Cuprins

1. Leușteanul - sursa vegetală…………………………………………………….2

2. Principii active…………………………………………………………………3
3. Terpineol – compus cu activitate biologică……………………………………3
4. Utilizările terpineolului……………………..………………….……………....4
5. Metode optime de extracție, identificare a uleiurilor esențiale…………………5
6. Metode de analiză instrumentală a uleiurilor esenţiale…………………………9
Bibliografie…………………………………………………………………….....14

1
 1.Leușteanul- sursă vegetală

Leuşteanul este o plantă aromatică de origine mediteraneană, cunoscută şi apreciată din

antichitate, atât în scop culinar cât şi medicinal.
În bucătăria tradiţională românească, leuşteanul este folosit la murături, ciorbe , sosuri şi
aproape nu există gospodărie în mediul rural unde să nu fie cultivat în grădină pentru calităţile
sale culinare dar şi digestive.
Părţile folosite sunt planta întreagă, rădăcina, ramurile înflorite şi seminţele. Rădăcina de
leuştean conţine amidon, zahăr, zaharoză, apă, răşină, acid de angelică. Rădăcina proaspătă
conţine 0.3-0.5% ulei, iar cea uscată 0.6-1%. Conţine d-terpinol, o legătură de tipul cineolului,
un terpen, ester al acidului acetic, al acidului valeriic şi al celui benzoic. Toate părţile plantei
conţin ulei volatil, gumirezine, taninuri, grăsimi şi săruri minerale.
Leuşteanul are acţiune antiinflamatorie, antibacteriană, antiparazitară, antivirală,
antifungică, stimulează funcţia hepato-biliară, acţiune tonic-aperitivă, creşte pofta de mâncare,
diuretică, combate steatoza ficatului, reglează ciclul menstrual şi ameliorează dismenoreea,
neurotonic, uşor anticoagulant, sedativ, hipotensiv, efect expectorant în afecţiuni respiratorii,
antiinflamator, emolient şi cicatrizant la nivelul pielii în afecţiuni cutanate.
Leuşteanul este indicat în bronşite acute şi cronice, dischinezii biliare, dispepsii
digestive, anorexie, constipaţie, intoxicaţii alimentare, enterocolite, colopatii spastice, colite
fermentative, parazitoze intestinale, boli hepato-biliare, infecţii urinare, litiază renală,
hipertensiune arterială, tulburări menstruale
În uz extern, leuşteanul este folosit în afecţiuni dermice (psoriazis) şi dureri reumatice
(artrite, artroze).Preparate pe bază de leuştean: frunze proaspete, suc natural, pulbere de plantă
uscată, infuzie. Frunzele proaspete se folosesc în bucătăria tradiţională românească în scop
aromatic la diverse preparate: ciorbe, sosuri, salate, mâncăruri. Cataplasme cu frunze proaspete
zdrobite sunt indicate să se aplice pe piele în caz de psoriazis, ulceraţii ale pielii. Sucul din
frunze proaspete se obţine prin mixarea acestora şi este indicat să se consume 100-200 ml de suc
natural pe zi în curele de detoxifiere şi purificare a sângelui.
Pulberea din frunze uscate poate fi folosită atât la preparate culinare pentru aromatizare
cât şi pentru infuzie în scop terapeutic. Pulberea poate fi folosită ca atare, 1/2 linguriţă pe zi,
tinuta 10 minute sub limbă, apoi înghiţită cu multă apă pentru reglarea digestiei, boli digestive,
stimularea apetitului. Infuzia se prepară dintr-o linguriţă cu vârf de pulbere la o cană de apă
clocotită care se lasă la infuzat 10-15 minute, apoi se strecoară, se beau 2-3 căni pe zi. Rădăcina
de leuştean are acţiune diuretică şi se utilizează în tratarea afecţiunilor urinare, hidropiziei şi a
pneumoniilor.

2
 Ceaiul de leuştean este eficient în tulburări digestive, scaune proaste, formare de gaze,
influenţează sângerările organelor din bazinul mic, stimulează fluxul menstrual, eliminarea urinei
şi expectoraţiilor în caz de catar bronşic. Se recomandă îndeosebi în caz de afecţiuni cardiace
având un fond nervos. Rădăcina şi seminţele stimulează secreţia mucoaselor. Se recomanda
pentru întărirea scheletului sugarilor sau a copiilor firavi. În caz de umflături sau tumori se fierbe
rădăcina, partea aeriană sau seminţele şi se adaugă la apa de baie.

1. Principii active

Leușteanul conține o cantitate considerabilă de principii active care se regăsesc în:

frunzele de leuștean uscate (cu excepția uleiului esențial) conțin un set mare de compuși
polifenolici si terpenici. Constituienții volatili majori obținuți din frunzele plantei sunt
terpineolul 40,5% și b-phelandren 16,7%.
Rădăcinile plantei s-au dovedit a fi mai bogate in substanțe active și anume : b-
phelandren se găsește în proportie de 0,1-25% (în funcție de zona în care a fost cultivată planta)
terpineolul 13-56%, butilen ftalida 0,5-10,3%, (Z)-lingustilidă 0,2-45%, pentilciclohexadienă 0-
12,3%, acetat de trans-sabinil 0-13%.

2. Terpineol- compus cu activitate biologică

Terpineolul este un alcool monoterpenic natural care a fost izolat dintr-o varietate de
surse, cum ar fi uleiul de cajuput și uleiul de pin . Există patru izomeri: alfa- , beta- , gamma-
terpineol și terpinen-4-ol . Beta și gamma- terpineol diferă numai prin localizarea dublei
legături . Terpineolul este de obicei un amestec al acestor izomeri cu alfa- terpineol ca și
constituent major. Deși se întâlnește în mod natural, terpineolul este de obicei fabricat din alfa-
pinenul mai ușor disponibil. Terpineolul are un miros plăcut, asemănător liliacului, și este un
ingredient comun în parfumuri, cosmetice și arome. Alfa-Terpineol se găsește ocazional ca o
componentă volatilă în urină. Este un lichid uleios incolor, solid, cu aromă de liliac floral. Are
gust dulce de var.Se utilizează ca intermediar, solvenț și ca agent parfumat în parfumerie.

3
 Figura 1. Terpineol

Recunoscut sub numele de 2-(4-metil-1-ciclohex-3-enil)propan-2-ol prezintă următoarele

proprietăți chimice:
 formula chimică -C10H18O ;
 masa moleculară - 154,25 g/mol;
 densitate - 0,93 g/cm3 la 20°C;
 punct de topire - 39°C ;
 punct de fierbere - 217,7 °C;
 solubil în apă;
 solubil în etanol, eter dietilic, tetraclorură de carbon, acetonă;
 susceptibilitate magnetică - 109,1•10-6 cm3 /mol[3].

3. Utilizările terpineolului

Terpineolul este utilizat în industrie ca solvent pentru eticeluloza, plastifiant pentru rășina
epoxidică, și la fabricarea parfumurilor sintetice. În medicină este folosit în tratementele
pentru combaterea anumitor virusi și anume E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans. Potrivit raporturilor de cercetare daca terpineolul este
pulverizat pe pielea umană, in 2 minute poate ucide aproximativ 95% din germeni.
Se utilizează ca agent de aromatizare datorită caracterului său distinctiv. Se utilizează ca
intermediar, solvenț și ca agent parfumat în parfumerie.
Terpineolul mai este utilizat la fabricarea pastelor de dinți care se eliberează cu prospect
medical, si se administrează conform indicațiilor medicului. Acesta are activitate
antimicrobiană împotriva bacteriilor parodontopatice și cariogene. Alfa-terpineolul prezintă
activitate anticanceroasă împotriva carcinomului pulmonar cu celule umane.
În cosmetică este folosit la fabricarea cremelor si loțiunilor hidratante, deoarece are
capacitatea de a creste permeabilitatea pielii umane.

4
 4. Metode optime de extracție și identificare a uleiurilor
esențiale
1.Tehnici de extracție
Extractia uleiurilor esențiale se poate realiza prin procedee discontinue (macerare,
percolare, infuzare, decoctie, precum si metode noi performante: extractia accelerata cu solvent,
extractia asistată de microunde, extracţie cu fluid supercritic) si procedee continue (extracţie
continuă cu solventi organici, percolare continuă, extracţia Soxhlet).

Hidrodistilarea

Hidrodistilarea convențională a fost realizată cu un aparat de tip Clevenger și folosind

probe de cel puțin 10g de frunze uscate. Experimentele au fost realizate în triplicat timp de 2 ore.
Uleiul esențial obținut a fost colectat în fiole, deshidratat cu sulfat de sodiu anhidru și păstrat la
frigider.

Procedura de extracție Soxhlet

Probele de leuștean uscat au fost plasate într -un cartuș de celuloză și introdus într- un
ansamblu Soxhlet echipat cu baloane de 250 ml. Diferite proceduri au fost realizate în triplicat
timp de 4-6 ore, folosind etanol și hexan ca solvenți. S-au adăugat 150 ml din solvent și întreg
ansamblul a fost menținut într-un continuu reflux ulterior. Extractele au fost concentrate
utilizând un evaporator rotativ legat cu o pompă de vid pentru a îndepărta solventul, apoi au fost
depozitate în sticle de sticlă și păstrate la frigider.

Extractie cu fluid supercritic

Extracţia cu fluid supercritic a fost dezvoltată în ultimii ani pentru utilizare la scară
analitică, constituind o alternativă la extracţia clasică cu solvenţi. In practică, mai mult de 90%
din extracţiile cu fluide supercritice sunt efectuate cu extracţie CO2 supercritic din mai multe
motive practice. In afara faptului ca are presiunea critică (74 bari) şi temperatura (32°C), relativ
scazute, CO2 este relativ non-toxic, noninflamabil, disponibil la puritate crescută şi preţuri mici
şi este usor de înlaturat din extract.

Uleiul de leuștean a fost extras cu CO2 supercritic. Un vas de extragere de 50 mL a fost

împachetat cu 10g de probă uscată. Experimentul a fost realizat într-un proces continuu cu
trecerea dioxidului de carbon în matricea solidă. Presiunea și temperatura în vasul de extracție au
fost ajustate la 120 bar și 50 °C cu o pompă și o baie termostatică. Procesul a fost realizat timp
de aproximativ 2 ore. Uleiul esențial extras a fost colectat printr-un tub capilar din oțel inoxidabil
într-o capcană rece care conține izopropanol. Extracția a fost efectuată în triplicat și probele au
fost depozitate pentru răcire înainte de analiză.

5
 Separarea terpineolului din acest amestec se realizează prin distilare: separarea
distilatului în fracţii cu puncte de fierbere tot mai ridicate şi supunerea fracţiilor la redistilare
permit o separare mai riguroasă a amestecului în componentele sale constituente decât s-ar fi
obţinut printr-o singură distilare simplă. Cu cât procesul este repetat de mai multe ori, cu atât
separarea este mai bună.

2. Metode de identificare a uleiului esenţial

Toate componentele au fost identificate prin compararea spectrelor lor de masă cu cele
obținute din probe autentice și/sau baza de date spectrală de masă NIST05. Acestea au fost, de
asemenea, confirmate prin compararea indiciilor lor de retenție (RI) și a timpilor de retenție, cu
datele publicate; Și date MS cu cele obținute din standardele de referință autentice (terpineol si
ftalidă, Sigma-Aldrich).

Cromatografia de gaze

Analizele GC a uleiului esențial de leuștean au fost efectuate pe Shimadzu GCMS-QP

2010, cu o coloană capilară DB-5 MS (30m x 0,25mm x 0,25μm de fenil-metil siloxan reticulat)
și echipate cu un detector de ionizare cu flacără (FID). Temperatura coloanei a fost programată
de la 60 la 250 °C la o viteză de 5 °C/min. Temperaturile injectorului și detectorului au fost
programate la 260 și respectiv 280 °C. Se folosește drept gaz purtător heliu, debit de 1,1 mL/min.

Cromatografia de gaze cuplată cu spectrometrie de masă

GC-MS a uleiurilor esențiale a fost realizată utilizând un Shimadzu GCMS-QP 2010 care
funcționează în modul EI (echipat cu o coloană capilară DB-5 MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 pm).
La ambele cazuri, drept gaz purtător s-a folosit heliu (1,1 mL/ min). Temperatura injectorului și a
liniei de transfer au fost de 260 °C și 230 °C. Temperatura detectorului a fost stabilită la 280 °C.
Temperatura inițială a coloanei a fost de 60 °C la 5 °C/min timp de 5 min. Apoi a fost
ridicată la 250 °C timp de 17 min. Ionizarea a fost de 70 eV. Semnalele au fost înregistrate în
modul de scanare completă (35-450 m/z).

Determinarea conținutului total de fenoli

Cantitatea de conținut fenolic total a fost determinată prin metoda Folin Ciocâlteau,
conform lui Woisky și Salatino (1998), cu unele modificări. Extractele etanolice (volum de 1,5
mL cu două repetări) la 0,02-0,5 mg/mL au fost introduse în eprubete conținând 1,5 mL de
reactiv Folin-Ciocâlteau (Sigma-Aldrich, Germania) diluat în apă (1:10). După 8 minute s-au
adăugat 1,2 mL de carbonat de sodiu 4%.

Tuburile au fost amestecate și lăsate să stea timp de 2 ore. Absorbanța a fost măsurată la
740 nm într-un spectrofotometru Bell 1105. O măsură martor, pentru care proba a fost înlocuită
cu apă, a fost scăzută din absorbanță la 740 nm. Cuantificarea a fost obținută pe baza unei curbe

6
de calibrare folosind hidroxitoluen butilat (BHT) ca fenol standard (R2 = 0,998). Rezultatele au
fost exprimate în mg de BHT/100 g de probă uscată.

7
METODE MODERNE DE ANALIZĂ
STRUCTURALĂ APLICATE ÎN
INDUSTRIA ALIMENTARĂ,
COSMETICĂ ŞI FARMACEUTICĂ

8
6. Metode de analiză instrumentală a uleiurilor esenţiale

Pentru identificarea uleiurilor esenţiale volatile se folosesc metode moderne de analiză

cum ar fi cromatografia de gaze cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS) este cea mai
populară metodă pentru determinarea compoziției de ulei esențial.
Componentele existente în uleiul esențial pot fi identificate prin compararea indicilor lor
de retenție relativi și spectrele lor de masă (MS). Identificarea componentelor individuale de
uleiuri esențiale, nu este întotdeauna posibilă folosind datele MS.
Unii autori au evaluat, diferite tehnici de analiză esențiale de ulei, cum ar fi
cromatografia mai cuprinzătoare de gaz bi-dimensională (GC×GC). Cromatografia lichidă de
inaltă performanţă (HPLC) este si ea o metodă cu rezultate destul de precisă în ceea ce priveşte
identificarea principiilor active din uleiuri esentiale. Cu toate acestea, analiza GC-MS este în
continuare cea mai utilizată metodă de analiză de rutină a uleiurilor esențiale și trebuie avut grijă
pentru a optimiza condițiile cromatografice pentru a obține cele mai precise rezultate.

Cromatografia ionică totală (obținută prin analiza GC-MS) a uleiului esenţial de leuștean
extras prin hidrodistilare
In tabelul 1 sunt prezentate rezultatele procentuale ale terpineolului obținut prin metoda de
extracție Soxhlet, hidrodistilare, extracţie cu CO2 supercritic

Tabel 1. Compoziția % a terpineolului din uleiul esențial de leuștean

Substanță Hidrodistilare Extracție cu Soxhlet Soxhlet
activă (2ore) fluid supercritic (etanol) (hexan)
(120bar/50ºC/2h)
Terpineolul 0,76 - 0,50 0,39

Hidrodistilarea probelor uscate timp de 2 ore a produs un randament scăzut în uleiul

esențial (0,45% ± 0,02). Analiza GC și GC/MS a acestui ulei esențial a condus la identificarea și
cuantificarea a 14 componente care au reprezentat 92,2% din totalul uleiului. Terpineolul
(46,15%) a fost cea mai abundentă componentă a uleiului essential și prezintă activitate
antioxidantă şi activitate antimicrobiană eficientă împotriva agenţilor patogeni alimentari, de
exemplu Salmonella typhimurium, Bacillus cereus şi Staphilococcus aureus.
Această metodă de extracție a produs randamentul mai mare (%) al acestui principal
compus biologic activ în comparație cu alte metode utilizate în acest studiu.
Condițiile experimentale pentru ectracţia cu CO2 supercritic în acest caz (120 bar, 50° C,
2 ore), nu au avut rezultate bune în ceea ce privește randamentul compușilor antioxidanți.
Această metodă nu a extras terpineolul. Ea a fost mai selectivă în extracția butilen ftaltidei.
9
Rezultatele indică necesitatea de a îmbunătăți condițiile aplicate în extracţia cu CO2 supercritic
pentru a obține mai mulți compuși antioxidanți. Utilizarea unei densități mai mari decât cea
utilizată în acest studiu (aproximativ 0,50 g/cm3 ), expusă la temperaturi mai scăzute și/sau la
presiuni mai mari, ar putea îmbunătăți randamentul de extracție al alcoolilor monoterpenici.
Extracția Soxhlet cu etanol timp de 6 ore a produs randament mai mare în ulei/materie
uscată (26,49% ± 7,71) comparativ cu timpul de 4 ore (19,25% ± 1,39), totuși cu hexan
randamentul nu a prezentat diferențe semnificative.
Concentrația mai mică de hidrocarburi monoterpene obținută prin metodele de
hidrodistilare și Soxhlet se datorează instabilității lor atunci când sunt expuse la căldură, ceea ce
poate cauza degradarea lor prin efecte termice sau hidrolitice. Cu toate acestea, scăderea
numărului acestora poate implica o creștere în densitatea a terpineolului. Aceste concluzii nu se
aplică metodei de extracţie cu CO2 deoarece utilizează temperaturi mai scăzute.

Cromatografia de gaze cuplată cu spectrometrie de masă

Analizele au fost efectuate cu ajutorul sistemului Agilent 5975C Series GC-MSD (7890A
GC și 5975C inert MSD), care funcționează în modul EI la 70 eV, echipat cu o coloană capilară
HP-5MS (30 m x 0,25 mm; grosimea filmului 0,50 pm). Metoda Screener (cererea Agilent 5988-
6530EN, 2010) folosind liber disponibile Flavor2 bază de date compus screener pentru timpul de
retenție de blocare (RTL) la n-pentadecan (la 27.500 min) a fost utilizat pentru analiză, 1 mL de
ulei esențial diluat a fost injectat în modul divizat în două rapoarte pe părți diferite (25:1 și
12,5:1) și temperatură de intrare a avut loc la 250 °C.
S-a folosit heliu ca gaz purtător în modul presiune constantă la 9,4 psi. Temperatura
cuptorului a fost programată după cum urmează: 60 °C s-a ridicat la 240 °C (3 °C/min) și nu a
avut loc. MSD a fost operat în modul de scanare în 40-400 interval m/z, cu temperaturi sursă de
ioni și linia de transfer a avut loc la 230 și 300 °C, respectiv.

Identificarea compușilor

Identificarea compușilor se bazează pe compararea indicilor Kovats (KI), timpii de

retenție (RT) și spectrele de masă cu NIST/Flavor2/Adams. Software ChemStation (Agilent
Technologies) a fost utilizat pentru analiza datelor, și curbele utilizate pentru estimarea
experimentală a indicilor Kovats au fost reprezentate grafic și desenate folosind software-ul
SciDaVis.
Rezultatele analizei uleiului esențial de leuștean arată că compusul poate fi determinat în
ulei de leuștean prin metoda cromatografică utilizată. Folosind două rapoarte (25 părți:1 și
12,5:1) am realizat formal două concentrații diferite de analiți injectate (diluție 1/1250 și 1/625,
respectiv).

10
 Concentrație mai scăzută a uleiului (1:25 raport de separare) a arătat o mai bună formă de
vârf și rezoluția pentru compușii separați, dar vârfuri de hidrat de sabinene (trans), α-terpineol,
carvona dihidro (trans), carvona, anetol (trans), γ-muurolene, γ-cadinene și spathulenol nu au fost
prezente în cromatogramă. Vârful de β-bisabolen a fost prezentă la această concentrație, dar nu a
putut fi determinată prin comparație cu spectre de masă baze de date cu suficientă certitudine
pentru determinarea concludente.

Cromatografie lichidă de înaltă performanță

Într-un balon gradat s-au adăugat zece miligrame de ulei esențial și s-au diluat la 100 mL
cu acetonitril (CAN): apă (80:20) (100 pg/ mL). Au fost preparate șase probe și fiecare dintre
acestea a fost injectat de trei ori. Un sistem Jasco HPLC, compus dintr-o pompă izocratică PU-
1580, un injector Rheodyne 7725i cu o buclă de 10 μL (Rheodyne, Cotati, CA, SUA) și un
detector spectrofotometric UV-1575 a fost utilizat în experiment.
Sistemul cromatografic a fost controlat de HSS-2000 furnizat de Jasco utilizând interfața
LC-Net II/ADC. Datele au fost procesate folosind software-ul BORWIN (versiunea 1.50). O
coloană ODS-3 cu o coloană prefixată ODS-3 (10 4,0 mm ID, 5 μm), coloană ODS-3 Perfect Sil
Target (MZ-Analyze ntechnik, Germania) cu 250 mm 4,6 mm ID, 5 um menținută la temperatura
ambiantă, a fost utilizată pentru separare.
Faza mobilă izocratică a constat din acetonitril-apă în raport de 50:50, care curge prin
coloană cu un debit constant de 1 ml min-1 . Eluentul a fost monitorizat utilizând detectarea UV
la o lungime de undă de 274 nm. Faza mobilă s-a filtrat printr-un filtru GV de tip membrană de
0,22 pm (Millipore). A fost aplicată o baie de apă cu ultrasunete de 40 kHz și 138 W cu control
al temperaturii (model cu baie sonică LBS2- Instrumente FALC S.r.l TREVIGLIO, Italia) pentru
degazarea fazei mobile. Soluția standard de terpineol la o concentrație de 500 mg L-1 a fost
preparată în acetonitril-apă în raport de 30:20 stocat la 20 °C.

FT-IR al terpineolului
Vârful larg în regiunea de 3000 cm -1 este legat de vibrațiile de întindere ale fenolului OH.
Proporția CH aromatică cu vârf de vibrație de aproximativ 1080 cm-1 , vibrații de întindere
asimetrice ale CH alifatic la 2927 cm-1 .

11
 Figura 2. FT-IR al terpineolului

Masa terpineolului
Masa moleculară a compusului natural terpineol este de 155,143. Fragmentul observat la
135 fragment al moleculei [A-CH3] și fragmentul observat la 107 este legat de molecula de
fragment [grup A-izopropil]. Fragmentul observat la 91 fragment al moleculei tropiliu și
fragment observat la 77 legat de molecula de fragment fenil.

12
Figura 3. Masa terpineolului

13
BIBLIOGRAFIE
1. J. Novak, J. Langbehn, F. Panck, M. Chlodwig, C.M. Franzl, Essential oil compounds in a
historical sample of marjoram (Origanum majorana L., Lamiaceae), Flav. Fragr. J. 17,
175180 (2002);
2. http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Spec=C98555&Index=1&Type=IR
3. https://www.researchgate.net/figure/262844505_fig1_Figure-1-Mass-spectra-for-a-
terpineol-used-for-its-identification-in-Bergenia
4. http://www.katyaniexport.com/terpineol-oil.html
5. http://aromatherapybible.com/lovage/
6. http://www.anandaapothecary.com/aromatherapy-essential-oils/lovage.html
7. http://articles.mercola.com/herbal-oils/dill-oil.aspx
8. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669014006037
9. https://www.google.ro/search?q=schema+de+flux&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm
=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiEwdqx64nNAhVJshQKHfTNAFkQ_AUIBigB#tbm=isch&q
=ulei+esential+de+marar+tehnologie&imgrc=wrj1vNmr4z8MkM%3A
10. https://www.organicfacts.net/health-benefits/essential-oils/dill-essential-oil.html
11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3249919/
12. http://www.sfatulmedicului.ro/plante-medicinale/marar-anethum-graveolens_14351
13. http://www.esentialis.ro/articole/depozitarea-conservarea-si-pastrarea-uleiurilor-esentiale/
14. http://commons.wikimedia.org/wiki/Anethum_graveolens
15. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814605000907
16. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968089606004688
17. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3249919/

14