FEA

TEHNICI DE ANALIZA A
PRODUSELOR ALIMENTARE

Prof.dr. Eugenia Eftimie Totu

 TEHNICA ENZIMELOR CA INDICATORI AI CALITATII
ALIMENTELOR
Enzime ce degradeaza materiile prime alimentare:
- Polifenoloxidaza
- Clorofilaza
- Lipoxigenaza
- Lipaza schimba culoarea si aroma (gust si miros)
- Esteraza
- Proteaze
-Enzime pectice
-Celulazele
modifica structura tesuturilor vegetale
-Hemicelulazele

-Tiaminaza
-Acid ascorbic oxidaza degradeaza vitamine si acizi grasi esentiali
- Oxidoreductaze indicatori
 TEHNICA ENZIMELOR CA INDICATORI AI CALITATII
ALIMENTELOR
Enzime termostabile: peroxidaza, fosfataza alcalina
testare eficacitate a blansarii, pasteurizarii

produse f.b. blansate daca activitatea peroxidazei a ramas:

Mazare verde 6-6,3%
Fasole verde 0,7-3,2%
Conopida 2,9-8,2%
Varza de Bruxelles 7,5-11,5%

LIPOXIGENAZA
– miros nedorit si culoare modificata legume verzi si porumb
Monitorizare: folosire benzi de hartie de filtru impregnate cu clorofila sol. care
se decoloreaza in prezenta de lipoxigenaza reziduala (1-2%)

POLIFENOLOXIDAZA – culoarea bruna-neagra la piersici, caise, mere

 TEHNICA CU BIOSENZORI
BIOSENZOR
o enzima un anticorp

o bacterie

cuplat cu un traductor

Electrochimic Masa Optic Termic

• electrod • Cristale • optrod • termistori
piezoelectrice
• Dispozitive de
unde acustice

Determinare compus specific

 UREAZA – imobilizata pe un electrod sensibil la cationi

- electrodul sensibil raspunde la NH4+

- comportament Nernstian intr-un domeniu de
concentratii ale analitului 10-4 – 10-1 M

- folosit in laboratoare de analiza si control al calitatii

 ELECTROZI ENZIMATICI
Substrat Enzima/co-factor Produsi
Glucoza Glucoza oxidaza Acid gluconic
Acid uric Uricaza Alantoina
Acid lactic Lactaz oxidaza Piruvat
Etanol Alcool oxidaza Acetaldehida
Esteri colecterolici Colesterol esteraza Colestenona
+ colesterol oxidaza
Acid piruvic Piruvat oxidaza, Acetil posfat + CO2
Acid fosforic, FAD,
pirofosfat tiaminic,
Mg2+
Maltoza Maltaza, Glucoza Acid gluconic
oxidaza
 SCHEME DE IMOBILIZARE ALE ENZIMELOR

ELECTROD Brate spatiale

Enzima (distantiere)

Enzima legata covalent de electrod

Membrana poroasa
SCHEME DE IMOBILIZARE ALE ENZIMELOR

Membrana poroasa ELECTROD

Enzima imobilizata Imobilizare covalenta sau

blocare (“ENTRAPMENT”) –
“on beads”
de ex. Intr-un polimer
conductiv precum
polianilina sau polipirolul
CINETICA REACTIILOR ENZIMATICE
 1. RASPUNSUL BIOSENZORULUI

EIS/Biosenzorul raspunde la specia de interes conform

ecuatiei lui NERNST
RT
Ei = Ei +
0
ln ai
zi F
Potentialul celulei = suma potentialelor din sistem

Ei = E + ELJ + EM
i
0

Toate potentialele mentionate depind de concentratia

analitului, astfel ca:
E = E 0 + 59,16 lg ai
ECUATIA NERNST
Emas = Const. ± S log [ax ]
unde: S = (RT / zx F) ln 10
Const. = contine termeni precum potentialul jonctiunii
lichide si potentialul electrodului intern de referinta.

T = 298,15 K ; panta ideala: 59,16 mV/ p[I] + ; 29.58mV / p[I]++

∆E = (RT/zF) ln(a’/a’’) - ec. Nernst pentru dif. de potential transmembranar

- potential de membrana:

EM = φr - φs = EB(r) – ED + EB(s)

EB(r) ; EB(s) - potentiale Donnan

ED – potential de difuzie
aprox. Henderson pentru potentialul jonctiunii lichide:
~ ~
E D = φs − φr
ECUATIA NICOLSKY – EISENMANN
E = E0 + S log [ai + Kij aj zi/zj ]

S = (RT / ziF) ln 10 Kij – coeficient de selectivitate

Determinarea Kij

1. metoda solutiilor separate:

Ei = E0 + S log (a
(ai) (j absent)

Ej = E0 + S log (K
(Kij ajzi/
zi/zj) (i absent)

(ai/ajzi/
Kij = (a zi/zj ) 10 (E - E ) / S
J I

2. metoda solutiilor mixte - determinare grafica

 LIMITA DE DETECTIE
Definitia IUPAC
activitatea (concentratia) ionului primar,, i, la care potentialul deviaza
cu 18mV/zi de la extrapolarea portiunii liniare a graficului de
etalonare, unde zi este sarcina ionului de analizat.

LD – conditionata de:
Proprietatile electrodului
- solubilitatea materialului membranei in solutia de electrolit
Conditiile de determinare experimentala
- temperatura de lucru
- prezenta speciilor interferente
 TIMPUL DE RASPUNS
Definitia IUPAC
Timpul scurs intre momentul in care un electrod ion-selectiv si un elecrod de
referinta (o celula electrochimica) sunt pusi in contact cu o solutie de electrolit
(sau la care este schimbata activitatea ionului primar in solutie) si primul
moment la care valoarea pantei potential / timp (∆E/∆ E/∆t) devine egal cu o
valoare limita selectata pe baza conditiilor experimentale si a preciziei
necesare.

In cazul determinarilor cu o precizie ridicata, valoarea limita este de 0,6 mV/min.

METODE DE CALIBRARE A EIS / BIOSENZORILOR

I. Metode Simple de Imersare

A. Metoda Clasica

Calibrarile preliminare ale EIS se efectueaza in solutii avand 10-6–10-1 mol/L.

Pentru solutii cu tarie ionica ridicata nu este necesara agitarea.
Este rapida – elimina un electrod nefunctional.
Se aplica in special pentru electrozii cu un timp de raspuns lent.

B. Tehnica Adaosului Standard

Elimina dificultatile ce apar ca urmare a diferentelor intre matricea probei si

cea a solutiei etalon.
Un volum cunoscut de proba se adauga unui standard, sau invers,
inregistrandu-se modificarea corespunzatoare a diferentei de potential.
Aplicarea sa implica cunoasterea raspunsului Nernstian al electrodului.
II. Metode de Curgere
Esential este ca viteza de curgere sa fie reproductibila pompa peristaltica

Membrana in contact
permanent cu solutia

La supraf.membranei Realizare simpla a

se formeaza un starat analizelor
Avantaje automatizate
de difuzie = timp de
raspuns rapid (“on-line”)

E. Referinta plasat in flux dupa EIS,

orice compus eliminat din E.Ref. nu
interfera cu EIS
 Diametrul
interior
tub
Lungimea Vechimea
tubulaturii tubulaturii

Timp de
raspuns
A. Metoda curgere continua conventionala
Utilizata in analizaoarele chimice folosind un flux de aer purtator.

B. Tehnica de curgere nesegmentata (Flow Injection Analysis – FIA)

Se introduce un volum exact intr-un flux purtator nesegmentat – in

sistem nu sunt bule de aer, fiind astfel posibila o viteza ridicata de
analiza (100 – 300 h-1) si un timp de raspuns imbunatatit.

Flux de curgere
pulsant

Existenta bulelor de
aer

Necesara eliminarea
bulelor de aer din solutie
 METODA DILUTIEI LA VOLUM CONSTANT (CVD)

1976- Horvai si colab.

• Metoda des utilizata
• Metoda simpla, in care se determina concentratia, c, a unui ion, i,
a carui solutie curge prin celula CVD in timpul, t, intr-un volum constant,
sub agitare
W ⋅t
−
c = c0 e Vr

unde :
c0 = concentratia initiala a solutiei
W = viteza de curgere a solutiei de diluare
t = timpul de la inceperea dilutiei
Vr = volumul vasului de dilutie
 TEHNICA CU BIOSENZORI

Electrozi enzimatici
Imunosenzori Determinare de contaminanti
Termistori enzimatici

Carbohidrati Fluorina
Peptide Penicilina
Aminoacizi

Parametri ai prospetimii pestelui

• Electrodul XANTINOXIDAZA
Vitamina C
• det. IMP –inozin monofosfat
Etanolul • rap. Xantina/hipoxantina
• Amine biogene
Lactatul
• Bisenzor glutamat-oxidaza
• L-glutamat
• L-lactat
 TEHNICI IMUNOCHIMICE
- Se bazeaza pe reactia dintre un anticorp si un antigen specific
- Kit-uri pentru decelarea micotoxinelor, pesticidelor, subst. toxice din
alimente (solanina), proteine (gluten, alergeni, enterotoxine
stafilococice sau ale patogenilor Salmonella si Listeria)

- ANTICORPI Monoclonali = MAb autentificare de specie

decelare falsificare modificare proteine la procesare
termica
K-cazeina din lapte se foloseste ca antigen pt reactia cu anticorpul MAb
in analiza prod.lactate si det proteinelor din soia in lapte.

Anticorpii MAb – indirect in testele ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assays)
- pentru identificarea ovalbuminei denaturate termic;
- decelarea alftoxinei B1 in porumb si arahide prajite
 Imagini ale unor micro-mecanisme acoperite cu compusi activi

www.nanowerk.com
 TEHNICI BAZATE PE ADN
In functie de mecanismul implicat:
- Tehnici bazate pe PCR = Polymerase Chain Reaction
- Tehnici bazate pe secventierea ADN-ului
- Tehnici bazate pe hibridizarea ADN-ului

- ETAPE
- Incubarea probei cu hexadeciltrimetilbromura de amoniu
(DTAB) + extractie cu cloroform + precipitare ADN in izopropanol

- tratare cu proteinaza K + dodecil sulfat amoniu (SDS) + rasina

cu silice pentru purificarea ADN-ului eliberat.
 TEHNICI BAZATE PE ADN – METODA PCR CONEVTIONALA

A Secventa cunoscuta de ADN

B
este amplificata cu 2 initiatori:

- Unul actioneaza la capatul

5’al secventei A, care este
apoi extins cu Taq polimeraza
cu capatul 3’ al initatorului

- Al 2-lea initiator actioneaza

la capatul 3’ al secventei
lantului pe care il extinde cu
capatul 5’ al initiatorului

http://www.universe-review.ca/DNAsequencing
Metoda PCR se aplica pt conc.
mai mari de 102CFU/g de specii:
- Brochothrix din probe de carne
- Patogene:
- Shigella sonei
- S. flexneri
- S. hoydii
- S. dysenteriae
- Salmonella paratyphi
- Aeromonas Hydrophila
- Staphylococcus aureus
- Clostridium perfringens
Permite detectia falsificarii si
autentificarea materiilor prime si a
produselor.
www.serc.carleton.edu

Avantaje: simplitate, specificitate, Se folosesc:

sensibilitate, timp relativ scurt de - secvente de ADN de min.200 bp in
procesare, cost scazut. lungime pt a fi detectati pe gel de
agaroza;
-1,5-2,0 cicluri logaritmice.
Tehnici derivate din PCR:

-Tehnica SCAR = Simple Characterized Amplified Region

- Tehnica ARMS = Amplification Refractory Mutation System
- Tehnica SSR = Simple Sequence Repet
- Tehnica DMAD = Direct Amplification of Minisatellite Region DNA
-Tehnica DAF = DNA-Amplification Finger Printing
- Tehnica ISSR = Inter Simple Sequence Repeat
- Tehnica AP-PCR = Arbitrary Prime – PCR
- Tehnica QC-PCR = Quantitative Competitive - PCR

www. oceanexplorer.noaa.gov
 TEHNICI BAZATE PE ADN

Metoda PCR in timp real (REAL – TIME PCR)

- Detectarea tintei PCR-amplificare ADN – ampliconi
- Se aplica mai multe cicluri de amplificare (5-6 cicluri)
- Se foloseste o secventa scurta de ADN (50-60 bp)
- Se foloseste 10-20 µL proba
- Se masoara un semnal de fluorescenta indus de radiatii UV, a carui
intensitate este proportionala cu cant. de ADN obtinuta
- Se foloseste pentru:
- Det. specii de cereale
- Diferentierea graului dur de cel comun
- Det. falsificarii cerealelor
- Det. de alergeni in condimente

www. genengnews.com
 ALTE TEHNICI BAZATE PE ADN
- Tehnica ADN-RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA
- Initiatorul are 10 nucleotide pentru a recunoaste secventa tinta
- se foloseste la identificarea clonelor identice din bacterii patogene implicate in
toxiinfectii alimentare
- Metoda AFLP = Amplified Fragment Lenght Polymorphism
- implica restrictia initiala a ADN-ului genomic + lergarea unor adaptori
complementari in locurile restrictionate + amplificarea selectiva a PCR
- ampliconii finali sunt denaturati termic si separati prin electroforeza pe
gel folosind gel de poliacrilamida 10% denaturat cu uree si formamida.
-Tehnica RFL-PCR = Restriction Fragment Polymorphism
- permite diferentierea speciilor prin analiza produselor de scindare a ADN-ului
cu o nucleaza de restrictie (endonucleaza)
- ampliconii sunt scindati si fragmentele sunt
supuse electroforezei pe gel de agaroza
cu vizualizarea benzilor de ADN.
-Tehnica PCR-SSCP = Single Strand Polymorphism – PCR
- implica amplificarea PCR a unei secvente dintr-o gena (mitocondriala) +
denaturare + electroforeza unui singur lant – ssADN, pe gel de poliacrilamida
nedenaturat + vizualizarea unui nr. limitat de benzi ADN de pe gel.
www.scielo.br
 METODE DE AUTENTIFICARE - EVALUARE
Analiza microscopica
- se foloseste in cazul mierii de albine:
- se det. granulele de polen si amidon
- decelarea falsificarii mierii cu diferite probe de origine vegetala

Analiza microscopica electronica cu scanare (SEM)

- evidentiaza structura diferitelor tesuturi utilizate la falsificarea
produselor alimentare

Metoda HPLC – aplicata pentru determinari de:

-Flavonoide si acizi organici din diferite sucuri de fructe

- Pigmenti fenolici din ceai, fructe si sucuri de fructe
- Izomerii pirolinei si aminoacizii din vin
- Pigmentii antocianici din vin, sucuri de fructe, gemuri
- Analiza constituentilor produselor alimentare
- Decelarea falsurilor din produsele alimentare www.foodsafetynews.com