
sativa). En la Empresa INCA'BIOTEC S.A.C., Tumbes”, realizado en el período
comprendido del 26 de abril al 27 de mayo del 2017.
El presente informe está basado en una serie de experiencias y conocimientos adquiridos

durante el desarrollo de las prácticas preprofesionales III en el que se plasma la
descripción de procedimientos realizados para aplicar técnicas moleculares en bacterias
celulolíticas aisladas de la base de pilas de cascarilla de arroz.
Con la satisfacción de haber cumplido con los objetivos trazados someto a vuestra
consideración el presente informe.
Correa Valverde Eymar Enrrique
iii
ÍNDICE
DEDICATORIA ________________________________________ ______________ i

AGRADECIMIENTO ____________________________________ _____________ ii
PRESENTACIÓN________________________________________ __________iii
ÍNDICE ____________________________________________________ ____ __ _iv
INDICE DE TABLAS __________________________________________ _______ vii
INDICE DE FIGURAS __________________________________________ _____ viii
I. INTRODUCCIÓN ____________________________________________ ______ 1
II. OBJETIVOS_____________________________________________ ____ ______ 3
2.1 Objetivos generales ___________________________________ _____ _____ 3
2.2 Objetivos específicos__________________________________ ______ ____ 3
III. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL CENTRO DE PRÁCTICAS _________ __ _ 4
3.1 Generalidades del centro de prácticas ________________ ____________ __ 4
3.2 Objetivo__________________________________________________ ___ _ 4
3.3 Ubicación geográfica ____________________________________ _____ 4
3.4 Estructura organizacional 5
3.5 Servicios___________________________________________________-___ 5
a) Diagnóstico de enfermedades ___________ _______________________5
b) Mejoramiento Genético e Inmunología __ _______________________ 6
c) Identificación y caracterización molecular de microorganismos _ ______ 6
IV. DESCRIPCIÓN DE LA CASCARILLA DE ARROZ Y BACTERIAS
CELULOLÍTICAS ______________________ __________ _____ _ 7
4.1 Arroz 7
4.2 Producción de arroz con cáscara en el Perú 7
4.3 Residuos generados en la producción de arroz 8
4.4 Composición de la cascarilla de arroz 9
4.5 Usos de la cascarilla de arroz 9
4.6 Celulosa 9
4.7 Celulasas 10
4.8 Bacterias celulolíticas 11
4.9 Fuentes de biomasa lignocelulósica 11
V. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA _____________________________ ______ 12
5.1 Recolección de las muestras ______________________________ ___ ______ 12
iv
5.2 Preparación de muestra estándar de la base de PCA _____________________ 12
5.3 Preparación de medio de cultivo para bacterias presentes en la base de PCA 13
5.4 Preparación de diluciones seriadas para el aislamiento de bacterias presentes
en la muestra patrón de la base de PCA ______________ ___ __ 13
5.5 Análisis morfológico y bioquímico de bacterias aisladas de PCA usando
microscopía 16
5.6 Determinación del índice de actividad enzimática (IAE) de bacterias
aisladas de la base de PCA 18
5.7 Conservación de bacterias celulolíticas aisladas de la base de PCA 22
5.8 Extracción de ADN genómico bacteriano 23
5.9 Cuantificación de ADN genómico bacteriano_____ ________________ ____ 23
5.10 Amplificación del gen del ARNr 16s mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) 26
5.11. Separación de amplicones mediante electroforesis ___________ ___28
VI. CONCLUSIONES ______________________________________________ _ _32
VII. RECOMENDACIONES ____________________________________________ 32
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________________________ 33
IX. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN 40
9.1 GENERALIDADES____ _ 40
9.1.1 Título 40
9.1.2 Personal investigador 40
9.1.3 Tipo de investigación 40
9.1.4 Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto 40
9.1.5 Cronograma de trabajo 41
9.1.6 Recursos 41
9.1.7 Presupuesto 42
9.2 PLAN DE INVESTIGACIÓN _______________________________________ _ 43
9.2.1 Antecedentes_________________________________________________ _ 43
9.2.2 Justificación del problema ________________________________________ 45
9.2.3 Importancia ______________________________________________ ____ 46
9.2.4 Objetivos __________________________________________________ __ 46
9.2.4.1 Objetivo general 46
9.4.2.2 Objetivos específicos 47
9.2.5 Hipótesis
v
9.2.6 Diseño experimental ____________________________________ 47
9.2.7 Estrategia de trabajo ___________________________________________ _ 47
9.2.7.1 Población 47
9.2.7.2 Muestra 48
9.2.7.3 Unidad de análisis 48
9.2.7.4 Recolección de muestras 48
9.2.7.5 Preparación de muestra estándar de gabazo de caña de azúcar 48
9.2.7.6 Obtención de esporas 48
9.2.7.7 Diluciones decimales 49
9.2.7.8 Acondicionamiento de la fuente de carbono lignocelulósica 49
9.2.7.9 Preparación del medio de cultivo para el aislamiento de hongos
filamentosos con capacidad lignocelulolítica 49
9.2.7.10 Aislamiento de hongos filamentosos 49
9.2.7.11 Obtención de cultivos puros de hongos filamentosos con capacidad
lignocelulolítica 49
9.2.7.12 Producción de celulasas por hongos filamentosos con capacidad
lignocelulolítica 50
9.2.7.13 Obtención del extracto enzimático 50
9.2.7.14 Determinación de la actividad celulasa total 50
9.2.7.15 Extracción de ADN genómico de hongos filamentosos
lignocelulolíticos 51
9.2.7.16 Cuantificación de ADN genómico hongos filamentosos
lignocelulolíticos 51
9.2.7.17 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 52
9.2.7.18 Separación de amplicones por electroforesis 52
9.2.7.19 Secuenciación 52
9.2.7.20 Identificación molecular de hongos filamentosos lignocelulolíticos
(Análisis bioinformático) 53
9.2.7.21 Análisis estadístico 53
9.2.8 Referencias Bibliográficas ________________________________________ 54
vi
INDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Principales regiones del Perú productoras de arroz con cáscara. 7
Tabla 2. Bacterias aisladas de la base de PCA en medio TSA. 15
Tabla 3. Tinción Gram de bacterias aisladas a partir de suelo de PCA. 17
Tabla 4. Composición del medio de cultivo. 18
Tabla 5. Índice de actividad enzimática de bacterias aisladas de la base de PCA. 20
Tabla 6. Características del ADN genómico extraído. 24
Tabla 7. Ratios de pureza del ADN. 25
Tabla 8. Componentes y volúmenes del Mix de la PCR para amplificar el gen
del ARNr 16S. 26
Tabla 9. Perfil térmico para amplificar el gen del ARNr 16S mediante la PCR. 27
Tabla 10. Concentración de agarosa para la separación de fragmentos de ADN. 29
Tabla 11. Diluciones de los productos de PCR del gen del ARNr 16S de
bacterias y códigos utilizados para el secuenciamiento de las muestras. 30
vii
INDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Mapa de la ubicación geográfica de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C. 4
Figura 2. Organigrama de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C. 5
Figura 3. Partes de la planta de arroz. 8
Figura 4. Estructura química de la celulosa. 9
Figura 5. Estructura de la celulosa en su forma natural. 9
Figura 6. Hidrólisis de la celulosa. 10
Figura 7. Recolección de muestra de PCA. 12
Figura 8. Preparación de muestra estándar de la base de PCA. 12
Figura 9. Vertido de medio de cultivo TSA en el interior de la cabina de flujo

laminar. 13
Figura 10. Diluciones seriadas de la base de PCA. 13
Figura 11. Siembra de bacterias por esparcimiento en superficie de cultivo. 14
Figura 12. Numeración de colonias bacterianas de muestra de la base de PCA

con diferente morfología. 14
Figura. 13. Aislamiento por estrías en superficie. 15
Figura 14. Colonia bacteriana aislada de la base de PCA indicando sus

características morfológicas. 15
Figura 15. Tinción Gram de la cepa B18. Observación 100X. 16
Figura 16. Reactivos para el ensayo de degradación de Carboximetilcelulosa. 19
Figura 17. Determinación del IAE. 19
Figura 18. Programación del termociclador. 26
Figura 19. Electroforesis con muestras de ADN productos de PCR del gen
del ARNr 16S, ADN de bacterias aisladas de la base de PCA. 28
viii
I. INTRODUCCIÓN
La biotecnología ambiental integra un conjunto de actividades tecnológicas que permiten

comprender y gestionar sistemas biológicos (microorganismos y plantas) con el fin de
proveer a la sociedad productos y servicios que contribuyan a proteger y restaurar la
calidad del medio ambiente (Blanch, 2010). Una de sus principales áreas de aplicación
está orientada a la valorización de residuos lignocelulósicos agrícolas y agroindustriales
(Arora et al., 2002; García, 2013; Rajeev & Amit, 2016).
En el Perú, se generan diariamente grandes volúmenes de residuos lignocelulósicos

agrícolas y agroindustriales que no reciben tratamiento, ni mucho menos se les brinda un
valor agregado. Dentro de estos residuos se encuentran la coronta del maíz amarillo,
restos de caña de azúcar, la cascarilla de arroz, la broza del pimiento, broza de la alcachofa
y broza del espárrago (Bardales et al., 2015).
La cascarilla de arroz en el Perú se produce en grandes cantidades durante el proceso de

pilado lo que genera un costo de almacenamiento o quema, sobre todo por parte de
pequeños productores (Camus et al., 2014). Según el MINAGRI (2017) entre enero y
diciembre del 2016, en el Perú se generaron 624 820 TM de cascarilla de arroz, 45 500
TM más que en el 2015, donde se generaron 579 320 TM.
Saha & Cotta (2008), Nichols et al. (2014), Bardales et al. (2015) afirman que la cascarilla
de arroz es un residuo lignocelulósico que tiene poco uso comercial, pero que, puede ser
utilizado como materia prima para la elaboración de bioetanol, abono de suelos (García,
2013), entre otros productos biotecnológicos.
Parte de las investigaciones sobre cascarilla de arroz están enfocadas en descubrir

tratamientos físicos, químicos y/o biológicos que faciliten su degradación y
aprovechamiento en otros procesos (Saha & Cotta, 2008). Otras investigaciones están
enfocadas en utilizar la cascarilla de arroz como sustrato para la producción de enzimas
celulolíticas (Lee et al., 2008). Sin embargo, poco se ha trabajado en el aislamiento y
aprovechamiento de los diversos microorganismos tales como bacterias, actinomicetos y
hongos encontrados en la base de pilas de cascarilla de arroz (Pérez et al., 2011).
1
El uso del ARNr 16S como marcador molecular en la identificación de bacterias, estudio
de filogenia bacteriana y taxonomía ha sido el más usado por una serie de razones. Estas
razones incluyen: a) Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias
actuales. Constituye, por tanto, una diana universal para su identificación. b) Su estructura
y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que
las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios. c) Los
cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar información no sólo
los organismos más alejados, sino también los más próximos. d) El tamaño relativamente
largo de los ARNr 16S (1.500 nucleótidos) minimiza las fluctuaciones estadísticas. e) La
conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones,
aportando una base para el alineamiento preciso. f) Dado que resulta relativamente fácil
secuenciar los ARNr 16S existen bases de datos amplias, en continuo crecimiento
(Rodicio & Mendoza, 2004).
En el presente informe de prácticas se presentan las actividades realizadas para el

aislamiento de bacterias de la base de pilas de cascarilla de arroz, purificación de colonias,
ensayos de degradación de celulosa y aplicación de técnicas que faciliten su identificación
molecular en la empresa INCA'BIOTEC S.A.C., Tumbes. Empresa dedicada a la
investigación en el campo de la biotecnología molecular con aplicación en el sector
acuícola, agrícola, agroalimenticio y ambiental.
2
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
 Reforzar y complementar los conocimientos teóricos y prácticos adquiridos

durante la formación académica profesional, con la finalidad de dar solución a
situaciones y problemas concretos de la empresa INCA´Biotec S.A.C., en
temas relacionados con la biotecnología ambiental.
 Aplicar técnicas moleculares en bacterias celulolíticas aisladas de pilas de

cascarilla de arroz.
2.2. Objetivos específicos
 Participar activamente en el desarrollo de la práctica preprofesional III.

 Identificar un tema aún no abordado en la empresa e implementar un proyecto
de investigación para solucionarlo.
 Aislar bacterias celulolíticas a partir de la base de pilas de cascarilla de arroz.
 Extraer, purificar y cuantificar ADN genómico de bacterias celulolíticas
aisladas de la base de pilas de cascarilla de arroz.
 Amplificar el gen que codifica el ARN ribosomal 16S (ARNr 16S), mediante
la reacción en cadena de la polimerasa.
 Separar mediante electroforesis los amplicones de ADN de bacterias aisladas
de la base de pilas de cascarilla de arroz.
3
III. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL CENTRO DE PRÁCTICAS
3.1. Generalidades del centro de prácticas
INCA'BIOTEC S.A.C., es una empresa peruana de biotecnología molecular

especializada en los sectores acuícola, agrícola, agroalimenticio y ambiental.
INCA'BIOTEC S.A.C., desarrolla actividades dentro del ámbito de la genética,
patología, microbiología, e inmunología, a través de la aplicación de técnicas modernas
de biología molecular e ingeniería genética.
3.2. Objetivo
Proveer asistencia científica y técnica a empresas e instituciones, peruanas y extranjeras,

públicas y privadas, para la concepción y puesta en marcha de programas de
investigación, servicios, productos y tecnología de punta adaptados a las necesidades de
cada cliente.
3.3. Ubicación geográfica
La empresa INCA'BIOTEC S.A.C. se encuentra ubicada en el departamento de Tumbes,

ciudad de Tumbes, Jr. Filipinas N° 212 (Fig. 1).
Jr. Filipinas N° 212, Tumbes
Figura 1. Mapa de la ubicación geográfica de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C. Fuente: Google maps
(2017).
4
3.4. Estructura organizacional
La empresa INCA'BIOTEC S.A.C., está integrada por un gerente general, un

coordinador de investigación, un personal de administración, técnicos de laboratorio,
tesistas, practicantes, personal de mantenimiento y personal de limpieza (Fig. 2).
Gerente General
Coordinador de Administración
investigación
Técnicos d e Tesistas Personal de Personal de

Laboratorio mantenimiento limpieza
Practicantes
Figura 2. Organigrama de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.
3.5. Servicios
a) Diagnóstico de enfermedades
Servicio de diagnóstico para múltiples patógenos, caracterización de genes de

toxinas y de resistencia. Realizan estudios de epidemiología descriptiva y
analítica según las necesidades y productos cultivados por los clientes
(modalidades de transmisión y prevención de agentes patógenos).
Utilizan técnicas de biología molecular, las cuales se caracterizan por su alta

especificidad, sensibilidad y rapidez, técnicas basadas en la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR, Nested-PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real) y la Loop-
mediated isothermal amplification (LAMP y RT-LAMP).
Estos diagnósticos incluyen el aislamiento, purificación y análisis molecular de

los agentes etiológicos, extracción de ADN o ARN, concepción y diseño de
primers (iniciadores y sondas moleculares).
5
b) Mejoramiento Genético e Inmunología
INCA'BIOTEC S.A.C., propone programas de asesoría científica y técnica para

la prevención de enfermedades y mejoramiento genético. Es una empresa
especializada en el diseño de estrategias para prevenir enfermedades mediante
la certificación de reproductores e incremento de la resistencia a través de la
selección de sobrevivientes a infecciones experimentales.
La asesoría comprende uno o más componentes según las necesidades de los

clientes. Entre los servicios de asesoría cuentan con:
Establecimiento, control y certificación de animales/plantas libres de patógenos

(líneas puras y/o familias de reproductores).
 Selección de cepas resistentes a patógenos.

 Evaluación de la capacidad inmunitaria de animales (langostinos, peces,
otros) a través de técnicas enzimáticas y moleculares.
 Metodología y aplicación de marcadores genéticos e inmunitarios para
identificar individuos con características de interés.
 Identificación y análisis de la regulación de la expresión de genes
inmunitarios (óxido nítrico sintetasa, hemocianina, dicer, argonauta,
otros) por RT-PCR, Real-Time PCR y microarrays.
 Estudio de los mecanismos de interferencia del ARN (RNAi).
 Desarrollo de vacunas convencionales y vacunas de ADN para peces, y
otros organismos.
 Software multicriterios para el control de reproductores en programas de
mejoramiento genético.
c) Identificación y caracterización molecular de microorganismos
INCA'BIOTEC S.A.C, propone el aislamiento, identificación y caracterización

molecular de cepas de microorganismos beneficiosos (probióticos, simbióticos,
bio-degradadores) en el sector acuícola, agrícola y ambiental.
6
IV. DESCRIPCIÓN DE LA CASCARILLA DE ARROZ, CELULASAS Y
BACTERIAS CELULOLÍTICAS
4.1 Arroz
El arroz (Oryza sativa) es uno de los cereales más importantes en el mundo, pertenece
a la familia de las gramíneas de origen milenario que proviene de las regiones húmedas
de Asia tropical y subtropical. Existen 19 especies del género Oryza, de los cuales Oryza
sativa es el cultivo más utilizado para el consumo humano (Rariz et al., 2012). El grano
de arroz es el tercer grano de cosecha más abundante en el mundo (Nichols et al., 2014).
4.2 Producción de arroz con cáscara en el Perú
Según el MINAGRI (2017), en el Perú, las principales regiones productoras de arroz

con cáscara son la región San Martín, Piura, Lambayeque, Amazonas, La Libertad,
Arequipa, Cajamarca, Tumbes, Loreto y Ancash (Tabla 1).
Tabla 1. Principales regiones del Perú productoras de arroz con cáscara.

Región Producción de cascarilla de arroz (TM)
San Martín 135 220
Amazonas 100 640
La Libertad 88 280
Piura 70 320
Lambayeque 68 900
Arequipa 52 680
Cajamarca 40 060
Tumbes 25 800
Loreto 17 020
Ancash 9 900
Fuente: MINAGRI (2017)
4.3 Residuos generados en la producción de arroz
La producción de arroz trae consigo la generación de residuos lignocelulósicos, como:

raíces, tallos y hojas durante la cosecha ya que de las partes de la planta (Fig. 3), sólo se
recolecta la panícula (Huaraz, 2013).
7
Panícula
Hoja
Tallo
Raíz
Figura 3. Partes de la planta de arroz (Huaraz, 2013).
Durante el proceso de pilado se generan como residuos la cascarilla de arroz, polvillo y

arrocillo (Huaraz, 2013). La cáscara o cascarilla de arroz, es la capa protectora de los
granos de arroz, que constituye del 8-23% del peso seco de los granos de arroz con
cáscara (Lee et al., 2008; Jeon, 2011; Nichols et al., 2014). La cascarilla de arroz es un
material lignocelulósico que se encuentra en abundancia en los países donde el arroz es
un alimento básico para las personas (Economou et al., 2011; Dahui et al., 2014).
La cascarilla de arroz es considerado un material de desecho por su bajo valor como

alimento animal debido a su baja densidad, digestibilidad, tamaño particular y alto
contenido de sílice que lo hace un compuesto abrasivo (Saha & Cotta, 2008; Nichols et
al., 2014), es usualmente desechada y quemada sin tener en cuenta la contaminación
que esto genera en el medio ambiente (Takaku et al., 2006; Gupta et al., 2012).
4.4 Composición de la cascarilla de arroz
La cascarilla de arroz es un material lignocelulósico complejo compuesto por celulosa

(35.62 +/- 0.12%), hemicelulosa (11.96 +/-0.73%), lignina (15.38 +/- 0.2%), y ceniza
(18.71 +/- 0.01%), relación w/w (Jeon, 2011; Nichols et al., 2014; Chun & Tony, 2015).
Posee una estructura granular, es insoluble en agua, tiene estabilidad química, alta
resistencia mecánica y un alto contenido de cenizas (Chuah et al., 2005).
8
4.5 Usos de la cascarilla de arroz
A pesar de contener silicio y cenizas, la cascarilla de arroz contiene una proporción

significante de glicanos, los cuales pueden ser descompuestos en azúcares fermentables
por ácidos y enzimas (Dahui et al., 2014), puede ser utilizada como materia prima para
producir bioenergía (Jeon, 2011; Chun & Tony, 2015), bioetanol (Economou et al.,
2011; Nichols et al., 2014; Bardales et al., 2015), abono de suelos (Takaku et al., 2006;
García, 2013), celulasas (Lee et al., 2008), glucosa y xilosa (Nichols et al., 2014).
4.6 Celulosa
La celulosa es un homopolisacárido compuesto por largas cadenas de moléculas de D-

glucosa unidas por enlaces β-1,4 (Fig. 4) que se ordenan en fibras y paquetes mediante
numerosos enlaces no covalentes de hidrógeno, sin capacidad de degradación
espontánea, estas características la hacen difícilmente degradable (Van Dyck &
Pletschke, 2012). En estado natural, la celulosa tiene regiones cristalinas alternadas con
zonas amorfas, las regiones cristalinas son altamente ordenadas y más resistente a la
degradación enzimática; mientras que las regiones amorfas son poco ordenadas y más
sensibles a la degradación (Guevara & Zambrano, 2006). Ver Fig. 5.
Figura 4. Estructura química de la celulosa (Heldt, 1997).
Figura 5. Estructura de la celulosa en su forma natural (Guevara & Zambrano, 2006).
9
4.7 Celulasas
Las celulasas han experimentado una mayor demanda desde 1995 en varias aplicaciones
industriales como: detergentes, industria textil, alimentación animal e industria
alimentaria, industria papelera e industria de los biocombustibles (Pandey et al., 2017).
Las celulasas son un complejo multienzimático que consiste principalmente en tres

componentes diferentes, endo-1,4-b-D-glucanasa (EC 3.2.1.4), exoglucanasa / exo-
celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) y b-glucosidasa (EC 3.2.1.21). Estas tres enzimas actúan
sinérgicamente para hidrolizar completamente el polímero de celulosa en sus
monómeros de glucosa (Fig. 6). Primero, la endo-1,4-b-D-glucanasa actúa al azar, entre
fibras de celulosa para generar extremos reductores y no reductores, que son atacados
además por exo-celobiohidrolasa, liberando celobiosa (dímeros de glucosa unidos por
enlaces b-1,4 glicosídicos). Finalmente, la celobiosa es hidrolizada por b-glucosidasa en
monómeros de glucosa, el producto final final. (Pandey et al., 2017).
Figura 6. Hidrólisis de la celulosa. (Pandey et al., 2017).
4.8 Bacterias celulolíticas
En las dos últimas décadas, la fermentación en sustrato sólido (SSF) ha atraído la

atención debido a sus grandes ventajas biotecnológicas, tales como: mayor capacidad
de fermentación, mayor estabilidad del producto final, menor represión catabólica y
tecnología rentable (Pandey,1991; Singhania et al., 2010; El-Bakry, 2015). La mayoría
de los microorganismos empleados en la producción de celulasas en SSF son hongos,
10
bacterias y en menor medida actinomicetos (Behera & Ray, 2016). Dentro de las
principales bacterias lignocelulolíticas que se han aislado de diferentes residuos
agroindustriales y seleccionado debido a sus propiedades xilano degradantes, tenemos:
Acidothermus celulolyticus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus pumilus,
Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, etc. (Heck et al., 2005;
Phitsuwan et al., 2013; Juturu & Wu, 2014; El-Bakry, 2015).
4.9 Fuentes de biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica más abundantemente y disponible son los residuos agrícolas

como: paja de trigo y arroz, hoja de maíz, cáscara de cacahuete, fibra de alfalfa, tallos
de algodón, cáscara de arroz, bagazo de caña (Kim et al., 2008; Kumar et al., 2008;
Carvalho et al., 2009; Wang et al., 2009), residuos forestales y residuos urbanos (Arora
et al., 2015).
11
V. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
5.1 Recolección de las muestras
Se recolectó 100 g de muestra de la base de pila de cascarilla de arroz (PCA) del molino
de arroz Paredes (Fig. 7). Ubicado en el centro poblado San Isidro del distrito de
Corrales, Tumbes-Perú.
Figura 7. Recolección de muestra de PCA.
5.2 Preparación de muestra estándar de la base de PCA
En el interior de una cámara de flujo laminar (BIOBASE, BBS-H1300, China) se

preparó una muestra estándar de la base de PCA a partir de las siete muestras de la base
de PCA recolectadas. Para esto se extrajo 10 g de las muestras de la base de PCA de
cada bolsa recolectada, se mezcló y rotuló en una bolsa ziploc estéril (Fig. 8).
Figura 8. Preparación de muestra estándar de la base de PCA. A. Extracción de 10 g de cada bolsa de la

base de PCA; B. Muestra estándar de la base de PCA.
12
5.3 Preparación de medio de cultivo para bacterias presentes en la base de PCA
Primero, se esterilizó la cabina de flujo laminar (BIOBASE, BBS-H1300, China) con

luz UV. Luego, se ingresó los matraces con agar tripticasa de soya (TSA) y placas Petri
estériles. Finalmente, se realizó el vertido de TSA en las placas Petri en el interior de la
cabina de flujo laminar (Fig. 9).
Figura 9. Vertido de medio de cultivo TSA en el interior de la cabina de flujo laminar.
5.4 Preparación de diluciones seriadas para el aislamiento de bacterias presentes

en la muestra patrón de la base de PCA
Se adicionó 1 g de muestra estándar de la base de PCA en un tubo cónico de 50 ml y se

agregó 9 ml de agua destilada estéril, se homogenizó en un agitador de mesa (Vortex
Mixer VX 200) a velocidad media por 2 min (dilución 10 -1). Después se extrajo 100 µl
de la dilución 10-1 y se adicionó en un microtubo de 1.5 ml al cual se le agregó 900 µl
de agua destilada y se homogenizó en el agitador de mesa (dilución 10 -2). Se realizó este
procedimiento sucesivamente hasta obtener las diluciones 10 -5 y 10-6 (Fig. 10).
H2O
Destilada
estéril
9 ml 900µl
1g
100µl
100µl 100µl 100µl 100µl
Base 10-1
de
PCA
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Figura 10. Diluciones seriadas de la base de PCA.

13
Se adicionó 100 µl de las diluciones 10-5 y 10-6 de la muestra estándar de base de PCA
en placas Petri con medio TSA. La siembra se realizó por triplicado y se esparció con
una espátula Drigalski (Fig. 11). Las siembras se realizaron en el interior de una cámara
de flujo laminar (BIOBASE, BBS-H1300, China) y se utilizó una placa con medio TSA
como control. Finalmente, todas las placas fueron incubadas a temperatura ambiente.
Figura 11. Siembra de bacterias por esparcimiento en superficie de cultivo.
Después de 24 h de incubación se observó el crecimiento de las bacterias sembradas a

partir de diluciones 10-5 y 10-6 de muestras de la base de PCA. Se enumeró cada colonia
que presentó una morfología diferente respecto al tamaño, color, forma, borde y
elevación de la colonia (Fig. 12). Cada colonia enumerada fue transferida a otra placa
Petri con medio TSA y aislada por estrías (Fig. 13), el aislamiento por estrías se realizó
en condiciones asépticas y se repitió hasta obtener cultivos puros. Finalmente, todas las
placas se incubaron a temperatura ambiente.
Figura 12. Numeración de colonias bacterianas de muestra de la base de PCA con diferente morfología. A.
Placa control; B. Tres repeticiones de la dilución 10-5; C. Tres repeticiones de la dilución 10 -6.
14
Figura. 13. Aislamiento por estrías en superficie.
En los medios TSA donde se sembraron las diluciones 10 -5 y 10-6 de la muestra de la

base de PCA se aislaron en total 28 colonias (Tabla. 2). Cada colonia presentó una
morfología diferente respecto al tamaño, color, forma, borde y elevación (un ejemplo se
observa en la Fig. 14).
Tabla 2. Bacterias aisladas de la base de PCA en medio TSA.

Muestra Dilución Repetición n° de colonias Colonias Totales
R1 7
10−5 R2 7 22
Base de PCA R3 8
R1 4
10−6 R2 1 6
R3 1
Figura 14. Colonia bacteriana aislada de la base de PCA indicando sus características morfológicas.
Después de obtener colonias bacterianas puras, se sembró una azada de cada una en
1000 µl de caldo Luria Bertani (caldo LB), en microtubos de 1.5 ml, todos los
microtubos se protegieron con parafilm y se incubaron a temperatura ambiente.
15
5.5 Análisis morfológico y bioquímico de bacterias aisladas de la base de PCA
usando miroscopía
Después de 24 h de incubación se observó el crecimiento de las bacterias por turbidez y

se realizó tinción Gram para determinar la pureza de los cultivos. Primero, se adicionó
una asada de cada bacteria cultivada en caldo LB sobre láminas portaobjeto y se fijó por
calor con ayuda de un mechero Bunsen. Luego, se agregó azul violeta, se esperó 1 min
y se lavó suavemente con agua. Después se agregó lugol, se esperó 1 min y se lavó
suavemente con agua. Después se agregó alcohol acetona, se esperó 30 s y se lavó
suavemente con agua. Finalmente se agregó safranina, se esperó 1 min, y se lavó
suavemente con agua.
Las muestras de bacterias con tinción Gram se observaron en un microscopio óptico

compuesto (OLYMPUS CX21, EEUU). Las observaciones se realizaron utilizando los
objetivos de 4X, 10X, 40X y 100X, en este último se utilizó aceite de inmersión. La
observación en el microscopio se realizó con el fin de verificar si los cultivos bacterianos
correspondían a un sólo tipo de bacterias.
Las tinciones en las que se observó un sólo tipo de forma y coloración se registraron
como cultivos puros. En la Tabla 3 se indican los resultados obtenidos de la tinción
Gram (un ejemplo se aprecia en la Fig. 15.)
Figura 15. Tinción Gram de la cepa B18. Observación 100X.
16
Tabla 3. Tinción Gram de las bacterias aisladas de la base de PCA.
Código de la Bacteria Purificada Código Corto Gram
10-5R1B1 B1 -
10-5R1B2 B2 NP
10-5R1B3 B3 -
10-5R1B4 B4 -
10-5R1B5 B5 -
10-5R1B6 B6 +
10-5R1B7 B7 -
10-5R2B1 B8 -
10-5R2B2 B9 +
10-5R2B3 B10 -
10-5R2B4 B11 NP
10-5R2B5 B12 +
10-5R2B6 B13 -
10-5R2B7 B14 -
10-5R3B1 B15 +
10-5R3B2 B16 -
10-5R3B3 B17 -
10-5R3B4 B18 -
10-5R3B5 B19 -
10-5R3B6 B20 -
10-5R3B7 B21 -
10-5R3B8 B22 -
10-6R1B1 B23 NP
10-6R1B2 B24 -
10-6R1B3 B25 +
10-6R1B4 B26 -
10-6R2B1 B27 -
10-6R3B1 B28 -
10-5 y 10-6: Diluciones

R1, R2 y R3: Repeticiones 1, 2 y 3 respectivamente.
Bi: Representa el número de la colonia aislada por repetición en la dilución.
NP: No puro
+: Positivo
-: Negativo
17
De acuerdo con los resultados de la tinción Gram se puede ver que el 90% de las
bacterias purificadas presentaron coloración Gram negativa, esto indica que la mayoría
de bacterias purificadas presentan una capa muy delgada de peptidoglucano en su pared
celular y una capa externa cubierta por una membrana de lipoproteínas, que hizo que no
retuvieran el colorante azul violeta durante el proceso de coloración (Mollinedo &
Gonzáles, 2014). Además, se puede apreciar que de las 28 colonias aisladas solo 25
colonias presentaron un solo tipo de forma bacteriana.
5.6 Determinación del índice de actividad enzimática (IAE) de bacterias aisladas

de la base de PCA
Después de determinar la pureza de cada cultivo aislado se determinó el índice de

actividad enzimática de los 25 cultivos puros. La degradación de la celulosa se evaluó a
través de la prueba de índice de actividad enzimática (Briones-Roblero et al., 2017).
Este ensayo se realizó según Dantur et al. (2015). Primero se prepararon placas Petri
con agar mínimo salino complementado con Carboximetilcelulosa (CMC) 0.1% (w/v)
como fuente única de carbono (Tabla. 4), rojo congo 0.1% y NaCl 1M (Fig. 16).
Tabla 4. Composición del medio de cultivo (Dantur et al., 2015).

Compuesto g/L
Na2HPO4 1g
KH2PO4 1g
MgSO4 0.05 g
NaCl 3g
CaCl2 0.05 g
(NH4)2SO4 2g
Agar 20 g
H2O 1000 ml
CMC 0.1%(p/v)
CMC: Carboximetilcelulosa.
18
Figura 16. Reactivos para el ensayo de degradación de Carboximetilcelulosa. A. Rojo congo 0.1%; B.
NaCl 1M.
Luego, se inoculó por triplicado 5 ul de cada cepa bacteriana con densidad óptica (OD)
igual a 0.2 en una placa Petri con agar mínimo salino complementado con CMC al 0.1%
(w/v). A continuación, se incubó a temperatura ambiente por 5 días. Después, se realizó
la coloración con 4 ml de rojo congo 0.1% y se dejó fijar el colorante por 30 min. Luego,
se eliminó la solución del colorante rojo congo y se agregó 4 ml de solución NaCl 1M
por 15 min. Después, se eliminó la solución de NaCl 1M. Finalmente, se realizó la
medición del índice de actividad enzimática (IAE), el cual se obtuvo mediante la
aplicación de la siguiente formula:
(Diámetro del halo + diámetro de la colonia)

IAE= Diámetro de la colonia
Cada ensayo para determinar el IAE (Fig. 17) se realizó por triplicado.
Figura 17. Determinación del IAE. A. Preparación de agar mínimo salino con CMC; B. Sembrado de
alícuotas bacterianas; C. Incubación; D. Medición del diámetro de la colonia bacteriana; E. Lavado con
rojo congo 0.1%; F. Eliminación del rojo congo 0.1%; G. Lavado con NaCl 1M y su posterior eliminación;
H. Medición del diámetro de los halos de degradación.
19
En los resultados obtenidos, de las 25 cepas bacterianas aisladas de la base de PCA, 20
cepas formaron halo de degradación al aplicarse el rojo congo 0.1% de las cuales solo
las cepas B18 y B26 reportaron mayor índice de actividad enzimática. Los resultados
obtenidos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA de una vía) con
significación estadística de p <0,05, seguido de una prueba post hoc HSD de Tukey
(Tabla 5).
Tabla 5. Índice de actividad enzimática de bacterias aisladas de la base de PCA.

Bacteria Ø de la colonia (mm) Ø del halo (mm) IAE
B1 5.54 7.92 1.43±0.05c
B3 6.80 7.75 1.14±0.11a
B4 NC
B5 7.69 8.62 1.12±0.07a
B6 7.47 10.27 1.38±0.20c
B7 7.53 7.76 1.03±0.15a
B8 9.08 10.66 1.17±0.16a
B9 6.74 7.50 1.11±0.26a
B10 7.84 9.33 1.19±0.15b
12B 8.77 9.25 1.06±0.13a
13B NC
14B 8.39 8.44 1.01±0.18a
15B 5.79 8.83 1.53±0.09c
16B NC
17B 6.59 9.15 1.39±0.10c
18B 4.23 7.98 1.89±0.53e
19B 4.24 5.31 1.25±0.33b
20B 8.86 10.03 1.13±0.11a
21B 6.13 8.43 1.38±0.12c
22B 11.46 12.43 1.08±0.07a
24B NC
25B 6.16 8.44 1.37±0.38c
26B 4.86 9.00 1.85±0.22d
27B 8.51 9.09 1.07±0.03a
28B NC
Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Las letras diferentes en los superíndices indican
diferencia estadísticamente significativa (p<0.05)
Ø: Diámetro.
NC: No creció.
20
El aislamiento de microorganismos se puede realizar de manera directa mediante la
técnica de dilución sobre agar utilizando una muestra fresca o también se puede aplicar
enriquecimientos ex situ con sustratos específicos (Achayra & Chaudhary, 2012; Lynd
et al., 2002), celulosa cristalina (Wang et al., 2011) y sustratos insolubles, conformado
por papel filtro, biomasa lignocelulósica pretratada, muchos de ellos residuos
agroindustriales (Waldron, 2014).
Stutzenberger (1972), demostró que el uso de un medio mínimo de sales minerales

suplementado con glucosa y CMC incrementó 11 veces la actividad extracelular
celulasa en comparación con un medio previamente usado con extracto de levadura y
CMC.
Teather & Wood (1982), observaron que el rojo congo podía ser usado en los ensayos
para evidenciar la hidrólisis de CMC ya que el colorante forma complejos con los
polisacáridos con enlaces β-1,4-D-glucopiranosil, facilitando así la diferenciación entre
microorganismos celulolíticos y no celulolíticos por la formación de zonas de
aclaramiento alrededor de las colonias.
Para determinar la actividad celulolítica de los microorganismos se evalúa la actividad

endoglucanasa (EG), exoglucanasa o celobiohidrolasas (CBH), y β-glucosidasa (BGL),
por ser las enzimas que participan en la degradación de la celulosa (Bhat, 2000;
Schwarz, 2001; Moya, 2011; Gupta et al., 2012; Juturu & Wu, 2014). Pero es necesario
considerar que estos ensayos no predicen completamente la eficiencia de las celulasas
durante la bioconversión de materiales lignocelulósicos, porque no hay una clara
relación entre la actividad sobre sustratos solubles con los insolubles (Singhania et al.,
2010).
La actividad endoglucanasa se mide a través de la degradación del carboximetilcelulosa

(CMC), la actividad exoglucanasa por la degradación de avicel (celulosa cristalina o alfa
celulosa) y la actividad β-glucosidasa mediante la degradación de celobiosa (Dantur et
al. (2015). Sin embargo, los celulosomas son complejos enzimáticos característico de
bacterias y pueden ser definidos como protuberancias que emergen desde la pared
celular, estas protuberancias albergan complejos enzimáticos estables los cuales son
21
capaces de degradar la celulosa uniéndose a ella (Pandey et al., 2017). Han et al. (2003)
evidenció que la expresión de los celulosomas está regido bajo la existencia de un cluster
genético el cual contiene los genes necesarios para la degradación de la celulosa a
glucosa.
Cuantitativamente la actividad celulolítica se puede medir teniendo en cuenta la

formación de productos de la hidrólisis mediante el método de DNS o el método de
Nelson Somogy (Percival et al., 2006).
Una de las desventajas del método del DNS es que algunos azúcares reductores pueden
ser degradados durante el desarrollo del protocolo (Dashtban et al., 2010). La lectura de
la prueba de DNS a 540 nm en un espectrofotómetro es altamente influenciada por las
condiciones de la prueba, como la temperatura del agua de calentamiento, la
transferencia de calor, el tiempo de reacción, la proporción de glucosa, celobiosa y
celodextrinas presentes y el tiempo de preparación del reactivo, el cual con frecuencia
es ignorado (Percival et al., 2006).
5.7 Conservación de bacterias celulolíticas aisladas de la base de PCA
Después de determinar la pureza e índice de actividad enzimática, se sembró de cada

cultivo 10 µl en microtubos de 1.5 ml con 1000 µl de caldo LB. La siembra se realizó
en condiciones asépticas. Todos los microtubos se protegieron con parafilm y se
incubaron a temperatura ambiente por 24 h. Finalizado el periodo de incubación se
observó el crecimiento de las bacterias por turbidez y se conservaron con glicerol al
15%, relación v/v (Núñez et al., 2012) en una congeladora (Coldex CH 40) a -20°C
como parte del cepario del proyecto: “Capacidad celulolítica e identificación molecular
de bacterias y hongos filamentosos aislados de distintos estratos de pilas de cascarilla
de arroz (Oryza sativa)” del estudiante de maestría Jimmy Breitner López Pérez. El otro
grupo de bacterias a partir del cual se replicaron las cepas se conservó a 4°C para su
posterior uso en la extracción de ADN.
22
5.8 Extracción de ADN genómico bacteriano
La extracción de ADN genómico de bacterias se realizó utilizando el protocolo PBS 1X

(Estandarizado por la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.) el cual consta de los pasos
básicos como son lisis celular, degradación de la fracción proteica asociada al ADN y
la purificación (Micheli & Bova, 1997). Finalmente, todas las muestras se conservaron
a -20°C en una congeladora (Coldex CH 40). Debemos recordar que, la elección de un
método particular de extracción de ADN depende de las especies bacterianas de las que
el ADN se va a extraer. Por ejemplo, las bacterias Grampositivas, debido a su pared
celular gruesa, usualmente requieren tratamientos más severos durante los primeros
pasos de la extracción, es decir, aquellos que están dedicados a la lisis de las células
(Micheli & Bova, 1997).
5.9 Cuantificación de ADN genómico bacteriano
La cuantificación de ADN genómico se realizó en un espectrofotómetro Eppendorf

Biophotometer (Modelo AG 22331, fabricado en Alemania, con rango de medida
fotométrica de 0.000 - 3.000 A, y error sistemático +/- 0.01-1 A). Para la cuantificación
de ADN genómico se seleccionó la opción 7 (ds DNA, ADN de cadena doble). El equipo
fue calibrado empleando 60 µl de TE. Para las lecturas, se tomó 60 µl de las muestras
de ADN previamente diluidas (se realizó una dilución 1/12, 5 µl de ADN en 55 µl de
TE) de bacterias. Después de cada lectura, la cubeta se lavó con 100 µl de agua destilada
estéril. Cada 5 lecturas la cubeta se lavó con 100 µl de NaOH 0.1M y luego, con 100 ul
de agua destilada estéril. Los resultados de la cuantificación, pureza y diluciones de
ADN para la PCR se indican en la Tabla 6.
23
Tabla 6. Características del ADN genómico extraído.
Código del ADN Concentración (µg/ml) Pureza (260/280) Dilución para la PCR
B1 449 2.01 1/10
B3 229 1.9 1/10
B5 113 1.82 1/5
B6 40 2.09 D
B7 173 1.89 1/5
B8 170 1.67 1/5
B9 186 1.79 1/5
B10 425 1.95 1/10
B12 320 1.95 1/10
B14 141 1.74 1/5
B15 168 1.8 1/5
B17 469 1.92 1/10
B18 448 1.98 1/10
B19 195 1.85 1/5
B20 170 1.85 1/5
B21 531 1.97 1/10
B22 199 1.79 1/5
B25 351 1.93 1/10
B26 115 1.82 1/5
B27 36 2.01 D
D: Directo
La concentración de ADN genómico varió entre 36-531 g/ml mientras que la pureza
estuvo entre 1,67 y 2,09.
Una muestra pura de ácido nucleico tiene un perfil de absorbancia característico entre
230–320 nm, siendo a 260 nm donde se alcanza el pico más alto de absorbancia. Una
A260 de 1,0 es equivalente a una concentración de 50 µg/ml para ADN de doble hebra
y 40 µg/ml para ADN de cadena sencilla o ARN (Pandey & Couto, 2016).
En los últimos años se ha cuestionado la exactitud de la absorbancia A260 como

indicador de concentración y el ratio A260/A280 como indicador de pureza (Glasel,
1995; Huberman, 1995; Manchester, 1995; Manchester, 1996). Esto debido
principalmente a que las absorbancias varían en función del pH y la cantidad de sales
presentes en la muestra. El pH de la muestra influye en la absorbancia, pero es más
fiable cuando se realizan mediciones entre pH 7,5 - 8,5 (Wilfinger et al., 1997). Por lo
tanto, se recomienda diluir las muestras de ADN en tampón TE o fosfato. También es
24
común que cantidades excesivas de sal de arrastre (coprecipitado de ácido nucleico)
pueden enmascarar la pendiente positiva de la curva que se asocia usualmente con la
porción 240 - 260 nm del espectro. Esto se puede solucionar con un lavado del pellet
con etanol 70-75% después de la centrifugación para eliminar la mayor parte de sal que
se usó para acelerar la precipitación de las moléculas de ácido nucleico (Farrell, 2010).
Los ratios de calidad proporcionan una estimación razonable de la pureza de la muestra.

Aljanabi & Martinez et al. (1997) nos dice que las preparaciones puras de ADN deben
tener un valor de 1,8 a 2, valores por debajo de este rango son un indicativo de
contaminación con proteínas o fenol. Farrell (2010) lo confirma en la Tabla 7. Así
también, Pandey & Couto, (2016) mencionan que la relación A260/A280 debería ser de
alrededor de 1,8 para el ADN puro y 2,0 para preparaciones puras de ARN.
Tabla 7. Ratios de pureza del ADN (Farrell, 2010).
Muestra Ratio Valor Pureza
A260/A280 1.8 Pureza opima. Ratios inferiores, contaminación

con proteínas.
ADN A260/A230 2.0-2.4 Pureza aceptable. Ratios inferiores,

contaminación con compuestos orgánicos.
A260/A240 1.4 Ratios inferiores, sugieren excesiva cantidad de

sal en la muestra.
A260/A280 2.1 Ratios superiores, contaminación con ARN
La cuantificación por espectrofotometría es poco sensible y para la mayoría de los

espectrofotómetros se requiere una concentración de ADN de al menos 1 μg/ml en la
muestra para poder realizar estimaciones válidas (Sambrook & Russell, 2001). Como se
puede apreciar la cantidad de ADN presente es buena lo que permitió que los datos
obtenidos sean confiables. Por otro lado, la pureza varió entre optima y aceptable.
5.10 Amplificación del gen del ARNr 16S mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
La amplificación del gen del ARNr 16S se realizó mediante la PCR. La PCR se realizó
en el termociclador Biometra UNO-Thermoblock bioton. Antes de programar el
25
termociclador se preparó el Mix para la PCR. Para la preparación del mix se utilizó los
reactivos del KIT de la Taq Polimerase Recombinant, ThermoScientific (Deng et al.,
2008; Huang et al., 2012). En la preparación del Mix se calculó el volumen de cada
componente según el número de muestras. Se preparó el Mix para un total de 20
muestras correspondiente a las 20 cepas bacterianas aisladas. En la Tabla 8 se indican
los componentes del Mix y los volúmenes utilizados. El Mix se preparó en un microtubo
de 1.5 ml. Después de preparar el Mix, se extrajo 20 alícuotas de 23 µl las cuales se
transfirieron a 20 microtubos de 0.2 ml. Luego, se adicionaron 2 µl de ADN genómico
de cada bacteria en cada microtubo de 0.2 ml.
Tabla 8. Componentes y volúmenes del Mix de la PCR para amplificar el gen del ARNr 16S (Deng et al.,
2008; Huang et al., 2012).
Reactivo Concentración µl/reacción
Agua Ultra Pura (AUP) - 16.2
Buffer Taq 1X 2.5
MgCl2 2.5 mM 2.5
dNTP´s 0.2 mM 0.5
Forward 0.36 pmol/µl 0.6
Reverse 0.36 pmol/µl 0.6
Taq Polimerasa 0.02 U/µl 0.1
Después de preparar las reacciones se colocaron los 20 microtubos de 0.2 ml en el

termociclador Biometra UNO-Thermoblock bioton más 4 microtubos de 0.2 ml en las
esquinas de la caja para permitir el equilibrio del peso que ejerce la tapa. Finalmente, se
programó en el termociclador los ciclos de temperatura y tiempo, según se muestra en
la Fig. 18 (Tabla 9).
Figura 18. Programación del termociclador.
26
Tabla 9. Perfil térmico para amplificar el gen del ARNr 16S mediante la PCR.
Etapa Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94°C 6 min 1
Desnaturalización 94°C 30 s
Alineamiento 58°C 45 s 30
Polimerización 72°C 1 min
Polimerización final 72°C 4 min 1
Conservación 4°C indefinido
Fuente: Empresa INCA'BIOTEC S.A.C.
Aunque la PCR es una técnica valiosa debido a su alta sensibilidad tiene limitaciones ya
que cualquier forma de contaminación en la muestra puede producir falsos resultados.
Tal cual lo mencionaron Pandey & Couto, (2017) es crucial reducir al mínimo la
presencia de agentes quelantes (ejemplo, EDTA) y aniones (ejemplo, fosfato) en la PCR
ya que estos reducen la accesibilidad del Mg+2.
La secuencia y tamaño de los primers determina la especificidad y la sensibilidad de la

PCR. Algunas consideraciones que se deben tener en cuenta según Westermeier (2016)
en el diseño de primers son: deben estar diseñados en la dirección 5'→ 3'; tener una
longitud de 17-28 pares de bases (pb); su contenido de GC debe ser 40-60%; los
extremos 3' deben terminar en una G o C, o CG o GC; los extremos 3' no deben ser
complementarios; se debe evitar la autocomplementación de los cebadores. Finalmente,
se debe evaluar la especificidad de los primers con herramientas bioinformáticas. Gupta
et al. (2017) mencionaron que la Pfu polimerasa aislada de Pyrococcus furiosus se usa
ampliamente por su mayor fidelidad al polimerizar ADN, aun cuando la Taq polimerasa
también es resistente al calor.
5.11 Separación de amplicones mediante electroforesis
Después de realizar la PCR, se realizó una corrida electroforética (Fig. 19) en un equipo
de electroforesis horizontal marca Cleaver, modelo cs-300v Scientific ltd. Primero, se
preparó 120 ml de disolución de agarosa 1.5% en TAE 1X. Se dejó enfriar hasta una
temperatura de 40-50°C. Luego, se adicionó 6 µl de bromuro de etidio, se homogeneizó
27
y vertió en el molde de preparación de geles (se utilizó un peine de 20 dientes). Después,
se dejó enfriar por 30 min, luego se retiró el peine y los jebes laterales. Posteriormente,
el gel formado se introdujo en el interior del equipo, que contenía disolución tampón
TAE 1X. En cada pocillo del gel de agarosa se adicionó 10 µl de una disolución
compuesta por 2µl de Buffer de carga y 8 µl de amplicones. Finalmente, se encendió el
equipo de electroforesis y se programó a 90 voltios por 30 min. Después de transcurrir
los 30 min se retiró el gel de agarosa, y se colocó en un transiluminador Bioblock vilder
para su revelado.
Figura 19. Electroforesis con muestras de ADN productos de PCR del gen del ARNr 16S, ADN de bacterias
aisladas de la base de PCA. A. Preparación del gel; B. Enfriamiento del gel en el molde; C. Mezcla de
amplicones y buffer de carga; D. Vertido de buffer de carga y amplicones en pocillos del gel; E.
Programación de voltios, tiempo y amperaje del equipo eletroforético; F. Migración de los amplicones.
Las muestras B3, B5 y B26 mostraron bandas con fluorescencia baja mientras que las
demás muestras presentaron bandas con fluorescencia alta.
En la electroforesis la movilidad de un fragmento de ADN es inversamente proporcional

a su tamaño, esto se debe a que el tamaño del poro depende de la concentración de
agarosa y dicha concentración debe estar en función a la longitud de la muestra (Lee et
al., 2012). Ver Tabla 10. Las pérdidas inevitables de agua que se producen durante el
calentamiento pueden afectar la porosidad del gel. Usualmente, se utilizan geles con un
tamaño de poro de 150 nm a 1% (p/v) a 500 nm a 0,16% (Westermeier, 2016). Serwer
28
(1980) empleó también geles muy suaves con diámetros de poros de hasta 800 nm
(0,075% de agarosa) para la separación de moléculas de ADN muy grandes.
Tabla 10. Concentración de agarosa para la separación de fragmentos de ADN (Lee et al., 2012)
Agarosa Tamaño del fragmento de ADN
0.5% 2000 pb – 50000 pb
0.6% 1000 pb – 20000 pb
0.7% 800 pb – 12000 pb
0.8% 800 pb – 10000 pb
0.9% 600 pb – 10000 pb
Los geles se tiñen con colorantes fluorescentes tales como bromuro de etidio o SYBR
Green y las bandas son visibles bajo luz UV en un transiluminador. El bromuro de etidio
es una molécula plana, tiene el tamaño adecuado para entrar entre los pares de bases del
ADN (Waring, 1965).
El uso de geles de poliacrilamida produce bandas mucho más nítidas y una mayor
resolución cuando son teñidas con nitrato de plata, se puede conseguir una sensibilidad
de hasta 15 pg por banda (Bassam et al., 1991).
Después de confirmar la amplificación del gen del ARNr 16S mediante electroforesis
de las 20 muestras, se diluyeron los productos de PCR de acuerdo a la intensidad
obtenida de cada banda. Se prepararon 30 µL de cada producto de PCR y se codificaron
utilizando las iniciales PCA, (Tabla 11). Las alícuotas de los productos de PCR se
enviaron a la empresa Macrogen para su secuenciamiento. La empresa Macrogen es una
empresa que brinda servicios de secuenciamiento de ADN (productos de PCR,
plásmidos, y cromosomas artificiales bacterianos) a nivel mundial.
29
Tabla 11. Diluciones de los productos de PCR del gen del ARNr 16S de bacterias y códigos utilizados para
el secuenciamiento de las muestras.
Código del Intensidad AUP Amplicon Total Código de
Amplicon de la Banda (µL) (µL) (µL) Secuenciación
Bacteriano
B1 Alta 27 3 30 PCAB1
B3 Baja 0 30 30 PCAB3
B5 Baja 0 30 30 PCAB5
B10 Alta 27 3 30 PCAB10
B12 Alta 27 3 30 PCAB12
B14 Alta 27 3 30 PCAB14
B15 Alta 27 3 30 PCAB15
B17 Alta 27 3 30 PCAB17
B18 Alta 27 3 30 PCAB18
B19 Alta 27 3 30 PCAB19
B20 Alta 27 3 30 PCAB20
B21 Alta 27 3 30 PCAB21
B22 Alta 27 3 30 PCAB22
B25 Alta 27 3 30 PCAB25
B26 Baja 0 30 30 PCAB26
B27 Alta 27 3 30 PCAB27
AUP: Agua ultra pura.
Las bacterias celulolíticas aerobias que generalmente se encuentran en el suelo,

materiales vegetales, campos de caña de azúcar, cascarilla de arroz y en la hojarasca son
Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Cellulomonas fimi, Cellulomonas flavigena,
Cellulomonas gelida, Cellulomonas iranensis, Cellulomonas persica, Cellulomonas
uda, Cellvibrio gilvus, Cellvibrio mixtus, Pseudomonas fluorescens, Streptomyces
antibioticus, Streptomyces cellulolyticus, Streptomyces lividans y Streptomyces reticuli
(Pandey et al., 2017).
Por otro lado, las principales bacterias celulolíticas que se han aislado de diferentes
residuos agroindustriales y seleccionado debido a sus propiedades xilano degradantes,
son: Acidothermus celulolyticus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus pumilus,
30
Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, etc. (Heck et al., 2005;
Phitsuwan et al., 2013; Juturu & Wu, 2014; El-Bakry, 2015).
Así mismo, un estudio en diferentes suelos ambientales en Korea del norte reportó que
las actividades multienzimáticas lignocelulolíticas se observaron principalmente en
Bacillus y Streptomyces, mientras que Burkholderia fue el género más abundante con
actividad lignolítica solamente (Gong et al., 2017). Por otro lado, los géneros
Pedobacter, Mucilaginibacter y Luteibacter fueron aislados de suelos forestales en
República Checa. Pedobacter y Mucilaginibacter mostraron sistemas enzimáticos
complejos para la degradación de celulosa y hemicelulosa. Mientras que, Luteibacter
no expresó ninguna actividad celulasa (López et al., 2016). Un análisis metagenómico
de los suelos puertorriqueños evidenció el dominio de los géneros Aquitalea, Bacillus,
Burkholderia, Cupriavidus, Gordonia y Paenibacillus de los cuales raramente se estudia
su capacidad lignolíticas o celulolíticas (Woo et al., 2014). Así también Streptomyces
griseorubens se aisló del suelo en la India (Prasad et al., 2013). En suelos de la provincia
del Chaco en Argentina se identificó taxas celulolíticos como Acidothermus,
Micromonospora, Streptomyces, Paenibacillus y Pseudomonas (Talia et al., 2012).
Géneros como Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas con actividad celulolítica fueron
aisladas del intestino de Coptotermes gestroi (Tarun,2016).
En base a toda la información científica reportada hasta la actualidad y con sustento en

las pruebas microbiológicas y bioquímicas realizadas en la presente practica es probable
identificar géneros bacterianos como Cellvibrio, Mucilaginibacter, Pseudomonas y
Acidothermus por ser aerobios y negativos. También, es tentativo encontrar géneros
como Bacillus, Cellulomonas y Streptomyces por ser grampositivos. Se debe resaltar
que, todos los géneros bacterianos mencionados anteriormente poseen actividad
celulolítica.
31
VI. CONCLUSIONES
1. El adiestramiento adquirido en las técnicas microbiológicas de aislamiento permitió

aislar 20 cepas bacterianas con actividad celulolítica endoglucanasa presentes en la
base de la pila de cascarilla de arroz (Oryza sativa).
2. Se reforzaron los conocimientos teóricos y prácticos en las técnicas de biología

molecular que se usan para la identificación de bacterias.
3. Se observó la necesidad de evaluar el efecto de la temperatura en la producción de

celulasas por hongos filamentosos aislados del compost de bagazo de caña de
azúcar (Saccharum officinarum).
VII. RECOMENDACIONES
1. Determinar la actividad celulasa total de las bacterias celulolíticas aisladas de la

base de PCA en sustratos lignocelulósicos insolubles para evaluar su rendimiento
en la naturaleza.
2. Caracterizar molecularmente el celulosama de las bacterias celulolíticas aisladas de

la base de PCA para evidenciar que genes son los responsables de su expresión.
3. Determinar el perfil cinético de producción de glucosa de bacterias celulolíticas

aisladas de la base de PCA para determinar en que momento la glucosa funciona
como represor de los genes del celulosoma.
32
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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39
IX. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
9.1 GENERALIDADES
1. Título
Efecto de la temperatura en la producción de celulasas por hongos filamentosos

aislados de la base de composteras de bagazo de caña de azúcar (Saccharum
officinarum).
2. Personal investigador
2.1. Autor: Eymar Enrrique Correa Valverde, egresado de la Escuela Académico

Profesional de Biotecnología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
del Santa.
2.2. Asesor: Blgo. Mblgo. José M. Villanueva Carlos, docente de la E.A.P de

Biotecnología de la Universidad Nacional del Santa.
3. Tipo de investigación
3.1. Por su propósito: Aplicada
3.2. Por su naturaleza: Explicativa
4. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto
El proyecto se desarrollará en los Laboratorios de Microbiología y Biología Molecular

de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C., en el distrito de Tumbes, departamento de
Tumbes.
40
5. Cronograma de trabajo
ACTIVIDADES 2017
Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo
Recopilación de X X
Información
Preparación de X
técnicas e
instrumentos
Recolección de X X
datos
Procesamiento de X X
datos
Elaboración de X X
informe final
6. Recursos
6.1 Bienes disponibles
 01 mechero Bunsen
 02 asas bacteriológicas
 02 micropipetas de 0.5-10 µL, 10-100 µL, 20-200 µL, y 100-1000 µL
 01 cámara de flujo laminar BIOBASE, BBS-H1300
 01 microscopio óptico compuesto OLYMPUS CX21
 01 Microcentrífuga
 01 centrífuga refrigerada
 Reactivos para extraer ADN
 01 espectrofotómetro Eppendorf Biophotometer AG 22331, 0.00 - 3.00 A
 01 baño María
 01 baño termostático de Bloque seco
 02 Vortex Labnet VX-200
41
 01 termociclador Biometra UNO-Thermoblock bioton
 Reactivos para amplificación por PCR
 Primers
 01 equipo de electroforesis Cleaver scientific Ltd
 Agarosa
 Reactivos para migración de ADN
 01 transiluminador ultravioleta
 01 autoclave
 01 balanza analítica
 01 estufa de secado
 Medios de cultivo
6.2 Bienes no Disponibles
 100 placas Petri

 500 puntas de 10 µL, 100 µL, 200 µL, y 1000 µL para micropipetas
 500 microtubos de 0.2 y 1.5 ml
7. Presupuesto
Financiamiento Aporte (S/.) Participación (%)
INCA'BIOTEC S.A.C. 2250 75

Autofinanciamiento 750 25
Total 1500 100
42
9.2 PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. Antecedentes
La celulosa es un homopolisacárido compuesto por largas cadenas de moléculas de D-

glucosa unidas por enlaces β-1,4 (Van Dyck & Pletschke, 2012). Con ayuda de
celulasas, la celulosa es convertida en glucosa (Gupta et al., 2012). Las celulasas son un
complejo multienzimático que consiste principalmente en tres componentes diferentes,
endo-1,4-b-D-glucanasa (EC 3.2.1.4), exoglucanasa / exo-celobiohidrolasa (EC
3.2.1.91) y b-glucosidasa (EC 3.2.1.21). Estas tres enzimas actúan sinérgicamente para
hidrolizar completamente el polímero de celulosa en sus monómeros de glucosa (Pandey
et al., 2017).
Los microorganismos que tienen la capacidad de hidrolizar la celulosa, se les denomina

microorganismos celulolíticos o microorganismos con capacidad celulolítica. La
mayoría de los microorganismos empleados en la producción de celulasas en
fermentación en sustrato sólido (SSF) son hongos filamentosos, bacterias (tanto aerobias
como anaerobias) y en menor medida actinomicetos (Behera & Ray, 2016).
Los hongos filamentosos son los microorganismos más estudiados para la producción
de celulasas debido a su mayor rendimiento enzimático y a su capacidad de secretar el
complejo celulolítico extracelularmente. Dentro de los hogos más estudiados tenemos
Trichoderma sp., Penicillum sp., Aspergillus sp., Penicillium pinophilum, Fusarium sp.,
Penicillium funiculosum, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Sclerotium rolfsii,
Humicola sp. y Cladosporium herbarum (Woodward, 1982; Schwarz, 2001; Milala et
al., 2005; Guzmán et al., 2014; Pandey et al., 2017).
Trichoderma reesei, es a partir de la literatura conocida el mejor productor de celulasa,

capaz de hidrolizar celulosa nativa en glucosa (Singhania et al., 2017).
También se sabe que hongos termófilos tales como Sporotrichum thermophile,

Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum, Humicola grisea y
Myceliopthora thermophila producen celulasas. Estos hongos son de mayor interés
43
debido a su capacidad para producir celulasas termoestables. Estas enzimas han
demostrado estabilidad a temperaturas de hasta 90 °C (Vyas, 2004).
Adicionalmente, las enzimas termoestables ofrecen ventajas potenciales en la hidrólisis

de lignocelulosa: (a) incrementan la solubilidad de los sustratos y productos, lo cual
aumenta la velocidad de la reacción y reduce la cantidad de enzima requerida; (b)
acortan el tiempo de hidrólisis; (c) reducen el riesgo de contaminación e incrementan la
productividad; (e) facilitan la recuperación de los productos volátiles, por ejemplo el
etanol; (f) reducen el costo energético que implica el enfriamiento del sustrato después
del pre-tratamiento térmico (Bhalla et al., 2013).
Muchos de los hongos filamentosos con capacidad celulolítica reportados han sido
aislados de residuos lignocelulolíticos y otras fuentes. Lin et al. (2016) aislaron
Aspergillus fumigatus N2 de madera en descomposición, esta cepa produce xilanasas y
celulasas extracelulares. Así también, Zhang et al. (2014) evidenciaron la
predominancia de los hongos filamentosos celulolíticos Tichoderma y Penicillum con
alta eficiencia de β-glucosidasa en los bosques tropicales y subtropicales de China. Por
otro lado, Ang et al. (2013) aislaron un hongo lignocelulítico, Aspergillus fumigatus
SK1 del estiércol de vaca y afirmaron que la cepa SK1 era el productor de xilanasas más
fuerte con un alto nivel de secreción de celulasa en comparación con otros 16 hongos
filamentosos examinados, utilizando como sustrato el tronco de palma de aceite no
tratado.
Delabona et al. (2012) aislaron una cepa de Aspergillus fumigatus de la selva amazónica,
como un eficiente productor de celulasa y xilanasa. Así también, Deswal et al. (2011)
informó de la optimización de los diversos parámetros fisiológicos y nutricionales para
la producción de celulasas por un hongo de pudrición marrón Fomitopsis sp. (RCK2010)
aislado de sustratos de bajo costo tales como paja de trigo y paja de arroz bajo
condiciones de fermentación en sustrato sólido. Por otro lado, Herculano et al. (2011),
aislaron los hongos celulolíticos: Aspergillus niger, Emericela variecolor y Aspergillus
japonicus de residuos de higuerilla.
Castillo (2011) reportó la caracterización morfológica y enzimofuncional de hongos

ligninocelulolíticos aislados a partir de la corteza de aliso (Alnus acuminata), arrayán
44
(Myrcianthes hallii) y Pumamaqui (Oreopanax heterophyllus). Donde, Fusarium sp.
presentó mayor actividad carboximetilcelulasa y avicelasa con 183.08 U/L y 722.04
U/L, respectivamente. Mientras que, Moya (2011) reportó la determinación de la
capacidad celulolítica in vitro de un consorcio de hongos aislados a partir de muestras
de suelo de bosque alto andino y de tusas de palma de aceite en descomposición.
Ortiz & Uribe, (2010) identificaron hongos ligninolíticos y celulolíticos con capacidad
para degradar desechos de cosecha y mejorar las características del suelo. Encontraron
dos cepas con alta actividad exoglucanasa (055C y 061C Penicillium spp.) y una cepa
con alta actividad endoglucanasa (019C Trichoderma spp.). Por otro lado, Gutierrez et
al. (2008) aisló hongos filamentosos de muestras de suelo; Gaitan & Perez, (2007) de
residuos vegetales frescos y Kato et al. (2004) de muestras de pilas de compostaje.
Mientras que, Prasertsan et al. (1992) aislaron 34 cepas de hongos filamentosos
celulolíticos procedentes de efluentes de molino de aceite de palma; Darmwal & Gaur,
(1991) de paja de arroz; Tan et al. (1985) de viruta de madera y Eggins & Malik, (1969)
de tierra de pastizales.
En base a lo expuesto, se formula el siguiente problema: ¿Cuál es el efecto de la

temperatura en la producción de celulasas por hongos filamentosos aislados de la base
de composteras de bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum)?
2. Justificación del problema
Los hongos filamentosos lignocelulolíticos reportados hasta la fecha han sido aislados
en condiciones controladas de laboratorio de diferentes fuentes (Eggins & Malik, 1969;
Tan et al., 1985; Darmwal & Gaur, 1991; Prasertsan et al., 1992; Kato et al., 2004;
Gaitan & Perez, 2007; Gutierrez et al., 2008; Ortiz & Uribe, 2010; Castillo, 2011; Moya,
2011; Herculano et al., 2011, Deswal et al., 2011; Delabona et al., 2012; Ang et al.,
2013; Zhang et al., 2014; Lin et al., 2016).
Sin embargo, hasta la fecha no se han reportado estudios del efecto de la temperatura en
la producción de celulasas por hongos filamentosos aislados de la base de composteras
de bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum).
45
3. Importancia
Las celulasas han experimentado una mayor demanda desde 1995 en varias aplicaciones
industriales como: detergentes, industria textil, alimentación animal e industria
alimentaria, industria papelera e industria de los biocombustibles (Pandey et al., 2017).
Identificar molecularmente hongos filamentosos con capacidad lignocelulolítica

aislados del bagazo de caña de azúcar es importante porque se podrán utilizar estos
hongos filamentosos para biodegradar el bagazo de caña de azúcar en altas temperaturas
y así producir celulasas termoestables con mayor productividad a escala planta piloto o
industrial. Las celulasas termoestables podrían emplearse en las diversas aplicaciones
biotecnológicas donde se requiera trabajar con altas temperaturas como: producción de
detergentes, producción de alimento animal e industria alimentaria, industria textil,
industria papelera, industria de los biocombustibles, producción de enzimas
celulolíticas, y producción de azúcares fermentables (Tamariz, 2014).
Por otro lado, al utilizar el bagazo de caña de azúcar se disminuirá los costos de
pretratamiento del bagazo de caña de azúcar, se reducirá el impacto negativo que se
genera cuando se quema, se dispondrá de más espacio en lugares donde se almacena
actualmente y se le brindará un valor agregado que beneficiará tanto a personas del
sector agrícola como industrial.
4. Objetivos
4.1. Objetivo General
1. Evaluar el efecto de la temperatura en la producción de celulasas por hongos

filamentosos aislados de la base de composteras de bagazo de caña de azúcar
(Saccharum officinarum).
4.2. Objetivos Específicos
1. Aislar hongos filamentosos con capacidad lignocelulolítica de la base de

composteras de bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum).
46
2. Cuantificar la actividad celulasa total de los hongos filamentosos con capacidad
lignocelulolítica aislados la base de composteras de bagazo de caña de azúcar
(Saccharum officinarum) a diferentes temperaturas.
3. Identificar molecularmente los hongos filamentosos con capacidad

lignocelulolítica aislados de la base de composteras de bagazo de caña de azúcar
(Saccharum officinarum) mediante la amplificación de los espacios internos
transcrito (ITS).
5. Hipótesis
Si se producen celulasas por hongos filamentosos aislados de composteras de bagazo de

caña de azúcar (Saccharum officinarum) a temperatura ambiente, 60°C y 90°C, será a
90°C dónde se obtengan celulasas con mayor actividad enzimática.
6. Diseño experimental
Se empleará un diseño experimental de estímulo creciente. La actividad celulasa total

de los hongos filamentosos aislados de la base de composteras de bagazo de caña de
azúcar (Saccharum officinarum) se evaluará cuantitativamente. Se cuantificará y
comparará la actividad celulasa total a temperatura ambiente, 60ºC y 90ºC.
7. Estrategia de trabajo
7.1 Población
Hongos filamentosos del bagazo de caña de azúcar de la base de compostera de 30 días

del Vivero Invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional
de Tumbes, Tumbes-Perú.
47
7.2 Muestra
Hongos filamentosos con capacidad lignocelulolítica presentes en 100 g de bagazo de

caña de azúcar de la base de compostera de 30 días del Vivero Invernadero de la
Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Tumbes, Tumbes-Perú.
7.3 Unidad de análisis
Actividad celulasa total de hongos filamentosos aislados del bagazo de caña de azúcar
de la base de compostera de 30 días del Vivero Invernadero de la Facultad de Ciencias
Agrarias de la Universidad Nacional de Tumbes, Tumbes-Perú.
7.4 Recolección de muestras
Se recolectará seis muestras de 100 g de bagazo de caña de azúcar en bolsas ziploc

estériles, cada muestra será tomada de la base en seis diferentes composteras de 30
días del Vivero Invernadero de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad
Nacional de Tumbes, Tumbes-Perú.
7.5 Preparación de muestra estándar de gabazo de caña de azúcar
En el interior de una cámara de flujo laminar se preparará la muestra estándar de

bagazo de caña de azúcar. Esto se realizará extrayendo 20 g de las seis muestras
obtenidas, luego se mezclará en una bolsa ziploc estéril.
7.6 Obtención de esporas
Se agregará 10 g de la muestra estándar de bagazo de caña de azúcar en un matraz de

250 ml. Luego, se agregará 200 ml de agua destilada estéril y se homogenizará
suavemente por 5 min. Posteriormente, se filtrará con gasa estéril, se descartará la parte
retenida y el medio filtrado será homogenizado en vortex. Finalmente, se conservará
en tubos cónicos estériles de 50 ml.
48
7.7 Diluciones decimales
De un tubo cónico, se extraerá de forma aséptica 1 ml, a partir del cual se realizarán
diluciones decimales en agua destilada estéril hasta las diluciones 10-4 y 10-5.
7.8 Acondicionamiento de la fuente de carbono lignocelulósica
Se extraerá 100 g de la muestra de estándar de bagazo de caña de azúcar. A

continuación, se molerá, cernirá, enjuagará con abundante agua potable corriente y una
última vez con agua destilada. Después, se secará en una estufa a 80 Cº por 24-48 h
hasta alcanzar peso constante y se transferirá a un vaso de precipitado de 500 ml.
Finalmente, se autoclavará (Rezende et al., 2002).
7.9 Preparación del medio de cultivo para el aislamiento de hongos filamentosos

con capacidad lignocelulolítica
Se preparará placas de Petri con agar mínimo salino (Dantur et al., 2015) al cual se le
agregará clorafenicol 0.5 mg/ml. Cada placa de Petri con agar será suplementada con
bagazo de caña molido estéril al 10% (p/v).
7.10 Aislamiento de hongos filamentosos
A partir de las diluciones 10-4 y 10-5, se sembrará 100 µl de cada dilución en placas de
Petri con medio de cultivo para el aislamiento de hongos filamentosos con capacidad
lignocelulolítica y se esparcirá con una espátula Drigalski. Cada dilución se esparcirá
en placas por triplicado. Después, se dejará en incubación por 5 días a temperatura
ambiente.
7.11 Obtención de cultivos puros de hongos filamentosos con capacidad

lignocelulolítica
Los cultivos puros de hongos se obtendrán a partir de las placas sembradas con las
diluciones 10-4 y 10-5, mediante el aislamiento del micelio seleccionado según sus
características macroscópicas morfológicas en medio agar papa dextrosa (PDA). Las
49
características de morfología macroscópica consideradas serán: diámetro del micelio,
aspecto, superficie, color, y textura (Huanaco, 2008). El aislamiento del micelio en
PDA se realizará tantas veces como sea necesario hasta obtener cultivos puros de
hongos filamentosos con capacidad lignocelulolítica. Una vez obtenidos los cultivos
puros se replicarán, rotularán y se conservarán en PDA a 4°C para su posterior uso en
la extracción de ADN genómico.
7.12 Producción de celulasas por hongos filamentosos con capacidad

lignocelulolítica
La producción de celulasas se realizará en placas de Petri con agar mínimo salino

(Dantur et al., 2015) al cual se le agregará clorafenicol 0.5 mg/ml. Cada placa de Petri
será suplementada con bagazo molido estéril al 10 % (p/v). En cada placa de Petri se
sembrará un hongo filamentoso puro aislado y se conservará en incubación por 10 días
a temperatura ambiente, 60ºC y 90ºC. Cada experimento se realizará por triplicado.
7.13 Obtención del extracto enzimático
La obtención del extracto enzimático de realizará según Paredes (2010), al tiempo

definido de fermentación, se adicionará a cada placa 8 ml de solución amortiguadora
de citrato 50mM, pH 5,3 y se agitará durante 15 min. Luego, se filtrará en gasa estéril
y el volumen obtenido se distribuirá en tubos de ensayo para centrifugarlos por 30 min
a 6000 rpm. Finalmente, se obtendrá el sobrenadante o extracto enzimático y luego se
conservará a 4°C para su posterior uso.
7.14 Determinación de la actividad celulasa total
La actividad celulasa total (FPU) se determinará según el procedimiento realizado por

Ghosh et al. (1987) descrito en Pandey (2017). Primero, se colocará Papel de filtro
Whatman No.1 cortado en tiras de 1 x 6 cm (aproximadamente 50 mg) en un tubo de
ensayo, luego se agregará 1.5 ml de solución tampón de citrato de sodio 50 mM (pH
4,8), después se agregará 0.5 ml del extracto enzimático. A continuación, se
homogenizará y se dejará incubar por 60 min a 50°C, posteriormente se detendrá la
50
reacción sumergiendo los tubos de ensayo en un baño de frío. Finalmente, se realizará
la prueba del ácido 5-dinitrosalicílico (DNS) descrito en Pandey (2017).
Las absorbancias obtenidas en el método de DNS serán insertadas en la curva de

calibración preparada según Pandey (2017). Finalmente, la actividad celulasa total será
reportada a partir la concentración de glucosa liberada considerando el volumen de
extracto enzimático, el volumen de buffer citrato de sodio, el tiempo de incubación, el
peso molecular de la glucosa y la dilución del extractico enzimático en caso se haya
diluido.
Según la Unión Internacional de Bioquímica, una unidad enzimática internacional (IU)

se define como la cantidad de enzima que puede catalizar 1 µmol de sustrato por
minuto en condiciones controladas de temperatura, pH y concentración adecuada de
sustrato. Al describir la actividad de la celulasa, una IU es equivalente a la cantidad de
celulasa para liberar 1 µmoles de glucosa por minuto (Dutta, 2008).
7.15 Extracción de ADN genómico de hongos filamentosos lignocelulolíticos
La extracción de ADN de hongos se realizará empleando el protocolo CTAB 2X para

hongos, protocolo estandarizado por la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.
7.16 Cuantificación de ADN genómico hongos filamentosos lignocelulolíticos
La cuantificación de ADN se realizará en un espectrofotómetro Eppendorf

Biophotometer (Modelo AG 22331, con rango de medida fotométrica de 0.000 - 3.000
A, y error sistemático +/- 0.01-1 A). Para la cuantificación de ADN genómico se
seleccionará la opción 7 (ds DNA, ADN de cadena doble).
7.17 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificación de la región espaciadora interna transcribible (ITS) para la

identificación de hongos, se realizará mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) en un termociclador Biometra UNO-Thermoblock bioton. Se utilizará como
primer forward, el primer ITS1 5´-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3´, y como
51
primer reverse, el primer ITS4 5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´ (Nilsson et
al., 2008). Para la preparación de las reacciones se utilizarán los reactivos del KIT de
la Taq Polimerase Recombinant, ThermoScientific (Huang, 2012).
En el termociclador se programarán los siguientes parámetros de temperatura y tiempo.

Para la etapa de desnaturalización inicial (94°C por 6 min), etapas de
desnaturalización, alineamiento y polimerización (94°C por 30 s, 54°C por 45 s y 72°C
por 45 s, respectivamente, para 35 ciclos), para la etapa de polimerización final (72°C
por 5 min) y para la etapa de conservación (4°C por un tiempo indefinido), parámetros
estandarizados por la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.
7.18 Separación de amplicones por electroforesis
La migración de los amplicones, se realizará en un equipo de electroforesis horizontal

marca Cleaver, modelo cs-300v Scientific ltd. Se preparará una disolución de agarosa
1.5%. Se programará el equipo de electroforesis para que se realice la migración a 90
voltios por 30 min. Luego se retirará el gel de agarosa, y se colocará en un
transiluminador Bioblock vilder para su revelado. Procedimientos y parámetros
estandarizados por la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.
7.19 Secuenciación
Los amplicones de la región ITS, se enviarán a la empresa Macrogen de Estados

Unidos en alícuotas de 30 µl para su secuenciamiento. En el envío se solicitará el
secuenciamiento de las hebras de ADN amplificadas por los primers forward y reverse.
7.20 Identificación molecular de hongos filamentosos lignocelulolíticos (Análisis

bioinformático)
La identificación de hongos se realizará utilizando las secuencias de nucleótidos

proporcionadas por la empresa Macrogen. Primero, se alinearán las secuencias
mediante el programa MEGA 5.1; luego, se comparará las secuencias alineadas con
las secuencias de la base de datos del NCBI (Centro nacional para la información en
biotecnología), mediante el programa BLAST (Herramienta de búsqueda y
52
alineamiento básico local). La identificación de los microorganismos se realizará en
función del porcentaje de identidad y cobertura de secuencias (Schoch et al., 2012).
7.21 Análisis estadístico
Se calculará el promedio y la desviación estándar de los resultados obtenidos en la

actividad celulasa total; se realizará un análisis de varianza simple (ANOVA de una
vía), y se comparará la significación de las diferencias mediante la prueba HSD Tukey
con un nivel de confianza del 95%. Los cálculos se realizarán a través del programa
estadístico SPSS versión 23.0.
53
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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57

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INFORME DE PRÁCTICAS PREPROFESIONALES III

APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA

NUEVO CHIMBOTE - PERÚ, 2017

INFORME DE PRÁCTICAS PREPROFESIONALES III

APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA

Revisado y Aprobado por el Asesor:

INFORME DE PRÁCTICAS PREPROFESIONALES III

APLICACIÓN DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA

A mis padres Dorotea y

A toda mi familia por

A todas las personas que

Agradezco a Dios por esta bendición.

A Eric Mialhe, Ph.D., gerente general de INCA'BIOTEC S.A.C., por brindarme la

A todos mis compañeros y compañeras que laboran en la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.,

A Melitza, Jimmy, Karina y Tatiana. Compañeros de investigación por su amistad,

Al profesor José Villanueva Carlos, por su asesoramiento en la redacción de este informe.

A mi familia por todo su cariño, apoyo y comprensión brindado durante el tiempo de

Dando cumplimiento a lo dispuesto en el reglamento de Prácticas Preprofesionales de la

El presente informe está basado en una serie de experiencias y conocimientos adquiridos

Correa Valverde Eymar Enrrique

DEDICATORIA ________________________________________ ______________ i

Figura 2. Organigrama de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C. 5

Figura 3. Partes de la planta de arroz. 8

Figura 4. Estructura química de la celulosa. 9

Figura 5. Estructura de la celulosa en su forma natural. 9

Figura 6. Hidrólisis de la celulosa. 10

Figura 7. Recolección de muestra de PCA. 12

Figura 8. Preparación de muestra estándar de la base de PCA. 12

Figura 9. Vertido de medio de cultivo TSA en el interior de la cabina de flujo

Figura 10. Diluciones seriadas de la base de PCA. 13

Figura 11. Siembra de bacterias por esparcimiento en superficie de cultivo. 14

Figura 12. Numeración de colonias bacterianas de muestra de la base de PCA

Figura. 13. Aislamiento por estrías en superficie. 15

Figura 14. Colonia bacteriana aislada de la base de PCA indicando sus

Figura 15. Tinción Gram de la cepa B18. Observación 100X. 16

Figura 16. Reactivos para el ensayo de degradación de Carboximetilcelulosa. 19

Figura 17. Determinación del IAE. 19

Figura 18. Programación del termociclador. 26

La biotecnología ambiental integra un conjunto de actividades tecnológicas que permiten

En el Perú, se generan diariamente grandes volúmenes de residuos lignocelulósicos

La cascarilla de arroz en el Perú se produce en grandes cantidades durante el proceso de

Parte de las investigaciones sobre cascarilla de arroz están enfocadas en descubrir

En el presente informe de prácticas se presentan las actividades realizadas para el

2.1. Objetivo general

 Reforzar y complementar los conocimientos teóricos y prácticos adquiridos

 Aplicar técnicas moleculares en bacterias celulolíticas aisladas de pilas de

2.2. Objetivos específicos

 Participar activamente en el desarrollo de la práctica preprofesional III.

3.1. Generalidades del centro de prácticas

INCA'BIOTEC S.A.C., es una empresa peruana de biotecnología molecular

Proveer asistencia científica y técnica a empresas e instituciones, peruanas y extranjeras,

3.3. Ubicación geográfica

La empresa INCA'BIOTEC S.A.C. se encuentra ubicada en el departamento de Tumbes,

Jr. Filipinas N° 212, Tumbes

La empresa INCA'BIOTEC S.A.C., está integrada por un gerente general, un

Técnicos d e Tesistas Personal de Personal de

Figura 2. Organigrama de la empresa INCA'BIOTEC S.A.C.

Servicio de diagnóstico para múltiples patógenos, caracterización de genes de

Utilizan técnicas de biología molecular, las cuales se caracterizan por su alta

Estos diagnósticos incluyen el aislamiento, purificación y análisis molecular de

INCA'BIOTEC S.A.C., propone programas de asesoría científica y técnica para

La asesoría comprende uno o más componentes según las necesidades de los

Establecimiento, control y certificación de animales/plantas libres de patógenos

DEDICATORIA __________________________ i