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Al cortar ambas cadenas del ADN, pero en forma escalonada, esas enzimas
producen fragmentos con idénticos extremos complementarios de cadena simple:
Esos extremos se llaman extremos pegajosos porque se emparejan mediante
enlaces de hidrógeno con los extremos de cadenas complementarias, de otras
moléculas de ADN que han sido cortadas con la misma enzima. Una vez que los
extremos pegajosos de las dos moléculas se han unido de esta manera, entonces
se tratan con ADN ligasa, una enzima que une covalentemente a los dos
fragmentos de ADN para formar una molécula de ADN recombinante estable.
Corte de ADN con una enzima de restricción Muchas enzimas de restricción, como
la HindIII, cortan el ADN en secuencias que son palindrómicas, produciendo
extremos pegajosos complementarios. Las pequeñas fl echas negras designan los
sitios de escisión de la enzima.
El ADN recombinante se forma cuando el ADN está empalmado en un vector
En la tecnología del ADN recombinante, los genetistas cortan el ADN que va a ser
clonado y el ADN del plásmido mediante la misma enzima de restricción. Entonces
las dos muestras de ADN son mezcladas bajo condiciones que faciliten el enlace
de hidrógeno entre las bases complementarias de los extremos pegajosos, y las
muescas en el ADN recombinante resultante se sellan por el ADN ligasa.
Empalme de ADN ajeno (gen de interés) en un vector de clonación (en este
ejemplo, un plásmido bacteriano) para producir ADN recombinante
Los plásmidos que ahora se utilizan en el trabajo del ADN recombinante han sido
extensamente manipulados en el laboratorio para incluir características útiles para
aislar y analizar el ADN clonado.
Entre éstos está un origen de replicación ), uno o más sitios de restricción, y genes
que dejen a los investigadores seleccionar células transformadas mediante
plásmidos recombinantes. Estos genes permiten que las células transformadas
crezcan bajo condiciones específi cas en las cuales las células sin esta modifi
cación, no pueden hacerlo. Típicamente, los plásmidos no contienen genes
esenciales de las células bacterianas en condiciones normales. Sin embargo, con
frecuencia transportan genes que son útiles bajo condiciones ambientales específi
cas, como genes que confi eren resistencia a antibióticos particulares o que
permiten que las células utilicen un nutriente específi co. Por ejemplo, las células
transformadas con un plásmido que incluye un gen para resistencia al antibiótico
tetraciclina pueden crecer en un medio que contiene tetraciclina, mientras que ahí
las células no transformadas no pueden hacerlo.
Una propiedad limitante de cualquier vector es el tamaño del fragmento de ADN
que puede transportar de manera efectiva. Es frecuente que el tamaño de un
segmento de ADN se presente en kilobases (kb), con 1 kb igual a 1000 pares de
bases. Normalmente, los fragmentos que son más pequeños que 10 kb son
insertados en plásmidos para empleo en E. coli. Sin embargo, fragmentos
mayores requieren el uso de vectores bacteriófagos, que pueden manejar hasta
23 kb de ADN. Otros vectores son vectores de clonación cósmidos, que son
vectores de combinación con características de bacteriófagos y plásmidos, y
cromosomas artifi ciales bacteriales (BAC), que acomodan fragmentos mucho más
grandes de ADN. Un solo BAC puede incluir hasta 200 kb de ADN extra, una
cualidad que hace a los BAC especialmente útiles en el Proyecto Genoma
Humano.
El ADN recombinante también se puede introducir en las células de organismos
eucariotas. Por ejemplo, los genetistas emplean virus modifi cados como vectores,
en células mamarias. Estos virus son desactivados para que no maten a las
células que infecten. En su lugar, las moléculas de ADN viral, así como el ADN
ajeno que transportan, quedan incorporados en los cromosomas de la célula
después de la infección. Posteriormente se analizarán otros métodos que no
requieren un vector biológico.
-El ADN puede ser clonado en el interior de las células
Debido a que un gen individual sólo es una pequeña parte del ADN total en un
organismo, aislar el pedazo de ADN que contiene ese gen particular es igual a
encontrar una aguja en un pajar: se necesita un poderoso detector. Actualmente,
muchos métodos permiten a los biólogos aislar una secuencia específi ca de
nucleótidos de un organismo. En seguida se presenta el análisis de métodos para
clonar el ADN en el interior de las células bacterianas. Como ejemplo se utiliza la
clonación del ADN humano, aunque el procedimiento es aplicable para cualquier
organismo.
El ADN total en una célula constituye su genoma. Por ejemplo, si el ADN se extrae
de las células humanas, entonces se conoce como ADN genómico humano. Una
biblioteca de ADN genómico es una colección de miles de fragmentos de ADN que
representan a todo el ADN en el genoma. Cada uno de estos fragmentos se puede
insertar en un plásmido, que a su vez normalmente se incorpora en una célula
bacteriana. Así, una biblioteca de ADN genómico está almacenada en una
colección de bacterias recombinantes, cada una con un diferente fragmento de
ADN humano. Los científi cos emplean bibliotecas de ADN genómico para aislar y
estudiar genes específi cos. Además, las bibliotecas de ADN genómico contienen
un gran número de secuencias de bases que no codifi can proteínas.
Los cromosomas individuales también se pueden aislar para elaborar una
biblioteca cromosómica que contiene todos los fragmentos de ADN en ese
cromosoma específi co. Si se conoce que un gen de interés está asociado con un
cromosoma particular, entonces es más fácil aislar ese gen de una biblioteca
cromosómica que de la biblioteca de ADN genómico. Los métodos de clonación
básicos apenas descritos se utilizan para elaborar ADN genómico o bibliotecas
cromosómicas. Primero, el ADN se corta con una enzima de restricción,
generando una población de fragmentos de ADN