BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LIC. QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

Ensayos de las vías de inoculación en huevo fértil de pollo.

Replicación del virus de la enfermedad de Newcastle en huevo fértil de pollo.
Titulación (DI50) del virus de la enfermedad de Newcastle en huevo fértil de
pollo.
Rodríguez Guerrero, Perla; Romero Boti, Alejandro; Fernandez Martínez Miguel A.; Nava Olivares, Lina
A.; Tomé Ponce Yessica, S.; Ramirez Patricio, Román.

Practica 2. Departamento de microbiología. M.C. Laura Martinez Perez. Primavera 2017.

RESUMEN
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo Una vez realizado el ensayo de la inoculación,
empleado como un sistema sensible para el cultivo, deberá observarse el conjunto del huevo fértil para
titulación e identificación de virus. En comparación reconocer las cavidades y fluidos que constituyen
con los animales de laboratorio empleados para al sistema biológico empleado.
otros ensayos virales, el modelo de huevo fértil
ofrece diversas ventajas tales como:

a) Desarrollo en condiciones de esterilidad Los objetivos principales del estudio fueron:

b) No poseen funciones inmunológicas
desarrolladas 1. Determinará al ovoscopio la viabilidad del
c) Bajo costo embrión.
d) Manipulación relativamente sencilla
e) No requieren de una infraestructura 2. Dominará las técnicas comúnmente utilizadas
compleja. para la inoculación de huevos fértiles de ave.

El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, 3. Diferenciara las estructuras embrionarias
debe obtenerse de aves libres de patógenos observando la organización de los tejidos fuera de
su cutícula.
específicos (ALPES), para evitar la presencia de
virus que comúnmente afectan a las aves, en
especial Adenovirus, Coronavirus, Bronquitis 4.- El alumno titulará la vacuna del Virus de la
enfermedad de Newcastle, determinando la
Infecciosa Aviar, etc., o bien, bacterias de los
DLEP50 calculando sus concentración por unidad
géneros Salmonella, Pseudomonas, Pasteurella, de volumen
etc. Para el cultivo y titulación de virus, es
indispensable determinar la viabilidad del embrión,
Palabras clave: Huevo fértil, vías de
así como tener destreza en el dominio de las
inoculación, virus, cultivo, modelos de cultivo,
técnicas de inoculación, todo ello debido a la
patógenos, embrión, viabilidad, titulo.
especificidad que presentan algunos viriones por
determinadas células o tejidos.

1
INTRODUCCIÓN
Se han utilizado huevos fecundados para
cultivar virus durante más de 15 años. El
cultivo de virus gripal en huevo embrionado
fue empleado por primera vez por Burnet en
1935, demostrando que el embrión de pollo es
un medio muy sensible para el aislamiento de
estos virus, siendo además un medio estéril y
poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de Figura 1. Esquema general de la forma en que se realiza
diversos grupos en varias cavidades del la inoculación en la membrana Coriolantoidea
huevo fecundado, o en el propio embrión en
Cavidad Alantoidea:
desarrollo. Se usa el huevo de gallina de 6 a 8
días de incubación aproximadamente. Los Se emplean embriones de 9 – 12 días y la
virus sólo pueden reproducirse en cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml.
determinadas partes del embrión; por
consiguiente, se deben inyectar en la región Entre los virus que desarrollan en el
apropiada, por ejemplo mixovirus crecen bien endodermo alantoideo tenemos: peste,
en la membrana corioalantoidea, en tanto que Newcastle, virus de la bronquitisinfecciosa,
el virus de laparotiditis prefiere la cavidad encefalitis equina occidental y oriental
alantoidea. El método exacto de inoculación y Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de
la edad del embrión que se emplea depende la inoculación y toma de muestra.(Fig. 2)
del virus problema. Los lugares más utilizados
para la inoculación, a parte de las cavidades
amniótica y alantoidea, son la membrana
corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas
veces, puede inyectarse directamente el virus
en el embrión en desarrollo, recurriendo a la
inoculación intravenosa, intraperitoneal o
intracerebral. El crecimiento de un virus en un
embrión de pollo puede provocar la muerte del
embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir
Figura 2. . Esquema general de la forma en que se realiza
pústulas o placas sobre la membrana la inoculación en la membrana alantoidea
corioalantoidea (como herpes, viruela),
Cavidad Amniótica:
desarrollar hemaglutininas en los líquidos o
tejidos embrionarios (p.ej.influenza) o Se emplean embriones de 7 – 15 días y la
desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. La
2). edad de los mismos depende
fundamentalmente del tipo de virus o del
Entre los lugares de inoculación tenemos:
estudio que se realiza. (Fig. 3)
Membrana Corioalantoidea:

Se emplean embriones de 10 – 12 días y la

cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml.
Apropiada especialmente para elaislamiento y
cultivo de virus variolicos; virus de
laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de
Beyer (Pseudorrabia); que provocan focos o
pústulas fácilmente visibles. (Fig. 1)

2
 Figura 3. Esquema general de la forma en que se
realiza la inoculación en la cavidad amniotica
Saco Vitelino:
Se emplean embriones de 5 – 8 días de
incubación y la cantidad de inóculo es de 0.2–
1 ml. La vía es sumamente adecuada para el
aislamiento y cultivo de los virus de
enfermedades venéreas, neumonía y
rickettsias. El vitelo es empleado para la
preparación de vacunas y como antígeno para
reacciones serológicas de los virus ya
mencionados. (Fig. 4)
Figura 4. Esquema general de la forma en que se
realiza la inoculación del saco vitelino.
Vía Intravenosa:
La membrana corialantoidea está irrigada por
vasos sanguíneos, es susceptible de
inoculación para casos especiales, virus que
ocasionan cambios hematológicos; por
ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados
embriones de 10 - 15 días y la cantidad de
inóculo es de 0.02 -0.05 ml. Fig. 5
Figura 5. Esquema general de la forma en que se realiza
la inoculación via intravenosa
Vía Intracerebral (embrión):
Se emplea embriones de 8 – 14 días
específicamente para virus que producen
alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc;
0.01 – 0.02 ml. Fig. 6
Figura 6. Esquema general de la forma en que se realiza
la inoculación via intracerebral.
Uno de los procedimientos importantes en
virología es medir la concentración de un virus
en una muestra, o el título viral. Las técnicas
de titulación viral son en muchos casos un
paso previo y necesario para desarrollar otros
tipos de estudios tales como: ensayos de
neutralización, determinación de actividad
antiviral de un extracto dado, ensayos de
identificación viral como en el caso de virus
influenza (ensayo de inhibición de la
hemaglutinación), etc. La cantidad de virus
presente en una muestra se calcula por
diversos métodos entre los cuales se
encuentra la dosis infectante al 50% (DI50).
Para llevar a cabo este ensayo, diluciones
seriadas de virus son inoculadas en cultivos
celulares, huevos embrionados o animales.
Los resultados son observados después de
dejar el tiempo apropiado para que la infección
y replicación viral se lleve a cabo. El título viral
es definido como aquella dilución de virus que
infecta (o mata) el 50% de la población
inoculada.
3
Materiales Resultados

Huevos fértiles de ave de 10 días de Resultados de los ensayos de las vías de

inoculación (+/- 1 día), calidad ALPES. inoculación en huevo fértil.
Ovoscopio
Recipiente para recibir desechos En esta práctica todos los integrantes del
Charolas de plástico equipo logramos ver la viabilidad de cada
Yodo huevo y reconocer cuando estos ya no se
Perforadores, lápiz y pegamento encuentran viables utilizando el ovoscopio y el
Jeringas de insulina apoyo del maestro. Logramos ensayar la
Agujas de 20 x 38 mm forma de inocular los huevos y para saber si
Colorantes íbamos a ser capaces de inocular el virus en
Guantes la práctica posterior. Los resultados de cada
Vacuna con viriones atenuados de la
integrante del equipo se anotaron en la tabla
enfermedad de Newcastle
Estufa a 37ºC 1. (Ver parte de anexos).
Mechero Resultados de la práctica de replicación del
Microplaca virus de la enfermedad de newcastle en huevo
fértil de pollo
Metodología
En esta práctica inoculamos los huevos de
pollo viables previamente marcados y
desinfectados con yodo vía membrana
alantoidea con 0.1 ml de la dilución del virus
1.Realizar con . Trasluminar el
(que fue preparada por la profesora) en zona
solución salina
diluciones
huevo fértil de ave y
seguir la técnica de de esterilidad. Se inocularon 5 huevos con
seriadas de la inoculación para
vacuna viral desde
10-1 hasta 10-8 cavidad alantoidea dilución 10^-3 y así sucesivamente cada 5
huevos hasta llegar a la concentración 10^-6.
4. Inocular 0.1
Se sellaron con una gota de resistol blanco y
mLde las cuatro
3. Desinfectar el
sitio marcado con
ultimas diluciones se llevaron a la incubadora.
en cada uno de 5
el punto o cruz de embriones de 9 a
inoculación con 11 días de
tintura de yodo
antes y después
incubación (20 Resultados de la práctica titulación (DI50) del
embriones en
de perforar total), vía cavidad
alantoidea
virus de la enfermedad de newcastle en huevo
fértil de pollo
6. Marcar con 5. Desinfectar
lápiz sobre nuevamente y
cada embrión sellar la Después de una semana de incubación
perforación con
la dilución y
una gota de
abrimos los huevos inoculados con el virus
vacuna
inoculada
pegamento
blanco
para extraer el fluido alantoideo y poder
7. Incubar a 37°C
realizar la prueba de hemaglutinación, los
durante 7 dias,
revisando resultados se anotaron en la tabla 2 Los
diariamente la
viabilidad de los resultados de los cálculos se anotaron en la
embriones al
ovoscopio, señalando
en el primer dia los
tabla 3. (Ver apartado de anexo)
embriones que
resulten muertos por
traumatismo

Discusión de resultados

Hemaglutinación por virus

Este fenómeno fue descrito por primera vez

por Hirst en 1941, quien observo en un
embrión de pollo la aglutinación de glóbulos
rojos en un vaso sanguíneo roto, mientras

4
realizaba pases de virus de influenza en el
líquido alantoideo.
Hirst reconoció la importancia de este hallazgo
y describió la hemoaglutinación como un
método para ensayo de virus.
En la práctica inoculamos 20 embriones, y
como vía de inoculación se usó la cavidad
alantoidea, después de realizar las pruebas de
HA, pudimos observar que el número de
embriones que resultaron con HE+ fue
decreciendo conforme iba disminuyendo la
concentración de la disolución viral lo cual se
esperaba que así fuese. También se pudo
encontrar la cantidad de viriones presentes en
100ul de vacuna con ayuda de cálculos
matemáticos, lo cual es muy importante para
saber que cantidad de vacuna se requiere
para hacer que los viriones se repliquen en el
modelo animal elegido (embriones de pollo).
ensayo de inoculación por cavidad alantoidea
esto con el objetivo de infectar a los embriones
para su posterior diagnóstico, al igual que
verificar la dosis letal 50%, y hemaglutinación
en los 20 embriones utilizados en la práctica,
pero por problemas de mala manipulación,
mala inoculación los resultados obtenidos no
fueron los esperados. Estos son ensayos
donde no se cuenta el número de partículas
infecciosas presentes en el inóculo, pero en su
lugar se obtiene un valor para el título de ese
virus donde la medida está basada en el
principio de todo o nada, además esta se
utiliza en virus que sean capaces de matar el
50% de la población de animales.
BIBLIOGRAFÍA
Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999).
Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorial Masson. S.A. Barcelona.

Conclusión

En esta práctica aprendimos a utilizar medios

de cultivo vivos para el estudio del virus de
Newcastle así como aprendimos a identificar
las partes que componen a un huevo
embrionado y la técnica para inocular cada de
estas partes en el huevo. Aprendimos a
identificar la viabilidad de los embriones y
reconocer cuando estos no son aptos para
entrar en el estudio por diversos factores que
alteren su composición o vitalidad. Aplicamos
nuestros conocimientos previos para realizar
la prueba de hemaglutinación y obtener la
dosis infectante al 50% (DI 50).

En la práctica, con la inoculación de los virus

New Castle se debió haber realizado un

5
Anexos
Tabla 1. Ensayos de inoculación
Membrana
corioalantoidea Membrana alantoidea Saco vitelino
Perla
Miguel
Alejandro
Lina
Yessica
Roman

Tabla 2. Resultados de la prueba de Hemaglutinación

Dilución Embriones HA+ HA-

inoculados

10-3 5 4 1
10-4 5 4 1
10-5 5 2 3
10-6 5 0 5

6
 Tabla 3. Cálculos

Acumulados Acumulados Radio de positividad Porcentaje

positivos negativos

10 1 10/11 90.9
6 2 6/8 75
2 5 2/7 28.57
0 10 0/10 0

75-50.0 25
V.I.= ___________ = _______ = 0.53
75-28.57 46.43
V.I.C.= (-log(10))(0.53)= -1x0.53= -0.53
DIEP50= 10-4+(-0.53) = 10-4.53

Título: 10-4.53/0.1ml

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