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Aspectos generales de la tecnología del ADN recombinante

A mediados de la década de 1970, inició el desarrollo de nuevas formas de


estudio del ADN que condujeron a métodos de investigación radicalmente
novedosos, como la tecnología del ADN recombinante, en la cual los
investigadores empalman ADN de diferentes organismos en el laboratorio. Un
objetivo de esta tecnología es permitir a los científicos obtener muchas copias de
un segmento específico de ADN para fines de estudio. Ya que continuamente
están surgiendo nuevos métodos para analizar el ADN, aquí no se intentará
explorarlos en detalle. En lugar de ello, se analizan algunos de los métodos
importantes que han aportado un fundamento para las tecnologías comúnmente
utilizadas por los genetistas moleculares.
En principio se considera cómo los estudios de secuencias de ADN han ayudado a
los científi cos a entender la organización de los genes y la relación entre los
genes y sus productos. En efecto, la mayor parte de nuestro conocimiento actual
de la estructura y control de la expresión de los genes eucariotas, y de sus
funciones durante el desarrollo de un organismo, proviene de la aplicación de esos
métodos. La secuenciación de ADN también ha revolucionado sistemáticamente
ayudando a aclarar las relaciones evolutivas.
Este capítulo también explora algunas de las aplicaciones prácticas de las
tecnologías del ADN. Una de las áreas de estudio, de rápido avance, es la modifi
cación molecular, que altera el ADN de un organismo para producir nuevos genes
con nuevos rasgos. La modifi cación molecular, también llamada ingeniería
genética, puede tomar múltiples vías, que van desde la investigación básica a la
producción de cepas de bacterias para fabricar productos proteínicos de diversa
utilidad, hasta el desarrollo de plantas y animales que expresan genes ajenos.
El desarrollo de la clonación de ADN, de la modifi cación molecular, y de técnicas
relacionadas ha transformado el punto de vista de las personas acerca de la
biotecnología, que es el uso comercial o industrial de células u organismos.
Actualmente, la biotecnología incluye numerosas aplicaciones en tan diversas
áreas como medicina, alimentos y agricultura, y en ciencias forenses.
CLONACIÓN DEL ADN

La tecnología del ADN recombinante no se desarrolló rápidamente.


Tiene sus raíces en la década en 1940 en estudios genéticos de bacterias y
bacteriófagos (“devoradores de bacterias”) o virus que las infectan.
El biólogo molecular Paul Berg fue el primer investigador que elaboró una
molécula de ADN recombinante; en 1980, compartió el Premio Nobel en Química
por sus contribuciones a la tecnología del ADN recombinante. Después de
décadas de investigación básica y la acumulación de extenso conocimiento, esta
tecnología se ha hecho alcanzable y es disponible entre muchos científi cos que
ahora emplean esos métodos.
En la tecnología del ADN recombinante, los científi cos utilizan enzimas de
restricción (endonucleasas) de las bacterias para cortar moléculas de ADN sólo en
lugares específi cos. Las enzimas de restricción permiten dividir la molécula de
ADN en segmentos manejables. Luego, cada fragmento se puede incorporar a
una molécula vectorial apropiada, un portador capaz de llevar el fragmento de
ADN al interior de la célula.
Los bacteriófagos y las moléculas de ADN llamadas plásmidos son dos ejemplos
de vectores. La molécula de ADN bacteriano es una doble cadena generalmente
circular y cerrada; mientras que la mayoría de los plásmidos son moléculas sueltas
de ADN, mucho más pequeñas, que pueden estar presentes y replicarse dentro de
una célula bacteriana, como la E. coli. Los investigadores introducen plásmidos en
células bacterianas mediante un método llamado transformación, mediante el cual
las células permiten el ingreso de ADN ajeno Para que la transformación sea efi
ciente, los científi cos alteran la química de las células mediante la electroporación
o electropermeabilización, que consiste en aplicar un shock eléctrico, para que la
membrana plasmática sea permeable a los plásmidos. Cuando el plásmido entra a
la célula, puede integrarse al genoma, replicarse y transmitirse a las células hijas
durante la división celular. Cuando un plásmido recombinante, que tiene
empalmado un ADN ajeno, se replica de esta manera, se elaboran muchas copias
idénticas del ADN ajeno; en otras palabras, el ADN ajeno se clona.
Los transposones son otros vectores efi cientes para transferir genes en ratones y
en otros organismos modelo utilizados en la investigación. Recuerde, del capítulo
13, que un transposón es un elemento genético móvil que puede cortarse a sí
mismo de un lugar del genoma de una célula e insertarse en un lugar o posición
diferente.
Las enzimas de restricción son “tijeras moleculares”
El descubrimiento de las enzimas de restricción constituyó un importante avance
en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante. En la actualidad, un gran
número de distintos tipos de enzimas de restricción, cada uno con sus propias
características, están fácilmente disponibles a los investigadores. Por ejemplo, una
enzima de restricción conocida como HindIII es capaz de buscar un segmento de
ADN llamado sitio de restricción del tipo 5¿–AAGCTT –3¿, y cuando lo encuentra,
lo corta. Un sitio de restricción es una secuencia de ADN que contiene el sitio que
será eliminado o cortado por una enzima de restricción específi ca. La secuencia
5¿-GAATT C– 3¿ es cortada por otra enzima de restricción, conocida como EcoRI.
En general, los nombres de las enzimas de restricción son derivados de los
nombres de las bacterias en que originalmente fueron aisladas. Así, HindIII y
EcoRI son derivados de Hemophilus infl uenzae y E. coli, respectivamente.
¿Por qué las bacterias producen estas enzimas? Durante la infección, un
bacteriófago inyecta su ADN en la célula bacteriana. La bacteria se puede
defender a sí misma si tiene enzimas de restricción que ataquen al ADN del
bacteriófago. La célula bacteriana cuida que su propio ADN no sufra algun daño,
modifi cándolo después de la replicación. Para ello, una enzima agrega un grupo
metilo a una o más bases en cada sitio de restricción de tal forma que la enzima
de restricción no pueda actuar en el ADN bacteriano.
Las enzimas de restricción son una herramienta que permite a los científi cos
cortar, de manera controlada, el ADN cromosómico en fragmentos más cortos.
Muchas de las enzimas de restricción empleadas para estudios de ADN
recombinante cortan secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas
direcciones), lo que signifi ca que la secuencia de bases de una cadena, como una
molécula de doble cadena se diagrama como sigue:

Al cortar ambas cadenas del ADN, pero en forma escalonada, esas enzimas
producen fragmentos con idénticos extremos complementarios de cadena simple:
Esos extremos se llaman extremos pegajosos porque se emparejan mediante
enlaces de hidrógeno con los extremos de cadenas complementarias, de otras
moléculas de ADN que han sido cortadas con la misma enzima. Una vez que los
extremos pegajosos de las dos moléculas se han unido de esta manera, entonces
se tratan con ADN ligasa, una enzima que une covalentemente a los dos
fragmentos de ADN para formar una molécula de ADN recombinante estable.

Corte de ADN con una enzima de restricción Muchas enzimas de restricción, como
la HindIII, cortan el ADN en secuencias que son palindrómicas, produciendo
extremos pegajosos complementarios. Las pequeñas fl echas negras designan los
sitios de escisión de la enzima.
El ADN recombinante se forma cuando el ADN está empalmado en un vector
En la tecnología del ADN recombinante, los genetistas cortan el ADN que va a ser
clonado y el ADN del plásmido mediante la misma enzima de restricción. Entonces
las dos muestras de ADN son mezcladas bajo condiciones que faciliten el enlace
de hidrógeno entre las bases complementarias de los extremos pegajosos, y las
muescas en el ADN recombinante resultante se sellan por el ADN ligasa.
Empalme de ADN ajeno (gen de interés) en un vector de clonación (en este
ejemplo, un plásmido bacteriano) para producir ADN recombinante
Los plásmidos que ahora se utilizan en el trabajo del ADN recombinante han sido
extensamente manipulados en el laboratorio para incluir características útiles para
aislar y analizar el ADN clonado.

Entre éstos está un origen de replicación ), uno o más sitios de restricción, y genes
que dejen a los investigadores seleccionar células transformadas mediante
plásmidos recombinantes. Estos genes permiten que las células transformadas
crezcan bajo condiciones específi cas en las cuales las células sin esta modifi
cación, no pueden hacerlo. Típicamente, los plásmidos no contienen genes
esenciales de las células bacterianas en condiciones normales. Sin embargo, con
frecuencia transportan genes que son útiles bajo condiciones ambientales específi
cas, como genes que confi eren resistencia a antibióticos particulares o que
permiten que las células utilicen un nutriente específi co. Por ejemplo, las células
transformadas con un plásmido que incluye un gen para resistencia al antibiótico
tetraciclina pueden crecer en un medio que contiene tetraciclina, mientras que ahí
las células no transformadas no pueden hacerlo.
Una propiedad limitante de cualquier vector es el tamaño del fragmento de ADN
que puede transportar de manera efectiva. Es frecuente que el tamaño de un
segmento de ADN se presente en kilobases (kb), con 1 kb igual a 1000 pares de
bases. Normalmente, los fragmentos que son más pequeños que 10 kb son
insertados en plásmidos para empleo en E. coli. Sin embargo, fragmentos
mayores requieren el uso de vectores bacteriófagos, que pueden manejar hasta
23 kb de ADN. Otros vectores son vectores de clonación cósmidos, que son
vectores de combinación con características de bacteriófagos y plásmidos, y
cromosomas artifi ciales bacteriales (BAC), que acomodan fragmentos mucho más
grandes de ADN. Un solo BAC puede incluir hasta 200 kb de ADN extra, una
cualidad que hace a los BAC especialmente útiles en el Proyecto Genoma
Humano.
El ADN recombinante también se puede introducir en las células de organismos
eucariotas. Por ejemplo, los genetistas emplean virus modifi cados como vectores,
en células mamarias. Estos virus son desactivados para que no maten a las
células que infecten. En su lugar, las moléculas de ADN viral, así como el ADN
ajeno que transportan, quedan incorporados en los cromosomas de la célula
después de la infección. Posteriormente se analizarán otros métodos que no
requieren un vector biológico.
-El ADN puede ser clonado en el interior de las células
Debido a que un gen individual sólo es una pequeña parte del ADN total en un
organismo, aislar el pedazo de ADN que contiene ese gen particular es igual a
encontrar una aguja en un pajar: se necesita un poderoso detector. Actualmente,
muchos métodos permiten a los biólogos aislar una secuencia específi ca de
nucleótidos de un organismo. En seguida se presenta el análisis de métodos para
clonar el ADN en el interior de las células bacterianas. Como ejemplo se utiliza la
clonación del ADN humano, aunque el procedimiento es aplicable para cualquier
organismo.
El ADN total en una célula constituye su genoma. Por ejemplo, si el ADN se extrae
de las células humanas, entonces se conoce como ADN genómico humano. Una
biblioteca de ADN genómico es una colección de miles de fragmentos de ADN que
representan a todo el ADN en el genoma. Cada uno de estos fragmentos se puede
insertar en un plásmido, que a su vez normalmente se incorpora en una célula
bacteriana. Así, una biblioteca de ADN genómico está almacenada en una
colección de bacterias recombinantes, cada una con un diferente fragmento de
ADN humano. Los científi cos emplean bibliotecas de ADN genómico para aislar y
estudiar genes específi cos. Además, las bibliotecas de ADN genómico contienen
un gran número de secuencias de bases que no codifi can proteínas.
Los cromosomas individuales también se pueden aislar para elaborar una
biblioteca cromosómica que contiene todos los fragmentos de ADN en ese
cromosoma específi co. Si se conoce que un gen de interés está asociado con un
cromosoma particular, entonces es más fácil aislar ese gen de una biblioteca
cromosómica que de la biblioteca de ADN genómico. Los métodos de clonación
básicos apenas descritos se utilizan para elaborar ADN genómico o bibliotecas
cromosómicas. Primero, el ADN se corta con una enzima de restricción,
generando una población de fragmentos de ADN

Producción de una biblioteca de ADN genómico o una biblioteca cromosómica

Esos fragmentos varían en tamaño y en la información genética que transportan,


pero todos ellos tienen extremos pegajosos idénticos. Los genetistas tratan al
plásmido de ADN, que será empleado como un vector, con la misma enzima de
restricción que convierte los plásmidos circulares en moléculas lineales con
extremos pegajosos complementarios a aquellos de los fragmentos de ADN
humano. Los plásmidos recombinantes se producen mezclando los dos tipos de
ADN (humano y plásmido) bajo condiciones que promueven el enlace de
hidrógeno de las bases complementarias. Entonces, el ADN ligasa se utiliza para
unir covalentemente los extremos emparejados del plásmido y del ADN humano,
formando ADN recombinante. Inevitablemente, también se producen plásmidos no
recombinantes (que no se muestran en la fi gura) porque algunos plásmidos
revierten a su confi guración circular original sin incorporar el ADN ajeno, en este
caso el humano.
Mediante transformación, los genetistas insertan plásmidos en células bacterianas
sensibles al antibiótico. Ya que la proporción de plásmidos a las células se
mantiene muy baja, es raro que una célula reciba más de una molécula plásmida,
y no todas las células reciben un plásmido. Normalmente los investigadores
incuban células sensibles al antibiótico en un medio nutriente que incluye
antibióticos; sólo crecen células que incorporan un plásmido que contiene un gen
de resistencia al antibiótico. Además, normalmente el plásmido se ha modifi cado
en formas que capacitan a los investigadores para identifi car las células con
plásmidos recombinantes.
Las bibliotecas de ADN genómico y cromosómicas contienen redundancias; es
decir, ciertas secuencias de ADN humano han sido insertadas en plásmidos más
de una vez, al azar. Sin embargo, cada plásmido recombinante individual, como
un libro en la biblioteca, sólo contiene un único fragmento del genoma humano
total.
Para identifi car un plásmido que contiene una secuencia de interés, el
investigador clona cada plásmido hasta que hay millones de copias para trabajar
con ellas. Este proceso ocurre conforme la célula bacteriana crece y se divide.
Una muestra diluida del cultivo bacteriano se esparce en un medio de crecimiento
sólido (placas de agar), así las células quedan bastante separadas. Cada célula se
divide muchas veces, produciendo una colonia visible, que es un clon de células
genéticamente idénticas a partir de una célula individual.
Todas las células de una colonia particular contienen el mismo plásmido
recombinante, así durante este proceso también se clona una específi ca
secuencia de ADN humano. La tarea importante es determinar qué colonia, de las
miles, contiene un fragmento clonado de interés. Secuencias específi cas de ADN
se identifi can en diversas formas.

Hoy en día gracias al desarrollo de la ingeniería genética, los investigadores


pueden lograr que un sistema vivo o inclusive artificial, desarrolle alguna
propiedad específica presente en otra especie, esto se logra aislando segmentos
“pequeños” de la molécula de ADN de una fuente externa; se transforman y
recombinan para finalmente introducirlos en células que expresarán el nuevo gen.
En suma, la tecnología del ADN recombinante consiste en introducir un gen que
contiene información para desarrollar cierta característica, en otro organismo que
adquiere la condición deseada.
Hamilton Smith y Daniel Nathans logran el Aislamiento de la
primera restrictasa, que es una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en
una secuencia específica.
La invención de la tecnología del ADN recombinante es el resultado de una serie
de descubrimientos importantes realizados durante la década de los 70’s y 80´s.
Tiene su origen con el aislamiento de la primera restrictasa (enzima capaz de
reconocer y cortar el ADN en una secuencia específica), realizado por Hamilton
Smith y Daniel Nathans en 1970 y cuya importancia radica en el hecho de que tal
hallazgo impulso nuevas metodologías de investigación que ampliaron los
horizontes de estudio de disciplinas como: la medicina, bioquímica, fisiología,
genética molecular, fisicoquímica y biotecnología, entre otras áreas no menos
importantes y más específicas como la fertilización de óvulos “in vitro”, la
prevención y el tratamiento del cáncer y el diagnóstico prenatal, por citar algunas.
Este trabajo les valió el Premio Nobel de Medicina en 1978.

En síntesis, la Tecnología del ADN recombinante consiste en la integración de


múltiples descubrimientos realizados por equipos de trabajo multidisciplinarios y
que en términos generales se realizan (de acuerdo al objetivo de la investigación)
en las siguientes fases, aunque no necesariamente en este orden:

 Secuenciación: las enzimas de restricción se emplean para


obtener fragmentos específicos de ADN.

 Reasociación/Transformación: ligar covalentemente las moléculas para


 obtener hebras continuas de ADN e introducirlas en un vector.

 Amplificación: la producción de miles de secuencias idénticas de ADN


recombinante.

 Localización: ubicación de segmentos específicos de ADN.


BIBLIOGRAFÍA
 Solomon, E., Berg, L., Martin, D., Biología. Ed. McGraw-Hill Interamericana, 5ª.
Ed, México, 2001, pp.1230.
Paginas:
323-336