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Ecole Centrale Paris

Année 2009-2010
1ère année.
Cours « Biologie ». Vendredi 28 mai 2010

Contrôle des Connaissances.


2ème session)
(Durée : 1h30, tous documents autorisés, ordinateur interdit)

Important : il est demandé aux élèves d’apporter un soin particulier à leur copie :
l’orthographe et la présentation des réponses pourront être prises en compte dans la
note finale.

Certaines bactéries ont développé avec le temps des stratégies variées pour résister aux
antibactériens. C’est notamment ce que l’on constate avec l’émergence de nombreuses
souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. L’une des stratégies de ces bactéries
consiste à exprimer à leur membrane plasmique des protéines, appelées transporteurs
d’efflux multispécifiques, réalisant le transport vers le milieu extracellulaire d’une grande
variété de molécules « toxiques ».

Bacillus subtilis est une bactérie non pathogène pour l’homme qui est un excellent modèle
pour l'étude d’autres bactéries qui sont responsables de pathologies diverses
(Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis…) ou à l'origine d'infections alimentaires (Listeria
monocytogenes). La protéine membranaire BmrA de Bacillus subtilis, et ses homologues
chez les bactéries pathogènes citées plus haut, font partie de ces transporteurs d’efflux qui
confèrent la résistance à certains antibactériens. La mise au point et le développement de
nouveaux antibactériens, potentiellement non transportés par ces protéines, passent tout
d’abord par la compréhension de la fonction et de la structure de ces protéines.

1. Donnez la différence majeure qui existe entre une cellule eucaryote et une cellule
procaryote. La cellule eucaryote possède un noyau individualisé, délimité par
l’enveloppe nucléaire, dans lequel on trouve le matériel génétique de la cellule. En
revanche, chez les procaryotes, ce matériel génétique est présent sous la forme d’un
unique chromosome, directement dans le cytosol. Il n’y a pas de compartimentation.
2. Donnez le nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme procaryote
couramment utilisé au laboratoire comme hôte d’expression. Donnez également le
nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme eucaryote unicellulaire
couramment utilisé au laboratoire ou dans l’industrie. Les réponses faisant référence
aux organismes déjà cités dans l’énoncé ne seront pas prises en compte. Escherichia
coli (procaryote), Saccharomyces cerevisiae (eucaryote).

On souhaite tout d’abord procéder à l’amplification du gène codant BmrA dans le génome de
B. subtilis, dont le séquençage complet a été réalisé en 1997 et est disponible dans les
bases de données de biologie. A partir de ces données, on définit un couple
d’oligonucléotides permettant d’initier la réaction de PCR pour amplifier le gène de BmrA.

3. Rappelez le principe et les principales étapes de l’amplification d’un fragment d’ADN


par PCR. Faites un schéma si vous l’estimez nécessaire. Quel est le nom donné aux
deux oligonucléotides définis plus haut ? Quel est leur rôle dans la PCR ? Quel est le
rôle et la particularité de la Taq polymérase ? Schéma dans le cours. Etapes de

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dénaturation, d’hybridation des amorces et de polymérisation (ou élongation). Les
amorces permettent le début de la polymérisation par l’ADN polymérase et
« encadrent » la région à amplifier. La Taq polymérase est une ADN polymérase
thermophile et résistant aux températures élevées utilises lors des cycles de la PCR.
4. A quoi correspond la température de fusion Tm ? Faites-en une estimation pour
l’oligonucléotide suivant : 5’-ATCGGGCTAGCTAATTAGTA-3’ (on pourra utiliser la
formule empirique suivante : Tm (°C) = 4 (GC) + 2 (AT) ). Ecrivez la séquence de
l’oligonucléotide complémentaire en en précisant les extrémités. La température de
fusion est la température à laquelle 50 % des liaisons hydrogène des paires
complémentaires de deux brins d’ADN complémentaires sont établies. AT = 12 et
GC = 8 donc Tm = 56 °C. L’oligonucléotide complémentaire est : 3’ -
TAGCCCGATCGATTAATCAT-5’.

Afin d’isoler la protéine BmrA pour étudier


sa structure et sa fonction, on choisit de
produire cette protéine sous la forme
d’une protéine recombinante dans
l’organisme procaryote indiqué en
réponse à la question 2). Pour cela, on
réalise tout d’abord le clonage du gène
codant BmrA dans le vecteur d’expression
dont la carte est donnée ci-contre.

5. Définir précisément la nature et le rôle des quatre parties du vecteur indiquées par les
flèches dans la figure ci-dessus. Citer un « gène de résistance » fréquemment utilisé
en biologie moléculaire. Site multiple de clonage : région d’ADN contenant un grand
nombre de sites de restriction propices au clonage du gène d’intérêt. Promoteur :
séquence permettant l’activation de la transcription du gène placé en aval, contenant
notamment les sites de fixation du complexe ARN polymérase. Ori : origine de
réplication permettant la fixation de l’ADN polymérase de E. coli et la réplication
autonome du vecteur in vivo. Gène de résistance : gène induisant la résistance à un
agent de sélection placé dans le milieu de culture comme un antibiotique. Le gène
peut par exemple coder une enzyme dégradant l’antibiotique en question : AmpR
code pour une protéine qui dégrade l’ampicilline.
6. A partir des informations figurant dans les deux portions de cartes de restriction ci-
dessous (vecteur d’expression « vide » et ADN amplifié), indiquez le nom de
l’enzyme (des enzymes) de restriction qui peut (peuvent) être utilisé(es) pour cloner
le gène de BmrA. Justifiez votre réponse en précisant le rôle précis de cette (ces)
enzyme(s) dans le processus de clonage du gène BmrA. Le site EcoRI est le seul qui
permet le clonage du gène BmrA : ouverture du vecteur dans MCS par l’enzyme
EcoRI et présence de sites EcoRI de part et d’autre de la séquence codant BmrA.

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7. Combien de plasmides recombinants différents peut-on obtenir après recombinaison
du vecteur initial et du fragment d’ADNc préparé après action de l’enzyme (des
enzymes) de restriction définie(s) à la question 6) ? Le cas échéant, indiquez le
plasmide permettant l’expression correcte du gène BmrA. Deux suivant les
orientations relatives du fragment contenant le gène BmrA et du plasmide lors de la
recombinaison. Seul le plasmide recombinant contenant le gène BmrA orienté 5’3’
en aval du promoteur permettra l’expression de BmrA.
8. Qu’est ce qu’une ADN ligase ? Quel est son rôle en biotechnologie ? Enzyme
catalysant la formation de la liaison phosphodiester entre la fonction 3’-OH du
désoxyribose d’un nucléotide avec le 5’-phosphate du nucléotide consécutif dans un
brin d’ADN (elle catalyse la ligation entre deux nucléotides successifs dans un brin
d’ADN et permet la construction d’ADN recombinant).
9. Donner le nom et le principe d’une technique de biotechnologie utilisée pour faire
« entrer » un plasmide dans une bactérie. Transformation bactérienne : soit chimique
en utilisant un choc thermique et le phosphate de Ca2+ (précipitation des ADN), soit
électroporation.

Après application de la technique indiquée à la question 9) pour le (les) plasmide(s)


recombinant(s) de la question 7), on récupère de nombreux clones bactériens sur un milieu
de culture permettant la sélection des bactéries compétentes. Neuf de ces clones sont
choisis, à partir desquels on extrait les ADN plasmidiques. On utilise l’enzyme de restriction
SacI pour vérifier les ADN plasmidiques purifiés. Le produit de l’action de SacI sur les 9 ADN
plasmidiques est analysé par électrophorèse sur gel d’agarose. Les 9 profils
d’électrophorèse sont indiqués ci-dessous, avec celui d’un mélange de marqueurs de poids
moléculaires (PM).

10. Sachant que la longueur du vecteur d’expression « vide » est l1 = 5 kb et que la


séquence clonée de BmrA a une longueur l2 = 1,8 kb, donnez (a) le nombre de
fragments de restriction attendus après action de SacI sur l’ADN plasmidique des
bactéries compétentes et (b) une estimation de la longueur de chacun d’eux. 2
fragments. Longueur totale de l’ADN recombinant : 5 + 1,8 = 6,8 kb. Recombinaison
avec orientation correcte : 0,5 kb et 6,3 kb. Recombinaison avec orientation
opposée : 1,3 kb et 5,5 kb.

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11. Pourquoi les fragments d’ADN migrent-
ils vers l’anode du dispositif
d’électrophorèse ? Les groupes phosphate
apportent de nombreuses charges
négatives à l’ADN qui est une molécule
fortement chargée négativement.
12. Que pouvez-vous dire du clone n°7 ?
Quelle peut en être la raison ? Découpé en
trois fragments par SacI : mutation
introduite lors des étapes de PCR/clonage
ou recombinaison multiple ayant conduit à
l’apparition d’un autre site SacI.
13. A partir des résultats de
l’électrophorèse, quel clone suggérez-vous
de choisir pour produire la protéine BmrA
par surexpression ? Les clones 1, 2, 4 et 9
sont OK.

PM = Poids Moléculaire

Le clone sélectionné est mis en culture dans les conditions propices à l’expression de la
protéine recombinante. Afin de vérifier l’expression, on lyse les bactéries et on dépose les
extraits brut de protéine sur un gel d’électrophorèse SDS-PAGE.

14. Rappeler le principe de l’électrophorèse SDS-PAGE. Afin d’illustrer votre définition,


vous ferez un schéma et indiquerez les légendes suivantes : anode, cathode, sens de
migration, gel, puits, marqueur de poids moléculaire. Vous pouvez bien entendu
ajouter d’autres légendes si vous le jugez nécessaire. Schéma correct avec les
légendes proposées et les mots Sodium Dodécyle Sulfate (détergent), charge globale
négative, masse moléculaire, dénaturation.
15. La protéine BmrA a une longueur de 589 acides aminés. En comparant les profils
d’électrophorèse de fractions protéiques obtenus pour le clone choisi à la question
13) et pour une bactérie ne possédant pas le plasmide, on constate, dans le premier,
la présence d’une bande intense à environ 70 kDa. Est-ce le résultat attendu ?
Justifiez. 589*110 Da = 64790 Da (masse réelle calculée : 64515 Da). Etant donné la
précision de la technique, on peut dire que tout va bien.

On envisage de purifier la protéine exprimée en utilisant deux techniques


chromatographiques successives : une chromatographie échangeuse d’ions suivie d’une
chromatographie d’exclusion stérique ou tamis moléculaire (filtration sur gel).

16. Le pHi de la protéine est égal à 4,3. Sachant que la plupart des protéines
bactériennes ont un 6,5 < pHi < 8,0, vous choisissez de travailler avec une résine
échangeuse d’anions avec le pH initial, pH = 5,5. Justifiez ce choix. Vous pourrez
éventuellement faire un schéma pour appuyer votre démonstration. Etant donné les
pHi, à pH = 5,5, la plupart des protéines de la bactérie seront plutôt chargées
positivement alors que BmrA sera négative. BmrA sera retenue sur la colonne alors
que les autres protéines seront éluées au pH initial.
17. Rappelez le principe de la chromatographie d’exclusion stérique (filtration sur gel).
Les protéines sont séparées en fonction de leur taille (volume dans l’espace plus

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exactement). Les petites protéines interagissent avec les aspérités de la phase
stationnaire de ce type de colonne alors que les plus volumineuses en sont exclues.
On obtient donc un profil d’élution avec les plus grandes masses en début d’élution et
les plus petites à la fin.
18. A l’issue de cette seconde étape de purification, on observe un pic majoritaire
correspondant à une masse de 130 +/- 4 kDa. Pouvez-vous proposer une explication
pouvant justifier la différence de masse avec le résultat au 15) ? La masse observée
ici est double de celle calculée à la question 15. BmrA est donc éluée sous forme
d’un dimère.
19. Quel est le nom de la représentation suivante de la protéine BmrA, décrite dans la
base de données Protein Data Bank ? Indiquez le nom du résidu situé à l’extrémité
N-terminale. Pouviez-vous prévoir ce résultat ? Pourquoi ? Indiquez l’état d’ionisation
de cette extrémité à pH = pHi. C’est la structure primaire encore appelée séquence
polypeptidique. Il s’agit de la méthionine (Met) qui est toujours à l’extrémité N-
terminale des protéines bactériennes car elle est codée par le codon START ATG. A
pH = pHi, l’extrémité est NH3+.

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1 MPTKKQKSKS KLKPFFALVR RTNPSYGKLA FALALSVVTT LVSLLIPLLT KQLVDGFSMS
61 NLSGTQIGLI ALVFFVQAGL SAYATYALNY NGQKIISGLR ELLWKKLIKL PVSYFDTNAS
121 GETVSRVTND TMVVKELITT HISGFITGII SVIGSLTILF IMNWKLTLLV LVVVPLAALI
181 LVPIGRKMFS ISRETQDETA RFTGLLNQIL PEIRLVKASN AEDVEYGRGK MGISSLFKLG
241 VREAKVQSLV GPLISLVLMA ALVAVIGYGG MQVSSGELTA GALVAFILYL FQIIMPMGQI
301 TTFFTQLQKS IGATERMIEI LAEEEEDTVT GKQIENAHLP IQLDRVSFGY KPDQLILKEV
361 SAVIEAGKVT AIVGPSGGGK TTLFKLLERF YSPTAGTIRL GDEPVDTYSL ESWREHIGYV
421 SQESPLMSGT IRENICYGLE RDVTDAEIEK AAEMAYALNF IKELPNQFDT EVGERGIMLS
481 GGQRQRIAIA RALLRNPSIL MLDEATSSLD SQSEKSVQQA LEVLMEGRTT IVIAHRLSTV
541 VDADQLLFVE KGEITGRGTH HELMASHGLY RDFAEQQLKM NADLENKAG

20. Donnez les structures secondaires susceptibles d’être rencontrées dans la protéine
BmrA. Illustrez-les à l’aide d’un schéma dans lequel vous indiquerez soigneusement
les liaisons chimiques importantes pour ces structures. Cours : Hélices-α, brins et
feuillets-β, tours et coudes, toutes structures stabilisées uniquement par des liaisons
hydrogènes entre les motifs peptidiques C=O et N-H.
21. A quel niveau de structure correspond le résultat obtenu à la question 18) ? Structure
quaternaire.

La protéine ainsi purifiée peut être utilisée pour les études structurales. En parallèle, on
souhaite tester le rôle éventuel de BmrA dans la résistance des bactéries à une collection de
molécules chimiques développées comme antibactériens.

22. Sachant qu’il existe des souches de bactéries dépourvues de BmrA ou d’homologues
de BmrA, proposez un protocole qui permettrait à un laboratoire pharmaceutique
désirant développer ces antibactériens de réaliser un tel crible (3-5 lignes). On peut
transformer l’une de ces souches bactériennes qui ne comportent pas BmrA avec le
plasmide construit et comparer la croissance de ces bactéries transformées avec
celle de bactéries ne possédant pas la protéine du tout. Les bactéries seront testées
dans/sur des milieux contenant les molécules à tester et leur croissance comparée à
celle observée sur un milieu sans ces molécules.

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