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DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
En los organismos vivos, gran parte de los procesos bioquímicos ocurren espontáneamente,
pero a velocidades muy lentas, pudiendo ser incluso en un margen de años, por lo cual
requieren ser biocatalizadas por enzimas, que son agentes proteicos que reducen la energía
de activación de estas reacciones, permitiendo que ocurran en un margen de segundos.
Estas enzimas poseen un sitio activo en el que ocurre la reacción y que también puede ser
utilizado por los organismos como regulatorio, mediante inhibidores que pueden unirse a
este sitio activo o a otra parte de la enzima de forma reversible o irreversibles, este último
por formación de enlaces covalentes, impidiendo la correcta interacción entre el sitio activo
de la enzima y el sustrato como indica Lodish et al. (1).
𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆]
𝑉0 = (𝐸𝑐. 1)
𝐾𝑚 + [𝑆]
Se comenzó con el material de vidrio dispuesto en una gradilla plástica añadiendo con
ayuda de una micropipeta de 1000[µL] los reactivos en los tubos de hemólisis según lo
indicado en la tabla 2.1 presente a continuación.
1
Tabla 2.1: Volúmenes de reactivos añadidos a los tubos de hemólisis para calibración.
Reactivo / Tubo 1 2 3 4 5 6
pNP1 60 µM en [mL] 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
NaOH 0,05 M en [mL] 4,0 3,5 3,0 2,0 1,0 0,0
El mismo procedimiento descrito anteriormente se utilizó para preparar las muestras en esta
parte de la experiencia, con diferencia en que los volúmenes de reactivos corresponden a
los presentados en la tabla 2.2.
Tabla 2.2: Volúmenes de reactivos añadidos a los tubos de hemólisis para determinar los
parámetros cinéticos.
Reactivo / Tubos 7 8 9 10 11
pNPP2 2,5 mM [mL] 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Buffer citrato [mL] 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50
KH2PO4 mM [mL] 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Enzima 0,5 mg/mL [mL] 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
3.- RESULTADOS
Los puntos medidos por espectrofotometría para la curva de calibración son los siguientes:
Para elaborar la curva de calibración estos son graficados en las figuras 3.1 y 3.2, donde en
esta última se eliminan los datos fuera de la tendencia.
1
Para-Nitrofenol.
2
Para-Nitrofenil fosfato.
2
70
60
50
pNP [µM]
40
30
20
10
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbancia
50
45
40
35
pNP [µM]
30
25
20
15
10
5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbancia
3
Tabla 3.3: Concentración de sustrato, producto y velocidad inicial.
0.035
0.03
0.025
Vo[µmol/L*min]
0.02
0.015
Con inhibidor
0.01
Sin inhibidor
0.005
0
-0.005 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-0.01
pNPP[mM]
𝟏 𝟏 𝟏 𝑳∙𝒎𝒊𝒏 𝟏 𝑳∙𝒎𝒊𝒏
[ ] 𝑽 [ µ𝒎𝒐𝒍 ] [
𝑽𝟎 µ𝒎𝒐𝒍
]
𝒑𝑵𝑷𝑷 𝒎𝑴 𝟎
4
450
350
1/V0 [L∙min/µmol]
250
150 Con inhibidor
50 Sin inhibidor
Figura 3.4: Curvas de dobles recíprocos para cinéticas con y sin inhibición.
Tabla 3.6: Velocidad máxima y constante de Michaelis para cinéticas con y sin inhibición.
Con Sin
inhibición inhibición
Vmax -0,0048 0,0430
Km -1,6636 0,5289
4.- DISCUSIÓN
Los datos medidos para la curva de calibración presentes en la tabla 2.1 indican que el pNP
cumple la ley de Lambert-Beer para el rango de concentraciones hasta 45[µM], puesto que
a 60[µM] la tendencia lineal no es adecuada para modelar el comportamiento de la
absorbancia del sistema en ese punto. La mayor parte de las desviaciones de la ley de
Lamber-Beer ocurren con el aumento de la concentración, producto de que la radiación
emitida por el espectrofotómetro no es completamente monocromática y por ende el
incremento de la concentración hace más evidente la desviación de la tendencia. Si bien la
posibilidad de que en la preparación del tubo 6 tuviese errores es considerable, estas se
descartan puesto que se realizó un duplicado de este tubo para corroborar la tendencia. Es
por esto que la curva de calibración utilizada es la correspondiente a la tabla 3.2 y figura
3.2, donde la absorbancia a 60[µM] es eliminada.
5
Como indica Nelson & Cox (2) las velocidades iniciales de la catálisis enzimática
aumentan con el incremento de la concentración de sustrato en el sistema esto producto de
que se facilita la formación del complejo enzima-sustrato. Aquellas enzimas Michaelianas
describen un comportamiento hiperbólico de velocidad inicial en función del sustrato.
Cualitativamente los datos presentes en la tabla 3.3 en ausencia de fosfato y graficados en
la figura 3.3 describen el comportamiento presente en la literatura (3), es decir, de tipo
Michaelis-Menten, no obstante, la cinética descrita para la reacción con presencia de
fosfato no se observa el mismo fenómeno. El fosfato inorgánico es un inhibidor de tipo
competitivo como indica Guija et al. (3), esto quiere decir que junto con el sustrato buscan
unirse al sitio activo. Como consecuencia de esto la velocidad de catálisis disminuye, dado
que menos sustrato alcanza a conformar el complejo enzima-sustrato requerido para la
formación de productos, esto puede observarse en que todos los puntos en la curva de
inhibición de la figura 3.3 se encuentran a una velocidad menor que la cinética en ausencia
de fosfato. Los datos determinados para la cinética en presencia de inhibidor describen un
comportamiento menos hiperbólico y más sigmoideo, producto de la formación de un
complejo enzima-fosfato ligado covalentemente según Guija et al. (3). Las desviaciones del
comportamiento Michaeliano pueden deberse a errores en la preparación de los tubos o en
la medición de la absorbancia, como en el caso del tubo 8 que presentó valores de
absorbancia negativos lo que indica que no hubo formación de pNP.
Por otra parte, para determinar los parámetros cinéticos se requiere linealizar los datos
medidos en las corridas cinéticas anteriores mediante el método de dobles recíprocos,
donde para inhibiciones de tipo competitivas debería observarse que la velocidad máxima
de la reacción es la misma, mientras que la constante Michaeliana debería ser mayor.
Producto de las desviaciones mencionadas anteriormente para la cinética con inhibición no
es posible determinar los parámetros cinéticos en estas condiciones.
5.- CONCLUSIONES
6
6.- REFERENCIAS
[1] Lodish H., Kaiser C., Berk A., Krieger M., Matsudaira P. & Scott M. (2005).
Biología Celular y Molecular. Fundamentos químicos, Equilibrio Químico. (5aed,
pp. 73-77). Buenos Aires, Argentina: Editorial médica panamericana S.A.
[3] Guija E., Soberón M. & Haak-Mares H. (2007). Mecanismo de acción de fosfatasas
ácidas de bajo peso molecular. (pp. 356 – 362). Anales de la facultad de Medicina,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.