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UNIDAD 1. HISTOLOGÍA Y SUS MÉTODOS DE ESTUDIO

Tema 1. Introducción a la histología

Objetivo terminal:

Destacar la importancia del estudio de la histología.

DEFINICIÓN DE HISTOLOGÍA

De acuerdo a la traducción literal histología significa el estudio del tejido. Deriva del griego

histos: tejido de telar y logos: estudio o conocimiento de.

Las primeras investigaciones histológicas fueron posibles en el año 1600, cuando se

incorporó el recién inventado microscopio a los estudios anatómicos. La anatomía, que es el

estudio de la forma y estructuras de los organismos vivos, comienza a dividirse gradualmente en

dos ramas: 1) anatomía macroscópica, que comprende el estudio de las estructuras visibles a

simple vista y, 2) anatomía microscópica, la cual requiere el uso del microscopio.

La anatomía microscópica incluye las siguientes ciencias:

 Citología. Estudia la estructura microscópica de las células.

 Histología. Estudia la estructura microscópica de los tejidos.

 Organología. Estudia la estructura microscópica de los órganos.

HISTORIA DE LA HISTOLOGÍA

El fundador de la histología fue Marcelo Malpighi (1628-1694). En el año 1665, Robert Hook

estudió el tejido vegetal en cortes de corcho y observó que el tejido vegetal estaba formado por
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pequeñas cámaras a las que denominó célula, también fue quien desarrolló el primer microscopio

compuesto y es a partir de este que los avances tecnológicos lograron diseñar los más modernos

microscopios usados en la actualidad. Bichat a finales de 1700, introduce el término tejido.

Brown en el año 1833, descubre el núcleo celular. Los adelantos tecnológicos conducen al

desarrollo de la generalización más básica de la ciencia la “Teoría Celular”, que fue desarrollada

por Schleiden (1838), para el reino vegetal y por Schwann (1839), para el reino animal y no es

más que el reconocimiento de que la célula es el elemento fundamental del organismo, al que, en

última instancia se deben trasladar todos los procesos vitales y que las plantas y los animales son

agrupaciones de estas unidades vivas potencialmente independientes. Remak en el año 1852,

descubrió que las células se originan por división de otras células y que el proceso se origina en

el núcleo. Virchow (1852) confirma este hallazgo en la famosa teoría “ovnis cellula e cellula”

(toda célula se origina de otra). Koelliker en el mismo año, establece la clasificación de los cuatro

tejidos fundamentales, es decir, tejido epitelial, tejido conectivo, tejido muscular y tejido

nervioso. En el año 1932, Knoll y Ruska construyen el primer microscopio electrónico.

OBJETIVOS DE LA HISTOLOGÍA

 Comprender la estructura de las células, tejidos y órganos a nivel microscópico incluyendo

relaciones tridimensionales entre sus componentes bioquímicos.

 Comprender la relación entre la subestructura y funciones normales de las células, tejidos y

órganos.

 Establecer una base para el aprendizaje de la histología, relación entre las estructuras

anormales de tejidos y órganos, y los defectos funcionales.

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 Proporcionar una base para el estudio de los tejidos y órganos enfermos.

En base a lo expuesto, la histología ocupa un lugar central entre la educación y la

investigación médica. Al explicar las interrelaciones entre células, los tejidos y la estructura y

composición molecular de los órganos, la histología representa el nexo de unión entre la

bioquímica, la fisiología y la genética por un lado, y los procesos patológicos y la clínica por el

otro lado.

COMPONENTES QUÍMICOS ELEMENTALES DE LA CÉLULA

Las estructuras microscópicas son una ordenación concreta de los componentes químicos, los

mismos se dividen en inorgánicos, los cuales son agua y sales minerales, y orgánicos que

incluyen los carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

De los elementos de la tabla periódica sólo una veintena conforman a los seres vivos y de

acuerdo al porcentaje de átomos en la materia viva se clasifican en tres grupos:

Primer grupo. Incluye carbono (C), hidrógeno (H), nitrógeno (N) y oxígeno (O 2). Son

indispensables para la formación de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos.

Comprenden entre el 2 y 60% de la composición celular.

Segundo grupo. Son sodio, potasio, cloruro, los cuales forman las soluciones salinas;

magnesio, calcio intervienen como elementos indispensables en ciertas reacciones enzimáticas;

fósforo participa en la transferencia de energía y azufre interviene en la formación de los enlaces

peptídicos en las proteínas. Este grupo representa entre el 0,02-0,1% de los componentes de la

materia viva.
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Tercer grupo. Corresponde a boro, silicio, vanadio, manganeso, hierro, cobalto, cobre, zinc y

molibdeno. Son indispensables para el funcionamiento de las enzimas.

Componentes inorgánicos

Agua

Es el mayor componente de la célula, representa el 70-95% del peso de la célula. El agua es

indispensable dado a que casi todas las reacciones químicas y, en consecuencia, las actividades

celulares, ocurren en medio acuoso. Esto se debe a una de las propiedades más importantes y

básicas del agua, la capacidad de actuar como solvente de sustancias con cargas y polares, lo

cual, a su vez, se relaciona con el pequeño tamaño de la molécula de agua y su fuerte polaridad.

Se puede considerar al agua como un dipolo, puesto que su molécula posee un reparto

asimétrico de las cargas. El agua se encuentra en la célula en dos formas: estado libre y ligada.

Estado libre. Interviene en el metabolismo y desempeña un papel de:

a) Solvente estable:

La solubilidad del agua está dada por su polaridad y aptitud de ligar el H+, así por los grupos

funcionales de la molécula a disolver. Los grupos funcionales miscibles en agua son:

- Hidroxilo (OH): alcoholes (metílicos, etílicos, propílicos y glicerol).

- Carboxilo (COOH): ácidos (propiónico, acético, fórmico, entre otros).

- Cetónicos (CO): cetonas.

- Aldehidos (CHO): acetoaldehidos.

- Amino (NH2): aminas (metilaminas, etilaminas).

- Amido (CONH2): amidas (tormamida, acetamida, entre otros).

b) Medio ionizante:
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Provoca la disociación de las sustancias llamadas electrolitos débiles (COOH y NH 2, son los

más abundantes), que liberan o aceptan un protón H+ en medio acuoso.

Estado ligado. Representa sólo el 5% del total del agua, está ligada a las proteínas donde

cumple funciones de constitución.

Sales minerales

Las sales minerales están presentes en el medio intracelular como en el medio extracelular;

sin embargo, sus concentraciones difieren.

Las sales minerales se consiguen combinadas a carbohidratos, lípidos o proteínas, o bien,

libres. En este caso, la mayor parte se encuentran en estado ionizado por el agua en aniones y

cationes.

Es especialmente característico que la célula posea una elevada concentración de potasio y

magnesio, mientras que el sodio, calcio y cloro están más elevados en el líquido extracelular. La

mayor concentración de aniones celulares corresponde al fosfato (tabla 1).

Tabla 1. Concentración en miliequivalentes por litros de agua de los diferentes iones en los
medios intra y extracelular.
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IÓN MEDIO INTRACELULAR MEDIO EXTRACELULAR

POTASIO 120 5
SODIO 5 145
CALCIO 2 4
MAGNESIO 30 3
CLORO 5 105
BICARBONATO 10 28
FOSFATO 98 3
SULFATO 20 1

Las sales minerales tienen como función:

 Mantenimiento de la presión osmótica: las diferencias de las concentraciones iónicas tanto

dentro como fuera de la célula permiten mantener una misma presión osmótica intra y

extracelularmente.

 Mantenimiento del pH: los iones H2PO4- y HPO4= constituyen un sistema tampón que

estabiliza el pH de la sangre y líquido tisular.

 Mantenimiento del equilibrio ácido-básico.

 Actúan como cofactores imprescindibles de procesos enzimáticos.

Componentes orgánicos

Todas las sustancias orgánicas contienen carbono y éstas comprenden los hidratos de carbono,

lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

Hidratos de carbono
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Son moléculas formadas por C, H y O, que tienen la función de fuente de energía y de

componente estructural para la célula. Se clasifican en monosacáridos, disacáridos y

polisacáridos.

De los monosacáridos las pentosas ribosa y desoxirribosa son las más importantes, dado a que

forman parte de los ácidos nucleicos. La hexosa glucosa, es la principal fuente de energía de la

célula. También son hexosas importantes la galactosa, que forma parte del disacárido lactosa y la

fructosa componente de la sacarosa.

Los disacáridos se forman por la unión de dos monosacáridos con eliminación de una

molécula de agua. Los más importantes son la sacarosa, es el azúcar común que se acumula en

los vegetales, y la lactosa, es el azúcar de la leche, que se sintetiza y secreta por las células de las

glándulas mamarias.

Los polisacáridos se forman por la unión de muchas moléculas de monosacáridos. El de

mayor importancia es el glucógeno formado por varias moléculas de glucosa y representa una

sustancia de reserva energética de la célula animal, se puede detectar en numerosos tejidos y

órganos, no obstante, la mayor parte de él se encuentra en las fibras musculares y hepáticas.

Los polisacáridos pueden formar combinaciones con lípidos, denominándose, glucolípidos,

los cuales intervienen en la construcción de las membranas celulares, o con proteínas como por

ejemplos glucoproteínas, que forman parte de las membranas celulares y son componentes de las

secreciones de muchas células; y los glucosaminoglucanos, componentes esenciales del tejido

conectivo. A diferencia del glucógeno, el glucosaminoglucano incluye más de un tipo de

monosacárido en el polisacárido.

Lípidos
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Representan un grupo heterogéneo de sustancias con la característica común fundamental de

ser pocos solubles en agua, pero muy solubles en solventes orgánicos (alcohol, éter, benceno y

xileno).

Los lípidos se encuentran en la célula como reserva energética y componente estructural, bajo

la forma de membrana. Los lípidos se clasifican en lípidos simples y complejos.

Los lípidos simples están formados por la combinación de un alcohol y un ácido graso. Los

más importantes son los triglicéridos y su función principal es de depósito de energía

concentrada, acumulándose como gotas en las células, y el esteroide colesterol, que compone las

membranas celulares y también interviene en la formación de distintas hormonas, entre ellas, las

hormonas sexuales.

Los lípidos complejos son ésteres de ácidos grasos y alcohol, que además contienen una base

aminada y ácido fosfórico. Los fosfoaminolípidos son un grupo importante, dado a que se

encuentran extensamente distribuidos, entre ellos se destacan las lecitinas, es un componente de

las membranas celulares y las esfingomielinas forman parte de la capa de mielina de las fibras

nerviosas.

Proteínas

Son polipéptidos formados por 50 o más aminoácidos. Un polipéptido es un polímero

formado por aminoácidos que se unen covalentemente unos a otros en secuencia mediante enlace

peptídico.

Las proteínas tienen un importante rol en la estructura y función de las células y el organismo

como unidad. Desde un punto de vista estructural, forman parte de moléculas estructurales de las

células, estructuras extracelulares como las fibras de colágeno que contribuyen a la fuerza de
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tracción de tejidos como tejido conectivo. Por otra parte, las proteínas forman enzimas,

anticuerpos y hormonas. Juegan un papel importante en el metabolismo celular, ya que la

mayoría de las reacciones químicas son catalizadas por enzimas.

Ácidos nucleicos

Son macromoléculas con importancia biológica esencial, dado que las características

hereditarias tienen su base química en el ADN. Existen dos tipos ADN, presente en el núcleo y

ARN, se sintetiza en el nucléolo y pasa al citoplasma. Las macromoléculas están formadas por

nucleótidos, cada una compuesta por una base nitrogenada, una pentosa y ácido fosfórico.

PROTOPLASMA

Estos componentes bioquímicos, orgánicos e inorgánicos, forman la sustancia viva

denominada protoplasma, y la integración de las funciones de estos componentes le otorgan al

protoplasma las propiedades de la vida que señalan las funciones de la célula:

Absorción. Es la capacidad de la célula de captar sustancias del medio entorno.

Secreción. Ciertas células tiene la capacidad de transformar las sustancias absorbidas en

productos específicos, para luego ser eliminados bajo la forma de secreción.

Excreción. Es la capacidad de las células de eliminar el producto de desecho de su

metabolismo.

Irritabilidad. Es la capacidad de las células de reaccionar ante un estímulo. Esta propiedad

está más exacerbada en las células nerviosas.

Conductividad. Es la capacidad de las células de transmitir un impulso.

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Contractilidad. Es una capacidad especial de las células musculares, donde se acortan en una

dirección determinada, como reacción a un estímulo.

Respiración. Se refiere a la respiración celular donde la célula produce energía a través de la

utilización del oxígeno absorbido en la oxidación de nutrientes.

Reproducción. La célula tiene la capacidad de renovarse por medio del crecimiento y

división. El crecimiento está limitado a la síntesis de material celular, mientras que la división

celular es el origen de una célula a partir de otra preexistente.

Tema 2. Métodos histológicos

Objetivo terminal:

Describir los diferentes métodos de estudios histológicos.

MICROSCOPIO

Existen dos tipos de microscopios los microscopios ópticos de luz y los microscopios

electrónicos.

Propiedades de las lentes

El poder de resolución es el factor más significativo de una buena imagen, el mismo se define

como la menor distancia que debe existir entre dos puntos del objeto para poder visualizarse por

separados. El poder de resolución determina la calidad (claridad y mayor riqueza en detalles) de

la imagen y depende de la longitud de onda de la luz empleada y la apertura numérica del

objetivo y condensador.
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El aumento es el producto de la multiplicación del aumento del objetivo por el del ocular, esta

propiedad de la lente permite amplificar el tamaño del objeto en estudio.

La apertura numérica (NA) es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las

refracciones de los rayos de luz producidos por los pequeños detalles de la muestra y depende del

índice de refracción en que está trabajando la lente y la mitad del ángulo superior del haz de luz.

El valor de NA aumenta a medida que el objetivo se acerca a la muestra.

El índice de refracción es la relación existente entre la velocidad de la luz en el vacío y el

medio que atraviesa. Es una medida del índice de dispersión de la luz.

Se manejan los índices de tres medios como aire que es 1, vidrio que es 1,52 y aceite de

cedro, 1,515. Este último es el que se utiliza con los objetivos de inmersión (son aquellos que

requieren de un líquido interpuesto entre la lente frontal y la superficie de la muestra), dado que

es el líquido cuyo índice de refracción se acerca al vidrio (lentes, cubre y portaobjetos)

estableciendo un medio homogéneo al paso de la luz a través de la muestra anulando la brusca

refracción de los rayos de luz al pasar del vidrio (cubre y portaobjetos)-aire, y aire-lente del

objetivo, tal como acontece cuando se utilizan los objetivos secos.

Tipos de microscopios de luz

Microscopio compuesto de campo brillante. Es el de mayor uso en la práctica. Se

caracteriza porque está compuesto por una serie de lentes y el campo de la muestra está

completamente iluminado. La bombilla es eléctrica con alambre de tungsteno. Las muestras

histológicas tienen que ser traslúcidas y colorearse para proporcionar contraste.

Microscopio de campo oscuro. Usa un condensador especial, donde la luz que llega al

objetivo es la dispersada por las pequeñas partículas de la muestra. La muestra se observa como
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una estructura luminosa sobre un fondo oscuro. Se usa para el estudio de estructuras vivas muy

pequeñas con poco contraste con el microscopio de campo brillante, como es el caso del

Treponema pallidum en bacteriología clínica.

Microscopio de contraste de fase. Se fundamenta en las diferencias de índice de refracción

de los componentes tisulares, que son transformadas en diferencia de intensidad que son

distinguidas por el ojo humano. Posibilita la observación de muestras sin colorear, por lo que es

útil para estudiar material vivo como los cultivos de tejidos.

Microscopio de interferencia. Tiene el mismo principio que el microscopio de contraste de

fase; sin embargo, permite cuantificar la masa de los componentes de las células y tejidos, al

comparar un haz de luz de referencia con las diferencias de fases.

Microscopio de fluorescencia. Usa como fuente de luz la luz ultravioleta, la cual se hace

incidir sobre la muestra marcada con compuestos fluorescentes (fluorocromos), estos son

excitados y emiten una luz visible al ojo humano. Se utiliza en las técnicas de

inmunufluorescencia o tinciones fluorescentes.

Microscopio de luz polarizada. Se basa en la propiedad de ciertas estructuras de dividir la

luz polarizada (luz que vibra en un sólo plano) en dos componentes con velocidades distintas

(estructuras birrefringentes o anisotrópicas). Aquellas estructuras que no dividen la luz polarizada

se denominan isotrópicas. Se utiliza para obtener información respecto a la estructura a nivel

molecular y el estudio de células vivas.

Microscopio de luz ultravioleta. Utiliza luz ultravioleta que tiene la mitad de longitud de

onda (250 nm) que la luz visible (500 nm), duplicando el poder de resolución. La formación de la
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imagen se registra sobre una película fotográfica. Se utiliza en la detección de ácidos nucleicos

que absorben esta luz.

Tipos de microscopios electrónicos

Los microscopios electrónicos emplean como fuente luminosa un haz de electrones con

longitud de onda aproximada de 0,005 nm, elevando notablemente el poder de resolución. Las

lentes son campos electromagnéticos que modifican el trayecto del haz de electrones en una

atmósfera al vacío, al igual como se refracta el haz de luz visible en las lentes de cristal. La

imagen formada se registra sobre una pantalla fluorescente o película fotográfica, dado a que el

haz de electrones no es visible por el ojo.

Existen dos tipos de microscopios electrónicos:

Microscopio electrónico de transmisión. Permite la observación en detalles a escala

macromolecular. Los electrones atraviesan el objeto.

Microscopio electrónico de barrido. El haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que

choca contra ella, permite una gran magnificación de las imágenes.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS HISTOLÓGICOS

Los métodos histológicos se clasifican como:

1) Los basados en la observación directa de células y tejidos vivos.

2) Los que analizan material muerto o inanimado.

En un punto medio se ubican los métodos de centrifugación que permiten el aislamiento de

componentes de células vivas.

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VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LOS MÉTODOS HISTOLÓGICOS

Ventajas. Permiten la observación de estructuras microscópicas y la interpretación de los

procesos fisiológicos.

Limitaciones. La obtención de material para estudio histológico interfiere con el desarrollo

de los procesos que se estudian. Ciertos procedimientos utilizados implican muchas posibilidades

de modificación del aspecto de las estructuras, debidas a causas técnicas y dejan sin respuestas

numerosas incógnitas referidos a los procesos celulares vitales.

MÉTODOS BASADOS EN LA OBSERVACIÓN DE CÉLULAS Y TEJIDOS VIVOS

Coloración vital y supravital

Existen colorantes pocos inocuos que son captados selectivamente por las células, de modo,

que la localización del colorante permite detectar grupos celulares o sus organelas. En la

coloración vital se inyecta el colorante en el animal vivo. En la coloración supravital, el colorante

se agrega directamente sobre la célula o tejido luego de haber sido extraído del organismo, por

ejemplo (p. ej.): azul de tripán, carmín de litio, rojo neutro, verde jano, alizarina.

Cultivo de tejidos

Permiten los estudios de crecimiento, diferenciación y división de células. Comprende la

aplicación de ciertas técnicas para el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos. Tipos:

Cultivo celular. Es el crecimiento y expansión de las células in vitro procedentes de la

migración o disgregación espontánea, mecánica o enzimática de un tejido determinado, p. ej.:

cultivos de células sanguíneas para el estudio del número y morfología de los cromosomas
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(cariotipo). Cultivo de células HeLa para la formación de híbridos (fusión de dos células) en la

elaboración de anticuerpos monoclonales, cuya utilización tiene gran importancia en la

investigación inmunohistoquímica. Cultivo de oocitos útil en las técnicas de fertilización.

Cultivo de tejidos y órganos. Comprende la transferencia de tejidos u órganos (embrionarios

o maduros) a un medio de cultivo. Son útiles en los estudios de la clonación donde se cultiva

tejido ovárico o el órgano para la recuperación de oocitos que sirven como células receptoras.

Fraccionamiento celular

Se basa en el uso de la fuerza centrífuga para separar los componentes celulares, de acuerdo

con el coeficiente de sedimentación de cada uno de ellos. Esta técnica permite determinar la

composición bioquímica y funcional in vitro de las organelas celulares. Se reconocen dos tipos:

Centrifugación deferencial. Es la más usada, previamente, el tejido es homogeneizado. El

sobrenadante es sometido a fuerzas centrífugas crecientes. Las organelas más densas precipitan

primero. El sobrenadante de cada centrifugación es sometido a una fuerza centrífuga mayor,

separándose así los componentes celulares.

Centrifugación por gradientes de densidad. En la centrifugación por gradiente de densidad

el homogeneizado se coloca en una solución cuya concentración aumenta a medida que se acerca

al fondo. Tras la aplicación de una fuerza centrífuga las organelas se detienen en la profundidad

de la solución que posea su misma densidad. Permite obtener fracciones más puras.

MÉTODOS BASADOS EN EL ANÁLISIS DE MATERIAL MUERTO

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El método de uso cotidiano en histología es el que permite obtener preparaciones histológicas

permanentes (cortes) para la observación al microscopio óptico.

El material o espécimen a emplear se clasifica según la procedencia del tejido y la finalidad

de estudio. Se distinguen dos tipos:

Material histológico. Es toda muestra de tejido obtenida de animales o individuos sanos, con

la finalidad de estudiar la composición y estructura normal. Los tejidos normales de humanos se

obtienen habitualmente a partir de cadáveres.

Material anatomopatológico. Son muestras que proceden de animales o individuos

enfermos, que son utilizadas para el diagnóstico o investigación etiológica de la enfermedad. El

material anatomopatológico procede de necropsias, biopsias, extensiones citológicas o patología

experimental.

El conjunto de manipulaciones y métodos empleados para la confección de preparados

histológicos recibe el nombre de “Procesamientos Histológico de Tejidos” y comprende los pasos

de fijación, inclusión, corte y coloración.

Procesamiento histológico de tejidos para microscopia óptica

Fijación

El objeto de la fijación es conservar la composición química y estructural del tejido con la

menor alteración posible con respecto a la que poseía in vivo, por ello debe realizarse en el

menor tiempo posible para evitar la autólisis y putrefacción.

Según su mecanismo de acción los agentes fijadores se clasifican en dos grupos:

1) Fijadores por métodos físicos.

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2) Fijadores por métodos químicos.

En el primer caso se emplea el enfriamiento por congelación que evita la autólisis y

putrefacción. Los fijadores por congelación son útiles para estudios de la morfología y función de

tejidos que requieren mantener intacta la estructura antigénica y actividad enzimática.

En el segundo caso emplea sustancias líquidas que bloquean la autólisis al desnaturalizar e

insolubilizar las proteínas, algunas evitan también el crecimiento bacteriano. La fijación con

procedimientos químicos puede ser por:

 Inmersión: se sumerge la muestra en el líquido fijador.

 Perfusión: se administra el fijador por vía vascular a los tejidos y células antes de estos ser

extirpados (p. ej.: el embalsamamiento).

Los fijadores químicos se clasifican de acuerdo a su mecanismo de acción sobre los tejidos:

 Fijadores por deshidratación del tejido: es eliminada el agua libre y ligada de las proteínas,

estas últimas precipitan. Este cambio proteico es conocido con el nombre de

desnaturalización. Son ejemplos la acetona, alcohol etílico, alcohol metílico. Son útiles para

el mantenimiento de la estructura antigénica en los estudios histoquímicos e

inmunohistoquímicos.

 Fijadores por cambios en el estado coloidal de las proteínas: precipitan las proteínas sin

sustraer el agua de los tejidos, al cambiar el punto isoeléctrico de ellas. Son ejemplos el ácido

acético, ácido crómico, ácido tricloroacético. Se utilizan para estudios del núcleo, sistema

nervioso, descalcificación ósea.

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 Fijadores que actúan por formación de sales con los tejidos: el agente fijador es un catión,

por lo general mercurio o cromo, o un derivado orgánico como el ácido pícrico. Son fijadores

de acción rápida y provocan un notable endurecimiento por lo que es recomendable usarlos

en mezclas fijadoras. Son ejemplos el cloruro de mercurio, dicromato de potasio, ácido

pícrico. Son excelentes en la conservación de los caracteres morfológicos celulares, no

disuelven lípidos, ni glucógeno. Son excelentes mordientes intensificando las coloraciones

nucleares y citoplasmáticas.

 Fijadores por reticularización de las proteínas: se produce desnaturalización de las

proteínas por rotura de los puentes de hidrógenos, con la formación ulterior de una malla

reticular por asociación entre los grupos químicos desenmascarados por el líquido fijador. Por

lo común el mismo fijador forma nexos de unión con los grupos químicos contribuyendo con

la formación de la red. En este grupo se encuentra el fijador más usado para los estudios

histológicos en la microscopia óptica; el formaldehido o formalina al 40%. Es el más barato,

preserva bien las células y tejidos, no endurece mucho, es un buen desinfectante, produce

escasa retracción tisular, es compatible con la mayor parte de las tinciones.

Mezclas fijadoras

Proceden de la combinación de fijadores simples, los cuales pretenden sumar las ventajas de

cada uno de ellos amortiguando sus inconvenientes. Se clasifican como:

 Contienen formol: líquido de Bouin, Zenker formol.

 No contienen formol: líquido de Zenker.

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Cuando se utiliza la fijación química es necesario tres pasos previos a la inclusión, de modo

de acondicionar al tejido extrayéndole toda el agua y sustituirla por un medio que sea miscible en

el medio de inclusión, continuándose por lo tanto con la deshidratación, aclaración e infiltración.

Deshidratación

El objetivo es extraer el agua completamente y sustituirla por alcohol. El tejido es sometido a

concentraciones crecientes de alcohol hasta 100%.

Aclaramiento e infiltración

El objetivo es aclarar el tejido, lo que se logra sustituyendo el alcohol por la sustancia

aclarante, en la microscopia óptica se usa el xileno. La infiltración tiene como objeto impregnar

el tejido con el medio a utilizar en la inclusión, como la parafina para la microscopia óptica. El

fundamento del proceso es que el medio de inclusión ocupe los espacios intra y extracelulares

ocupados anteriormente por el agua y se logra eliminando la sustancia aclarante.

Inclusión

La finalidad es proporcionar un bloque rígido que sirva de soporte para el tejido en la

elaboración de cortes. El medio de inclusión fundido a 56 ºC es colocado en unas “L” o envases

metálicos, el tejido se lleva al fondo dándole una orientación determinada, una vez solidificada la

parafina se obtiene el tejido incluido en un bloque (fig. 1).

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Figura 1. Dibujo esquemático del procedimiento de inclusión del tejido

con parafina fundida a 56 ºC empleando como moldes unas L.

Cortes

En la microscopia óptica los cortes deben ser finos oscilando entre 5-10 m de espesor. El

equipo utilizado es el micrótomo que emplea cuchillas de acero inoxidable que proporcionan

cortes entre 3-10 m. El micrótomo también puede utilizar cuchillas de diamante que

proporcionan cortes de 1-5 m. El criostato es un micrótomo que proporciona cortes más gruesos

entre 10-30 m, y es empleado en el procedimiento de fijación por congelación (fig. 2).

a b c

Figura 2. Dibujo esquemático de varios tipos de micrótomos. a) micrótomo tipo Minot; b) micrótomo de congelación,
utiliza gas carbónico y proporciona cortes de 5, 10, 15, 20 m.; c) criostato, tiene una cámara frigorífica donde se
encuentra el micrótomo, utiliza gas freón.

Montaje
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En la microscopia de luz los cortes se montan en láminas portaobjetos. En el montaje se hace

necesario la utilización de sustancias que permitan fijar el corte al portaobjeto como albúmina,

gelatina (fig. 3).

Figura 3. Dibujo esquemático del montaje de los cortes. Los cortes son
colocados en un baño de María a 40ºC, luego son colocados en láminas
portaobjetos, dejándose secar a 37ºC.

Tinción

Tiene como finalidad destacar los componentes celulares y tisulares. Los mecanismos de

tinción son físicos, fisicoquímicos e histoquímicos.

Físicos. Se fundamentan en la propiedad de disolución e impregnación del colorante sobre el

tejido. En la primera el colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente que actúa como

transporte, difundiendo el colorante hacia el tejido. Es ejemplo el Sudán III, que es utilizado para

la coloración de las grasas (fig. 4). En el segundo caso el colorante por su gran tamaño o

precipitación formando agregados insolubles, queda atrapado entre las mallas celulares y fibras

que constituyen los tejidos. Entre estos están la coloración argéntica para el sistema nervioso o

tejido conectivo reticular (fig. 5) o las coloraciones selectivas para fibras de colágeno como las

tinciones tricrómicas de Mallory y van Gieson.

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Figura 4. Fotomicrografía de corte de tejido adiposo con la coloración Sudan III. Las células adiposas se tiñen de color
pardo por acción del colorante Sudan III que por ser más soluble en el tejido difunde hacia éste.

Figura 5. Fotomicrografía que muestra fibras reticulares (color negro) teñidas con coloración argéntica. Método de
impregnación, basado en la precipitación de sales de plata sobre estructuras fibrosas.

Físicoquímicos. Se basa en la atracción de cargas opuestas y en la organización molecular del

colorante. Un ejemplo de atracción de cargas es el método de tinción empleado en la rutina como

lo es la coloración de hematoxilina y eosina (H-E). La hematoxilina es el colorante básico que

imparte color violeta y tiñe estructuras ácidas (carga negativa) de la célula como el núcleo; las

estructuras con afinidad por el colorante básico son denominadas basófilas. La eosina es el
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colorante ácido (carga negativa) y se fija a las estructuras básicas (carga positiva) de la célula

como el citoplasma, el color proporcionado es rosado; las estructuras afines a los colorantes

ácidos se les denominan acidófilas. En la tabla 2 se presentan las características tintoriales de

diversas células y tejidos cuando se usa la técnica de H-E (fig. 6).

La organización molecular del colorante, se refiere a la tinción de metacromasia en donde el

colorante con un color previo interacciona con una estructura fuertemente ácida, se organiza

molecularmente conduciendo a un cambio de color. El azul de toluidina derivado de la anilina es

un colorante que expresa este efecto de metacromasia, el cual al interaccionar con los grupos

sulfatos de los glucosaminoglucanos cambia de su color original azul a púrpura (fig. 7).

Histoquímicos. Se basa en la reacción química de grupos específicos. Un ejemplo es la

coloración de PAS (Peryodic Acido Schiff). Se fundamenta en la oxidación de los grupos

hidroxilos por el ácido peryodico con la formación de grupos aldehidos, el reactivo de Schiff

(leucofucsina) reacciona con ellos formando un producto estable de color rojo magenta (fig. 8).

Útil para la detección de carbohidratos como el glucógeno y glucoproteínas.

Métodos complementarios

Citoquímicos e histoquímicos. Son métodos que tienen como objeto estudiar la estructura

química y composición de los tejidos. Se basan en reacciones químicas específicas de grupos.

Uno de los criterios para que un método sea histoquímico es que debe conservar la composición

química normal, p. ej.: PAS, reacción de Feulgen para detección de ADN.

Histoquímica enzimática. Comprenden métodos que tienen como objetivo demostrar la

actividad enzimática, se fundamenta en la especificidad de sustrato. Se usa en la detección de

fosfatasas alcalina en los neutrófilos que en la clínica es útil en la diferenciación de las leucemias.
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También estos métodos son usados para determinar la actividad osteoblástica, detectar defectos

enzimáticos en la biopsia yeyunal.

Métodos inmunohistoquímicos. Son métodos que se basan en el uso de anticuerpos

marcados con enzimas o fluorocromos, con el fin de localizar moléculas específicas, enzimas,

hormonas, estructuras tisulares, p. ej.: inmunofluorescencia, ELISA.

Hibridación in situ. Es una técnica molecular que se basa en la capacidad de las cadenas de

ácido nucleico de unirse entre sí. Permite demostrar la presencia y secuencias de ácidos nucleicos

sobre cortes histológicos o extensiones citológicas. Dentro de las aplicaciones están detección de

virus, antígenos virales, oncogenes en tejidos normales y neoplásicos.

Tabla 2. Características tintoriales de distintas estructuras con hematoxilina y eosina (H-E).

Células y componentes extracelular Coloración

Núcleo
Heterocromatina (cromatina laxa) Azul
Eucromatina (cromatina condensada) Violeta
Nucléolo Azul

Citoplasma
Ergastoplasma (retículo endoplasmático rugoso) Azul
Citoplasma en general Rosado
Filamentos citoplasmáticos Rosado
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Material extracelular
Fibras colágenas Rosado

Fibras elásticas Rosado, en general no se

distinguen de las colágenas,
para verlas se usan técnicas
especiales

Fibras reticulares Rosado, en general no se

distinguen de las fibras
colágenas, para verlas se
requieren de técnicas
especiales

Sustancia fundamental Azul, pero sólo si es

abundante como en la matriz
cartilaginosa
Matriz ósea (descalcificada) Rosado

Membrana basal Rosado

Figura 6. Fotomicrografía de tejido epitelial teñido con H-E. Los núcleos (flechas) se tiñen de color violeta y el
citoplasma (puntas de flecha) de color rosado.
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Figura 7. Fotomicrografía de mastocitos teñidos con azul de toluidina. Los gránulos citoplasmáticos son
metacromáticos, los cuales se hacen evidentes con el colorante azul de toluidina que los colorea de púrpura.

Chapa estriada

Células
caliciformes

Figura 8. Fotomicrografía de corte de intestino delgado teñido con PAS. Los células caliciformes secretan el
carbohidrato mucina, este componente se pone en evidencia cuando reacciona con el colorante de PAS, distinguiéndose
de color rojo magenta. Por otra parte, la chapa estriada de las células epiteliales, presentan un glucocálix que contiene
polisacáridos y también son PAS positivo.