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ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
TRABAJO DE GRADO
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
Bogotá, D. C.
Julio de 2008
1
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
2
EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS
PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA
ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
APROBADO
Directora Codirectora
Ma. CLEMENCIA F. DE LA ROTTA Ma. Fernanda Charry
ING. AGR. M. Sc. FITOPATOLOGÍA Microbióloga industrial
Asesora
Zulma Arguelles
Bacterióloga Floramérica C.I
3
EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS
PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA
ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
APROBADO
4
A Dios por haberme brindado paciencia y fortaleza para salir
A “My princess” Valery por ser la luz de mis ojos y darle alegría a mi
vida.
no la habría cumplido.
más difíciles que hemos afrontado y por darme la alegría más grande
6
AGRADECIMIENTOS
7
TABLA DE CONTENIDO
PAGINA
1. Introducción 1
2. Marco Teórico 3
2.1. Generalidades del clavel 3
2.1.1.Suelos y clima 3
2.1.2.Taxonomía del clavel 3
2.2. Proceso de producción de las flores 4
2.3 Principales enfermedades en bancos de enraizamiento en clavel 9
2.3.1. Mancha foliar anillada Cladosporium echinulatatum. 11
2.3.2. Pudrición del tallo por Fusarium roseum 13
2.3.3. Pudrición de la corona Rhizoctonia solani 17
2.3.4. Alternariosis o tizón por Alternaría dianthi 21
2.4. Mecanismos de control de enfermedades 24
2.4.1. Control químico de fungicidas 24
2.4.2. Tipos de fungicidas 25
2.4.3. Mecanismos de acción 27
2.4.4. Resistencia a los fungicidas 27
2.5. Control biológico 29
2.5.1 Organismos útiles en control biológico 31
2.5.2. Mecanismos de control biológico 32
3. Justificación 35
4. Objetivos 36
4.1. Objetivos general 36
4.2. Objetivos específicos 36
5. Materiales y Métodos 37
5.1. Diseño experimental 37
8
5.2. Aislamiento de los hongos 38
5.3. Caracterización macroscópica y microscópica de los hongos 39
5.4. Evaluación del efecto fungicida y fungistático de los fungicidas 39
5.5. Inhibición de crecimiento micelial 40
5.5.1. Método de Bloques de Agar 41
5.5.2. Prueba de acción fungicida o fungistático 42
9
LISTA DE FIGURAS
PÁG
10
Figura 22. Halos inhibición técnica sensidiscos R. solani. 56
Figura 23. Porcentajes inhibición técnica de bloques A. dianthi. 57
Figura 24. Técnica de Bloques A. dianthi frente a Trichoderma spp 58
Figura 25. Técnica de Bloques C. echinulatum frente a Trichoderma spp 58
Figura 26. Porcentajes inhibición técnica de bloques C. echinulatum 58
Figura 27. Técnica de Bloques para F. roseum frente a Trichoderma 60
Figura 28. Porcentajes de inhibición micelial contra F. roseum. 60
Figura 29. Técnica de Bloques para R. solani frente a Trichoderma spp. 61
Figura 30. Porcentajes inhibición técnica de bloques R. solani. 62
Figura No 31. Productos con mayor eficacia para el control de patógenos
en clavel. 63
11
LISTA DE TABLAS
PÁG
Ventajas y Desventajas. 7
12
RESUMEN
Los cultivos de flores día a día enfrentan problemas fitosanitarios donde se incluyen
enfermedades causadas por hongos y bacterias los cuales disminuyen la calidad del
producto final generando grandes perdidas económicas. El interés del proyecto fue
evaluar tres tratamientos para 10 productos utilizados en el control de A. dianthi, C.
echinulatum, F, roseum y R. solani hongos presentes en bancos de enraizamiento
de clavel. Los productos se evaluaron mediante las técnicas in vitro de pozos,
sensidiscos y trozos, lo que permite definir el mejor producto químico o biológico de
control, expresado en porcentaje o halos de inhibición micelial, mediante un análisis
de varianza ANOVA multifactorial.
13
ABSTRACT
The flowers’ crops day by day have problems phytosanitary, illnesses which include
caused by fungi and bacteria which reduce the quality of the final product generating
great economic losses. The interest of the project was to evaluate three treatments
for 10 products used in controlling A. dianthi, C. echinulatum, F. roseum and R.
solani fungus present in rooting banks of carnation. The products were evaluated by
in vitro techniques of wells, absorbent paper disc and cuts, which lets you set the
best chemical or biological control, expressed as a percentage of inhibition or halos
mycelial through an analysis of variance Anova multifactorial. According to the result
obtained in the investigation Trichoderma spp was the best product, which showed
an effective inhibition of fungal pathogens evaluated, followed by prochloraz,
carboxin + capture, and etridiazol metalaxyl + mancozeb. For treatments was found
statistically significant difference being the Treatment 1 showed that the most
effective in evaluating products. The statistical analysis no showed significative
differences in the fungus growth obtained for absorbent paper disc and wells
techniques, since the results for both techniques were homogeneous. The action
fungistática or fungicides of the products are not evaluated by the technical
achievement of blocks as they found disadvantages in the assembly of the
technique.
14
1. INTRODUCCION
15
La industria de flores desde su iniciación en Colombia en el año 1967 alcanzó una
posición destacada en el mercado internacional a lo largo de los años. Gracias a la
oportuna intervención del gobierno y grandes empresarios la industria de las flores
para exportación ha presentado un incremento constante en la producción y
exportación; actualmente ocupa el tercer lugar como productor de flores. (Díaz et
al., 2002).
Los floricultores han encaminado sus esfuerzos a una producción sostenible con un
desarrollo de los canales logísticos y de comercialización, permitiéndoles un mayor
conocimiento de sus mercados, especialmente el de Estados Unidos, país al cual se
dirigen la mayoría de las exportaciones. Según cifras de Asocolflores (2007) de las
exportaciones en el 2007 el 81 % de estas están dirigidas a Norte america, Rusia
3.8 %, Reino Unido 3.7 %, Canada 2.1 %, Japon 1.8 % y Alemania 1.1%.
16
3. MARCO TEÓRICO
Es una planta herbácea, anual o perenne, de tallos articulados y nudosos, sus hojas
son lineales, rígidas y paralelinervias de color verde azuloso, revestidos de una capa
cerosa y dispuestas en partes opuestas y decusadas. Las flores se producen al final
de los tallos y son hermafroditas, con cáliz gamosépalos, verde coriáceo,
persistentes. Los pétalos están fuertemente sujetos por el cáliz y son de colores
muy diversos (Botón et al., 1994)
Reino: Plantae
Phylum: Angiospermas
Clase: Dicotiledoneas
Subclase: Archiclamideas
Orden: Centrospermales
Familia: Caryophyllaceae
Genero: Dianthus
(Pérez, 2003).
Existen dos grupos hortícolas de clavel que son: Clavel estándar y Clavel miniatura.
Para exportaciones comerciales este cultivo se produce bajo cubierta, ya que de
esta forma se obtiene una calidad muy superior a la producida en campo abierto
(Barbosa, et al., 1993)
18
Propagación de plantas madres
Es el área del cultivo donde se siembran las plantas madre para producción de
esquejes; los esquejes seleccionados se agrupan en conjuntos de 25- 50 unidades y
se tapan con plástico, colocándolos en cuartos refrigerados (Asocolflores, 2002).
Bancos de enraizamiento
Son sitios destinados para colocar los esquejes sin raíz, obtenidos en el proceso
anterior, con el objeto de lograr su enraizamiento, en un sustrato determinado estéril
e inocuo (Asocolflores, 2002).
Esta operación se hace normalmente a mano; un buen esqueje debe tener dos
nudos bien desarrollados y otro en formación. Al cortarlo se dejan en la planta un
par de hojas para que siga brotando. El cultivo de plantas madres dura un año y se
puede sacar una media de 20 esquejes por planta (Garcia et al., 1977).
Para inducir la emisión de raíces la base del esqueje se trata con sustancias
estimulantes de enraizamiento; el compuesto mas utilizado ha sido por tradición el
ácido indól butírico (IBA), que debe ser disuelto y diluido en alcohol y agua destilada
19
(Pizano, 2000). Después de tratada la base del esqueje, se puede poner este a
enraizar o guardarlo en frigorífico (Garcia et al., 1977).
Antes de enterrar los esquejes, el sustrato debe estar húmedo al menos hasta
capacidad de germinación. Si se humedece cuando se encuentra relativamente
seco, es recomendable voltearlo con alguna herramienta limpia, para asegurar un
porosidad máxima (Pizano, 2000).
20
Tabla 1. Comparación entre sustratos utilizados en el enraizamiento: Ventajas y
Desventajas.
SUSTRATO DE
VENTAJAS DESVENTAJAS
ENRAIZAMIENTO
Bajo costo Pesada
Arena Gruesa (de mina)
Limpia Mala retención de agua
Posible contaminación
Pesada
Arena fina (de rio) Bajo costo
Excesiva retención de
agua
Bajo costo
Porosidad ( si no es demasiado Consistencia
Escoria ( De carbón coke)
fina) Posible contaminación
Medianamente pesada
Limpia ( si se maneja
adecuadamente) Uniformidad
Cascarilla de arroz quemada
De peso ligero Se requiere vapor
Porosidad
Preparación uniforme
Escoria/cascarilla (50/50) Porosidad Se requiere vapor
Atractiva para los pájaros
Ligera, Costo
Mezcla de turba y perlita
Porosidad Puede tener pH bajo
Limpias, Mecanización
Manejo Mínimo Costo
Plugs o pellets de turba Raíces son visibles Adaptación al suelo d
Mayor densidad campo
Menos nebulización/m2
Fuente: (Pizano, 2000)
Enraizamiento de esquejes
La altura del sustrato debe ser de unos 10 cm, y los esquejes van enterrados hasta
el primer par de hojas. El sustrato debe ser renovado o desinfestado a fondo antes
de colocar una nueva serie de esquejes (Garcia et al., 1977).
21
La decisión mas importante, clave para el enraizamiento exitoso de los esquejes de
clavel, reside en el sustrato utilizado. El costo es por supuesto un factor limitante,
dado el volumen requerido. El material debe estar libre de contaminación si no se
dispone de esterilización con vapor. Un buen esqueje debe formar raíces
abundantes aunque no excesivas y en todo caso, sobre la totalidad de su base. Los
esquejes de enraizamiento pobre o parcial deben ser eliminados (Pizano, 2000)
Producción
Una vez enraízados los esquejes se llevan al área de producción para ser
sembrados; en esta área se llevan a cabo diferentes sub-procesos como son:
preparación y desinfestación del suelo, siembra, riego y fertilización, control de
plagas y enfermedades, cosecha de flor y labores de renovación del cultivo, entre
otros (Asocolflores, 2002).
22
Post-cosecha
23
Alternaria dianthi Tizón alternaría
Alternaria dianthicola Tizón alternaría
Stemphyllium botryosum Pudrición del cáliz
Peronospora dianthicola Mildeo velloso
Cladosporium echinulatum Mancha foliar
Hongos
Fusarium roseum Pudrición del tallo
Fusarium oxysporum Marchitez vascular
Botrytis cinerea Moho gris
Pythium ultimun Pudrición
Rhizoctonia solani Pudrición
Fuente: APS
24
2.4.1. MANCHA FOLIAR ANILLADA Cladosporium echinulatum
(Heterosporium echinulatum).
La enfermedad fue registrada por primera vez en Colombia en 1927 en los jardines
de algunas casas del Departamento de Antioquia. Las primera epidemias de
mancha foliar anillada se presentaron en 1972 y 1973 y llevaron incluso al instituto
Colombiano Agropecuario a tomar medidas cuarentenarias en algunos cultivos, con
la prohibición de exportar claveles hasta tanto la enfermedad no se erradicara
(Pizano, 2000).
TAXONOMIA
Division: Eumycota
Subdivision: Deuteromycotina
25
Clase: Hyphomycetes
Orden: Moniliales
Familia: Dematiaceae
Genero: Cladosporium
Especie: echinulatum
La mancha foliar anillada se presenta en las hojas, los tallos y los sépalos según la
susceptibilidad de la variedad. En las hojas los primeros síntomas corresponden a
puntos cloróticos de apariencia aceitosa y redondeada, luego las manchas
aumentan de tamaño presentándose un borde rojizo, menores a 1 mm de diámetro,
los cuales son difíciles de evidenciar a trasluz (Figura 1). En algunos casos las
26
manchas presentan un halo violáceo alrededor de la lesión, observándose tanto en
el haz como en el envés (Barbosa, 1993) (Pérez, 2003).
27
completas. Es la enfermedad más importante en cultivo de clavel en bancos de
enraizamiento (Pérez, 2003).
28
produciendo colonias de un típico color rojizo, que sirve para diferenciarlas de
aquellas de F. oxysporum, de color morado (Pizano, 2000).
TAXONOMÍA
Reino: Fungi
División: Deuteromycota
Clase: Deuteromycetes
Orden: Moniliales
Familia: Tuberculariaceae
Genero: Fusarium
Especie: roseum
Este hongo tolera niveles bastantes bajos de acidez, se ha establecido que no tiene
requerimientos especiales para germinar, sólo necesita agua y es muy adaptable a
una gran diversidad de condiciones nutricionales del medio de cultivo (Pérez, 2003).
Este hongo requiere un punto de entrada a los tejidos susceptibles (usualmente una
herida), razón por la cual ataca principalmente tres estadios diferentes de su ciclo
productivo: a nivel de la propagación en las plantas abuelas y plantas madres, a
través de los puntos de cosecha de los esquejes y en los esquejes que se
encuentran en proceso de enraizamiento, pues la base del esqueje es una vía
abierta para la infección; y en plantas que se encuentran en procesos de floración, a
través de los puntos de cortes de las flores (Figura 2) (Pizano, 2000).
29
Figura 2. Ciclo de infección Fusarium sp en trigo.Fuente:
http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/fusarium/fusarium.htm
30
Figura 3. Síntomas ocasionados por Fusarium roseum en hojas de clavel. Fuente: el Autor
31
Dentro de cada uno de los tres principales grupos de Rhizoctonia sp pueden
realizarse subdivisiones basadas en un fenómeno conocido como Anastomosis
Hifal, implementado en el año de 1969 por Parmeter, el cual es la manifestación de
incompatibilidad somática o vegetativa entre aislamientos (Cardona et al., 2002).
Esta reacción puede alcanzar la fusión de las paredes y las membranas de las hifas
de los aislamientos enfrentados (reacción de auto-anastomosis, con formación de
una hifa heteocariotica), como puede no presentarse (reacción de incompatibilidad
somática); aquellas reacciones intermedias, en las cuales las paredes y
posiblemente las membranas, reconectan pero no se fusionan, ocurre típicamente
entre miembros de mismo grupo de anastomosis (Cardona et al., 2002).
TAXONOMIA
Reino:Fungi
Filo: Basidiomycota
Clase: Basidiomycetes
32
Subclase: Agaricomycetidae
Orden: Polyporales
Familia: Corticiaceae
33
Figura 4. Ciclo de infección de Rhizoctonia sp.
Fuente: www.apsnet.org/.../Rhizoctonia/discycle.htm
34
2.4.4. ALTERNARIOSIS O TIZÓN POR Alternaría dianthi.
Los tizones causados por Alternaria sp fueron el problema mas serio para la
producción de clavel en la primera mitad del siglo pasado en EE.UU. Esta
enfermedad reporta grandes perdidas en cultivos al aire libre o bajo invernadero
cuando la humedad relativa es muy alta y se combina con la alta temperatura
(Pizano, 2000).
TAXONOMIA
Reino:Fungi
Filo: Ascomycota
Clase: Dothideomycetes
35
Subclase: Pleosporomycetidae
Orden: Pleosporales
Familia: Pleosporaceae
Genero: Alternaria
Especies: dianthi
Síntomas: Se desarrollan manchas sobre las hojas, tallos e incluso las flores,
inicialmente pequeñas de color morado, que pronto adquieren un borde amarillento,
tornándose el centro de color gris oscuro. En casos avanzados las manchas pueden
unirse afectando brotes complejos e incluso plantas enteras (Pizano, 2000).
36
Figura 6. Ciclo de infección Alternaria sp
Fuente: www.apsnet.org/.../PotatoTomato/discycle.htm
En las hojas los primeros síntomas son generalmente pequeños puntos de color
violeta. Bajo condiciones húmedas estos aumentan hasta formar manchas típicas de
hasta 1,5 cm de diámetro. Las márgenes de las manchas son usualmente violáceas
en color y con el centro marrón grisácea (Figura 7). Pueden estar presentes esporas
negras en esta área central, dando a la mancha una apariencia sucia, las lesiones
37
llegar a unirse produciendo la muerte de la hoja. Algunas variedades son más
susceptibles que otras, especialmente las de origen Mediterráneo (Pérez, 2003).
38
Aspectos biológicos: debe ofrecer un control de la enfermedad eficaz y
consistente. No debe ser toxico a la concentración recomendada. No debe
afectar adversamente a otras partes del ecosistema del cultivo.
Aspectos toxicológicos: residuos que queden en el cultivo no deben ser un
problema para el consumidor. No debe construir un peligro durante la aplicación.
Aspectos de la formulación: debe ser seguro al almacenarse y transportarse. El
método de formulación debe aumentar su eficiencia como fungicida. Debe ser
fácil de aplicar a la concentración precisa (Ochoa, 2004).
SEGÚN SU TOXICIDAD
Compuesto cuya DL50 va de 0.50mg del toxico por kg de peso. Estos productos son
muy peligrosos, solo pueden manejarse bajo normas de seguridad muy estrictas y
por personal preparado.
Se encuentran en ella productos con DL50 superior a 500mg del toxico por kg de
peso (Patiño et al., 2001).
39
CLASIFICACIÓN SEGÚN SUS USOS
Cutícula de la planta
Células subcuticulares
(ACFCA, 1994).
40
2.5.3. MECANISMOS DE ACCIÓN
Todos los fungicidas son inhibidores metabólicos; es decir, estos bloquean algunos
procesos metabólicos vitales de la célula. Por consideración se han clasificado los
deferentes mecanismos de acción dentro de tres amplios grupos:
41
Menor permeabilidad de las membranas celulares: en este caso, los
individuos resistentes escapan a la acción fungicida porque las membranas
celulares no permiten la entrada del producto; los que si permiten la entrada, son
susceptibles (Guzmán, 1997).
Rutas metabólicas alternas: en este caso el toxico toma otra ruta en los
individuos resistentes, de manera que esquivan los sitios de acción de los
patógenos (Guzmán, 1997).
Han sido diferentes los factores que han impulsado un mayor desarrollo del control
biológico en este campo; tal vez uno de los más importantes es la percepción que
se tiene del impacto negativo en el medio ambiente que ocasionan los pesticidas y
la calidad de los productos agrícolas para el consumo humano y animal. La relativa
facilidad en el manejo de ciclos biológicos bajo condiciones controladas, la
determinación de enemigos naturales y la cría masiva de estos, han sido factores
que han permitido un mayor desarrollo en el control biológico de plagas (Duarte et
al., 1996).
43
Resulta, por una parte, que la actividad de los organismos vivos es afectada
sustancialmente por las condiciones ambientales, de tal forma, que el control que
ejercen estos agentes pueden resultar inconsistentes cuando se trata de
generalizar, resultados de investigaciones realizadas en un lugar determinado
(Duarte et al., 1996).
44
rotíferos, virus, bacterias y hongos. Dentro del grupo de los hongos se destacan el
genero Trichoderma sp, el cual posee varias características que lo ubican como un
buen agente antagonista de otros hongos fitopatógenos (Elias et al., 1984).
45
2.6.2. MECANISMOS DE CONTROL BIOLOGICO
COMPETENCIA
HIPERPARASITISMO
46
Un ejemplo que ilustra este mecanismo es Trichoderma spp el cual es bien
conocido como un micoparásito de R. solani. Típicamente, sus hifas son atraídas
hacia los talos de los hongos patógenos alrededor de las cuales se enroscan,
ocasionando la desintegración de las células del hongo hospedero. Tal
hiperparasitismo durante el monocultivo de un hospedero susceptible puede reducir
las densidades de inóculo del patógeno hasta niveles indeterminables, por ejemplo
para R. solani (Duarte et al., 1996).
ANTIBIOSIS
PROTECCION CRUZADA
47
3. JUSTIFICACIÓN
48
4. OBJETIVOS
49
5. MATERIALES Y METODOS
Este estudio se realizo en las instalaciones del Laboratorio Dr. Calderón Asistencia
Técnica Agrícola L.T.D.A. ubicado en la ciudad de Bogotá y en el Laboratorio de
sanidad vegetal de Floramerica ubicado en el municipio de Cajica.
50
Efecto fungistático: Capacidad de un fungicida para inhibir la germinación de las
esporas o el desarrollo inicial de un hongo, mientras permanezca en contacto
continuo (Achicanoy, 1981).
Para los aislamientos de los hongos se utilizó agar PDA para: R. solani y Fusarium
roseum y para el aislamiento de C. echinulatum y Alternaria sp se utilizó agar V8
especifico para la recuperación de estos microorganismos (Anexo 1).
51
Aislamiento en agar PDA y V8: Se realizaron cortes de aproximadamente 4mm de
diámetro proveniente de plantas sintomáticas; se desinfestaron con hipoclorito de
sodio al 2,5% v/v por un tiempo de 5 minutos. Posteriormente se realizó un lavado
con agua destilada estéril y se secó el material con papel absorbente estéril. En
condiciones de esterilidad se introdujeron los bloques del material vegetal en agar
PDA y agar V8 (Quintero, et al., 1997).
La evaluación del efecto preventivo de los fungicidas, tuvo como finalidad verificar
el efecto fungicida y/o fungistático que ejerce cada producto sobre los hongos
evaluados Tabla 3..
52
Tabla 3. Fungicidas evaluados para cada cepa con sus respectivos tratamientos.
Carboxin +
Vitavax 1 1.25 0.75
Captan
Hidroxido de
Kocide 1 1.25 0.75
cobre
Trichoderma
Trichoderma spp 2 2.5 1.5
Alternaria spp
dianthi
Dithane Mancozeb 1.2 1.5 0.9
Cladosporium
echinulatum Sportak Procloraz 0.6 0.75 0.45
Trichoderma
Trichoderma spp 2 2.5 1.5
spp
Metalaxyl +
Ridomil gold 1.2 1.5 0.9
Mancozeb
Rhizoctonia
solani Carboxin +
Pro-gro 1.2 1.5 0.9
Thiram
Cobre
Kocide 1 1.25 0.75
maetalico
Fuente: El autor
53
5.5. INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO MICELIAL
Con el fin de evitar que las cajas con el medio mas fungicida se contaminaran, la
mezcla se realizó en cámara de flujo laminar, adicionando lentamente la solución del
fungicida al agar PDA ó V8 fundidos a 45 – 50 ºC, para evitar inactivar cualquier
componente del principio activo del fungicida. Por ultimo se mezcló hasta lograr la
homogenización completa, del medio más el fungicida (Díaz, 1986).
En el centro de las cajas de petri que contenían las respectivas dosis del producto
químico incorporado al medio de cultivo, se colocó un bloque de PDA de 5 mm de
diámetro con el crecimiento micelial del microorganismo ensayado, previamente
incubado durante 7 días; las cajas de petri se mantuvieron a una temperatura de 22
+/- 2 ºC. (Achicanoy, 1991). Los testigos absolutos se inocularon sobre medios sin
solución fungicida.
54
diámetro en mm del crecimiento del hongo influenciado por el fungicida, expresado
en porcentaje, tal como se especifica en la siguiente formula:
% IM = CML – CMI
x 100
CML
55
cajas de petri; con ayuda de un rastrillo las esporas se removieron de la superficie
del agar, obteniendo de esta forma la solución madre (Sharvelle, 1983)
A partir de esta solución, se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3, hasta obtener
un recuento de 106 conidios/ mL, el recuento se realizo en cámara de Neubauer;
para la evaluación de uso la siguiente formula:
Montaje de La Técnica
56
5.6.2. Método de los discos de papel
Para comparar los resultados obtenidos con las diferentes especies de hongos
evaluados se realizo un ANOVA multifactorial, en el cual el halo de inhibición (HIMM
ó HINIB) y el porcentaje de inhibición micelial (PINB), fueron tomados como las
variables dependientes (Eje Y) y las técnicas, los fungicidas y los tratamientos como
las variables independientes o factores (Eje X). Se trabajo con un rango de
confianza del 95%.
57
6. RESULTADOS
A B
58
Cladosporium echinulatum: Macroscópicamente las colonias son de color verde
oliva a verde oscuro, rugosas, pulverulentas, cubiertas por un micelio bajo y velloso
(Figura 9 A). Microscópicamente las hifas son demateaceas, septadas, presenta
conidióforos ramificados de color café (Figura 9 B). (Patiño et al., 2001)
A B
59
A B
A B
60
6.2. EVALUACION IN VITRO DE FUNGICIDAS
Alternaria dianthi
61
En la Figura 12 se muestran los halos de inhibición generados por el fungicida para
las técnicas de pozos y sensidiscos; Igualmente se observa el control, el cual
contiene agua destilada y donde no hay presencia de halo de inhibición.
FITOTRIPEN
A B
Figura 12. Halos de inhibición A. dianthi. A. Técnica de pozos para Procloraz.. B. Técnica
de Sensidiscos para Trichoderma spp
62
TECNICA DE SENSIDISCOS A. dianthi T1 T2 T3
28,00
24,00
HALOS DE INHIBICION MICELIAL
20,00
16,00
12,00
(mm)
8,00
4,00
0,00
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp
FUNGICIDAS
Cladosporium echinulatum
63
Figura 14. Halos de inhibición C. echinulatum, Técnica de pozos para Procloraz.
30
25
HALOS DE INHIBICION MICELIAL
20
15
(mm)
10
0
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma
spp
FUNGICIDA
64
Fusarium roseum
A B
Figura 16. Halos de inhibición F. roseum. A. Técnica de pozos para Carboxin + Captan B.
Técnica de Pozos para Trichoderma spp.
65
Figura 17. Halos de inhibición F. roseum. Técnica de sensidiscos para
Carboxin + Captan.
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Difeconazol Etridiazol Hidroxido de Carboxin + Trichoderma
cobre Captan spp
FUNGICIDA
66
Figura 18. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos para la
evaluación de fungicidas contra F. roseum.
Rhizoctonia solani
A B
67
Figura 20. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Sensidiscos
para Trichoderma spp
Figura 21. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Pozos para Metalaxil + Mancozeb.
68
TECNICA DE SENSIDISCOS R. solani
25,00
HALOS DE INHIBICION
T1 T2 T3
20,00
MICELIAL(mm)
15,00
10,00 17
5,00
0,00
Carboxin + Metalaxyl + Hidroxido de Etridiazol Trichoderma
thiram Mancozeb Cobre spp
FUNGICIDA
Figura 22. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos para la
evaluación de fungicidas contra R. solani.
Alternaria dianthi
69
A partir de la prueba Tukey, se encontraron tres comportamientos diferentes de
fungicidas; en el primer grupo: Carbendazim, presentó el menor porcentaje de
inhibición del crecimiento micelial en el ensayo. En el segundo grupo: Procloraz, en
el tercer grupo: Trichoderma spp. y Mancozeb presentaron altos porcentajes de
inhibición micelial, siendo los que permitieron la mayor inhibición, pero al evaluar su
acción como fungicida, se encontro que el único producto que presento tal
comportamiento para A. dianthi fue Trichoderma spp., por el contrario los demás
productos evaluados presentaron solamente una acción fungistática (Fig. 23 y 24).
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp
FUNGICIDAS
Figura 23. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en
la evaluación de fungicidas contra A. dianthi.
70
Figura 24. Técnica de Bloques de agar para A. dianthi Frente a Trichoderma spp
Cladosporium echinulatum
Para esta técnica no fue necesario realizar análisis de varianza ANOVA, teniendo
en cuenta que todos los fungicidas con sus respectivos tratamientos fueron
efectivos para inhibir el crecimiento micelial de C. echinulatum y presentaron el
mismo porcentaje de inhibición. Sin embargo, únicamente Trichoderma spp.
presentó un efecto inhibitorio eficaz sobre el patógeno (Figura 25 y 26).
Figura 25. Técnica de Bloques de agar para C. echinulatum frente a Trichoderma spp
71
TECNICA DE BLOQUES DE AGAR Cladosporium echinulatum
T1 T2 T3
100
90
80
% DE INHIBICION
70
60
50
40
30
20
10
0
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma
spp
FUNGICIDAS
Figura 26. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en
la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum
Fusarium roseum
72
Figura 27. Técnica de Bloques de agar para F. roseum frente a Trichoderma spp
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Difeconazol Etridiazol Hidroxido Carboxin + Trichoderma
de cobre Captan spp
FUNGICIDA
73
Figura 28. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en
la evaluación de fungicidas contra F. roseum.
Rhizoctonia solani
Figura 29. Técnica de Bloques de agar para R. solani frente a Trichoderma spp.
100,00
90,00
% DE INHIBICION MICELIAL
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Carboxin + Metalaxyl + Cobre Etridiazol Trichoderma
thiram Mancozeb metalico spp
FUNGICIDA
Figura 29. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en
la evaluación de fungicidas contra R. solani.
75
7. DISCUSIÓN
76
actúa inhibiendo enzimas importantes en el ciclo de Krebs impidiendo la producción
de ATP, y la biosíntesis de acido ribonucleico (Tabares, 2002).
Para el fungicida procloraz, se presento una eficaz inhibición en las tres técnicas
empleadas; esto se debe a que es un fungicida sistémico que actúa en la inhibición
de síntesis de ergosterol (compuesto celular de gran importancia en la estructura de
la membrana de diversos hongos). Al realizar las pruebas confirmatorias en la
técnica de bloques, se comprobó la viabilidad del patógeno contrario a los reportes
de Everett et al.,(1996) donde el fungicida afecto irreversiblemente el patógeno.
Para la técnica de bloques se obtuvo una inhibición eficaz por parte de etridiazol, al
igual que en los estudios realizados por Heungens et al., (2005), en donde el
mecanismo de acción fue mencionado anteriormente.
78
Con respecto a la técnica de bloques de agar, no se obtuvieron los resultados
esperados, debido a que bajo esta técnica no se pudo evaluar el efecto fungicida y
fungistático ya que se presentaron varias desventajas.
Por otro lado, en esta técnica se pueden presentar resultados erróneos debido a
que no se asegura el contacto directo del patógeno con el fungicida.
79
8. CONCLUSIONES
80
evaluados, sin descartar que al entrar en contacto con los tejidos la planta pueda
inducir algún mecanismo de resistencia.
También se observo que con la dosis recomendadas por las casas formuladoras
para los productos químicos ensayados, se inhibió el crecimiento de todos los
microorganismos que con frecuencia se presentan en los esquejes durante el
proceso de enraizamiento, sin embargo dada la presencia de fungicidas
sistémicos, es probable que sea necesaria su confirmación mediante nuevas
pruebas tanto de laboratorio como de campo.
81
9. RECOMENDACIONES
82
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
83
ingeniero Agrónomo. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Agronomía.
Bogotá D.C. 148 págs.
84
ELIAS, P. 1984. Contribución al estudio del control biológico de Fusarium
oxysporum, Rhizoctonia solani y Pythium sp. mediante especies de Trichoderma
spp. Trabajo de grado para optar por el titulo de Biologo. Universidad Nacional De
Colombia. Facultad de ciencias. Bogotá D.C. 79 págs.
GILMAN, J., 1963. Manual de los hongos del suelo. Compañía editorial continental.
Edición 2 ed. Mexico. 572 págs
86
Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias
Básicas.
MEYER, M., BUENO, C., SOUZA, N., YORINORI, J. 2006. Effect of doses of
fungicides and plant resistance activators on the control of Rhizoctonia foliar blight
of soybean and Rhizoctonia solani AG1-IA in vitro development. Crop protection Vol
25. 848-854 págs.
OMAR, I., O`NEILL, T., ROSSALL, S. 2006. Biological Control Of Fusarium Crown
And Root Rot Of Tomato With Antagonistic Bacteria And Integrated Control When
Combined With The Fungicide Carbendazim. Plnat Pathology. Vol 55 . Pag 92 – 99.
SHARVELLE, E. 1983. The nature and uses of modern fungicides. Editorial Burgess
publishing company. Mineapolis. 308 págs.
89
PAGINAS WEB
ASOCOLFLORES. 2002.
www.upme.gov.co/.../AGRICOLA%20Y%20PECUARIO/Guia%20ambiental%20para
%20el%20subsector%20Floricultor.pdf. Consulta 5 febrero 2008.
AGROGEA
www.zoetecnocampo.com/.../fusarium/fusarium.htm Consulta 2 De Julio 2008
AGROBIOLOGICOS SAFER
www.agrobiologicossafer.com/Trichoderma spp.htm Consulta 2 De Julio 2008
BAYER CROPSCIENCE
www.bayercropscience.com.ec/productdesc.aspx?prodid=43 Consulta 2 De Julio
2008
CHEMIPLANT
www.chemiplant.com.ar/es/nuestros_productos/fungicidas/kocide_101.htm Consulta
2 De Julio 2008
FLORINTEGRAL S.A.
www.florintegral.com.co/producto.php?id=productofi17 Consulta 2 De Julio 2008
SYNGENTA S.A.
www.syngentaagro.es/es/productos/producto.aspx?id=60&cat=15 Consulta 2 De
Julio 2008.
90
BAYER CROPSCIENCE
http://www.bayercropscience.com.pe/web/index.aspx?articulo=264 Consulta 2 De
Julio 2008
91
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR PDA
Disolver 39 g por litro de agua y esterilizar en autoclave (15 min a 121°C). Para
ajustar el pH a aproximadamente 3.5, incorporar una solución estéril de acido
tartarico al 10% a razón de 14ml/L (Merck, 1999).
AGAR V8
92
ANEXO 2
AZUL DE LACTOFENOL
Fenol 20g
Glicerina 40ml
Ácido láctico 20g
Agua destilada 20ml
Azul de algodón 0.05g
93
ANEXO 3
MAIN EFFECTS
A: DOSIS 114,689 2 57,3444 5,32 0,0068
B: FUNGICIDA 3731,07 4 932,767 86,49 0,0000
C: REPLICA 1,68889 2 0,844444 0,08 0,9248
D: TECNICA 16,9 1 16,9 1,57 0,2143
94
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
KOCIDE 18 0,0 X
DIFECONAZOL 18 0,0 X
TERRAZOLE 18 0,0 X
FITOTRIPEN 18 12,8889 X
VITAVAX 18 13,3889 X
95
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
T3 30 4,13333 X
T1 30 4,83333 XX
T2 30 6,8 X
T1 - T2 -1,96667 2,02502
T1 - T3 0,7 2,02502
T2 - T3 *2,66667 2,02502
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 2815,1 2 1407,55 7,58 0,0018
B:FUNGICIDA 13074,8 4 3268,71 17,60 0,0000
C:REPLICA 0,0615148 2 0,0307574 0,00 0,9998
96
All F-ratios are based on the residual mean square error.
T3 15 70,9804 X
T1 15 80,8627 XX
T2 15 90,3529 X
T1 - T2 -9,4902 12,1648
T1 - T3 9,88235 12,1648
T2 - T3 *19,3725 12,1648
KOCIDE 9 49,1503 X
VITAVAX 9 76,6013 X
DIFECONAZOL 9 89,6732 X
TERRAZOLE 9 94,1176 X
97
FITOTRIPEN 9 94,1176 X
98
Tukey
Tukey
99
ANEXO 4
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 575,444 2 287,722 20,06 0,0000
B:FUNGICIDA 2109,04 3 703,014 49,02 0,0000
C:REPLICA 2,11111 2 1,05556 0,07 0,9291
D:TECNICA 0,125 1 0,125 0,01 0,9259
T3 24 3,54167 X
T1 24 6,70833 X
T2 24 10,4583 X
100
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-3,75 2,62438
T1 - T3 *3,16667 2,62438
T2 - T3 *6,91667 2,62438
CARBENDAZIM 18 0,0 X
DITHANE FMB 18 5,83333 X
SPORTAK 18 6,61111 X
FITOTRIPEN 18 15,1667 X
101
ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 222,81 2 111,405 9,15 0,0009
B:FUNGICIDA 30368,5 3 10122,8 831,36 0,0000
C:REPLICA 1,69132 2 0,845662 0,07 0,9331
RESIDUAL 340,935 28 12,1763
T1 12 69,0928 X
T3 12 69,3038 X
T2 12 74,4726 X
T1 - T2 *-5,37975 3,52577
T1 - T3 -0,21097 3,52577
T2 - T3 *5,16878 3,52577
* denotes a statistically significant difference.
102
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
CARBENDAZIM 9 22,6442 X
SPORTAK 9 73,8397 X
DITHANE FMB 9 93,6709 X
FITOTRIPEN 9 93,6709 X
103
104
ANEXO 5
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 568,361 2 284,181 31,48 0,0000
B:FUNGICIDA 2701,82 3 900,606 99,76 0,0000
C:REPLICA 5,36111 2 2,68056 0,30 0,7441
D:TECNICA 74,0139 1 74,0139 8,20 0,0057
T3 24 4,0 X
T1 24 7,16667 X
T2 24 10,875 X
105
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-3,70833 2,08211
T1 - T3 *3,16667 2,08211
T2 - T3 *6,875 2,08211
CARBENDAZIM 18 0,0 X
DITHANE FMB 18 3,55556 X
FITOTRIPEN 18 9,77778 X
SPORTAK 18 16,0556 X
106
107
ANEXO 6
MAIN EFFECTS
A:REPLICA 1,48889 2 0,744444 0,07 0,9294
B:TECNICA 179,211 1 179,211 17,65 0,0001
C:DOSIS 482,756 2 241,378 23,78 0,0000
D:FUNGICIDA 8828,04 4 2207,01 217,40 0,0000
108
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
T3 30 7,76667 X
T1 30 10,8333 X
T2 30 13,4333 X
T1 - T2 *-2,6 1,96471
T1 - T3 *3,06667 1,96471
T2 - T3 *5,66667 1,96471
-
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 18 0,0 X
TERRAZOLE 18 0,0 X
PROGRO 18 9,22222 X
RIDOMIL 18 21,8333 X
FITOTRIPEN 18 22,3333 X
109
Contrast Difference +/- Limits
-
FITOTRIPEN - KOCIDE *22,3333 2,96415
FITOTRIPEN - PROGRO *13,1111 2,96415
FITOTRIPEN - RIDOMIL 0,5 2,96415
FITOTRIPEN - TERRAZOLE *22,3333 2,96415
KOCIDE - PROGRO *-9,22222 2,96415
KOCIDE - RIDOMIL *-21,8333 2,96415
KOCIDE - TERRAZOLE 0,0 2,96415
PROGRO - RIDOMIL *-12,6111 2,96415
PROGRO - TERRAZOLE *9,22222 2,96415
RIDOMIL - TERRAZOLE *21,8333 2,96415
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 231,927 2 115,964 3,72 0,0340
B:FUNGICIDA 7040,18 4 1760,05 56,45 0,0000
C:REPLICA 18,8662 2 9,43311 0,30 0,7408
110
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE LSD PARA LAS DOSIS
T3 15 84,8571 X
T1 15 85,1429 X
T2 15 89,8095 X
T1 - T2 *-4,66667 4,13514
T1 - T3 0,285714 4,13514
T2 - T3 *4,95238 4,13514
111
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
KOCIDE 9 61,5873 X
PROGRO 9 92,8571 X
FITOTRIPEN 9 92,8571 X
TERRAZOLE 9 92,8571 X
RIDOMIL 9 92,8571 X
Contrast Difference +/- Limits
112
113