MICROBIOLOGIA

SIEMBRA Y AISLAMIENTO MICROORGANISMOS

INTRODUCCION

Siembra y aislamiento es el acto de ponerlo en un lugar adecuado para que a partir

de pocos microrganismos puedan desarrollarse en gran cantidad formando
agrupaciones de acuerdo al tipo de bacteria que se esté cultivando. Se siembra para
aislar, guardar, cosechar, conservar.

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones

mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman
por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los microorganismos se
consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas en el laboratorio
en cultivos puros (o axénicos). En ocasiones el estudio molecular conduce a la
caracterización de los microorganismos, aún en poblaciones mixtas. Sin embargo la
identificación bacteriana y la caracterización completa solo son posible tras el
aislamiento de la bacteria y la obtención de cultivos puros. Por ello el primer problema
al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes
(enn una muestra patológica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se
ha logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.

El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la

superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el
mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias
confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales deberán
aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido
inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población sobre el asa
(por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar
que finalmente algunas células queden suficientemente separadas (aisladas unas de
otras) sobre la superficie

El aislamiento de los distintos microorganismos contenidos se lleva a cabo sobré la

superficie de un medio de cultivo solido contenido en un placa de Petri. Los medios
de cultivo que se van utilizar dependen del tipo de muestra y de los microorganismos
presentes en ella, pero deben ser medios sólidos en placa. Así, se usaran: Medios

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 1

 MICROBIOLOGIA

nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios

enriquecidos si los microorganismos que se van aislar son nutricionalmente exigentes.
En general el contenido desarrollado en el presente informe se divide en 3 unidades:
La primera aborda en marco teórico donde damos a conocer los conceptos básicos
para el desarrollo de la práctica. La segunda comprende los materiales y
procedimientos desarrollados en laboratorio. La tercera parte trata sobre la
obtención de resultados y conclusiones que obtuvimos. La siembra y aislamiento de
cultivos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su
aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo el estudio y
caracterización.

OBJETIVOS

 Aislar bacterias mediante medios sólidos.

 Observar la agrupación que forman las bacterias presentes en el suelo.
 Diferenciar las diferentes formas de agrupamiento de las bacterias.

MARCO TEORICO

Siembra y aislamiento: es la incorporación a un medio de cultivo de una muestra

(inoculo), con propósitos cualitativos y cuantitativos.

Los propósitos de la siembra pueden ser: obtener un nuevo cultivo fresco, determinar
alguna propiedad de microorganismos u obtener un cultivo puro.

Siembra en placa:

Por estría

Por inclusión

Por extensión o bañado

Siembra en tubos:

Con agar inclinado

Con medio solido horizontal

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 2

 MICROBIOLOGIA

Con medio liquido

Con medio solido

Bacterias: Las bacterias son organismos unicelulares microscópicos, sin núcleo ni

clorofila, que pueden presentarse desnudas o con una cápsula gelatinosa, aisladas o
en grupos y que pueden tener cilios o flagelos.

La bacteria es el más simple y abundante de los organismos y puede vivir en tierra,

agua, materia orgánica o en plantas y animales.

Cultivo de microorganismos: El cultivo de microorganismos consiste en

proporcionarles las condiciones físicas químicas y nutritivas adecuadas para que
puedan multiplicarse de forma controlada. En general podemos
distinguir cultivos líquidos y sólidos en función a las
características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función a
su disponibilidad de nutrientes.

Enriquecimiento: permite aislar microorganismos que encuentran en bajo número en

una muestra compleja como el suelo o agua. Los métodos de siembra pueden
combinarse con el uso de medios selectivos o diferenciales para enriquecer o aislar
microrganismos poco frecuentes.

Agar-Agar: Sustancia mucilaginosa que se extrae de algunas algas rojas o

Rodofíceas, frecuentes en el Océano Atlántico, Pacífico e Índico. Es una sustancia
amorfa. Se emplea como medio de cultivo en bacteriología, como apresto de sedas,
como sustituto de la gelatina, etc.

La forma seca del Agar-Agar se conoce de mediados del siglo XVIII, cuando un
japonés descubrió, accidentalmente, la manera de purificarlo y secarlo. Fue llevado
de China a Europa y traído a América a mediados del siglo XIX, para utilizarse,
principalmente, como substituto de la gelatina en la confección de postres gelatinosos.

Químicamente, el Agar-Agar es una mezcla compleja de sales de polisacáridos,

fundamentalmente, galactósidos. Las grandes moléculas que lo constituyen
determinan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lo han
hecho hasta ahora insustituible.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 3

 MICROBIOLOGIA

Cocos :estas son células bacterias en forma esférica que se pueden

agrupar individualmente, en parejas(diplococos), formando racimos irregulares en
varios planos de división (estafilococos), formando cadenas (estreptococos), dos
planos perpendiculares (tétradas cuatro células, en un plano) o múltiplos tres planos
ortogonales (sarcinas paquetes pequeños).

Bacilos: son células en forma de bastón alargado, que a su vez pueden tener varios
aspectos: cilíndricos, fusiformes, en forma de maza, etc. Atendiendo a lostipos de
extremos, estos pueden ser: redondeados (lo más frecuente), cuadrados, biselados,
afilados y que pueden presentarse individualmente, en parejas(diplobacilos),
formando cadenetas (estreptobacilos), bacilos en empalizada o en paquetes de
cigarrillos (debido a giros de 180º), dos bacilos en ángulo (en formade letra v o l),
varios bacilos formando “letras chinas”.

Espirilos: al igual que los bacilos tienen un eje más largo que otro, pero dicho eje no
es recto, sino que sigue una forma de espiral, con una o más de una vuelta de hélice
y que generalmente no se agrupan.

Gram positivos: Estas bacterias por su contenido de Peplidoglican en su pared

celular, el bajo contenido de lípidos y la ausencia de Lipopolisacárido, tiene la
capacidad de retener el complejo cristal violeta de la coloración de Gram, razón por la
cual se consideran bacterias Gram positivas. La rigidez de la pared celular y el bajo
contenido de lípidos hacen que las bacterias Gram positivas sean muy resistentes a
la desecación, los rayos del sol, los agentes antisépticos y los desinfectantes como
jabones, detergentes y compuestos fenólicos.

MATERIALES

o Placas pectri

o Matraz erlenmayer

o Agua destilada

o Mechero

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 4

 MICROBIOLOGIA

o Fósforos

o Autoclave

o Haza de siembra

o Laminillas portaobjetos y cubreobjetos

MÉTODOS DE SIEMBRA

A. Medios líquidos.
Como herramienta de siembra se utiliza cualquier instrumento, como haza de
siembra, pipeta, jeringa hipodérmica; etc. En este caso se utilizó el haza de siembra.

Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El
medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente
de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se
pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada
concentración.

B. Medios solidos
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los
más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de
los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y
además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a
temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que
es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un
polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble
enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme
entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez
fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos
orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas
de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en
1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y-
agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 5

 MICROBIOLOGIA

a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para
diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria
alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para
electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se
utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales
tóxicos.

Pueden distribuirse en tubos y placas

 TUBOS
 Picadura o puntura. Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se
lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo,
formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método
se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.
Medio de cultivo. Semisólido
Instrumento: aguja bacteriológica
Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias

 Estrías. Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de

ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente
esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias,

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 6

 MICROBIOLOGIA

pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie
inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.
Medio de cultivo: agar base inclinado
Instrumento: asa o aguja bacteriológica

 Mixta. Es una combinación de los dos medios por picadura y mixta.

 PLACAS

Estrías: Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las
colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en
caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material
de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando
estrías. Esto puede realizarse de varias formas:
a. Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se
quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri,
para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.
b. Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el
material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una
estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el
asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas
c. El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se
esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri
Instrumento. Asa
Finalidad. Obtener colonias aisladas
El método de estrías fue el que se empleó en la práctica en la cual se siguió una
serie de pasos que a continuación se listan.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 7

 MICROBIOLOGIA

Procedimiento:
1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.
2. Tomar el inóculo como se ha descrito anteriormente.
3. Transferir el inóculo a un aréa pequeña de la superficie de la placa, próxima al
borde. Extenderlo formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción .
4. Flamear el asa y enfriarla. Rozar una vez con el asa las estrias sembradas la
primera vez y realizar sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de
estrías que no toque la primera.
5. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operación descrita en el apartado anterior, pero
rozando al empezar la segunda tanda de estrias.
6. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37ºC.

 PLACA INVERTIDA: El principio de la técnica de la placa vertida es la dilución

(adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita
hacer diluciones en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas.

Luego de haber realizado todo el proceso de siembra de las bacterias, con bastante
cuidado lo trasladamos hasta la estufa o incubadora, en donde los microrganismos
tendrán todas las condiciones necesarias como temperatura, humedad, oxigeno;
etc. Luego de ocho días procederemos a extraerlo las placas pectri para continuar
con el proceso que corresponde a coloración en donde nos permitirá observar con
detalle a su forma y agrupación de las bacterias.

RESULTADOS

Luego de haberlo dejado por ocho días dentro de la estufa o incubadora procedemos
a sacarlo observando en primer lugar a simple vista la formación de diferentes colonias
agrupadas y que tienen un color medio verdusco.

Al percibir con el olfato percibimos un aroma a tierra, esto es debido a que los
organismos cultivados en este caso Streptomyces coelicolor son los encargados de
brindar el olor característico del suelo.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 8

 MICROBIOLOGIA

ANEXOS

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 9

 MICROBIOLOGIA

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Métodos de siembra (en línea). Consultado el 24 de May. 2014. Disponible en:

http://metodosdsiembras.blogspot.com/

 Salazar L. Medios de cultivo (en línea). Consultado el 24 de Mayo. 2014

Disponible en:
https://docs.google.com/presentation/d/1APv2UYRmLPzzVJNjUSUGUEl-
L5IW3Xr4-7QdEN5qmjY/edit#slide=id.i0

 Aislamiento de cultivos (en línea). Consultado el 24 May. 2014. Disponible en:

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-iv/pb-iv-2-introduccion.htm

 Cultivo de microorganizmos (en línea). Consultado el 24 May. 2014. Disponible

en: http://es.scribd.com/doc/90906521/Informe-to-de-Microorganismos

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 10

 MICROBIOLOGIA

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Página 11