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CAPÍTULO 10
MANCHAS HEMATICAS
Autor:
Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría Pericial
dependiente del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción
Según el diccionario, se entiende por mancha a “una señal que una cosa hace en un
cuerpo, ensuciándolo”. Desde el punto de vista forense, el estudio de las manchas de sangre
reviste un gran interés ya que a partir de éstas, las técnicas empleadas hoy en día permiten
llegar a resultados de gran certeza respecto de la persona a partir de la cual se originó la
misma.
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Reacciones de orientación:
Las reacciones de orientación, tal como su nombre lo indica, de ser positivas solo
expresan la posible presencia de sangre, adquiriendo un valor definitivo cuando resultan
negativas, situación esta derivada de su gran sensibilidad.
Las mismas aprovechan la actividad peroxidásica del grupo hemo, la cual se pone en
evidencia mediante el empleo de H2O2 y reactivos orgánicos que pasarán de una forma
incolora a otra coloreada o bien luminiscente. Podemos representar lo antedicho de la
siguiente manera:
Debemos tener en cuenta que diversas sustancias poseen una actividad similar a la del
grupo hemo y de allí su inespecificidad. Entre ellas podemos mencionar las peroxidasas de
origen vegetal y las sales de cobre y níquel.
Entre los numerosos reactivos utilizados para la realización de esta prueba,
mencionaremos los siguientes (Fig. 10.1):
Ensayo de Adler:
Emplea bencidina disuelta en ácido acético o bien en una mezcla de etanol y el
mencionado ácido. En caso de ser positivas dan color azul o azul-verdoso. Su sensibilidad es
de 1: 250.000. Un dato de interés y que ha hecho que la misma caiga en desuso es la actividad
carcinogénica de la bencidina. El reactivo se prepara en el momento de usar disolviendo 0,01 a
0,05g. del mismo en 10 ml de ácido acético glacial.
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Reacciones de certeza:
Son aquellas que nos permiten afirmar que una mancha es de sangre o bien descartar
esa posibilidad. Casi la totalidad de los estudios de este tipo se basan en la identificación del
grupo hemo de la hemoglobina. La excepción la constituye la búsqueda de los elementos
formes de la sangre, tal como los glóbulos blancos y/o rojos, hecho este que no es común en
laboratorios forenses.
Entre las diversas técnicas que se han descripto, podemos mencionar las siguientes:
Cristales de Teichman:
Se basa en la obtención de los cristales de hematina o hemina. La misma se realiza
dejando caer una gota de un macerado de la mancha en agua destilada o S.F. en el centro de
un portaobjetos la que se lleva a sequedad calentando sobre un mechero en forma suave (la
temperatura no debe superar los 60ºC.), repitiendo la operación (gota-secado) de dos a tres
veces (Fig. 10.2).
Se cubre con un cubreobjetos y luego, por capilaridad, se adiciona ácido acético glacial
(al que debe adicionarse ClNa en una concentración igual al 0.1% en caso de haber preparado
el macerado con agua destilada) y a continuación calentar de manera algo más enérgica a la
anterior. Repetir la operación una vez y luego observar al microscopio. La observación de
cristales de color castaño a castaño claro y con forma de prismas alargados a rómbicos, indica
una reacción positiva.
Una modificación digna de ser mencionada es la de Bertrand, para la cual se emplea el
siguiente reactivo: Cl2Mg 1g., agua destilada 1 ml, glicerol (30% v/v) 5g. y ácido acético glacial
20 ml. La técnica se desarrolla de manera similar a la anterior pero ahora observaremos
cristales algo más pequeños.
Cristales de Takayama:
Se basa en la obtención de los cristales de piridino-hemocromógeno. El
hemocromógeno es un derivado obtenido por la desnaturalización y reducción consecutiva de
la hemoglobina o de la oxihemoglobina, la cual posteriormente con una base origina las formas
cristalinas típicas de este derivado. El reactivo a emplear está formado por 5 ml de una
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Entre las condiciones que debe cumplir el antisuero a emplear pueden mencionarse:
esterilidad; que se encuentre libre de turbiedad, en ese sentido la presencia de la misma hace
desaconsejable su utilización; especificidad, es decir, debe reaccionar con muestras
procedentes de la especie animal contra la cual fue preparada.
Finalmente, puede destacarse el título del antisuero como un dato de importancia
siendo aquel de 1:10.000 el aconsejado.
En ese sentido, una forma de determinar el título del antisuero es la siguiente: preparar
diluciones del suero a emplear en S.F., por ejemplo de 1:1.000 a 1: 32.000 en forma seriada. A
continuación, en tubos de hemólisis adicionar 50 l del antisuero en estudio y luego, con sumo
cuidado a fin de evitar que se mezclen, 100 l de las diferentes diluciones a ensayar y dejar en
reposo.
La aparición antes de los 20 minutos de un anillo en la interfase suero-antisuero, indica
una reacción positiva siendo aconsejable la utilización de un fondo oscuro e iluminación
adecuada a fin de lograr una mejor visualización (Fig.10.3).
Preparación de la muestra:
Se realiza una dilución empleando Solución fisiológica siendo la concentración
adecuada de 1:1.000. A modo de ejemplo puede estimarse que 1 cm 2 de tela manchada debe
eluirse en 1 ml de la citada solución.
Técnicas para la investigación de especie:
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Antisuero Muestra
Muestra Antisuero
Finalizada la operación se
coloca la placa en cámara húmeda y
se lleva a estufa a 37ºC durante 24
hs. Luego se procede a la lectura de
los resultados siendo positivo
aquellas en las cuales se observe un
halo de precipitación entre la muestra
y el antisuero (Fig. 10.4). La lectura
deberá hacerse mediante el empleo
de luz y fondo adecuado.
Método electroforético:
Esta técnica nos permite efectuar el ensayo en forma rápida y con resultados
satisfactorios. Básicamente, la técnica puede explicarse de la siguiente manera: el antisuero
colocado en un orificio próximo al ánodo es enfrentado con un extracto sanguíneo ubicado en
un hoyuelo del lado del cátodo.
Los antígenos presentes en el extracto son fundamentalmente albúmina y alfa y beta
globulinas, mientras que los anticuerpos presentes en el antisuero son principalmente gamma
globulinas. La electroforesis causa un movimiento anódico y al mismo tiempo un flujo
endosmótico hacia el cátodo el cual se genera en el movimiento del líquido en sentido contrario
al de la migración de la corriente.
De lo expuesto surge que mientras la corriente eléctrica “arrastra” los antígenos del
extracto sanguíneo hacia el ánodo, las gamma globulinas lo hacen hacia el cátodo, pero
impulsadas por el flujo endosmótico.
Sobre un portaobjeto limpio y desengrasado vertir 2 a 2,5 cc de solución de agar al 0,2
%. El agar a utilizar deberá ser grado electroforético con baja electroendosmosis, propiedades
de suma importancia para la técnica a emplear. Dejar 30 a 40 minutos a temperatura ambiente
y luego llevar a estufa a 65ºC por 90 minutos.
A continuación adicionar a esta capa 4,5 ml de agar al 2% de modo tal que esta tenga
un espesor de 2 mm. Posteriormente practicar orificios en la capa de agar tal como se indicó
anteriormente y según la siguiente distribución.
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Los orificios deben tener un diámetro de 1.5 a 1.8 mm y separados, de a pares, una
distancia de 3 mm.
Una vez completada la placa colocar el antisuero de izquierda a derecha en los orificios
de las hileras 1ra., 3ra., 5ta. y 7ma y las muestras en los orificios restantes, de modo tal que los
líquidos queden al ras pero sin rebalsar.
A continuación agregar el buffer en la cuba electroforética y colocar el portaobjetos
debiendo quedar las columnas con el antisuero del lado del ánodo. Una vez ubicada la placa
hacer con papel absorbente los puentes correspondientes entre las mismas y los electrodos.
Efectuar la corrida electroforética según las siguientes condiciones: 150 voltios 20
minutos (aproximadamente 15 mAmp). La aparición de un halo de precipitación entre la
muestra y el antisuero indica una reacción positiva.
Una vez leídos los resultados, puede revelarse la placa de la siguiente manera:
Sumergir el portaobjetos en solución de ClNa 1 M durante una noche y luego lavar con agua
durante 5 minutos (para tal operación, la placa se sumerge en una cuba conteniendo agua
destilada dejándola el tiempo mencionado). A continuación secar o bien colocar papel de filtro
Whatman Nº1 sobre el gel y llevar a 60ºC. Esta operación deberá ser efectuada con sumo
cuidado a fin de no dañar el gel. Retirar el papel siendo conveniente que se encuentre húmedo.
Concluida esta operación se expone la placa a la acción de la solución colorante (ver más
adelante) durante 5 minutos. Transcurrido ese lapso, eliminar el exceso de esta solución con
solución de lavado (ver más adelante), dando por concluida esta operación cuando se observa
la aparición de bandas de color azul sobre un fondo claro.
Una variante de esta técnica emplea un buffer (pH 8,4) constituido por: tricina ( sigma T-
0377) 4,5 g (0,025 M); tris base ( sigma T-1503) 9 g (0,074 M); agua bidestilada csp 1 Lt. También
puede emplearse la siguiente mezcla: glicina (sigma G- 7126) 21,8 g ; tris base 4,5 g y agua
bidestilada csp 1Lt .
En esta técnica se emplea agar al 0,2 % pero, a continuación, se utiliza una solución de
agarosa al 1% en uno de los buffer descripto previamente. El resto de la metodología es idéntica a
la ya detallada.
Por otra parte, para este tipo de estudio hoy en día pueden emplearse kit comerciales
destinados al análisis de sangre oculta en materia fecal, los cuales ofrecen muy buenos resultados
y poseen entre sus ventajas la velocidad en la determinación. Así, por ejemplo, el Hem-check-1
(Veda Lab-France) emplea una única combinación de anticuerpo monoclonal conjugado y
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anticuerpo monoclonal en fase sólida para identificar hemoglobina humana, realizándose el test en
tan solo 10 minutos. Esta determinación es de carácter presuntivo.
Sistema ABO:
En las manchas de sangre seca los glóbulos rojos en general están destruidos, sin
embargo, los antígenos responsables de la especificidad de grupo mantienen su capacidad para
reaccionar con los anticuerpos específicos. Claro está que, en éstas condiciones, las técnicas de
aglutinación directa no son aplicables.
Pueden investigarse tanto las aglutininas (anticuerpos anti-A y anti-B) como los
aglutinógenos A, B y O. Por ser las más utilizadas se detallarán aquellas técnicas orientadas a
detectar la presencia de los últimos.
Muestra Blanco
Blanco Muestra
Adicionar a los dos primeros trozos de tela 2 gotas de suero anti-A y a los dos últimos una
gota de suero anti-B. Dichos antisueros deberán ser previamente titulados y la dilución a emplear
debe ser tal, que se produzca una aglutinación visible hasta la última dilución a realizar en esta
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técnica. En ese sentido digamos que los autores indican la dilución de 1 / 32 como aquella a
emplear pero es aconsejable la titulación previa a fin de evitar inconvenientes.
Bl
M : Muestra T
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Bl : Blanco
T : Testigo
3- Una vez seco el adhesivo adicionar a cada hilo una gota del antisuero indicado en la
columna respectiva. Para la dilución a emplear valen las mismas consideraciones hechas
previamente. El hilo debe quedar totalmente sumergido en el antisuero.
4- Incubar durante no menos de 3 hs. a 4 º C en cámara húmeda siendo aconsejable
dejarlo toda la noche
5 - A continuación lavar la placa con S.F. a 4º C con ayuda de una piseta. Secar con
papel de filtro con sumo cuidado y sumergir a un recipiente con S.F. a 4 º C durante 30
minutos con agitación suave y constante.
6- Retirar la placa y secar con papel de filtro.
7- Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos adecuada según el antisuero
utilizado. La misma se prepara en S.F. con el agregado de albúmina bovina al 0,3 % con
una concentración del 0,1 %. Los glóbulos rojos deben lavarse 3 veces con S.F.
empleando sangre heparinizada. Llevar a cámara húmeda y luego a estufa a 50 º C
durante 15 minutos.
8- Retirar de la cámara húmeda y colocar la placa en un agitador de baja velocidad durante
30 minutos.
9- Observar la presencia o no de aglutinación con ayuda de un microscopio. Así, de
verificarse esta en la columna anti A, indica que esa muestra corresponde al grupo A.
una pipeta Pasteur (con precaución de no tocar las paredes de los mismos), colocar una gota
de cada uno en un portaobjetos y observar con objetivo de 10X. La presencia de aglutinación
indica un resultado positivo para la presencia del antígeno en cuestión.
Por último, en relación a este tema, digamos que se han desarrollado numerosas
técnicas de tipo electroforético que permiten no solo la determinación del grupo
sanguíneo sino también el análisis del polimorfismo del sistema ABO, las cuales no
serán expuestas en el presente capítulo.
Bibliografía
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