PREPARACION DE UN

METODO DE PURIFICACION
DE PROTEINAS

Francisca Acevedo C-E

PASOS DE PURIFICACION

5. Pulido (polishing)
Alcanzar un alto grado de
pureza final
Pureza (%)

4. Concentración

1. Preparación
2. Extracción
3. Clarificación

Pasos
PREPARACION DE UN METODO LIPASAS: Se introduce
durante el proceso de
producción del queso
Responder a las siguientes preguntas: roquefort para favorecer
la maduración

1. ¿Cuál es la materia prima disponible?

 Célula vegetal

 Célula animal
2. ¿ cómo debiera ser tratada ?
 Hongos y levaduras

 Bacterias
• Gram positivas
• Gram negativas
3. ¿Se requiere purificar a gran escala ?

4. ¿ Qué consecuencia tendrá este escalamiento en las técnicas de

purificación escogidas ?

5. ¿ Cuál es el costo del proceso de purificación escogido ?

6. ¿Cuáles son los recursos y equipos disponibles para lograr la

purificación ?
7. ¿Cuál será el uso esperado de la proteína purificada ??
8. ¿ Cuál es el grado de pureza necesario o esperado en relación a
la materia prima y uso final de la proteína ?

Pureza (%) Uso

Alta (> 95 %) Cristalografía rayos X y caracterización fisicoquímica

Moderada (< 95%) Antígeno para la producción de anticuerpos

Reconstrucción de rutas metabólicas: estudio de la función

de proteínas y enzimas, estudio de la cinética y regulación de
la reacción, etc.

Uso de biocatalizadores (proteasas, lipasas, amilasas, etc.)

Uso en terapias (insulina, tratamiento hormonal, etc).

Uso de proteínas recombinantes para ensayos de

transformación genética

Baja (50%) Uso en biorremediación de suelos contaminados

Uso industrial
9. Es mejor “sobre-purificar” que “sub-purificar”

Aunque el n°de pasos de purificación debiera minimizarse, la

calidad del producto final no debiera estar comprometida.

10. Procedimiento costo-efectivo: diseñar un proceso de

purificación económico y escalable
11. ¿ Qué debe ser eliminado ?

12. ¿ Cuáles son los contaminantes que inactivan o interfieren con

los análisis ?

13. ¿ Debe ser eliminado completamente ?

Definir las propiedades de la proteína de interés e

impurezas críticas para simplificar la selección de
las técnicas y optimización.
BASE DE DATOS

http://www.brenda-enzymes.info/

• Tamaño

• pI

• Hidrofobicidad

• Solubilidad

• Estudios científicos
TAREA 1. PROPIEDADES DE LA ENZIMA A PURIFICAR

Exposición Lunes 28 Septiembre (10 min)

Enzimas

1. Pepsina EC 3.4.23.1
2. Tripsina EC 3.4.21.4
3. Catalasa EC 1.11.1.6
4. Triacylglycerol lipase EC 3.1.1.3.
5. L-asparraginasa EC 3.5.1.1
6. Acetilcolinesterada EC 3.1.1.7
7. Gamma-glutamyltransferase EC 2.3.2.2
8. L-lactate dehydrogenase EC 1.1.1.27
9. Fosfatasa ácida EC 3.1.3.2
 TAREA 1. PROPIEDADES DE LA PROTEINA A PURIFICAR

Ud. requiere purificar la enzima RENINA (EC 3.4.23.15)

1. ¿ Cuál es la función de esta enzima ?

 Es secretada por el riñón en respuesta a un disminución en la presión

sanguínea

 La RENINA activa el sistema renina angiotensina aldosterona al catalizar la

hidrólisis del angiotensinógeno producido por el hígado, formando la
angiotensina I.

 La angiotensina I es hidrolizada por una enzima liberada desde el tejido

pulmonar, la enzima convertidora de angiotensina (ECA), lo cual forma
finalmente angiotensina II, un péptido vasoconstrictor.

RENINA ECA
ANGIOTENSINÓGENO ANGIOTENSINA I ANGIOTENSINA II
(vasoconstrictor)
2. ¿ Porqué requiere purificarla ?

Porque deseo conocer su estructura para poder diseñar un

nuevo medicamento Hipotensor, consistente en un inhibidor
de la Renina.
3. ¿ De qué fuente Ud. la purificará ?

4. ¿ Cuál es el grado de purificación esperado de la enzima purificada ?

5. Definir los requerimientos de pureza de acuerdo al uso final del

producto

6. Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas críticas.

 Estabilidad a la temperatura, pH, fuerza iónica, solventes orgánicos, a la

oxidación, a condiciones de almacenamiento.

Cofactores, inhibidores, iones metálicos

Masa molecular

Punto isoeléctrico
Propiedades de la proteína Influencia en la purificación

Estabilidad a la Necesidad de trabajar rápidamente a bajas

temperatura temperaturas

Uso de detergentes Considerar sus efectos en las etapas cromatográficas y

la necesidad de remover el detergente. Escoger el
detergente adecuado.

Fuerza iónica Selección de las condiciones de técnicas de

precipitación y cromatografía de interacción
hidrofóbica

Co-factores para la Selección de aditivos, pH, sales, soluciones tamponadas

estabilidad o actividad

Sensibilidad a proteasas Necesidad de remover rápidamente las proteasas o

adicionar inhibidores
 Propiedades de la proteína Influencia en la purificación

Sensibilidad a iones metálicos Necesidad de agregar EDTA o EGDA en soluciones

tamponadas

Masa molecular Selección de resina de filtración en gel

Propiedades de cargas Selección de resina de intercambio iónico

Afinidad bioespecífica Selección de ligando por medio de afinidad

Hidrofobicidad Selección de un medio para la cromatografía de

interacción hidrofóbica
7. Método analítico

 ¿Cuál es el test enzimático que debo aplicar para determinar la

actividad enzimática de la enzima que deseo purificar ?

 ¿ Cuál es el sustrato utilizado y cuál es el producto de la reacción ?

 ¿ Cómo se mide ?

8. ¿ Se requiere purificar a gran escala ?

 ¿ Qué consecuencia tendrá ese escalamiento en las técnicas de

purificación escogidas ?
Enzimas

1. Pepsina EC 3.4.23.1
2. Tripsina EC 3.4.21.4
3. Catalasa EC 1.11.1.6
4. Triacylglycerol lipase EC 3.1.1.3.
5. L-asparraginasa EC 3.5.1.1
6. Acetilcolinesterada EC 3.1.1.7
7. Gamma-glutamyltransferase EC 2.3.2.2
8. L-lactate dehydrogenase EC 1.1.1.27
9. Fosfatasa ácida EC 3.1.3.2
 CONSIDERACIONES
IMPORTANTES
para el diseño de un
Método de purificación
Minimizar la manipulación de muestras en cada etapa
la cual puede provocar pérdida de la actividad
enzimática o reducir el rendimiento de purificación

Usar una técnica diferente para cada paso: de

modo de aprovechar al máximo las características
de la muestra las cuales pueden ser utilizadas para
la separación (tamaño, cargas, hidrofobicidad,
especificidad de ligando).
 Escoger los ADITIVOS adecuados

 Sales
 Iones metálicos
 Quelantes
 Surfactantes

Minimizar el uso de aditivos: puede que sea necesario remover

los aditivos en un paso adicional de purificación, como por
ejemplo en caso de que interfieran en los ensayos de
actividad enzimática.

Proteger las proteínas durante el proceso de purificación

 Efecto de la superficie
 Efecto de la temperatura
 Inhibidores de proteasas

Escoger las soluciones tamponadas adecuadas

 Sales
ADITIVOS  Iones metálicos
 Quelantes
 Surfactantes

 Sales: se usan KCl o NaCl 0.1-0.2 M, simulando las condiciones

fisiológicas
 Iones metálicos:

 En presencia de un catión divalente como Ca2+ o Mg2+, se puede

formar un complejo con la solución tamponada:

 La capacidad de los iones H+ de la solución tamponada es reducida.

 Además, la disponibilidad de los iones metálicos para participar en una
reacción enzimática puede ser disminuida.

 Evitar las soluciones tamponadas TRIS cuando un cofactor metálico es

requerido para la actividad o estabilidad de una enzima/proteína.

Por ej., en presencia de 100 mM TRIS con 2 mM Mn2+, un 29% del metal es
quelado.
 Quelantes

Cuando es necesario limitar los efectos de los metales,

se pueden usar quelantes específicos:

a. Para eliminar cantidades de trazas de metales pesados, se usa

EDTA 0.1-5 mM

b. EGTA tiene una alta afinidad por quelar el Calcio

c. O-phenanthroline quela zinc, mientras que m-phenanthroline no.

Surfactantes

• son moléculas anfipáticas.

• son a menudo usados para la extracción y purificación

de proteínas de membranas

• Las proteínas de membrana solubilizadas forman

micelas con los surfactantes.

•La concentración micelar crítica (CMC) se define

como la concentración de surfactante más baja a la
cual se forma la micela.
Usar concentraciones bajas de surfactantes (0.1%). De
lo contario, se puede producir una desnaturalización
de las proteínas.
1. Detergentes iónicos

• Contienen grupos con carga positiva (catiónicos) o cargas

negativas (aniónica).

• Presentan la desventaja de ser altamente desnaturante.

Sin embargo, permiten la separación de proteínas en su forma

monomérica, facilitando la determinación de la masa
molecular.
a) Dodecil sulfato de sodio o de litio (SDS, LiDS)

• Surfactantes aniónicos.

• LiDs tiene la ventaja de ser soluble a 4°C, mientras que

SDS no.

• El uso de estos surfactantes en presencia de solución

tamponada de sulfato de potasio o de amonio puede llevar
a su precipitación a temperatura ambiente.
b) Sodium cholate y sodium deoxicolato (DOC)

• Son surfactantes aniónicos que tienden a desnaturalizar menos

que otros detergentes iónicos.

• El pKa de estos surfactantes es entre 8 y 9, y la precipitación del

surfactante en su forma ácida es un problema a pH < 7.5.

• La presencia de cationes divalentes causan la precipitación de

DOC
2. Detergentes no-iónicos

• Poseen grupos no cargados en la cabeza hidrofílica por lo que

son menos propensos a romper las interacciones proteína-
proteína y son particularmente útiles para aislar complejos
proteicos funcionales.

• Desnaturalizan en menor grado que los surfactantes iónicos.

a) Triton X-100

• Muchas enzimas retienen su actividad usando 1-3 % Triton X-

100.

• Este surfactante posee una alta absorbancia a 280 nm.

b) Triton X-114

Trition X-114 (2%) adicionado a la solución de proteína tiene la

facultad de causar una separación entre éste y la fase
acuosa a temperaturas bajo 20 °C. Por lo tanto, proteínas
hidrofílicas se quedan en la fase acuosa mientras las proteínas
de membrana pueden ser recuperadas en la fase apolar del
surfactante.
c) Octyl glucoside (OG)

El surfactante OG es considerado mejor químicamente que

Triton X-114, permitiendo la obtención de resultados más
reproducibles con este surfactante.

Una concentración de 10-45 mM OG es suficiente para

solubilizar las proteínas de membrana.

OG es más fácil de remover de la solución que el surfactante

TRITON.
3. Detergentes zwitteriónicos

• Poseen grupos cabezales con carga positiva y negativa.

• Estos surfactantes son más eficientes que los detergentes no-

iónicos para sobrellevar las interacciones proteína-proteína y
causan menos desnaturalización de proteínas que los
detergentes iónicos.

a) CHAPS

CHAPs no interfiere con la cromatografía de

intercambio iónico y las proteínas en solución
conteniendo CHAPS pueden refrigerarse con
seguridad.
 PROTECCION DE LAS PROTEINAS
antes – durante- después del proceso de purificación

a) Efecto de superficie

 Las soluciones diluidas de proteínas pierden a menudo la

actividad en forma rápida, debido a la desnaturalización en las
superficies de vidrio.

 La pérdida de la proteína debido a la adhesión no específica

en las superficies de vidrio es de 1 μg de proteína en 5 cm2 de
superficie de vidrio. Pero este efecto se pierde al adicionar altas
concentraciones de otras proteínas, usualmente Albúmina.

Para evitar esa última medida (adición de proteína contaminante),

las soluciones diluidas de proteínas deben ser rápidamente
concentradas.
b) Almacenamiento

La vida media de una proteína se alarga mediante un

almacenamiento a baja temperatura.

Las mejores condiciones de almacenamiento:

 4 °C
 20 °C
 -80 °C
 - 200 °C (en nitrógeno líquido),

dependiendo de la muestra.
Para almacenamientos de corto tiempo (1- 7 días), la
proteína puede ser almacenada a 4 °C si:

• La actividad de la enzima de interés no disminuye

durante ese período

• No hay degradación visible por electroforesis 2-D

• Cantidad insignificante de material pelletizado luego de

centrifugar por 10 min a 20.000 x g (de lo contrario,
indicaría desnaturación)
Para almacenamiento de largo tiempo (más de 1
semana):

• Almacenar la proteína a 4°C como precipitado

suspendido en sulfato de amonio

• La proteína precipitada en sulfato de amonio puede ser

pelletizada por centrifugación 20 min a 20,000 x g y luego
congelada con nitrógeno líquido y almacenada a
temperatura – 80°C.

• Almacenar la proteína en forma liofilizada

• Glicerol al 50% es utilizado para estabilizar las

proteínas a 4 °C
c) Adición de inhibidores de proteasas

• Se adicionan para atrasar la proteólisis

• Muchos inhibidores de proteasas son poco solubles

en solución acuosa, por lo que debe ser mezclados
rápidamente para minimizar la precipitación.

• Los más comunes son:

o PMSF
o EDTA
o Pepstatina A
o Leupeptina
o Aprotinina
PMSF

 Inhibe las serina proteasas (quimiotripsina, tripsina,

trombina) y tiol proteasas (papaína).

 Soluble en isopropanol al 10 mg/mL

 Solución stock estable por más de 1 año a temperatura

ambiente

 Concentración de trabajo: 17-174 μg/mL (0.1 – 10 mM)

 Inestable en solución acuosas, adicionar PMSF recién

preparado en cada paso de purificación
EDTA

 Inhibe las metaloproteasas

 Soluble en agua a 0.5 M pH 8-9

 Solución stock estable por más de 6 meses a 4°C

 Concentración de trabajo: 0.2-0.5 mg/mL (0.5 – 1.5

mM)

 Adicionar NaOH para ajustar en pH de la solución

stock, de lo contrario EDTA permanece insoluble.
Pepstatina A

 Inhibe proteasas ácidas como pepsina, renina,

catepsina D y chymosin

 Soluble en metanol al 1 mg/mL

 Solución stock estable por 1 semana a 4 °C o 6 meses

a -20 °C

 Concentración de trabajo: 0.7 μg/mL (1 µM)

 Insoluble en agua
Leupeptina

 Inhibe las serina proteasas y tiol proteasas tales como

papaína, plasmina y catepsina B

 Soluble en agua a 10 mg/mL

 Solución stock estable por 1 semana a 4 °C o 6 meses

a -20°C

 Concentración de trabajo: 0.5 μg/mL (1 μ M)

Aprotinina

 Inhibe las serina proteasas como plasminia, kallikrein,

tripsina y quimiotripsina

 Soluble en agua a 10 mg/mL, ajustar a pH 7-8.

Inactiva a pH > 12.8

 Solución stock estable por 1 semana a 4 °C o 6 meses

a -20°C

 Concentración de trabajo: 0.06-2.0 μg/mL (0.01-0.3 μ

M)
CARACTERISTICAS DE LAS SOLUCIONES TAMPONADAS

Una solución tamponada es definido como:

Una mezcla de un ácido y su base conjugada la cual

reduce los cambios en el pH de una solución cuando se
agrega un ácido o una base.

• La selección de una adecuada solución tamponada

es importante de modo de mantener una proteína en un
pH deseado y para asegurar los resultados experimentos
reproducibles
• Todos los productos químicos deben ser para análisis
(no grado técnico)

• Para preparar una solución amortiguadora de un pH

determinado debe seleccionarse un ácido o una base
cuyo pKa sea cercano al pH de la solución tampón que
se requiere preparar.
Valores de pKa de tampones biológicos comunes

Name pKa
Acetate 4.76
Pyridine 5.23
MES 6.15
Bis-TRIS 6.46
PIPES 6.76
MOPS 7.20
HEPES 7.55
TRIS 8.06
Borate 9.23
Glycine 9.78
CAPS 10.40
• Una vez que la solución tamponada es escogida, lo mejor es
trabajar a una concentración baja (50 mM) para evitar
efectos de fuerza iónica.

• Considerar que las enzimas se desnaturalizan

irreversiblemente a valores de pH extremos.

• El pH fisiológico de la mayoría de las células animales es 7.0-

7.5 a 37 °C. Debido al efecto de la temperatura, este valor
aumenta cercano a 8 a temperaturas cercanas a 0.
La elección de las soluciones tamponadas
dependerá también de los métodos empleados:

 Para cromatografía por filtración en gel, la mayoría

de las soluciones tamponadas son compatibles con las
proteínas

 Para cromatografía de intercambio catiónico, las

soluciones tamponadas aniónicos tales como fosfato
funcionan bien.

 Para cromatografía de intercambio aniónico,

soluciones tamponadas catiónicos como TRIS son de
elección
Las “buenas” soluciones tamponadas tales como MES,
PIPES, MOPS son:

 Inertes

poseen baja absorbancia UV

son afectadas en menor grado por la temperatura y

fuerza iónica

Sin embargo, son más caras que las soluciones

tamponadas tradicionales, tales como citrato o
acetato.
El pH de una solución debe ser ajustado a la temperatura a la
cual la solución tamponada será usada

Sin embargo, esto requiere que el electrodo de pH sea

estandarizado a la temperatura de trabajo, 4°C.

En la práctica, la solución tamponada es preparada a

temperatura ambiente y el pH es ajustado también a
temperatura ambiente.

Los efectos de la temperatura en el pH de la solución

tamponada pueden ser grandes.

Por ejemplo, TRIS tiene un pKa de 8.06 a 25 °C pero cambia a

8.85 a 0 °C.
Es habitual preparar soluciones stock de tampón 10x o
100x.

Esto permite manejar volúmenes más

pequeños y la adición de agentes
bactericidas tales como azida de sodio
0.02%
• ATENCION: la adición de las soluciones stock
de solución tamponada pueden cambiar el pH.

Por ejemplo:

La solución tamponada fosfato 0.1 M tiene pH 6.7.

 Si se diluye 10 veces, el pH aumenta a 6.9

 Si se diluye 100 veces, el pH aumenta a 7.0

El pH del TRIS disminuye 0.1 unidad por cada dilución

10x
LIMITACIONES de algunas soluciones tamponadas

• Las soluciones tamponadas compuestas de componentes

inorgánicos (fosfato, borato, bicarbonato) pueden interactuar
con enzimas afectando sus actividades.

•Las soluciones tamponadas forman complejos de

coordinación con iones metálicos di- y trivalentes resultando
en la liberación de protones, disminución de pH, quelación
del metal y formación de complejos insolubles.

Las soluciones tamponadas con bajas constantes de unión a

metal son PIPES, TES, HEPES y CAPS los cuales son los de
preferencia para el estudio de enzimas.
El tampón fosfato:

-precipita o se une a muchos cationes polivalentes

- inhibe una gran cantidad de enzimas (quinasas,

fosfatasas, deshidrogenasas)

-Muestra una dependencia del pKa en la dilución del

buffer

El tampón citrato:

-Se une a algunas proteínas y forma complejos

metálicos
El tampón cacodilato es tóxico

El tampón carbonato tiene una solubilidad limitada y

como está en equilibrio con CO2, los estudios deben
realizarse en sistemas cerrados.

El tampón ADA absorbe luz a longitudes de onda

mayores a 260 nm y se une a iones metálicos.

El tampón MOPS interfiere con el método de Lowry, pero

no el método de Bradford o él de BCA
El tampón HEPES:

- Interfiere con el método de Lowry, pero no con el de Bradford o

BCA

- Todos los tampones “buenos” (HEPES; EPPS; PIPES) forman radicales

bajo diversas condiciones y debieran ser evitados en sistemas donde
se estudian los procesos redox.

El tampón TRIS:

- participa en varias reacciones enzimáticas, como por ej. aquellas

catalizadas por la fosfatasa alcalina

- pasa a través de las membranas biológicas y por lo tanto generar

valores falsos.

- es afectado por la concentración de la solución tamponada y

temperatura
Prevención de la contaminación de soluciones tamponadas

• Las soluciones tamponadas fosfato son altamente susceptibles a la

contaminación microbiana. Ocupar una solución stock de 1 M la
cual tiene menor riesgo de contaminación.

• Filtrar las soluciones tamponadas través de un aparato de

filtración estéril de modo de prevenir el crecimiento bacteriano y
de hongos especialmente a pH 6 a 8.

• Prevenir la contaminación del tampón durante el

almacenamiento con 0.02% (3 mM) de azida de sodio.
Este reactivo no interactúa significativamente con las
proteínas a esa concentración.

• La refrigeración ayuda a reducir la contaminación de las

soluciones tamponadas.

• Usar agua desionizada en la preparación de las soluciones

tamponadas