Université d’Alger 01 Faculté des Sciences Département SNV

Module TCM (Cours) 3ème année (L3/S5) 2017/2018

16/10/2017
VI.2. Numération par quantification de l’ATP: L’ATP-métrie

Une autre technique dans ce domaine est la détection d'ATP de cellules vivantes. L'ATP est
un produit du métabolisme cellulaire synthétisé dans des organites spécifiques appelés
mitochondries chez les eucaryotes par contre chez les procaryotes au niveau de la membrane
cellulaire (ATP synthase). Il est supposé que toutes les traces d'ATP sont le témoin d'une trace
de vie.

Utilisée dans les domaines de l’agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique, la détection

de l'ATP permet de fournir des comptes de cellules viables en quelques minutes.
Généralement, le niveau d'ATP est détecté en utilisant la quantité de lumière émise. La
technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant
une quantité d’ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise.

VI.2.1. Dosage de l'ATP par bioluminescence

Pour effectuer ce dosage, on mesure la lumière émise par la réaction enzymatique de

bioluminescence utilisant la luciférine et la luciférase de luciole (réaction la plus connue et la
plus étudiée), ainsi que de l’ATP. L’ATP intervient dans l'étape d’activation du complexe
luciférase-luciférine, dont l’oxydation est à l'origine d'une émission lumineuse. L’intensité
lumineuse varie proportionnellement à la quantité d’ATP présente dans le milieu.

Figure 18. Numération par la méthode de l’ATP

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VI.3. Numération par la Technique de la Filtration Direct en Epifluorescence (DEFT)

Ce procédé de comptage de bactéries par microscopie en épifluorescence utilisant un

analyseur d'images a été mis au point pour la première foi pour le dénombrement des
bactéries du lait puis étendu à d'autres produits alimentaires.

La première étape de cette technique de filtration directe par épifluorescence (DEFT) est
l'utilisation de la membrane de filtration pour récupérer les bactéries présentes dans les
aliments ou tout autre support. Une fois que les micro-organismes sont concentrés sur la
surface de la membrane, un colorant fluorescent tel que l'acridine orange est appliqué puis
déposé sur une lame de verre. Les micro-organismes sont examinés en utilisant la microscopie
fluorescente, et le nombre total d'organismes est compté.

Figure 19. Étape de cette technique de filtration directe par épifluorescence (DEFT)

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Figure 20. Aspect de Escherichia coli non-cultivé en utilisant

la technique de la filtration direct en epifluorescence (DEFT).

VI.4. La conductance-métrie

Cette technique est devenue une alternative aux méthodes conventionnelles à partir de 1970
avec le développement des instruments électroniques et de la micro informatique. Le principe
de la conductance-métrie repose sur l'évolution d'un paramètre électrique d'un milieu de
culture au cours du développement bactérien. A température constante, les produits du
métabolisme bactérien font varier la concentration ionique du milieu de culture en jouant le
rôle de dipôles électriques, modifiant ainsi sa conductance. En effet, à mesure que les micro-
organismes poussent, ils utilisent des nutriments dans le milieu, les convertissant en des
molécules plus petites et plus chargées, par exemple des acides gras, des acides aminés et
divers acides organiques. Si des électrodes sont immergées dans le milieu et qu'un courant
alternatif est appliqué, l'activité métabolique des micro-organismes entraîne des changements
détectables dans le flux de courant. Dans ce cas, l’impédance, diminue alors que la
conductivité augmente. Lorsque la population microbienne atteint un seuil de 106-107
UFC/mL, une variation exponentielle de l'impédance peut être observée. Le temps écoulé
jusqu'à ce que ce changement exponentiel se produise est défini comme le temps de détection
et est inversement proportionnel aux nombres microbiens initiaux dans l'échantillon. Ce test
détermine si un échantillon contient au-dessus ou au-dessous d'une concentration
prédéterminée de micro-organismes lors de la conservation des denrées alimentaires liquides.

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VI.5. Méthodes spectroscopiques

Diverses méthodes spectroscopiques ont été proposées comme méthodes rapides et non
invasives pour la détection de la détérioration microbienne dans les aliments. De telles
méthodes sont basées sur la mesure des changements biochimiques qui se produisent dans les
aliments, de la décomposition et de la formation de métabolites par la croissance et l'activité
enzymatique des microorganismes, ce qui aboutit finalement à la détérioration des aliments.

VI.5.1. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR)

Cette méthode implique l'observation de vibrations dans des molécules lorsqu'elles sont
excitées par un faisceau infrarouge. Un spectre d'absorption infrarouge donne une empreinte
digitale comme une signature spectrale, caractéristique de toute substance chimique ou
biochimique. Une telle méthode est donc potentiellement utile pour mesurer les changements
biochimiques dans les aliments en raison de croissance microbienne et pourrait être utilisé
comme indicateur de détérioration. La spectroscopie FT-IR a été employée pour distinguer,
classer et identifier les micro-organismes. Quelques exemples incluent les souches
d'Alicyclobacillus associées à la détérioration du jus de pomme, la discrimination des souches
de Staphylococcus aureus de différents staphylocoques.

Figure 21. Utilisation de la méthode FT-IR pour la détection des microorganismes indésirables du
lait

VI.5.2. La spectroscopie du proche infrarouge (Near-Infrared Spectroscopy)

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C’est une autre méthode spectroscopique qui a été utilisée ces derniers temps pour la
détection de microorganismes d’altération. Elle a l'avantage par rapport à la FT-IR dans la
mesure où il est utilisable dans les emballages alimentaires et peut être utilisé pour examiner
les propriétés en vrac d'un aliment en raison de sa plus grande longueur de trajet. Cette
technique a été appliquée pour prédire la détérioration du muscle de la poitrine de poulet et les
résultats ont montré cette méthode pouvait être utilisé dans les moindres carrés partiels pour
prédire la charge microbienne. Cette technique a été utilisée avec succès dans la prédiction de
la détérioration de la truite.

VI.6. Méthodes émergentes

Il existe un certain nombre de méthodes et de technologies émergentes qui s'avèrent
appropriées pour l'identification et le dénombrement rapide et spécifique de microorganismes
à partir d'échantillons cliniques ou liquides. Bien que la plupart n'aient pas encore été
appliquées pour prédire la flore microbienne totale ou la détérioration des aliments. Certains
de ces technologies sont résumées dans les sections suivantes.

VI.6.1. Cryométrie à flux cellulaire

La cytométrie en flux est une technique qui peut être utilisée pour détecter et énumérer les
cellules lorsqu'elles sont transmises sur une base de cellule individuelle, en suspension dans
un flux de fluide, au-delà d'un faisceau laser. Un cytomètre de flux a typiquement plusieurs
composants clés comprenant une source de lumière ou d'excitation, un laser qui émet de la
lumière à une longueur d'onde particulière, et un flux de liquide qui déplace les cellules
suspendues en suspension dans le laser et un détecteur qui est capable de mesurer les brefs
éclats de lumière émis des cellules qui s'écoulent au-delà du faisceau laser (Figure 22). Ainsi,
les cellules individuelles peuvent être détectées et comptées par le système. La technique a été
appliquée avec succès à l'énumération des micro-organismes dans le lait cru et le lait en
poudre.

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Figure 22. Numération par la méthode de cryométrie à flux cellulaire