11.10.

Separarea prin mecanism de excluziune sterică

Cromatografia de lichide bazată pe mecanism de excluziune este cunoscută şi

sub numele de cromatografia pe gel şi se bazează pe utilizarea unor faze staţionare
poroase (geluri), în care separarea componenţilor probei se efectuează în funcţie de
mărimea lor moleculară. Aceste materiale introduse într-o coloană în care vor ocupa un
volum notat cu Vtotal(gel) sunt constituite ca particule grosiere (având un volum notat cu
Vpart), caracterizate de pori interni particulelor (măsurat prin Vintern), în timp ce între aceste
particule rămâne un spaţiu liber, constituind porii externi gelului (măsurând Vextern).
Solventul apos cu pH controlabil care este utilizat ca eluent într-o separare bazată pe
aceste geluri au la dispoziţie atât porii externi, cât şi cei interni. Moleculele cu volum mare
sunt excluse din porii interni ai gelului eluând din coloană datorită mişcării prin porii
externi. In schimb, molecule cu volum mic vor putea penetra porii interni ai gelului, ceea
ce înseamnă ca acestea vor avea o parcurgere întârziată prin masa gelului. In felul
acesta, această operaţie este utilizată cu precădere la separarea substanţelor cu volum
molecular mare de cele cu volum molecular mic.

Vtotal(gel) = Vpart + Vextern + Vintern (11.20)

In general, gelurile utilizate în scop de filtrare trebuie să satisfacă câteva cerinţe:

- matricea gelului trebuie să fie destul de inertă faţă de componentele probei; interacţiile
care se stabilesc între gel şi solut să fie reversibile;
- gelul trebuie să fie stabil din punct de vedere mecanic şi chimic, astfel încât proprietăţile
de separare să se păstreze constante o perioadă mai lungă;
- stabilitatea gelului trebuie să fie într-un domeniu mai larg de pH al fazei mobile
(preferabil 2-10);
- prezenţa unor solvenţi, precum metanolul sau etanolul, nu trebuie să schimbe
proprietăţile de separare.
Câteva dintre cele mai cunoscute geluri hidrofile sunt menţionate în continuare:[126]
a) Dextranii sunt compuşi macro-moleculari având ca unitate monomerică
exclusiv glucoza, ce formează legături de tip 1,6-glicozidic. Aceste materiale se produc la
creşterea Leuconostoc mesenteroids pe sucroză. Prin reacţia dintre Dextran cu
epiclorhidrina, în mediu bazic, are loc o reticulare a structurii polimerice, redată parţial în
figura de mai jos. Aceste geluri sunt cunoscute comercial sub numele de Sephadex (Fig.
11.15). Creşterea microorganismelor poate fi prevenită prin adăugarea azidei de sodiu în
eluent (în concentraţie de 0,02% NaN3), sau prin saturarea eluentului cu cloroform.
Câţiva parametrii de volum a acestor geluri sunt redate în Tabel 11.4.
b) Polimerizarea acrilamidei conduce la poliacriamidă solubilă în apă. Dacă
polimerizarea se face în prezenţa unui derivat bifuncţional, cum ar fi N,N’-metilen-bis-
acrilamida (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-OC-CH=CH2), atunci produsul de polimerizare
obţinut devine insolubil în apă. Prezenţa derivatului bifuncţional conduce la o reticulare a
structurii macromoleculare, care totuşi, datorită grupărilor amidice permite interacţia
puternică cu moleculele de apă având ca efect umflarea masei polimerice în prezenţa
acestora.
c) Geluri de tip agar sunt polizaharide, care sunt extrase din unele alge marine
roşii. S-a stabilit că în structura agarului se găsesc două componente principale: agaroza,
care este componentul neutru, şi agaropectina, care conţine grupări funcţionale carboxil
şi sulfat.

201
 CH2
H O H
H
OH H
OH O CH
2
H OH H O H
H
OH H
OH O CH
2
H O H O H
CH2 H
OH H
HO CH OH O
H OH
CH2
H O
CH2 OH O CH2
OH H
H O H H O H
H
H H H H
O
OH H OH H
O O CH2 OH O
H OH H OH
H2C

CH OH
CH2 OH

Fig. 11.15. Structura parţială a gelului Sephadex pe bază de dextran.

Tabel 11.4. Valorile aproximative ale parametrilor de volum ce caracterizează

1 g de Sephadex după umflare cu apă.
Densitate
Volumul total al Volumul Volumul
(după
Tipul gelului masei de gel exterior interior
umflare,
(Vt, mL) (V0, mL) (Vi, mL)
g/mL)
G-10 2 0,8 1 1,24
G-15 3 1,1 1,5 1,19
G-25 5 2 2,5 1,13
G-50 10 4 5 1,07
G-75 13 5 7 1,05
G-100 17 6 10 1,04
G-150 24 8 15 1,03
G-200 30 9 20 1,02

Aplicaţii analitice

Aplicaţiile acestor separări se referă în special la domeniul compuşilor

macromoleculari de interes biologic (proteine, oligozaharide). Gelurile de tip Sephadex G-
25 permit trecerea tuturor substanţelor solubile în apă, cu masă moleculară mai mare de
50.000 u.a.m. Pentru reţinerea macromoleculelor cu mase moleculare mai mari se pot
folosi geluri de tip Sephadex G-50 (puternic umflabile). Câteva dintre aplicaţiile mai

202
importante ale separării pe gel sunt redate în tabelul următor.

Tabel. 11.5. Câteva aplicaţii mai importante ale separării pe gel.

Probă Analiţi Tipul gelului
Urine Piridinolină, deoxipiridinolină Biogel P2
Compuşi farmaceutici Cefalosporine Sephadex gel G-10 or G-50
Listeria monocytogenes, Listeriolisin O, Butyl-Sepharose,
Staphylococcus aureus α-toxin Superose 12HR10/30
Serum şi urină Dextran Sephacryl S-300 SF
Proteine Triptofan Sephadex G10
Amestecuri diverse Acizi oligogalacturonici Silica gel Diol 120
Glutaraldehidă, produşi de
Amestecuri diverse Bio-Gel SEC-10
condensare aldolică
Ou de găină Peptide Asahipak GS320
Cafea Cofeină TSK-G 3000-SW
Apa, sol Poluanţi organo-tiofosforici Bio-Beads SX-3
Proteine globulare
Probe biologice Zorbax SE-250
Carbohidraţi

11.11. Cromatografia de lichide bazată pe separări chirale

Separarea compuşilor optic-activi este de mare interes, deoarece majoritatea

compuşilor bio-organici (amino-acizi, proteine, acizi nucleici, zaharide) sunt compuşi
asimetrici, şi prin urmare optic-activi. In natură compuşii biomoleculari există doar în una
din formele enantiomerice cunoscute: de exemplu, amino-acizi există în formă levogiră
(L), iar zaharidele în formă dextrogiră (D). Datorită stereospecificităţii, organismele vii
manifestă răspunsuri diferite faţă de enantiomerii medicamentelor, pesticidelor, etc. De
aceea, necesitatea separării acestor izomeri este de mare importanţă din punct de
vedere preparativ, dar şi din punct de vedere al controlului analitic din diverse matrici
organice. Separarea cromatografică în mecanismele descrise anterior poate avea loc cel
mult în cazul unor diastereoizomeri, datorită unor proprietăţi diferite care pot interveni în
interacţia acestora cu faza staţionară sau cu faza mobilă (solubilităţi diferite). In cazul
enantiomerilor, sunt necesare condiţii de separare speciale, diferite de cele discutate în
capitolele anterioare, fiind necesar un mecanism de separare care să asigure
enantioselectivitate.[127]
Enantioselectivitatea separărilor cromatografice este asigurată de o grupare
funcţională din faza staţionară, numită selector stereospecific sau chiral. Interacţiile dintre
selectorul chiral şi enantiomeri sunt cele obişnuite: interacţii dipol-dipol, interacţii de
hidrogen, sau interacţii π-π. Selectorul chiral poate fi legat de structura fazei staţionare
(„chiral stationary phase”) sau poate proveni dintr-un material care este depus pe un
suport („chiral coated stationary phase”). In ambele situaţii se spune că coloana

203
cromatografică care conţine faza staţionară din cele două tipuri este de tip chiral.
Enantioselectivitatea separării cromatografice poate fi realizată şi cu ajutorul unui
selector chiral care face parte din compoziţia fazei mobile, utilizând în acest caz chiar o
coloană fără activitate stereospecifică. In acest caz în faza mobilă se găseşte un aditiv ce
conţine un selector chiral, care formează asociaţii moleculare cu stabilitate diferită faţă de
cei doi enantiomeri. Astfel, că enantiomerul care formează o asociaţie mai stabilă cu
selectorul chiral al aditivului din faza mobilă, va interacţiona mai puţin cu faza staţionară,
comparativ cu celalalt enantiomer şi astfel va elua din coloana cromatografică mai rapid.
Cel mai cunoscut exemplu este acela al ciclodextrinelor, care adăugate în faze mobile
pot forma asociaţii cu stabilităţi diferite faţă de doi enantiomeri.
Separarea unor enantiomeri se poate face şi indirect, printr-o reacţie de
derivatizare cu un reactiv chiral. In acest caz perechea de enantiomeri conduce la un
amestec de doi diastereoizomeri, care pot fi separaţi pe o coloană nechirală.
In cazul cel mai des întâlnit, acela al utilizării fazelor staţionare chirale, doi
enantiomeri (D şi L) interacţionează diferit cu selectorul chiral, putând fi astfel separaţi din
amestecul racemic. Enantioselectivitatea separărilor chirale pe o coloană chirală este
dată de raportul factorilor de capacitate corespunzători celor enantiomeri, definit în cap.
9.2 prin selectivitate cromatografică (relaţia 9.15). In Tabelul 11.6 sunt redate principalele
tipuri de faze staţionare chirale şi mecanismele de separare care pot fi aplicate în
vederea separării cromatografice de enantiomeri.

Tabel 11.6. Clasificarea celor mai importante faze staţionare chirale în LC.
Descriere / principiu
Tip Pirkle
(π-donor sau π-acceptor
Celuloza derivatizată
(forte electrostatice de
interacţie)
Principiul formarii
complecşilor de incluziune:
- ciclodextrine;
- poliacrilamide;
- eteri coroană.
Proteine
Exemple Mecanism de separare
DNB-fenilglicină
DNB-leucină Fază normală
DNB-naftilalanină
Chiracel OA, OB, OD, OF, OJ Fază normală
Fază inversă
Cyclobond I, II, III
(faza mobilă cu
Chiralpak OP, OT
componentă apoasă
Chiracel CR
acetonitril sau metanol)
Fază inversă cu soluţii
Albumina, glicoproteine
tampon

Fazele staţionare de tip Pirkle se obţin prin derivatizarea aminopropil-silicagelului

prin introducerea selectorului chiral care conţine gruparea de bază 3,5-dinitrobenzoil
legată la un rest de aminoacid, aşa după cum se poate observa din structurile celor trei
exemple din tabelul anterior, redate mai jos.

204
 NO2
O
CH3 H H
N C
O Si CH2CH2CH2 N C C
H
CH3 O NO2

NO2
O
CH3 H H
N C
O Si CH2CH2CH2 N C C
H
CH3 O CH2 NO2
CH
HC CH3
3

NO2
O
CH3 H3C H
N C
O Si CH2CH2CH2 N C C
H
CH3 O NO2

Separarea enantiomerilor pe faze staţionare de tip Pirkle se datorează: a)

interacţiunilor π-π între grupările π donoare ale enantiomerilor şi nucleul aromatic din
structura selectorului chiral cu caracter π-acceptor (datorită efectelor atrăgătoare de
electroni manifestate de grupările nitro); b) legăturilor de hidrogen care se pot forma între
grupările amino secundare sau carbonil din selectorul chiral şi grupări amino, hidroxil sau
carboxil din moleculele de enantiomeri; c) interacţii dipol-dipol. Datorită efectelor sterice
este posibil ca unul dintre enantiomeri să poată interacţiona mai mult cu selectorul chiral
decât celălalt, conducând la separarea lor din amestecul racemic.
Fazele staţionare de tip Pirkle pot fi utilizate în ambele mecanisme de retenţie
LC, dar mecanismul în fază normală este cel mai utilizat. Acestea pot fi utilizate la
separarea enantiomerilor având diverse structuri. In cazul în care enantiomerii conţin
grupări funcţionale puternic polare (amino, hidroxil sau carboxil) se recomandă
derivatizarea lor astfel încât interacţia cu selectorul chiral din faza staţionară să nu fie
foarte puternică. Aceasta conduce la grupări funcţionale de tip amino acilate, eteri sau,
respectiv, esteri.
In prezent sunt comercializate şi alte tipuri de faze staţionare cu proprietăţi chirale
de tip Pirkle, cum ar fi faza staţionară cu denumirea Whelk-O şi având structura
selectorului chiral redată în continuare.

NO2
H3C CH3 N H
Si H
O
O
NO2

205
 Cele trei grupări hidroxil din unitatea glucopiranozică a celulozei sau amilozei pot
fi derivatizate prin introducerea grupării acetil, benzoil, sau dimetilfenilcarbamat
(exemplificat mai jos), rezultând structuri care au proprietatea de a separa enantiomerii.
Faza staţionară chirală se obţine apoi prin depunerea celulozei derivatizate pe suprafaţa
silicagelului, care are rol de suport.
O-R

( O
O )n
R-O O-R
O CH3
Celuloza derivatizata
R: C
O-R N
H
( O
)n CH3

R-O O-R O (3,5-dimetilfenilcarbamat)

Amiloza derivatizata

Faze staţionare bazate pe principiul formarii complecşilor de incluziune pot fi

obţinute prin legarea de suprafaţa silicagelului la nivelul grupărilor silanol. Cel mai
cunoscut exemplu este cel al ciclodextrinelor, care pot forma complecşi de incluziune
doar cu unul dintre enantiomeri, aşa după cum se poate vedea şi din exemplificarea
mecanismului redat mai jos.
X X
Y Y
C C
Z Z
+

Y X
Y X
C C
Z Z
+

Proteinele sunt compuşi macromoleculari alcătuiţi din unităţi chirale de amino

acizi (L), ce pot fi imobilizate pe un suport solid, cum este silicagelul. Mecanismul de
separare în acest caz se bazează pe legături de hidrogen şi interacţii ion-dipol sau dipol-
dipol.

11.12. Componentele unui sistem HPLC

Componentele de bază ale unui cromatograf de lichide (LC) sunt: sistemul de

distribuire a solvenţilor (SDS), care asigură obţinerea şi transportul fazei mobile în
coloana cromatografică, compartimentul coloanei (termostatate), injectorul şi sistemul de
detecţie. Sistemele HPLC moderne sunt echipate cu un sistem de achiziţie şi prelucrare a
datelor (calculator), care totodată are rolul de a controla parametrii implicaţi în procesul
cromatografic.

206