UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS

MICROBIOLOGIA

GUACYRA ARIANNE FERREIRA DE MELLO

COLORAÇÕES:
Preparação microscópica corada

RELATÓRIO

PONTA GROSSA

2016
GUACYRA ARIANNE FERREIRA DE MELLO

COLORAÇÕES:
Preparação microscópica corada

Trabalho requisitado na
disciplina de Microbiologia, como
avaliação parcial do 1º período do
curso de Tecnologia em
Alimentos da Universidade
Tecnológica Federal do Paraná -
Campus Ponta Grossa.

Prof.ª Ms Giovana Arruda

Moura Pietrowski

PONTA GROSSA

2016
INTRODUÇÃO

Um dos maiores desafios da microbiologia sempre foi a visualização de

microrganismos, devido ao seu reduzido tamanho e/ou transparência quando em
contato com fontes de luz. De modo a contornar tais obstáculos, desenvolveram-
se diversas técnicas de coloração, que permitissem a visualização direta através
do realce de determinados componentes estruturais de microrganismos a fim de
facilitar sua identificação.
Para estas colorações, faz-se o uso de substâncias corantes, normalmente
compostos orgânicos complexos que podem ser ácidos, básicos ou neutros e o
processo de coloração normalmente envolve uma reação química com trocas
iônicas entre os sítios ativos bacterianos e as moléculas de corante. As
colorações podem ainda ser simples, diferenciais ou especiais
As colorações podem ser simples (uma única solução de contraste aquosa ou
alcoólica de corante básico), diferencial (mais de uma solução, para distinção de
estruturas celulares e/ou espécies), ou especial.
No método de coloração individual, destaca-se a coloração de Gram,
desenvolvida em 1884 pelo médico e bacteriologista dinamarquês Hans
Christian Joachim Gram, a coloração de Gram é um procedimento de coloração
diferenciado, uma vez que não dá cor aos tipos de células igualmente,
característica essa bastante útil, ao passo que permite classificar as bactérias
em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas, diferenciação obtida
através de distinções na parede celular das bactérias.
Como resultado, as células gram-positivas retêm o corante e permanecem
de cor púrpura enquanto que as células gram-negativas não retêm o corante e
ficam incolores até serem contracoradas com um corante vermelho, que leva à
aquisição de coloração rosa. O método de Gram é uma das mais importantes
técnicas de coloração em microbiologia médica.
Porém, os resultados da coloração de Gram não são universalmente
aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não
adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente quando usada em bactérias
jovens, em crescimento.
 O método de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma
cultura bacteriana cultivada em meio sólido ou líquido, com um corante primário,
(cristal violeta), seguido de tratamento com um fixador (lugol). A absorção do
corante primário e do fixador é feita de maneira idêntica para bactérias gram-
positivas e gram-negativas, o que provoca a aquisição de uma coloração violeta,
resultado da formação de um complexo insolúvel, o cristal violeta-iodo, no
citoplasma. Em seguida, realiza-se um tratamento com um solvente orgânico
(etanol-acetona) que dissolve a camada de lipídios das membranas externas das
bactérias gram-negativas, deixando também pequenos orifícios na fina camada
de peptideoglicana pelos quais o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) se espalha,
colorindo as células.
Paralelamente, ocorre a desidratação das espessas paredes celulares
das bactérias gram-positivas, o que promove a contração dos poros do
peptideoglicano, tornando-os impermeáveis ao complexo; o corante primário
permance preso e as células permanecem coradas. A etapa mais crítica da
análise ocorre na descoloração, uma vez que exposição prolongada ao solvente
provoca a remoção do cristal violeta de ambos os tipos de bactérias, o que pode
levar à produção de resultados e conclusões errôneas.
Deste modo, a retenção ou não do corante primário depende diretamente
das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como
espessura, densidade, porosidade e integridade. Trata-se então a amostra com
um corante secundário (fucsina básica), onde as bactérias gram-negativas
permanecem incolores após a lavagem com álcool, e a adição do contracorante
é a responsável por dar cor às células. Vistas sob o microscópio, as células gram-
positivas terão aspecto violeta e as gram-negativas aspecto rosa.
No caso de existência de células de bactérias gram-positivas velhas,
danificadas ou mortas, a tendência é a de perda do cristal violeta, o que pode
acarretar em uma exibição de todas as células coradas como gram-negativas;
assim, é essencial o uso de uma amostra nova. Em contrapartida, resultados do
tipo "falso gram-positivo" são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for
ignorado. É possível ainda substituir o corante cristal violeta pelo azul de
metileno e a fucsina básica, sem qualquer tipo de alteração nos resultados. Já o
solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%.
OBJETIVOS

Dominar as técnicas de colorações mais utilizadas em laboratórios de

microbiologia, realizar as etapas de uma preparação microscópica corada
segundo procedimentos adequados e identificar os tipos morfológicos
bacterianos.

MATERIAIS

o Lâminas de vidro para microscopia;

o Caneta para escrever em vidro;

o Pinças de Madeira;

o Bacia para coleta de resíduos de corante;

o Bico te Bunsen;

o Papel toalha;

o Microscópio óptico;

o Cabo Koole com alça de platina;

o Água destilada;

o Óleo de Imersão;

o Solução de Safranina A 0,5%;

o Solução de Cristal Violeta;

o Solução de Lugol;

o Álcool-Cetona;

o Solução de Fucsina Básica;

o Solução de Verde Malaquita 5%.

MÉTODOS

A prática iniciou-se com um procedimento de assepsia na bancada de

trabalho com a aplicação de álcool 70%. Com o auxílio de uma pinça de madeira,
expôs-se à chama do bico de Bunsen, por um pequeno intervalo de tempo, as
lâminas devidamente identificadas a fim de flambá-las e promover sua
esterilização. Ainda com o auxílio da pinça, flambou-se ao rubro o cabo de Koole
com alça de platina.

Fez-se uso de três inóculos distintos, sendo eles:

Lâmina nº 1: Coloração Simples – fermento de pão;

Lâmina nº 2: Coloração de Gram – Bacillus cereus fresco
Lâmina nº 3: Coloração de esporos – Bacillus cereus

Realizou-se o mesmo procedimento para o esfregaço e para a fixação dos

três inóculos. Promoveu-se o contato do cabo de Koole, previamente
desinfetado, com a colônia e aplicou-se uma gota de água nas lâminas de vidro,
que foram então expostas ao calor por meio da proximidade do bico de Bunsen
para promover sua secagem e fixação.
Para a coloração simples, cobriu-se a lâmina nº 1 com o corante Safranina
por um breve período de 30 segundos, permitindo o escorrimento do excesso de
corante. Em seguida, lavou-se então a lâmina com o auxílio de água destilada,
permitindo sua secagem naturalmente.
Para a coloração de Gram, cobriu-se a lâmina nº 2 com Cristal Violeta,
permitindo sua ação por um período de três minutos. Deixou-se escorrer o
excesso e cobriu-se a lâmina com Lugol, permitindo sua ação por um período de
um minuto. Após o escorrimento do excesso, lavou-se a lâmina com água
destilada. Em seguida, descoloriu-se a lâmina com álcool-cetona por m período
de 15 segundos e promoveu-se nova lavagem da lâmina com a água destilada.
Então cobriu-se o esfregaço com Fucsina Básica por um período de 30
segundos, deixando-se que houvesse o escorrimento do excesso. Em seguida,
lavou-se a lâmina com a água destilada e reservou-se a lâmina para que esta
secasse naturalmente.
 Para coloração de esporos, cobriu-se a lâmina nº 3 com a solução de Verde
Malaquita 5%. Em seguida, aqueceu-se a lâmina na chama do bico de Bunsen
por um período de cinco minutos, permitindo o escorrimento do excesso. Então,
lavou-se a lâmina com a água destilada, e cobriu-se o esfregaço com Safrina
0,5% por um período de 30 segundos. Por fim, lavou-se a lâmina com água
destilada e reservou-se para que a secagem ocorresse naturalmente.
A fim de permitir a visualização das lâminas sob o microscópio, colocou-se
óleo de imersão em cada uma após sua secagem completa.
RESULTADOS E DISCUSSÕES

Após a correta demonstração da maneira ideal de focar o esfregaço,

observou-se sob o microscópio a amostra da lâmina nº 1, com fermento de pão.
Com certa dificuldade, foi possível observar a presença de leveduras. Tal
dificuldade explica-se pelo estado de conservação do microscópio utilizado na
análise, que não se encontrava em condições ideias de funcionamento.
Levou-se então ao microscópio para observação a lâmina nº 2, com
Bacillus cereus fresco. Neste ponto, constatou-se a presença de bactérias
deformadas, fato que pode ser explicado pelo possível excesso de calor
fornecido às lâminas durante o processo de flambagem no bico de Bunsen, com
formatos que se assemelhavam a estreptococos, e não à bacilos.
Por fim, na observação da lâmina nº 3, com Bacillus cereus, embora
existisse a expectativa de observar a presença de esporos, isto tornou-se
impossível devido à fatores como: corantes com data de fabricação avançada
e/ou afetados por influências externas que alteraram sua composição e atuação,
além da possível influência de microscópios ultrapassados.

A visualização das lâminas está listada abaixo:

LÂMINA Nº 1 LÂMINA Nº 2 LÂMINA Nº 3

CONCLUSÕES
Devido às dificuldades operacionais encontradas na realização da prática,
os objetivos propostos foram atingidos parcialmente, não sendo possível
identificar as bactérias por amostras próprias preparadas, e sim apenas por meio
de amostras previamente realizadas por outros alunos.
Por esses motivos, a Coloração de Gram nunca deve ser utilizada como
um diagnóstico definitivo para a classificação de bactérias e sim como um ponto
de partida. Visto isto, a Coloração de Gram somente será um recurso rápido e
útil quando corretamente realizada e interpretada e com o uso de culturas em
que se saiba, pelo menos, o tempo de incubação.
REFERÊNCIAS

- BIER, Otto. Microbiologia e Imunologia. São Paulo: Com. Melhoramentos, 1994.

- FRANCO, B. M. & LANGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu,

2002.

- MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG. Microbiologia:
Conceitos e Aplicações - vol. 1. 2ª Ed.

- TORTORA, Gerard J., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori

Martins. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005.

- Apostila para Laboratório de Microbiologia I . Medianeira